Αφηρημένο

Η υποξία, εφρίνης-Α1 και ενδοθηλιακή συνθετάση του μονοξειδίου του αζώτου (eNOS ) έχουν αποδειχθεί ότι παίζουν κρίσιμους ρόλους στην αγγειογένεση των όγκων. Ωστόσο, πώς εφρίνης-Α1 ρυθμίζεται από υποξία και αν ephrin-Α1 συνεργάζεται με eNOS στη ρύθμιση της αγγειογένεσης θα πρέπει να αντιμετωπιστούν σε λεπτομέρειες. Εδώ αποδείξαμε ότι και οι δύο εφρίνης-Α1 σε κύτταρα πλακώδους καρκινώματος (SCC-9) και ιδιαίτερα διαλυτό εφρίνης-Α1 στα υπερκείμενα ρυθμίστηκαν προς τα πάνω κάτω από υποξικές συνθήκες. Μία αυξημένη νιτρικού οξειδίου (ΝΟ) σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVECs) παρατηρήθηκε σε εφρίνης-Α1-επαγόμενη αγγειογένεση που αντιστράφηκε μετά από συν-καλλιέργεια με eNOS συγκεκριμένο αναστολέα, Ν-νιτρο-Ε-αργινίνη μεθυλ εστέρα υδροχλωρίδιο (L -ΌΝΟΜΑ). Η ανάλυση στυπώματος Western επιβεβαίωσε ότι και οι δύο φωσφορυλίωση της Akt

Ser473 και eNOS

Ser1177 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω σε εφρίνης-Α1-διεγερμένα HUVEC, με τη συνολική έκφραση eNOS αμετάβλητη. Η ειδικός αναστολέας της κινάσης φωσφατιδυλινοσιτόλης-3 (ΡΙ3Κ), LY294002, σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται εφρίνης Α1-επαγόμενη έκφραση του φωσφορυλιωμένου Akt

Ser473 καθώς και η φωσφορυλίωση του eNOS

Ser1177. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ένα πιθανό νέο μηχανισμό με τον οποίο ephrin-Α1 ρυθμίζεται στο μικροπεριβάλλον του όγκου και προάγει την αγγειογένεση μέσω μιας συντονισμένης cross-talk με PI3K /Akt ενεργοποίηση που εξαρτάται από eNOS που μπορεί να σχετίζονται με την κανονική αγγειακή ανάπτυξη και νεοαγγείωση όγκου.

Παράθεση: Τραγούδι Υ, Zhao XP, Τραγούδι Κ, Shang ZJ (2013) Ephrin-Α1 ρυθμίζεται προς τα πάνω από την υποξία στα καρκινικά κύτταρα και προάγει την αγγειογένεση των HUVECs μέσω μιας συντονισμένης Cross-Συζήτηση με eNOS. PLoS ONE 8 (9): e74464. doi: 10.1371 /journal.pone.0074464

Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 18 του Ιανουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 3 Αυγ, 2013? Δημοσιεύθηκε: 9 Σεπτεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Song et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 81172570 και Νο 30872893). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Μια ποικιλία από προ-αγγειογενετική και αντι-αγγειογόνους παράγοντες συμμετέχουν στον έλεγχο της αγγειογένεσης η οποία παίζει ουσιαστικό ρόλο στην ανάπτυξη και μετάσταση όγκου [1] – [3]. Ephrin-A1 και πρωτογενείς υποδοχέα του, EphA2, δεν εκφράζεται μόνο σε πολλαπλές κακοήθειες, αλλά και να παίξουν σημαντικό ρόλο στην κανονική αγγειογένεση και νεοαγγείωση όγκου [4]. Υπερ-έκφραση του εφρίνης-Α1 σε καρκινικά κύτταρα μπορεί να προωθήσει την αγγειογενετική διαδικασία, ενώ γκρεμίζω του εφρίνης-Α1 σε κύτταρα όγκου συμβάλλει σημαντικά στη μείωση του όγκου που προκαλείται από μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων in vitro και μικροαγγειακή πυκνότητα in vivo [5]. προηγούμενη μελέτη μας έδειξε ότι υπερ-εκφράζεται EphA2 μπορεί να συνεισφέρει στην αγγειογένεση των όγκων και να έχουν προγνωστική αξία σε καρκίνωμα γλώσσα [6]. Υπάρχουν επαρκή πειραματικά στοιχεία που υποδηλώνουν ότι η ενεργοποίηση της EphA2 στα ενδοθηλιακά κύτταρα (ECs) απαιτείται για εφρίνης-A1 για να ασκήσει αγγειογονικά αποτελέσματα της in vitro και in vivo [7]. Εντούτοις, οι παράγοντες ρυθμίσεως και μηχανισμούς με τους οποίους εφρίνης-A1 /EphA2 προάγουν την αγγειογένεση των όγκων δεν ήταν καλά αποσαφηνιστεί.

Έχει αναφερθεί ότι διάφοροι παράγοντες ανάπτυξης και κυτοκίνες μπορούν να επάγουν την έκφραση προσδεμάτων εφρίνης, όπως νέκρωσης όγκου παράγοντα-α (TNF-α), ιντερλευκίνη-1β (IL-1β), et al [8]. Η υποξία είναι μια από τις πιο κοινές και σημαντικά χαρακτηριστικά σε μικροπεριβάλλον του όγκου, και συμβάλλει στην επαγωγή διαφόρων αγγειογενετικών παραγόντων [9]. Πρόσφατα, ο HIF-1α, ένας μεταγραφικός παράγοντας υποξία, έχει βρεθεί ότι πλειορύθμιση εφρινών και υποδοχέων Eph σε δέρμα ποντικού [10]. Σε καρκίνους της κεφαλής και του τραχήλου, η αυξημένη έκφραση εφρίνης Α1-συνδέθηκε με pO

2 σε μικροπεριβάλλον του όγκου [11]. Αν και εφρίνης-Α1 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην αγγειογένεση των όγκων και φαίνεται να εμπλέκεται σε απόκριση σε υποξία, οι περισσότερες από τις προηγούμενες μελέτες έχουν επικεντρωθεί κυρίως στην εφρίνης-Α1 ως πρωτεΐνη δεσμευμένη σε μεμβράνη. Για τις γνώσεις μας, υπάρχει σχετικά μικρή άμεση απόδειξη είτε υποξία μπορεί να προκαλέσει τα καρκινικά κύτταρα να παράγουν ephrin-Α1, ειδικά η διαλυτή μορφή, είτε όχι.

Οι μηχανισμοί που βρίσκονται πίσω ephrin αγγειογένεση που επάγεται δεν έχουν ακόμη πλήρως κατανοητή. Μέχρι τώρα, μόνο μερικά μονοπάτια σηματοδότησης, όπως ΜΑΡ /ΕΡΚ και ΡΙ3Κ [12], [13], έχουν βρεθεί να επηρεάζεται από εφρίνης-Α1. Επιπλέον, η προαγωγή καθώς και η αναστολή της ίδιας οδού σηματοδότησης από εφρίνης-A1 παρατηρήθηκε σε διαφορετικά κύτταρα ή τύπους καρκίνου. Είναι γνωστό ότι eNOS και δεν παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στη μετανάστευση των ενδοθηλιακών και αγγειογένεση [14]. Επαρκή στοιχεία έδειξαν ότι eNOS εκφράζεται κυρίως σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα όγκου, και η παραγωγή της ενεργεί ΝΟ ως άμεση μόριο τελεστή με διάφορους αγγειογόνων παραγόντων αγγειογένεσης επαγόμενης όγκου [15], [16]. Ως εκ τούτου, δεν είναι έκπληξη να υποτεθεί ότι eNOS /ΝΟ μπορεί επίσης να μεσολαβήσει εφρίνης Α1-επαγόμενη αγγειογένεση όγκου. Δυστυχώς, δεν υπάρχει άμεση πληροφόρηση είναι διαθέσιμη στο σταυρό-σύνδεση μεταξύ ephrin-Α1 και eNOS κατά τη διαμόρφωση της αγγειογένεσης σε ενδοθηλιακά κύτταρα μέχρι στιγμής.

Η τρέχουσα μελέτη ερεύνησε τους μηχανισμούς που διέπουν ephrin-Α1 διαμόρφωση της αγγειογένεσης μέσω της εξέτασης του επίδραση της υποξίας στην έκφραση εφρίνης-Α1 και έκκριση σε κύτταρα όγκου και την πιθανή συσχέτιση του εφρίνης-Α1 με eNOS /ΝΟ σε όγκο αγγειογένεση. Τα στοιχεία μας επιβεβαίωσε ότι τόσο η έκφραση ephrin-Α1 και διαλυτό έκκριση ephrin-Α1 σε καρκινικά κύτταρα αυξήθηκαν υπό διέγερση υποξία. Η εφρίνης Α1-επαγόμενη αγγειογένεση συνοδεύτηκε με φωσφορυλίωση eNOS και παραγωγής ΝΟ, η οποία έχει αποκλειστεί από L-NAME. Περαιτέρω μελέτη έδειξε ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού σήματος ΡΙ3Κ /Akt απαιτείται για την στιχομυθία μεταξύ εφρίνης-Α1 και eNOS σε προαγωγή αγγειογένεσης. Τα αποτελέσματά μας πρότεινε ότι ρυθμίζεται προς τα πάνω ephrin-Α1 στον όγκο υποξικό μικροπεριβάλλον μπορεί να προάγει την αγγειογένεση μέσω PI3K /Akt /eNOS οδού.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά |

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ephrin -Α1-Fc χίμαιρα και ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IgG1 Fc αγοράστηκαν από την R & amp? συστήματα D (Minneapolis, ΜΝ, USA). Αντισώματα έναντι της EphA2, eNOS και εφρίνης-Α1 αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, ΗΠΑ), Akt και φωσφο-eNOS (Ser1177) (P-eNOS

Ser1177) από την Cell Signaling Technology (Beverly, CA, ΗΠΑ), φωσφο-Akt (Ser473) (P-Akt

Ser473) από Epitomics, Inc. (Burlingame, CA, ΗΠΑ).

Cell Culture

SCC-9 κυτταρική γραμμή, η οποία αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, ΗΠΑ), παρασχέθηκε ευγενώς από τον καθηγητή Wen-Φενγκ Ζανγκ. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε DMEM /F12 (Hyclone, UT, USA) συμπληρωμένο με 10% FBS (Gibco, Carlsbad, Calif, USA). U-251 κυτταρική σειρά GBM αγοράστηκε από την Κίνα Κέντρο Προς Type Culture Collection (CCTCC, Wuhan, Κίνα), η οποία καλλιεργήθηκε σε ΜΕΜ (Hyclone, UT, USA) συμπληρωμένο με 10% FBS (Gibco, Carlsbad, Calif, USA). Πρωτογενή HUVECs προσεφέρθησαν ευγενώς από τον καθηγητή Yi-Fang Zhao και ο Δρ Hai-Xiao Ζου [17] και καλλιεργήθηκαν σε ΕΚ βασικό μέσο-2 (ΕΒΜ-2? Lonza, Walkersville, MD) συμπληρωμένο με 2% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και με μίγμα αυξητικού παράγοντα EGM-2 (Lonza). HUVECs που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη ήταν περιορισμένος στο πέρασμα 4 έως πέρασμα 6. Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα που περιέχει 5% CO

2. Οι μελέτες μας έχουν εγκριθεί από τις επιτροπές για τη δεοντολογία της Σχολής και το Νοσοκομείο της Στοματολογίας (Πανεπιστήμιο Wuhan, αριθμός αναφοράς 055/2011).

Κυττάρου Μετανάστευση Δοκιμασία

Η μετανάστευση των κυττάρων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μηδέν πληγή . Συρρέοντα HUVECs σε πλάκα 24 φρεατίων στερήθηκαν τροφής όλη τη νύχτα σε 0.1% BSA ΕΒΜ-2 μέχρι ένα τραύμα έγινε χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 200 μΐ. Μετά την έκπλυση με PBS τρεις φορές για να απομακρυνθούν τα αποσπασμένα κύτταρα και τα κυτταρικά θραύσματα, αυξητικός παράγοντας-ελεύθερο μέσο με εφρίνης-Α1-Ρο (1 μg /ml) μόνο του ή μαζί με L-NAME (100 μΜ) ή LY294002 (10 μΜ) ήταν προστίθενται σε κάθε φρεάτιο. Αυξητικού παράγοντα-ελεύθερο μέσο με ή χωρίς ανασυνδυασμένη IgG1 Fc (1 μg /ml) ελήφθη ως έλεγχος. Εικόνες στην ίδια θέση κατά μήκος του τραύματος μηδέν λήφθηκαν σε 0 h, 24 h. Το ποσοστό του κλεισίματος του τραύματος σε κάθε χρονικό σημείο υπολογίστηκε από τον ακόλουθο τύπο: [(/αρχική περιοχή του τραύματος τρέχουσα περιοχή του τραύματος) 1] × 100

In vitro Tube Δοκιμασία Σχηματισμού

Sub. -confluent HUVECs επαναιωρήθηκαν σε παράγοντες ανάπτυξης χωρίς ΕΒΜ-2 που περιέχει εφρίνης-Α1-Ρο (1 μg /ml) μόνο του ή μαζί με L-NAME (100 μΜ) ή LY294002 (10 μΜ), και σπάρθηκαν στο προ-στερεοποιήθηκε BD matrigel (BD Bioscience) σε πλάκα 96 φρεατίων (3 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο). Οι πλάκες στη συνέχεια επωάστηκαν στους 37 ° C, 5% CO

2 για 6 ώρες. Εικόνες ελήφθησαν από κάθε ομάδα. Όλα τα σημεία διακλάδωσης των δομών σωλήνα σε κάθε φρεάτιο μετρήθηκαν για την ποσοτικοποίηση του βαθμού σχηματισμού σωλήνα. Αυξητικού παράγοντα-ελεύθερο μέσο με ή χωρίς ανασυνδυασμένη IgG1 Fc (1 μg /ml) ελήφθη ως έλεγχος. Το ποσοστό σχηματισμού σωλήνα υπολογίστηκε λαμβάνοντας την ανασυνδυασμένη ομάδα ελέγχου IgG1 Fc ως σχηματισμός σωλήνα 100%. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές υπό παρόμοιες συνθήκες.

ΝΟ Συγκέντρωση Detection Δοκιμασία

συγκέντρωση Σύνολο ΝΟ σε μέσο καλλιέργειας ανιχνεύθηκε με μέτρηση της συγκέντρωσης του νιτρικού και νιτρώδους με τροποποιημένη μέθοδο αντίδραση Griess. Σύνολο μονοξειδίου του αζώτου Assay Kit (Beyotime, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε. Οι οπτικές πυκνότητες σε μήκος κύματος 540 nm καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας μια συσκευή ανάγνωσης μικρο-πλάκας (Thermo MutliscanMK3? Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) και τις συγκεντρώσεις του ΝΟ υπολογίστηκαν σύμφωνα με την πρότυπη καμπύλη

Δοκιμασία Block.

δοκιμασία Block διεξήχθη για να αξιολογηθεί η λειτουργία του eNOS σε εφρίνης Α1-επαγόμενη αγγειογένεση και HUVECs επίδραση εφρίνης-A1 για Ρ-eNOS

Ser1177 μέσω ΡΙ3Κ-Akt μονοπατιού. L-NAME (100 μΜ) ή LY294002 (50 μΜ) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας για να εμποδίσει eNOS ή ΡΙ3Κ. HUVECs των ομάδων ελέγχου καλλιεργήθηκαν σε παράγοντα-ελεύθερο μέσο ανάπτυξης με ή χωρίς ανασυνδυασμένη IgG1 Fc (1 μg /ml).

ανοσοφθορισμού Δοκιμασία

HUVECs που αναπτύσσονται σε καλυπτρίδες επωάστηκαν σε 2% FBS ΕΒΜ-2 που περιέχει 1 μg /ml εφρίνης-Α1-Ρο για 0 ​​ώρες, 8 ώρες και 24 ώρες. Οι καλυπτρίδες πλύθηκαν με PBS και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη κρύο για 10 λεπτά. Μετά την κατεργασία με 5% BSA-PBS στους 37 ° C για 30 λεπτά, τα κύτταρα επωάστηκαν με πρωτογενές αντίσωμα polyclone κουνελιού έναντι eNOS (αραίωση 1:600) ή EphA2 (αραίωση 1:400) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS τρεις φορές για 15 λεπτά και εκτέθηκαν σε Alexa Fluor 488 αντίσωμα κατσίκας αντι-κουνελιού IgG (αραίωση 1:300) για 1 ώρα στους 37 ° C. Οι πυρήνες χρωματίστηκαν για 2 λεπτά σε Hoechst (αραίωση 1:10000) (Sigma, USA), που ακολουθείται από τρεις ακόμη πλύσεις σε PBS για 15 λεπτά. Όλες οι καλυπτρίδες καλύφθηκαν με διαφάνειες και τοποθετημένα σε μικροσκόπιο φθορισμού (Leica DM4000B, Γερμανία) για ανίχνευση. Οι αρνητικοί έλεγχοι υποβλήθηκαν σε θεραπεία με την ίδια διαδικασία αλλά παραλείποντας το πρωτογενές αντίσωμα.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

HUVECs σε πλάκα 96 φρεατίων (1 χ 10

3 σε 100 μl /φρεάτιο) εκτίθενται σε εφρίνης-Α1-Ρο (1 μg /ml) για 0 ​​ώρες, 24 ώρες και 48 ώρες. Ο ρυθμός πολλαπλασιασμού των κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση ενός μέτρηση κυττάρων Kit-8 (Dojindo, Tokyo, Japan) με την προσθήκη 10 μΐ WST-8 σε κάθε φρεάτιο σε υποδεικνυόμενους χρόνους. Απορρόφηση σε μήκος κύματος 450 nm καταγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα αναγνώστη Micro-πλάκα (Thermo MutliscanMK3? Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Polymerase Chain Reaction

Το συνολικό RNA εξήχθη από τις ομάδες δοκιμής . cDNA συντέθηκε με RevertAid ™ Premium First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA). Real-time PCR πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του κιτ Maxima ™ SYBR Green qPCR Master Mix (Fermentas, Glen Burnie, MD, USA) και φασματοφθορισμομετρικού θερμική iCycler1 (Bio-Rad, Hercules, CA). Για eNOS, αλληλουχίες εκκινητών είναι 5′-GTGGCTGTCTGCATGGACCT-3 ‘(προς τα εμπρός) και 5′-CCACGATGGTGACTTTGGCT-3’ (αντίστροφο), το μέγεθος του προϊόντος 121 bp. Ανθρώπινη αφυδρογονάση 3-φωσφορικής αφυδρογονάσης (GAPDH) λήφθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος. Το επίπεδο έκφρασης mRNA σε κάθε ομάδα υπολογίστηκε με τη συγκριτική ΔΔCt.

υποξία Πείραμα

SCC-9 κύτταρα εκτέθηκαν σε υποξικές συνθήκες (1% O

2) ή ορθοξικές συνθήκες ( 21% O

2) για 0 ​​ώρες, 6 ώρες, 12 ώρες, 24 ώρες και 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος SDS για δοκιμασία κηλίδος Western. Τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στα 3000 χ g για 10 λεπτά για να απομακρυνθεί το συντρίμμια. Ίση ποσότητα υπερκείμενου φορτώθηκε για να ανιχνεύσει την διαλυτή μορφή της εφρίνης-Α1 με ανάλυση Western blot [18].

περικύκλωση κυττάρων Δοκιμασία

Τα υπερκείμενα (24 h) ανωτέρω ελήφθησαν ως ρυθμισμένο μέσο (CM) και συμπυκνώθηκαν 6 × πριν πείραμα στρογγυλοποίηση κύτταρο χρησιμοποιώντας 10 kDa MWCO Amicon Ultra συσκευές φυγοκεντρικής διήθησης (Millipore). κύτταρα U-251 GBM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CM ή 1 μg /ml ανασυνδυασμένη ανθρώπινη εφρίνης-Α1-Ρο. Ανεστραμμένο μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε για να παρατηρήσουν κύτταρο στρογγυλοποίηση στα 15 λεπτά, 30 λεπτά, και 2 ώρες μετά τη θεραπεία.

Ανάλυση Western Blot

HUVECs σε 90% συρροή υποβλήθηκαν σε αγωγή με εφρίνης-Α1-Ρο ( 1 μg /ml) σε 2% FBS ΕΒΜ-2 για ενδεικνυόμενους χρόνους. Η πρωτεΐνη συλλέχθηκε σε ρυθμιστικό λύσης που περιέχει κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης και του αναστολέα φωσφατάσης κοκτέιλ (Roche, Germany). Ίση ποσότητα πρωτεΐνης (30 μg) φορτώθηκε και διαχωρίζεται σε 8% SDS-PAGE. Και στη συνέχεια, οι πρωτεΐνες μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (Millipore Co., Billerica, ΜΑ, ΗΠΑ) στα 200 mA για 2 ώρες (100 mA, 1 h για εφρίνης-Α1) στους 4 ° C, αποκλείστηκε σε TBS που περιέχει 5% BSA (β /ο) και 0.1% Tween-20 για 1 ώρα, και επωάστηκε με κατάλληλα πρωτογενή αντισώματα στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Η αραίωση των αντισωμάτων ήταν ως εξής: εφρίνης-Α1 (1:500), eNOS (1:600), Ρ-eNOS

Ser1177 (1:1000), Akt (1:1000), Ρ-Akt

Ser473 (1:1000) και β-ακτίνη (1:2000). Μετά από πέντε εκπλύσεις των 5 λεπτών, τα τεμάχια επωάστηκαν με δευτερεύον αντίσωμα χρένο υπεροξείδιο-συζευγμένο (αραίωση 1:10,000) (Jackson Immunoresearch Laboratories) για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Επιτέλους, ταινίες εξετάστηκαν με τη χρήση ECL συν western αποτύπωση αντιδραστήρια ανίχνευσης (Beyotime, Κίνα). Η ανάλυση στυπώματος Western επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές υπό παρόμοιες συνθήκες.

Στατιστική Ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Η μονόδρομη ανάλυση διακύμανσης (ANOVA) χρησιμοποιήθηκε για να συγκριθεί η διαφορά μεταξύ των ομάδων δοκιμής.

P

τιμές μικρότερες από 0.05 θεωρήθηκαν σημαντικά διαφορετικές.

Αποτελέσματα

Ephrin-Α1 Ενισχυμένη αγγειογένεση in vitro

υποδοχέα EphA2 εκφράζει θετικά σε καλλιεργημένα κύτταρα HUVEC μας (Σχήμα S1A-C). Το μη-προ-συμπλέγματος ανθρώπινη ανασυνδυασμένη εφρίνης-Α1-Ρο χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα αποτελέσματα του εφρίνης-Α1 στον πολλαπλασιασμό, τη μετανάστευση και τον σχηματισμό σωλήνα σε HUVECs. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι εφρίνης-Α1-Ρο θα μπορούσε να αυξήσει σημαντικά τη μετανάστευση HUVECs (Σχήμα S2A, Β) και ο σχηματισμός σωλήνα επί matrigel (Σχήμα S3A-D), χωρίς να επηρεάζεται στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων (Σχήμα S4). Τα αποτελέσματα αυτά ήταν σε συμφωνία με προηγούμενες αναφορές [19], επιβεβαιώνοντας εφρίνης-Α1 ρύθμιση της αγγειογένεσης.

Ephrin-Α1 επαγωγή της αγγειογένεσης είναι διαμεσολαβείται από eNOS Η ενεργοποίηση και του ΝΟ

Παραγωγής

Αν και eNOS /ΟΧΙ έχουν θεωρήθηκε ως ζωτικό τελεστές στην αγγειογένεση των όγκων, δεν προηγούμενες μελέτες έχουν ασχοληθεί με το εάν eNOS /ΝΟ μεσολαβούν εφρίνης Α1-επαγόμενη αγγειογένεση. δοκιμασία ανίχνευσης ΝΟ παρουσίασαν δραματική αύξηση παραγωγής ΝΟ στο υπερκείμενο καλλιεργημένων HUVECs μετά από επώαση με 1 μg /ml εφρίνης-Α1-Ρο για 24 h (Σχήμα 1). Υπήρξε μια σημαντική στατιστική διαφορά σε παραγωγή ΝΟ μεταξύ της ομάδας ελέγχου (10,4 ± 3,4 μΜ) και η ομάδα εφρίνης-Α1-Ρο-διέγερση (42.1 ± 4.1 μΜ). Όταν παραγωγή ΝΟ αναστέλλεται με L-NAME (100 μΜ), τραύματος ρυθμός κλείσιμο κατεστάλη δραματικά (Σχήμα 2Α) (Σχήμα S2A, Β), και λιγότερο ανέπαφη παρατηρήθηκαν δομές σωλήνα και σημείων διακλάδωσης σε εφρίνης-Α1-διεγερμένα HUVECs (Εικόνα 2Β) (Σχήμα S3A-D), που δείχνει μια σημαντική μείωση στην κυτταρική μετανάστευση και το σχηματισμό του σωλήνα (Σχήμα 2C, 2D). Αυτά τα αποτελέσματα πρότειναν ότι eNOS /ΝΟ μπορεί να παίζει καθοριστικό ρόλο στην εφρίνης Α1-επαγόμενη αγγειογενετική διαδικασία.

Δεδομένα έδειξαν μια σημαντική αύξηση της παραγωγής του ΝΟ στην ομάδα EA1-Fc. (*,

P

& lt? 0,05, η = 3)

Η

Α:. Δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων έδειξε ότι η L-NAME και LY294002 ανέστειλαν εφρίνης-Α1-διεγερμένα μετανάστευση των HUVECs ( 200 ×). Β: δοκιμασία σχηματισμού Tube έδειξε ότι η L-NAME και LY294002 ανέστειλε ephrin-Α1-διεγείρεται σχηματισμός σωλήνα HUVECs (200 ×). Αιχμές βελών παρουσίασε το HUVECs που τεντωμένο ανεπαρκώς. C: Ποσοτικοποίηση της Α Δ: Ποσοτικοποίηση της Β (*,

P

& lt? 0.05, n = 3)

Η

Για περαιτέρω μελέτη, eNOS έκφραση και η φωσφορυλίωση κατάσταση ήταν. εξετάζεται στο ephrin-Α1-διεγείρονται HUVECs. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, 3Β, 3C, δεν υπάρχουν σημαντικές αλλαγές eNOS έκφραση ανιχνεύθηκαν με ανοσοφθορισμό, σε πραγματικό χρόνο PCR και ανάλυση στυπώματος western. Ωστόσο, εφρίνης-Α1-Ρο διέγερση προκάλεσε μια ταχεία χρονο-εξαρτώμενη αύξηση στη φωσφορυλίωση της eNOS στο χώρο Ser1177 (Σχήμα 3D) (Σχήμα S5). P-eNOS

Ser1177 άρχισε να αυξήσει σημαντικά σε περίπου 10 λεπτά και έφτασε στο μέγιστο αποτέλεσμα σε 30 λεπτά και στη συνέχεια μειώθηκε (Σχήμα 3Ε). Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η P-eNOS

ενεργοποίηση Ser1177 αλλά όχι την αύξηση της eNOS έκφρασης είναι κυρίως υπεύθυνη για την αυξημένη παραγωγή ΝΟ σε ephrin-Α1-επαγόμενη αγγειογένεση.

ανοσοφθορισμού (Α), σε πραγματικό χρόνο PCR ( Β) και ανάλυση κηλίδας Western (C) έδειξαν ότι εφρίνης-Α1-Ρο είχε καμία επίδραση στην eNOS έκφραση του HUVECs (#,

P

& gt? 0,05, η = 3). D: κηλίδες Western που αποδεικνύουν ότι η Ρ-eNOS

Ser1177 και P-Akt

Ser473 ήταν ρυθμισμένα προς τα πάνω κάτω από εφρίνης-Α1-Ρο διέγερση σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Ε: ανάλυση Ποσότητα Ρ-eNOS

Ser1177. F: ανάλυση Ποσότητα Ρ-Akt

Ser473. (*,

P

& lt? 0.05, n = 4).

Η

PI3K /Akt απαιτείται για ephrin-Α1 που προκαλείται από Ρ-eNOS

Ser1177 σε HUVECs

όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, 3F, εφρίνης-A1-εξαρτώμενη P-eNOS

Ser1177 συνοδεύτηκε επίσης από μια παρόμοια ταχεία φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση της Akt

Ser473, υποδηλώνοντας Akt μπορεί να δράσει ως ένα σημαντικό ανάντη διαμορφωτή ότι συμβάλλει στην Ρ-eNOS

Ser1177 σε αυτή τη διαδικασία. Ενώ PI3K έχει ως άμεσο ελεγκτή της Akt [20] – [22], LY294002 (50 μΜ) εφαρμόστηκε στη μελέτη μας για να επιβεβαιώσετε την επίδρασή της στην φωσφορυλίωση της Akt και eNOS. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι όχι μόνο Ρ-Ακί

Ser473 αλλά και P-eNOS

Ser1177 εξασθένισε με επεξεργασία με LY294002 (Σχήμα 4Α-C) (Σχήμα S6), αποκαλύπτοντας ότι η ΡΙ3Κ είναι θεμελιώδους σημασίας για την φωσφορυλίωση της Akt με ephrin- Α1 και με τη σειρά της φωσφορυλιώνει eNOS στο site Ser1177. Επιπλέον, προκειμένου να καθοριστεί εάν η ενεργοποίηση ΡΙ3Κ /Akt είχε εμπλακεί σε εφρίνης Α1-επαγόμενη κυτταρικές λειτουργίες, LY294002 προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας και τα αποτελέσματά του επί ECs αξιολογήθηκαν με δοκιμασία μηδέν πληγή και δοκιμασία σχηματισμού σωλήνα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, 2Β, μετά από έκθεση σε LY294002, ο ρυθμός σύγκλεισης πληγής ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με την ομάδα EA1-Fc (Σχήμα 2C)? HUVECs επί matrigel τεντωμένο ανεπαρκώς, λιγότερο σημείων διακλάδωσης καταγράφηκαν και παρατηρήθηκαν λιγότερες ανέπαφη δομές σωλήνα στην ομάδα EA1-Ρο + LY294002 (Σχ. 2D). Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι η φωσφορυλίωση της Akt παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην εφρίνης Α1-επαγόμενη HUVECs αγγειογόνου λειτουργίες. Στο σύνολό τους, θα μπορούσαμε να εξάγουμε ένα συμπέρασμα που ephrin-Α1 επάγει την ενεργοποίηση της eNOS μέσω του PI3K /Akt-εξαρτώμενη σηματοδοτικό μονοπάτι σε pro-αγγειογενετική λειτουργίες του

Α:. Εκπρόσωπος Western blots για την P-eNOS

Ser1177 και Ρ-Akt

Ser473 από HUVECs που στερήθηκαν τροφής εντός 0,1% BSA ΕΒΜ-2 όλη την νύκτα και διεγείρονται με εφρίνης-Α1-Ρο (1 μg /ml) για 30 λεπτά μόνο του ή μαζί με προ-αγωγή με LY294002. Β: Ανάλυση Ποσότητα Ρ-Akt

Ser473. Γ: Ανάλυση Ποσότητα Ρ-eNOS

Ser1177. (*,

P

& lt? 0.05, n = 4) (#,

P

& gt? 0.05, n = 4)

Η

υποξία-ρυθμίζεται. ephrin-Α1 Έκφραση και Διαλυτό ephrin-Α1 έκκριση στα καρκινικά κύτταρα

τα καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν κάτω από υποξία και νορμοξίας συνθήκες. Τα κύτταρα και τα υπερκείμενα συλλέχθηκαν για ανάλυση εφρίνης-Α1 με κηλίδα Western. Σε σύγκριση με κύτταρα που καλλιεργούνται σε νορμοξία, SCC-9 κύτταρα που εκτίθενται σε υποξία ανιχνεύθηκαν μια σημαντική αύξηση στην έκφραση εφρίνης-Α1 σε έναν χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, με τη μέγιστη δράση που εμφανίζεται στις 24 ώρες (Σχήμα 5Α) (Σχήμα S7A, Β). Το πιο σημαντικό, εφρίνης-Α1 πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε επίσης θετικά και αυξήθηκε σημαντικά στα υπερκείμενα από τις ομάδες υποξία, το επίπεδο των οποίων ήταν πολύ υψηλότερο σε σύγκριση με τις ομάδες νορμοξία (Σχήμα 5Β) (Σχήμα S7C, D), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα καρκινικά κύτταρα μπορεί επίσης εκκρίνουν διαλυτή μορφή της εφρίνης-Α1 στον όγκο υποξικό μικροπεριβάλλον. Περιέργως, όπως φαίνεται στο Σχήμα 5Α, τόσο νορμοξία και υποξία ομάδα είχαν παρόμοια εφρίνης-Α1 τάση έκφραση σε SCC-9 κύτταρα. Η εφρίνης-Α1 άρχισε να αυξάνεται σε περίπου 6 ώρες, έφτασε στο μέγιστο σημείο της σε 12 ώρες έως 24 ώρες και στη συνέχεια μειώθηκε αργότερα. Μια πιθανή αρνητική μηχανισμός ανάδρασης μπορεί να έχουν εμπλακεί σε αυτή την ειδική διαδικασία. Ephrin προκαλούμενη από υποδοχέα ενδοκυττάρωσης έχει μελετηθεί σε ένα αριθμό βιολογικών συστημάτων. Κατά την αλληλεπίδραση του συνδέτη εφρίνης-A1 και του υποδοχέα EphA2, σύμπλοκα συνδετήρα-υποδοχέα μπορεί να εσωτερικοποιηθεί αμφίδρομα σε κύτταρα όγκου [23], [24]. Αυτό σύμπλοκα συνδετήρα-υποδοχέα εσωτερικοποίηση μπορεί περαιτέρω να δρα ως αρνητικός κίνητρο ανάδραση στον έλεγχο της έκφρασης εφρίνης-Α1. Έτσι, είναι πιθανό ότι η αύξηση της ενεργοποίησης EphA2 τόσο δεσμευμένη σε μεμβράνη και διαλυτές εφρίνης-Α1 σε SCC-9 κύτταρα είχαν σαν αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα κάτω της εφρίνης-Α1. Όσο για το λόγο για τον οποίο εφρίνης-Α1 αυξάνεται δραματικά μεταξύ χρονικών σημείων 6 ωρών και 12 ώρες, ακόμη και σε ομάδα νορμοξία, χρειάζεται ακόμη περαιτέρω διερεύνηση

Α:. Κηλίδες Western που καταδεικνύει ότι η υποξία αυξημένη συνδεδεμένη με μεμβράνη έκφραση εφρίνης-Α1 σε SCC-9 κύτταρα. Β: στυπώματα Western που καταδεικνύει ότι η υποξία πάνω ρυθμισμένα διαλυτό εφρίνης-Α1 σε υπερκείμενα SCC-9 κύτταρα. SCC-9 κυτταρική πυκνότητα κατά 70-80% συρροή ελήφθη ως μηδέν h όταν προστέθηκε φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας. C: Κυττάρων στρογγυλοποίησης δοκιμασία που αποδεικνύει ότι διαλυτές ephrin-Α1 στο CM θα μπορούσε να ενεργοποιήσει την EphA2 στα κύτταρα U-251 GBM. Ephrin-A1 (S), διαλυτό εφρίνης-Α1? Ν, νορμοξίας ρυθμισμένο μέσο ομάδα? Η υποξία προσαρμοσμένο μέσο ομάδα.

Η

τηλέφωνα στρογγυλοποίησης είναι μια χαρακτηριστική απάντηση σε λειτουργική ephrin-Α1 [18], [25]. κύτταρα U-251 GBM φυσικά υπερεκφράζουν την EphA2 και έχουν πολύ χαμηλό επίπεδο ephrin-Α1 [26]. Η ικανότητα του διαλυτού εφρίνης-Α1 στο CM να επάγει κυτταρική στρογγυλοποίηση της U-251 κύτταρα GBM διερευνήθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5C (Σχήμα S8), κατεργασία κυττάρων U-251 GBM είτε με CM ή εφρίνης-Α1-Ρο είχε ως αποτέλεσμα μια δραστική αλλαγή στην κυτταρική μορφολογία, αντανακλώντας από κύτταρο στρογγυλοποίηση νωρίς, σε 15 λεπτά, που φθάνουν στο αποτέλεσμα peek σε 30 λεπτά και μειώνεται κατά 2 ώρες μετά τη χορήγηση CM και ephrin-Α1-Ρο. Παρά το γεγονός ότι παρατηρήθηκαν μορφολογικές αλλαγές του U-251 κυττάρων υπό διέγερση CM, επιπλέον λειτουργικά πειράματα εξακολουθούν να είναι απαραίτητες για να αποδειχθεί αν η υποξία που προκαλείται από διαλυτό ephrin-Α1 μπορεί να επάγει φωσφορυλίωση της EphA2 ή ακόμα και την αγγειογένεση των όγκων.

Το καταρράκτη σηματοδότησης που εμπλέκονται στην ephrin-Α1-επαγόμενη αγγειογένεση χαρακτηρίζεται σχηματικά στο Σχήμα 6.

Η

Συζήτηση

Η τρέχουσα μελέτη αποκάλυψε έναν μηχανισμό με τον οποίο ephrin-Α1 ρυθμίζει την αγγειογένεση και έναν παράγοντα οδήγησης για ephrin-Α1 up -κανονισμός. Ephrin-A1-επαγόμενη αγγειογένεση εμπλέκει μία αυξημένη παραγωγή ΝΟ που είναι μεταγενέστερη ενός ΡΙ3Κ Akt-εξαρτώμενη ενεργοποίηση /Ρ-eNOS

Ser1177 σε ενδοθηλιακά κύτταρα. Η υποξία θα μπορούσε να προκαλέσει αύξηση της ενεργά τόσο δεσμευμένη σε μεμβράνη και διαλυτές εφρίνης-Α1 σε κύτταρα όγκου. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι PI3K /Akt /eNOS καταρράκτη σηματοδότησης μπορεί να αντιπροσωπεύει μια κοινή πορεία για την υποξία ephrin-Α1-εξαρτώνται από την αγγειογένεση στην αγγειακή ανάπτυξη και την εξέλιξη του όγκου.

Συσσωρευμένα στοιχεία που επιβεβαίωσε ότι η αποτελεσματική αγγειογένεση απαιτεί βιοδραστικών ΝΟ που συντίθεται από eNOS που εκφράζεται κυρίως σε αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα. Έχει αναφερθεί ότι το ΝΟ είναι ένα κρίσιμο μεσολαβητής του VEGF-επαγόμενη αγγειογένεση η οποία μπορεί να μπλοκαριστεί από την L-NAME [27]. Ομοίως, οι στατίνες μπορούν να ρυθμίζουν την έκφραση eNOS, και την προώθηση της ΝΟ-εξαρτώμενων από αγγειογένεση μέσω της μείωσης caveolin-1 αφθονία [28]. Για πρώτη φορά, βρήκαμε ότι η παραγωγή ΝΟ είναι επίσης απαραίτητο για την αγγειογένεση σε απόκριση προς προ-αγγειογενετική μόριο εφρίνης-Α1. Ephrin-A1-Fc επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων και των τριχοειδών συναρμολόγηση εξασθένησαν όταν ECs υποβλήθηκαν σε αγωγή με L-NAME. Περιέργως, η περαιτέρω μελέτη μας έδειξε ότι αυξημένα σύνθεση του ΝΟ σε ephrin-Α1 που προκαλείται από ECs αποδόθηκε κυρίως στην φωσφορυλίωση eNOS στο κατάλοιπο Ser1177 αλλά όχι αύξηση της έκφρασης της eNOS. Είναι γνωστό ότι η φωσφορυλίωση είναι ένας από τους πιο σημαντικούς μετα-μεταβατικής ρυθμιστικούς μηχανισμούς που διέπουν eNOS ενεργοποίησης [20], [29]. Ως αποδεικτικά στοιχεία της διαπίστωσης μας, είναι πολλά είδη ερεθισμάτων που προάγουν την ενεργοποίηση της eNOS παρατήρησε επίσης να προκαλέσει φωσφορυλίωση σε διαφορετικές τοποθεσίες, όπως Thr495, Ser633 και Ser1177 [30]. Τα ευρήματά μας παρέχουν την πρώτη απόδειξη ότι ephrin-Α1 έχει μια συντονισμένη cross-talk με eNOS /ΟΧΙ στην προώθηση της αγγειογένεσης.

Αν και η συσχέτιση της αυξημένης δραστηριότητας eNOS με ephrin-Α1-διεγείρεται αγγειογένεσης βρέθηκε στην παρούσα μελέτη, η διαδρομή του σήματος που εμπλέκονται στην εφρίνης Α1-επαγόμενη αύξηση της δραστικότητας eNOS εξακολουθεί να χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Έχει αναφερθεί ότι η διατμητική τάση που προκαλείται από την παραγωγή του ΝΟ φαίνεται να ελέγχεται από το Akt-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση του eNOS σε καλλιεργημένα ECs [31]. Επιπλέον, πρωτεϊνική κινάση Akt έχει δειχθεί ότι λειτουργεί ως παράγοντας επιβίωσης ΕΚ και να προωθήσει το σχηματισμό σωλήνα in vitro [32]. Προηγούμενες μελέτες έχουν επίσης προτείνει ότι ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι διαμεσολαβούν την αγγειογένεση που επάγεται από διάφορα αγγειογονικούς διεγέρτες όπως ο VEGF [33], η φορσκολίνη [34], μικροβαρύτητα [35], και ούτω καθεξής. Για να διερευνηθεί η λειτουργική εμπλοκή του ΡΙ3Κ /Akt μονοπάτι σε εφρίνης-Α1-eNOS cross-talk, το αποτέλεσμα της LY294002 επί εφρίνης Α1-επαγόμενη γεγονότα σηματοδότησης προσδιορίστηκε. Μετά από διέγερση με εφρίνης-Α1-Ρο επί 30 λεπτά, φωσφορυλίωση τόσο Akt και eNOS ήταν σημαντικά αυξημένα. Αυτή η ανύψωση οφειλόταν στην φωσφορυλίωση της Akt

Ser473 και eNOS

Ser1177, όπως αποδεικνύεται με ανάλυση κηλίδος Western. Η έκθεση σε LY294002 εμπόδισε εφρίνης Α1-επαγόμενη έκφραση της Ρ-Akt

Ser473 και P-eNOS

Ser1177 προφανώς, υποδεικνύοντας ότι ΡΙ3Κ /Akt -εξαρτώμενη σηματοδοτικό μονοπάτι συμμετείχε στον έλεγχο της εφρίνης Α1-διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της eNOS.

η υποξία είναι ένα από τα πιο σημαντικά χαρακτηριστικά σε μικροπεριβάλλον του όγκου, και ρυθμίζει τις ποικιλίες των αγγειογόνων παραγόντων, όπως ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας (VEGF) [36]. Ephrin-A1 είναι επίσης γνωστή ως ενός αγγειογόνου παράγοντα, και παίζει καθοριστικό ρόλο σε νεοαγγείωση σε διάφορους καρκίνους [4]. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το γονίδιο εφρίνης-A1 μπορεί να προκληθεί με παράγοντα νέκρωσης όγκων-α (TNF-α) σε ενδοθηλιακά κύτταρα [37]. Πρόσφατα, Uemura et al. προσδιορίζονται εφρίνης-Α1 ως πιθανό υποψήφιο γονίδιο υποξία με ανάλυση μικροσυστοιχιών δειγμάτων ιστού από μεταστατικό ορθοκολικό καρκίνο [38]. Επίσης, η έκφραση της εφρίνης-A1 και τα συγγενικά γονίδια σημαντικά μειωμένη σε HIF-2α knockdown (kd /kd) ενδοθηλιακά κύτταρα, υποδηλώνοντας το ρόλο της υποξίας στη ρύθμιση εφρίνης-Α1 [39]. Στην παρούσα μελέτη, υπό τον όρο άμεσες αποδείξεις ότι η έκθεση σε υποξία οδήγησε σε αυξημένη έκφραση εφρίνης-Α1 στα καρκινικά κύτταρα με ανάλυση κηλίδος Western. Ephrin-A1 εντοπίστηκε για πρώτη φορά ως ένα GPI-αγκυροβολημένα πρωτεΐνη που απαιτεί σύνδεσης μεμβράνης ή ομαδοποίησης /ολιγομερισμό για την ενεργοποίηση της EphA2 [40]. Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα μας πρότεινε ότι πάνω ρύθμιση του συνδεδεμένου με μεμβράνη εφρίνης-Α1 που επάγεται από υποξία μπορεί να προάγει αγγειογένεση του όγκου μέσω αλληλεπίδρασης με τον υποδοχέα της EphA2 σε ενδοθηλιακά κύτταρα σε μικροπεριβάλλον του όγκου. Επιπλέον, τεκμηριώνεται σε αυτή τη μελέτη ότι η υποξία επάνω ρυθμισμένη μια διαλυτή μορφή του εφρίνης-A1 αποδεσμεύει από τα καρκινικά κύτταρα σε εξωκυτταρικό περιβάλλον. Σε συμφωνία με το εύρημα μας, εφρίνης-Α1 έχει επίσης ανιχνευθεί στον ορό των ασθενών με καρκίνωμα του ήπατος [41]. Πρόσφατα, αρκετές μελέτες έχουν αποδείξει ότι το διαλυτό μονομερικό εφρίνης-A1 είναι ένα λειτουργικό πρόσδεμα για EphA2, και ότι οι διαλυτές εφρίνης-A1 που απελευθερώνεται από κύτταρα HeLa και SK-BR3 είναι απαραίτητη για την ανάπτυξη των κυττάρων και μετασχηματισμού [4]. Παρόμοια με τις μελέτες αυτές, παρατηρήσαμε μορφολογικές αλλαγές του U-251 κυττάρων υπό διέγερση CM. Ωστόσο, περαιτέρω έρευνα είναι απαραίτητη για να επιβεβαιώσει αν η υποξία που προκαλείται από διαλυτό ephrin-Α1 μπορεί λειτουργικά να αλληλεπιδράσουν με την EphA2 για την έναρξη της αγγειογένεσης.

Εν περιλήψει, τα πιο σημαντικά και τα νέα ευρήματα που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη περιλαμβάνουν ότι 1) ephrin -Α1 συνεργάζεται με eNOS στην προώθηση της αγγειογένεσης σε HUVECs? ότι 2) cross-talk μεταξύ ephrin-Α1 και eNOS διαμεσολαβείται από PI3K /Akt-εξαρτώμενη οδό? και ότι 3) υποξία up-ρυθμίζει τόσο δεσμευμένη σε μεμβράνη και εκκρίνεται εφρίνης-Α1 πρωτεΐνη σε καρκινικά κύτταρα. Δεδομένου ότι μόνο λίγες μελέτες έχουν εστιάσει στις εφρίνης-Α1-ενεργοποιείται καθοδικά μοριακά συμβάντα, τα αποτελέσματα που αναφέρονται εδώ εντοπισμό /Akt-εξαρτώμενη eNOS

Ser1177 φωσφορυλίωση ΡΙ3Κ ως νέο μηχανισμό υποκείμενες εφρίνης-A1modulation της αγγειογένεσης (Σχήμα 6).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Έκφραση του υποδοχέα της EphA2 στα καλλιεργημένα κύτταρα HUVEC. Ανοσοφθορισμός (Α), RT-PCR (Β) και ανάλυση κηλίδας Western (C) έδειξαν θετική έκφραση της EphA2 σε HUVECs

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0074464.s001

(TIF)

Εικόνα S2 .

δοκιμασία μετανάστευσης κυττάρων έδειξαν ότι η L-NAME και LY294002 ανέστειλε ephrin-Α1-τόνωσε τη μετανάστευση των HUVECs (200 ×). Μετανάστευση ενδοθηλιακών κυττάρων μετρήθηκε σε HUVECs που είχαν πέθαναν σε αυξητικό παράγοντα-free 0,1% BSA ΕΒΜ-2 επί μία νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με εφρίνης-Α1-Ρο (1 μg /ml) για 24 ώρες

doi:. 10.1371 /περιοδικό. pone.0074464.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

δοκιμασία σχηματισμού Tube έδειξε ότι η L-NAME και LY294002 ανέστειλε ephrin-Α1-διεγείρεται σχηματισμός σωλήνα HUVECs. Α, Β, Γ: Εκπρόσωπος εικόνες σε 40 ×. D:. Εκπρόσωπος εικόνες σε 200 ×

doi: 10.1371 /journal.pone.0074464.s003

(ΔΕΘ)

Εικόνα S4. τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων

Endothelial μετρήθηκε σε HUVECs σε επεξεργασία με εφρίνης-Α1-Ρο (1 μg /ml) για 0 ​​ώρες, 24 ώρες και 48 ώρες. Δεν υπήρχε στατιστική σημαντικότητα μεταξύ της ομάδας EA1-Fc και Ελέγχου. EA1-Ρο, εφρίνης-Α1-Ρο. (#,

P

& gt? 0.05, n = 3)

doi: 10.1371 /journal.pone.0074464.s004

(ΔΕΘ)

Εικόνα S5..

Επίδραση της εφρίνης-Α1-Ρο επί της φωσφορυλίωσης της eNOS και Akt σε HUVECs. A, B, C: Western κηλίδες που αποδεικνύουν ότι η P-eNOS

Ser1177 και P-Akt

Ser473 ήταν επάνω-ρυθμίζονται από ephrin-Α1-Ρο διέγερση σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο

doi:. 10.1371 /journal.pone.0074464.s005

(ΔΕΘ)

Εικόνα S6.