Αφηρημένο

Αντίστροφη Μεταγραφή – ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-qPCR) είναι μια πρότυπη τεχνική στα περισσότερα εργαστήρια. Η επιλογή των γονιδίων αναφοράς είναι απαραίτητη για την ομαλοποίηση των δεδομένων και η επιλογή των κατάλληλων γονιδίων αναφοράς παραμένει κρίσιμη. Στόχος μας ήταν να 1) ανασκόπηση της βιβλιογραφίας από την εφαρμογή των κατευθυντήριων γραμμών MIQE προκειμένου να προσδιορίσει το βαθμό αποδοχής? 2) συγκρίνουν διάφορους αλγόριθμους σταθερότητα έκφρασή τους? 3) προσδιορίζει ένα σύνολο κατάλληλων και πιο αξιόπιστη γονίδια αναφοράς για μια ποικιλία ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών. Μια ανασκόπηση της βάσης δεδομένων PubMed έγινε και επιλέχθηκαν οι δημοσιεύσεις από το 2009. Δώδεκα υποθετικών γονιδίων αναφοράς προφίλ σε κανονικές και διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκίνου (n = 25) με χρήση 2-βήμα RT-qPCR. Διερευνηθεί γονίδια αναφοράς κατατάσσονται ανάλογα με τη σταθερότητα της έκφρασης τους από πέντε αλγορίθμους (geNorm, Normfinder, BestKeeper, συγκριτικά ΔΟΙ, και RefFinder). Η επισκόπησή μας αποκάλυψε 37 δημοσιεύσεις, με τα δύο τρίτα των δειγμάτων των ασθενών και ένα τρίτο κυτταρικές σειρές. αποτελεσματικότητα qPCR δόθηκε στο 68,4% του συνόλου των εκδόσεων, αλλά μόνο το 28,9% του συνόλου των μελετών που προβλέπονται RNA /ποσότητα cDNA και πρότυπες καμπύλες. GeNorm και Normfinder αλγόριθμοι χρησιμοποιήθηκαν σε 60,5% σε συνδυασμό. Σε μας επιλογή των κυτταρικών σειρών 25 καρκίνου, εντοπίσαμε

HSPCB

,

RRN18S

, και

RPS13

ως τις πιο σταθερές εκφρασμένα γονίδια αναφοράς. Στο υποσύνολο των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών, τα γονίδια αναφοράς ήταν

PPIA

,

RPS13

και

SDHA

, καταδεικνύοντας σαφώς την ανάγκη για την επιλογή γονιδίων, ανάλογα με την εστίαση της έρευνας. Επιπλέον, θα πρέπει να καθοριστεί εκ των προτέρων για τα πειράματα, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για μια ομάδα τουλάχιστον τρεις κατάλληλους γονίδια αναφοράς. Για τον καθορισμό ενός συνόλου γονιδίων αναφοράς για γονιδιακή εξομάλυνση συνιστούμε τη χρήση του ιδανική τριών γονιδίων αναφοράς που επιλέγεται από τουλάχιστον τρεις αλγορίθμους σταθερότητα. Η ατυχής έλλειψη συμμόρφωσης με τις κατευθυντήριες γραμμές MIQE αντικατοπτρίζει το γεγονός ότι αυτά πρέπει να καθορίζονται περαιτέρω στην ερευνητική κοινότητα

Παράθεση:. Jacob F, Guertler R, Ναΐμ S, Nixdorf S, Fedier Α, Hacker NF, κ.ά. . (2013) προσεκτική επιλογή των γονιδίων αναφοράς απαιτείται για αξιόπιστη απόδοση των RT-qPCR στην Ανθρώπινη φυσιολογική και καρκινικές κυτταρικές σειρές. PLoS ONE 8 (3): e59180. doi: 10.1371 /journal.pone.0059180

Επιμέλεια: Sui Huang, Ινστιτούτο Συστημικής Βιολογίας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Νοεμβρίου, 2012? Αποδεκτές: 12 Φλεβάρη 2013? Δημοσιεύθηκε: 15 Μαρτίου, 2013

Copyright: © 2013 Jacob et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα της Ελβετίας (PBZHP3-133289 και -138.752 για FJ? 320030000000000-120543000000000 δισεκατομμύρια σε VHS.)? Cancer Institute της Νέας Νότιας Ουαλίας (09 /CRF /2-02 σε VHS)? Royal Αυστραλίας και της Νέας Ζηλανδίας Κολέγιο Μαιευτήρων και Γυναικολόγων (σε VHS)? William Maxwell Εμπιστοσύνη (σε VHS) και το Βασιλικό Νοσοκομείο Γυναικών του Ιδρύματος (σε VHS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

αντίστροφης μεταγραφής (RT) – ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR) έχει γίνει μια ευέλικτη τεχνική για να εξεταστούν οι αλλαγές έκφρασης ενός ή περισσοτέρων γονιδίων που ενδιαφέρουν σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις. Λόγω ειδικότητα, η ευαισθησία, η απλότητα, το κόστος της και υψηλής απόδοσης, RT-qPCR προσφέρει ένα ευρύ φάσμα πλεονεκτημάτων σε σχέση με πρότυπες μεθόδους, όπως Northern blot και ημι-ποσοτική PCR. Ως εκ τούτου, έχει γίνει η πιο αναδυόμενη εργαλείο για την απόλυτη και σχετική ποσοτικοποίηση των επιπέδων μεταγραφής του mRNA [1]. RT-qPCR είναι μια ισχυρή δοκιμασία που χρησιμοποιεί καθιερωμένες ανάλυση χημεία και δεδομένα και είναι επομένως ανώτερη τεχνικές όπως στύπωση Southern ή DNA αλληλούχιση [2]. Παρά την ευρεία αποδοχή του, υπάρχουν ασυνέπειες στη χρήση του συνόλου των μεθόδων εξόρυξης RNA, ποσότητα RNA ανά αντίδραση [3], οι εκτιμήσεις ακεραιότητα του RNA [4], πλοίαρχος μείγματα qPCR και στους διάφορους κατασκευαστές των κιτ αντίστροφης μεταγραφής. Επιπλέον, η χρήση διαφορετικών μεθόδων ανίχνευσης qPCR όπως dye- ή συστήματα που βασίζονται σε ανιχνευτή διευρύνει το φάσμα των πιθανών εφαρμογών. Για να ξεπεραστούν πιθανές δυσκολίες και να επιτευχθεί συναίνεση κατά την εκτέλεση και την ανάλυση των ποσοτικών πειραμάτων PCR, η MIQE (Ελάχιστες Πληροφορίες για Δημοσίευση Πειράματα ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR) κατευθυντήριες γραμμές εισήχθησαν το 2009, ενισχύοντας το πειραματικό σχέδιο [5]. Επιπλέον, η εφαρμογή αυτών των κατευθυντήριων γραμμών θα παραδώσει την καλύτερη και επαναλήψιμα αποτελέσματα από την αναφορά παραμέτρων όπως η ακεραιότητα του RNA, όγκο αντίδρασης, συγκέντρωση cDNA /RNA, ή καμπύλες βαθμονόμησης [6].

γονίδιο εξομάλυνση στόχος αυτός επιτυγχάνεται συνήθως με τη χρήση γονίδια αναφοράς για να αντισταθμίσει ενδο- και δια-κινητική RT-qPCR [7]. Αρκετές μαθηματικές προσεγγίσεις έχουν δημοσιευθεί που παραδίδουν κατάλληλα γονίδια αναφοράς με τη χαμηλότερη διακύμανση και με υψηλή σταθερότητα σε όλες τις βιολογικά δείγματα. Τα συνηθέστερα χρησιμοποιούμενα τέσσερις προσεγγίσεις είναι: (1) αλγόριθμος NormFinder [8], η οποία είναι ένα στατιστικό μοντέλο που υπολογίζει το συνολικό μεταβολή της γονιδιακής έκφρασης για κάθε γονίδιο αναφοράς υποψήφιες και παραδίδει μια τιμή σταθερότητα. Αυτή η τιμή έχει σχέση με το συστηματικό σφάλμα του κάθε υποψηφίου γονιδίου. (2) GeNorm [9] υπολογίζει ένα μέτρο της σταθερότητας γονίδιο για κάθε υποψήφιο γονίδιο. Το γονίδιο αναφοράς με τη χαμηλότερη σταθερότητα (Μ) αφαιρείται από την περαιτέρω ανάλυση, και οι τιμές Μ επανειλημμένα υπολογίζονται μέχρι το πιο σταθερό γονίδιο αναφοράς είναι αριστερά. (3) BestKeeper, η Microsoft

® εργαλείο του Excel-based, χρησιμοποιεί ζεύγη συσχετισμούς [10]? και (4) η συγκριτική δέλτα Ct (με βάση τις κατευθυντήριες γραμμές ονοματολογία και MIQE: ο κύκλος ποσοτικοποίηση (Cq) προτιμάται στον κύκλο κατωφλίου (Ct), και οι δύο περιγράφουν το κλασματικό κύκλου PCR που χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση) μέθοδος κατατάσσει την σταθερότητα των υποψήφιων γονιδίων σύμφωνα με την επαναληψιμότητα των διαφορών γονιδιακής έκφρασης [11]. Κανένα από τα εισήγαγε αλγορίθμων φαίνεται να είναι η βέλτιστη και ο ερευνητής πρέπει πάντοτε να επιλέξει ποια γονίδιο αναφοράς να χρησιμοποιούν και πώς να προσδιορίσει. Αυτό μπορεί επίσης να επηρεάσει την ερμηνεία των αποτελεσμάτων RT-qPCR.

Πολυάριθμες υποθετικό γονίδια αναφοράς έχουν αναφερθεί για μία ευρεία ποικιλία ανθρώπινων ιστών, για ανθρώπινες κυτταρικές σειρές, και για καλλιέργειες κυττάρων κάτω από διαφορετικές πειραματικές συνθήκες, όπως φαρμακευτικές αγωγές ή περιβαλλοντικούς παράγοντες. Ωστόσο, υπάρχουν γονίδια αναφοράς κατάλληλα για την ανάλυση των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών προήλθαν από γυναικολογικούς καρκίνους και καρκίνους του παχέος εντέρου έχουν ακόμη περιγραφεί.

Ο πρωταρχικός στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει τις πιο σταθερές γονίδια αναφοράς κατάλληλη για τη μελέτη φυσιολογικών και καρκινικών κυτταρικών σειρών του ωοθήκης ή του κόλου καταγωγής από προφίλ ενός συνόλου 12 υποθετικών γονιδίων αναφοράς και για πρώτη φορά την εφαρμογή πέντε αλγόριθμοι σταθερότητα για να εκτιμηθεί η επίδραση του Βιοπληροφορική ανάλυση δεδομένων. Ήμασταν επίσης ενδιαφέρονται να δουν πώς οι διαφορετικοί κατασκευαστές της αντίστροφης μεταγραφάσης κιτ επηρεάζουν τη μεταβολή της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς. Επιπλέον, μια ανασκόπηση της τρέχουσας βιβλιογραφίας έγινε με σκοπό να αξιολογηθεί η συμμόρφωση με τις οδηγίες MIQE κατά την εκτέλεση της RT-qPCR αναφερθεί από την εισαγωγή τους.

Υλικά και Μέθοδοι

Λογοτεχνία κριτική

Ένα PubMed (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez) επανεξέταση της βάσης δεδομένων σχετικά με τη χρήση των υποθετικών γονιδίων αναφοράς RT-qPCR διεξήχθη. Εκδόσεις διαθέσιμη μεταξύ Ιανουαρίου 2009 και Απριλίου 2012 είχαν εξεταστεί και να προσδιοριστεί χρησιμοποιώντας τις λέξεις-κλειδιά: «γονίδια αναφοράς» ή «γονίδια καθαριότητας» ΚΑΙ «RT-qPCR« Ή «ποσοτική PCR». λίστες αναφοράς από επιλεγμένα δημοσιεύματα λήφθηκαν επίσης υπόψη για την ένταξη των εν δυνάμει σχετικών άρθρων. Εκδόσεις δεν είναι γραμμένα στην αγγλική γλώσσα και εκείνων που αναφέρουν RT-qPCR πραγματοποιείται σε λιγότερο από πέντε γονίδια αναφοράς αποκλείστηκαν. συμπεριλήφθηκαν μόνο οι δημοσιεύσεις με ανθρώπινα δείγματα. Εκδόσεις αξιολογήθηκαν σύμφωνα με το έτος δημοσίευσης, τον τύπο και την ποσότητα των δειγμάτων, ο αριθμός των γονιδίων αναφοράς, οι μέθοδοι που χρησιμοποιούνται για τον προσδιορισμό της ακεραιότητας του RNA, η ποσότητα του συνολικού RNA αρχικά χρησιμοποιήθηκε για RT ή /και qPCR, ο αριθμός των επαναλήψεων σε qPCR, οι λεπτομέρειες σχετικά με διαδοχικές αραιώσεις για καμπύλης βαθμονόμησης και της αποδοτικότητας, της χρησιμοποιούμενης χημείας qPCR (SYBRgreen ή TaqMan), και οι μαθηματικές προσεγγίσεις (αλγόριθμους υπολογιστών) για τη μέτρηση της σταθερότητας της έκφρασης του γονιδίου αναφοράς.

Cell Culture

Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 2 κανονικά και 23 καρκινικού κυττάρου γραμμές διαφόρων προελεύσεων. Οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από την ATCC (www.atcc.org) ή ήταν ένα δώρο από το Garvan Institute of Medical Research, Σίδνεϊ, Αυστραλία. Γραπτή ενημέρωσε ηθική συγκατάθεση χορηγήθηκε (HREC 09.08 /17 /3.02, σε VHS.). Μια λεπτομερής λίστα των κυτταρικών γραμμών και των συνθηκών καλλιέργειας δίδονται ως συμπληρωματικά δεδομένα (Πίνακας S1). Όλες οι κυτταρικές καλλιέργειες διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2. Πολιτισμών ήταν απαλλαγμένα από μυκόπλασμα, όπως καθορίζεται από την ποιοτική PCR χρησιμοποιώντας VenorGeM

® Mycoplasma Detection Kit (Biocene Pty Ltd, Rozelle, Αυστραλία).

RNA Εξόρυξη και Ακεραιότητα

Για να εξεταστεί η έκφραση από τα 12 υποθετικών γονιδίων αναφοράς σε κάθε μία από αυτές τις κυτταρικές σειρές, 1 × 10

5 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων (NUNC, Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark) σε συρροή 70-90%. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν δύο φορές με αποστειρωμένο αλατούχο διάλυμα και το ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ NucleoSpin RNAII (MACHEREY & amp? NAGEL, Scientifix Pty Ltd, Clayton, Australia). Για αυτό τα κύτταρα λύθηκαν με την προσθήκη ρυθμιστικού λύσης απευθείας πάνω στα κύτταρα. Εκχύλιση RNA συμπεριλαμβανομένης της θεραπείας με ϋΝάση διεξήχθη σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. RNA εκλούστηκε σε 60 μΙ RNase ελεύθερη συγκέντρωση του νερού και του RNA μετρήθηκε χρησιμοποιώντας NanoDrop ND-1000 φασματοφωτόμετρο (Thermo Fisher Scientific, Roskilde, Denmark). Η ακεραιότητα των δειγμάτων RNA επιβεβαιώθηκε με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης σε πήγμα αγαρόζης 1,0% που περιέχει GelRed ™ (Biotium, Inc., Hayward, CA, USA). δείγματα RNA χωρίς ένδειξη της υποβάθμισης περαιτέρω αξιολογούνται σε RNA 6000 Nano τσιπ χρησιμοποιώντας την Agilent 2100 ηλεκτροφόρηση Bioanalyzer (Η Ramaciotti Κέντρο Gene Συναρτησιακή Ανάλυση, Πανεπιστήμιο της Νέας Νότιας Ουαλίας, Sydney, NSW, Australia)

Reverse. η μεταγραφή του mRNA

Ολικό RNA (1 μ§) μεταγράφηκε αντίστροφα με τη χρήση της iScript αντίστροφη Μεταγραφή Supermix για RT-qPCR (# 170-8840, MMLV-based ΚΤ-άση, RNaseH

+, Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Australia) σε ένα συνολικό όγκο 20 μΐ σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η Supermix περιείχε τόσο ολίγο dT και τυχαία εναύσματα για να ληφθεί ένα μέγιστο αριθμό των αντιγράφων cDNA. Το μίγμα της αντίδρασης επωάστηκε στους 25 ° C για 5 λεπτά για αστάρωμα, στη συνέχεια στους 42 ° C για 30 min για την αντίστροφη μεταγραφή, και τελικά στους 85 ° C για 5 λεπτά για την αντίστροφη μεταγραφάση αδρανοποίηση. Το συμπληρωματικό DNA (cDNA) φυλάχθηκε στους -20 ° C μέχρι την περαιτέρω χρήση.

Εκτός από την BioRad, συμπεριλάβαμε δύο άλλες κατασκευές (Takara και Bioline) για να διερευνήσει την επιρροή του στην απόδοση της αντίστροφης μεταγραφής. Εμείς αντίστροφη μεταγραφή ολικού RNA (1 μg) από έξι αντίστροφες μεταγραφές (Takara και Bioline) ως ακολούθως: Το μίγμα της αντίδρασης παρασκευάστηκε χρησιμοποιώντας πρώτο βήμα προς ™ 1

st cDNA κλώνου κιτ σύνθεσης (# 6115A, MMLV-based ΚΤ-άση, RNaseH

+, Takara Bio Inc., Scientifix Pty Ltd, Clayton, Australia) σε ένα συνολικό όγκο 20 μΐ που περιέχουν τυχαίες 6 μερή, ολίγο dT ή και τα δύο σε ίσες γραμμομοριακότητα. Ένα τελικό όγκο 10 μΙ που περιέχει εκκινητή, μείγμα dNTP και το ολικό RNA επωάστηκε στους 65 ° C για 5 λεπτά και αμέσως ψύχεται. Στη συνέχεια, 5 × πρώτο βήμα προς

TM 1

ου ρυθμιστικό σκέλος, ανασυνδυασμένο αναστολέα RNase και πρώτο βήμα προς

TM ΚΤ-άση προστέθηκε σε τελικό όγκο 20 μl. Τελική αντίστροφη μεταγραφή επωάστηκε στους 30 ° C για 10 λεπτά, στη συνέχεια στους 42 ° C για 60 λεπτά που ακολουθείται από απενεργοποίηση στους 95 ° C για 5 λεπτά. Η αντίστροφη μεταγραφή χρησιμοποιώντας το κιτ σύνθεσης Tetro cDNA Bioline του (# ΒΙΟ-65042, MMLV-based ΚΤ-άση, RNaseH

+, Bioline (Aust) Pty Ltd, την Αλεξάνδρεια, την Αυστραλία) πραγματοποιήθηκε ως εξής: α τελικό όγκο 10 μl που περιέχει αστάρι ( τυχαία 6 μερή ή ολίγο dT ή και τα δύο σε ίσες μοριακότητα), μείγμα dNTP και RNA επωάστηκε στους 70 ° C για 5 λεπτά, ακολουθούμενο από την προσθήκη 5 χ RT ρυθμιστικού διαλύματος και Ribosafe RNase αναστολέα μέχρι 20 μΙ. Τελική μείγμα αντίδρασης επωάστηκε στους 45 ° C για 30 λεπτά και τερματίστηκαν στους 85 ° C για 5 λεπτά.

Ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (qPCR)

Ποσοτική PCR πραγματοποιήθηκε σε 12 υποθετικών γονιδίων αναφοράς . Τα χαρακτηριστικά τους όπως το όνομα, τον αριθμό πρόσβασης, χρωμόσωμα localization, μήκος προϊόντος, και την αντίστοιχη προς τα εμπρός και αντίστροφοι εκκινητές συνοψίζονται στον Πίνακα 1. Τα γονίδια αναφοράς και αλληλουχίες εκκινητή (αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich Pty. Ltd, Castle Hill, Australia) επελέγησαν με βάση τις προηγούμενες βάσεις δεδομένων και τις δημοσιεύσεις αναφορά σταθερό προφίλ γονιδιακής έκφρασης [8], [9], [12] – [15]. Primer ακολουθίες ήταν επίσης διασταυρώθηκαν με τη χρήση web-based εργαλείο

σε-silico

PCR (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr) στο ανθρώπινο γονιδίωμα πρόγραμμα περιήγησης στο UCSC [16] κατά γονιδίου και γονιδιωματική στόχους.

Η

Η έκφραση από τις πιο σταθερές γονίδια προσδιορίστηκε σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές του φυσιολογικού επιφανειακό επιθήλιο της ωοθήκης (n = 2) και των καρκινικών προέλευσης, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών (n = 9 ), του παχέος εντέρου (n = 9), του μαστού (η = 1), του τραχήλου της μήτρας (n = 1), ο καρκίνος της μήτρας (n = 1), και λευχαιμία (η = 2).

qPCR διεξήχθη επί το Stratagene Mx3005

® (Integrated Sciences Pty. Ltd, Chatswood, Αυστραλία) σε πλάκες μικροτιτλοδότησης 96 φρεατίων (Bio-Rad Laboratories (Ειρηνικός) Pty Ltd, Gladesville, Αυστραλία). Οι βέλτιστες συνθήκες αντιδράσεως ελήφθησαν με 1 × SsoFast ™ EvaGreen

® Supermix με χαμηλή ROX ως χρωστική αναφοράς (Bio-Rad Laboratories (Pacific) Pty Ltd, Gladesville, Αυστραλία), 400ηΜ ειδικό εκκινητή αίσθηση, 400 ηΜ συγκεκριμένες αντιπληροφοριακό εκκινητή, RNase /άνευ ϋΝάσης ύδωρ, και το πρότυπο cDNA (προηγουμένως απομονωθεί και μεταγράφηκε ανάστροφα RNA του 1 ng /φρεάτιο) μέχρι τελικό όγκο 10 μΙ. Εκτελέστηκαν ενισχύσεις ξεκινώντας με μια ενεργοποίηση 30 sec ένζυμο στους 95 ° C, ακολουθούμενη από 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C για 5 δευτερόλεπτα, και στη συνέχεια ανασύνδεσης /επέκτασης στους 60 ° C για 30 sec. Στο τέλος της κάθε τρέξει μια ανάλυση καμπύλης τήξης εκτελεστούν από 65-95 ° C. Όλα τα δείγματα και τους αρνητικούς μάρτυρες ενισχύθηκαν εις τριπλούν, και το ληφθέν μέση τιμή χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια για περαιτέρω ανάλυση. Κύκλος του ποσοτικού προσδιορισμού τιμών (Cq) της & gt? 35 αποκλείστηκαν από την περαιτέρω μαθηματικούς υπολογισμούς. Ένα «όχι πρότυπο δείγματος» (RNA από αντίστροφης μεταγραφής χωρίς ανάστροφης μεταγραφάσης) και ένα δείγμα χωρίς RNA ή cDNA ήταν οι αρνητικοί μάρτυρες.

PCR Απόδοσης (Ε)

Η συγκρισιμότητα αυτή διασφαλίζεται από τη διερεύνηση της qPCR απόδοσης για όλα τα γονίδια αναφορά σε ένα τυχαία επιλεγμένο εκχύλισμα RNA κυτταρική σειρά. Για να συγκρίνετε τα επίπεδα μεταγραφής RNA για τις 12 υποθετικές γονίδια αναφοράς, οι τιμές Cq δημιουργήθηκαν άμεσα σε ένα συγκεκριμένο όριο. Το CQ ορίζεται ως ο αριθμός των κύκλων που απαιτούνται για το σήμα φθορισμού να φθάσει ένα συγκεκριμένο κατώφλι ανίχνευσης και επομένως συσχετίζεται αντίστροφα με την ποσότητα εισόδου του ολικού RNA [17]. Να συγκρίνουν τις διάφορες πίστες qPCR εκτελούνται σε διαφορετικές ημέρες, πλάκες και τρέχει προσαρμόστηκαν στο κατώφλι του Cq 0.1. Αντίστροφη μεταγραφή cDNA αραιώθηκε από 100 ng έως 1 pg του RNA εισόδου πριν RT σε 10-πλάσιες αραιώσεις για κάθε γονίδιο αναφοράς εις τριπλούν. Λήφθηκε σήματα φθορισμού για την οριστική συγκέντρωση του RNA χαράχθηκαν και γραμμική παλινδρόμηση διεξήχθη για να προσδιορίσει την καλύτερη γραμμική σχέση που αντιπροσωπεύει την πρότυπη καμπύλη. Η κλίση της γραμμικής εξίσωσης εφαρμόστηκε για τον υπολογισμό της απόδοσης σύμφωνα με την εξίσωση Ε = (10

[- 1 /κλίση] -1). × 100

Ανάλυση Δεδομένων

Raw δεδομένων, συμπεριλαμβανομένων των καμπυλών τήξης και της ενίσχυσης λαμβάνεται με MxPro- Mx3000P v4.10 (Integrated Sciences Pty. Ltd, Chatswood, Αυστραλία) έχουν εξαχθεί για το Microsoft

® αρχεία Excel (.xls), αποθηκεύονται ως Microsoft

® αρχεία editor (.txt), και στη συνέχεια να φορτωθούν για ανάλυση περαιτέρω στοιχεία στην open source στατιστική γλώσσα προγραμματισμού R (https://CRAN.R-project.org/, έκδοση 2.13.2). Για περαιτέρω μοντελοποίηση και ανάλυση των δεδομένων RT-qPCR, χρησιμοποιήθηκε R πακέτο «qPCR» (https://cran.r-project.org/web/packages/qpcR/index.html). Η συσχέτιση Pearson (r) υπολογίστηκε για να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ εφαρμόζονται αλγόριθμοι.

Για να συγκρίνετε διαφορετικούς αλγόριθμους για την επιλογή των πιο σταθερές γονίδια αναφοράς, εφαρμόσαμε RefFinder (https://www.leonxie.com/referencegene.php), μια web-based ολοκληρωμένο εργαλείο. Χρησιμοποιεί το παρόν διαθέσιμο αλγορίθμων geNorm [9], Normfinder [8], BestKeeper [10] και συγκριτικών μεθόδων ΔCt [11], και εκχωρεί ένα κατάλληλο βάρος σε ένα άτομο γονίδιο και υπολογίζει τη μέση γεωμετρική για τη συνολική παραγγελία όλων των γονιδίων αναφοράς.

Αποτελέσματα

συμμόρφωση των κατευθυντήριων γραμμών MIQE για την ίδρυση της γονίδια αναφοράς

από την εισαγωγή τους το 2009 [5], η ερευνητική κοινότητα συνεχώς την αποδοχή των κατευθυντήριων γραμμών MIQE για τις δημοσιεύσεις και εξέταση των επιστημονικών χειρογράφων χρησιμοποιώντας RT-qPCR. Για τη μελέτη της αποδοχής της MIQE με περισσότερες λεπτομέρειες, πραγματοποιήσαμε μια ανασκόπηση της βιβλιογραφίας των δημοσιεύσεων προτείνοντας μια σειρά υποθετικών γονιδίων αναφοράς (n≥5) σε ανθρώπινα δείγματα για RT-qPCR. Εντοπίσαμε 37 δημοσιεύσεις από Ιανουάριος 2009 – Απρίλιος 2012, ο αριθμός των οποίων αυξάνεται συνεχώς κάθε χρόνο (Εικόνα 1Α). Οι περισσότερες από αυτές τις μελέτες διερευνήθηκε σε δείγματα ασθενών (63,2%), ακολουθούμενη από πρωτογενή και αθανάτων κυτταρικών γραμμών (31,6%). Ένα μικρό τμήμα (5,3%) που εξετάστηκαν δείγματα ιστού και κυτταρικές σειρές μαζί. ακεραιότητα του RNA ήταν στις περισσότερες περιπτώσεις (68,4%) ερευνήθηκε με δύο ανεξάρτητες μεθόδους, όπως φασματοφωτομετρία (90,9%) και αριθμός ακεραιότητα RIN (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, ΗΠΑ). Η ποσότητα του συνολικού RNA για αντίστροφη μεταγραφή ή cDNA για αντιδράσεις qPCR αναφέρθηκε στο 78,9% του συνόλου των εκδόσεων. SYBR

® Green (57.9%), μια φθορίζουσα χρωστική δέσμευσης dsDNA, ήταν περισσότερο συχνά χρησιμοποιούμενες από TaqMan (26,3%), ένα σημασμένο με φθορισμό στόχου-ειδικού ανιχνευτή. Η αποτελεσματικότητα qPCR για όλα τα γονίδια αναφοράς που διερευνήθηκαν παρασχέθηκε στο 68,4% του συνόλου των εκδόσεων, αλλά μόνο 28,9% που προβλέπεται λεπτομέρειες, όπως ύψος cDNA και το φάσμα της αραίωσης των πρότυπων καμπυλών. Τέλος, διερευνήθηκε ποια από τις γνωστών αλγορίθμων (geNorm, Normfinder, BestKeeper, συγκριτικά ΔΟΙ) εφαρμόστηκαν για τον εντοπισμό των πιο σταθερά εκφραζόμενα γονίδια αναφοράς. GeNorm και Normfinder αλγόριθμοι μαζί χρησιμοποιήθηκαν στις περισσότερες μελέτες που ακολουθείται από geNorm μόνο και geNorm, Normfinder, και BestKeeper μαζί (Σχήμα 1Β). Λαμβάνοντας υπόψη ότι μόνο οι δημοσιεύσεις που εκτελούν RT-qPCR για ταυτοποίηση σταθερώς εκφρασμένα γονίδια αναφοράς συμπεριλαμβάνονταν, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύουν ότι οι βασικές πληροφορίες όπως η ακεραιότητα του RNA, η ποσότητα του συνολικού RNA εις την αντίδραση, την αποτελεσματικότητα qPCR, και το ποσό cDNA λείπει σε ένα σημαντικό κλάσμα του Οι δημοσιεύσεις αυτές.

(Α). γράφημα γραμμής όλων των δημοσιεύσεων (n = 37) τη διερεύνηση των πιο σταθερά εκφραζόμενα γονίδια αναφοράς. (Β) Ποσοστό των αλγορίθμων που χρησιμοποιούνται για τον εντοπισμό αξιόπιστων γονίδια αναφοράς μεταξύ όλων των εκδόσεων.

Η

ποιότητα και την ακεραιότητα του RNA δείγματα

Το συνολικό RNA εξάγεται από σειρά μας των κυτταρικών σειρών αξιολογήθηκε ως προς την ποιότητα και ακεραιότητα. Τα λεπτομερή απαρίθμηση των κυτταρικών σειρών και των αντίστοιχων πληροφοριών για το ποσό του RNA, την ποιότητα και την ακεραιότητα (αναλογίες απορρόφησης 260/230 nm και 260/280 nm, αριθμός ακεραιότητα του RNA RIN, και 28 s /αναλογία 18 s) παρουσιάζονται ως συμπληρωματικά στοιχεία ( Πίνακας S2). Βρήκαμε ότι οι αναλογίες απορρόφησης, κατά μέσο όρο (μέσος όρος ± τυπική απόκλιση) έναντι όλων των κυτταρικών γραμμών 25, ήταν 1,97 ± 0,23 (260/230 nm) και 2,11 ± 0,04 (260/280 nm). Βρήκαμε επίσης ότι ο RIN κυμαινόταν από 8,4 έως 10, υποδεικνύοντας μία επαρκή συνολική ποιότητα του RNA. Ο αλγόριθμος RIN εκχωρεί μια βαθμολογία αριθμό RIN 1 έως 10, όπου η αξία των 10 αντιπροσωπεύει εντελώς άθικτο RNA και μια τιμή 1 αντιπροσωπεύει υποβαθμισμένο RNA. Επιπλέον, η ποιότητα του συνολικού RNA επιβεβαιώθηκε επίσης από την αναλογία του 28 s /18 s ριβοσωμικό RNA, το οποίο κυμαίνεται από 1,7 έως 2.7.

Η πιθανή παρουσία μολυσματικού DNA (Σχήμα S1) σε κάθε πείραμα ήταν qPCR ερευνήθηκε από γραφικές παραστάσεις ενίσχυσης, καμπύλες τήξης, και 1% ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης. Αντίστροφη μεταγραφή αρνητικές αντιδράσεις ελέγχου επιβεβαίωσε την απουσία μολυσματικών DNA. Παρ ‘όλα αυτά, υπήρχαν ενισχύσεις PCR στους αρνητικούς μάρτυρες του

PPIA

,

GUSB

,

RPII

και

TBP

σε μία ή δύο επαναλήψεις με τιμές Cq & gt? 35. Αυτές οι τιμές ήταν σημαντικά υψηλότερες από εκείνες των δειγμάτων που περιέχουν το πρότυπο του 1 ng cDNA, υποδεικνύοντας μία αμελητέα ενίσχυση του μολυσματικού DNA. Δεν PCR ενισχύσεις σε αρνητικό μάρτυρες ανιχνεύθηκαν για τα άλλα γονίδια αναφοράς. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η συνολική δείγματα RNA μας ήταν επαρκούς ποιότητας και σε μεγάλο βαθμό απαλλαγμένη από μολυσματικά DNA.

qPCR Αποδοτικότητα, ενδο- και δια-Δοκιμασία Μεταβλητότητα

Η αποτελεσματικότητα RT-qPCR του κάθε σετ εκκινητών προσδιορίστηκε με σειριακές αραιώσεις του προτύπου cDNA από την ανθρώπινη επιφανειακό επιθήλιο κυτταρική γραμμή ωοθηκών HOSE17-1 (Πίνακας 2). Χρησιμοποιήσαμε RNA από ένα τυχαία επιλεγμένο κυτταρική σειρά και όχι πλασμίδια γιατί το RNA μπορεί να προκαλέσει πιθανή μη-αμελητέα μεταβολή της αντίστροφης μεταγραφής [18], [19]. Με βάση τις λαμβανόμενες μέσες τιμές Cq για όλες τις αραιώσεις σε λογαριθμική σειρά αραίωσης cDNA, μια πρότυπη καμπύλη παρήχθη. Η κλίση, το σημείο τομής, αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης qPCR και συσχέτιση των συντελεστών (R

2) από κάθε ζεύγος εκκινητών υπολογίστηκαν από την πρότυπη καμπύλη (Σχήμα S2). Η αρχική σειρά αραίωσης από 100 ng έως 1 pg του RNA εισόδου πριν RT, προσαρμόστηκε λόγω μη ανιχνεύσιμα αμπλικόνια στο χαμηλότερο εύρος ή κορεσμού των αντιδράσεων qPCR σε υψηλότερες ποσότητες cDNA, τόσο που επηρεάζουν την αποτελεσματικότητα στο

RRN18S

,

RPII

και

B4GALT6

(Πίνακας 2).

GUSB

έδειξε μια βέλτιστη γραμμική περιοχή αραίωσης από 10 pg έως 10 ng. αποτελεσματικότητα PCR του μελέτησαν τα γονίδια αναφοράς που κυμαίνονταν από 87,1% έως 106,6%, η κλίση -3,680 έως -3,157, τομής 11,10 – 27,30 και R

2 0,994 έως 0,999.

Η

Για να εξασφαλιστεί ένα σταθερό επίπεδο μεταγραφής RNA, η επίδραση των τεχνικών μεταβλητότητα, ενδο- και παραλλαγή δια-δοκιμασίας διερευνήθηκαν χρησιμοποιώντας το τυχαία επιλεγμένο

HSPCB

επί RNA από κύτταρα SKOV3. διακύμανση μεταξύ των αναλύσεων προσδιορίστηκε από την εκτέλεση RT-qPCR με πανομοιότυπα δείγματα από πέντε διαφορετικές ημέρες, αποκαλύπτοντας ένα συντελεστή μεταβλητότητας (CV) του 1,74%. Η διακύμανση ενδο-δοκιμασίας ήταν λιγότερο από 0,3% CV χρησιμοποιώντας μία ποσότητα 0.5 ng και 2,0% χρησιμοποιώντας 5 pg του RNA. Αυτά τα στοιχεία δείχνουν ότι η τεχνική μεταβλητότητα είναι σε ένα αποδεκτό εύρος και ως εκ τούτου θεωρείται ως αμελητέα.

χρήση των κατάλληλων Αντίστροφη Ρύθμιση μεταγραφάσης

Για να μελετηθεί αν η προέλευση (κατασκευαστή) των αντίστροφες μεταγραφάσες επηρεάζει την ποιότητα της αντίδρασης, τέσσερα γονίδια αναφοράς (

SDHA

,

HSPCB

,

GUSB

και

TBP

) επιλέχθηκαν τυχαία και qPCR διεξήχθη μετά από αντίστροφη μεταγραφή. Για να ορίσετε τη συνολική απόδοση των τεσσάρων επιλεγμένων γονιδίων αναφοράς, οι μεταβολές υπολογίστηκαν για το CQ και οι τιμές CV (n = 7). Η διακύμανση για Cq κυμαίνονταν από ένα ελάχιστο 1,14 (

TBP

) με ανώτατο όριο 2,83 (

GUSB

) (Εικόνα 2Α). Η διακύμανση ενδο-δοκιμασία κατά τριπλούν ήταν υψηλότερη σε

SDHA

(CV = 2,51%) και το χαμηλότερο στην

GUSB

(CV = 0.04%) (Σχήμα 2Β). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι η προέλευση της ανάστροφης μεταγραφάσης και διαφορετικές ρυθμίσεις αστάρι έχει μόνο περιθωριακή επίδραση στην απόδοση αυτών των τεσσάρων γονιδίων αναφοράς.

(Α) Τυχαία 6 mer χρησιμοποιήθηκαν σε 2 και 5, ολίγο dT εκκινητή σε 3 και 6, και οι δύο μαζί σε 1, 4 και 7 (τετμημένη)? CQ για συντεταγμένη δείχνει τις διαφορές μεταξύ των εξετάστηκαν συνθήκες ανάστροφης μεταγραφάσης. (Β) Συντελεστής διακύμανσης (CV). προμηθευτές RT υποδεικνύεται από λατινικούς αριθμούς: Ι) BioRad, II) Takara, και III) Bioline. Χ-άξονας με διαφορετικούς εκκινητές RT: ολίγο dT (ολιγο), τυχαία 6 μερή (τυχαία), και τα δύο (δύο)

Η

Έκφραση Σταθερότητα υποψήφια γονίδια αναφοράς σε ανθρώπινες γραμμές κυττάρων

για να εντοπίσει τις πιο σταθερές γονίδια αναφοράς σε όλη την δοκιμή φυσιολογικών και καρκινικών κυτταρικών σειρών, οι σταθερότητες έκφραση των γονιδίων αναφοράς που εξετάστηκαν από την εκτέλεση των πέντε αλγορίθμους (RefFinder, geNorm, BestKeeper, Normfinder, και συγκριτική ΔΟΙ) και την κατάταξη των τα γονίδια από κάθε αλγόριθμο ξεχωριστά. Αυτές οι τάξεις ήταν συνόψισε, με τη χαμηλότερη κατάταξη ποσό που αντιπροσωπεύει το πιο σταθερά εκφράζεται το γονίδιο αναφοράς και την υψηλότερη κατάταξη ποσό που αντιπροσωπεύει το λιγότερο σταθερά εκφράζεται το γονίδιο αναφοράς. Σε όλες τις κυτταρικές σειρές ερευνήθηκε (Εικόνα 3Α) εντοπίσαμε

HSPCB

,

RRN18S

και

RPS13

ως τα 3 πιο σταθερά εκφραζόμενα γονίδια αναφοράς.

B4GALT6

ήταν το λιγότερο σταθερό γονίδιο αναφοράς. Στην υποομάδα των κυτταρικών σειρών καρκίνου του κόλου

HSPCB

, YWHAZ, και

RPS13

ήταν οι 3 πιο σταθερά εκφραζόμενα γονίδια αναφοράς (Σχήμα 3Β). Επιπλέον, στο υποσύνολο των φυσιολογικών και των ωοθηκών καρκινικές κυτταρικές σειρές, τα αντίστοιχα γονίδια ήταν

PPIA

,

RPS13

και

SDHA

(Εικόνα 3C).

(Α) (n = 25), (Β) καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές γραμμές (n = 9), και (C) κανονικό και ωοθηκών καρκινικές κυτταρικές γραμμές (n = 11). Αριθμοί αναδείξει τις τρεις πρώτες πιο σταθερό γονίδια αναφοράς σε κάθε πειραματική διάταξη.

Η

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι πιο σταθερά εκφραζόμενα γονίδια αναφοράς ποικίλουν μεταξύ των διαφόρων συνόλων κυτταρική γραμμή, με μόνο

RPS13

να είναι παρούσα σε όλες τις τρεις σειρές γραμμή κυττάρων μέσα στις πρώτες 3 κορυφαία γονίδια αναφοράς. Είναι ενδιαφέρον, το πιο συχνά χρησιμοποιούμενο γονίδιο αναφοράς

GAPDH

ήταν μεταξύ των λιγότερο σταθερά εκφράζεται το γονίδιο αναφοράς σε σετ μας επάνω.

Ερευνήσαμε περαιτέρω τη συσχέτιση μεταξύ των πέντε εφαρμοσμένων αλγορίθμων που παραδίδουν τις πιο σταθερές γονίδια . Η συσχέτιση μεταξύ των πέντε δοκιμασίες σταθερότητας ήταν μέτρια έως υψηλή θέση μεταξύ των εφαρμοστούν αλγόριθμοι. Η υψηλότερη συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ Normfinder και τη μέθοδο Ct συγκριτική δέλτα (r = 0,99) (Σχήμα 4), υποδεικνύοντας ότι όλα τα 12 γονίδια αναφοράς σχεδόν ταυτόσημα κατατάσσονται. Η χαμηλότερη συσχέτιση (r = 0,71) ήταν μεταξύ του δέλτα μέθοδο Ct και RefFinder, δείχνοντας μια υψηλή διαφορά στην κατάταξη.

Απόλυτη αξία του Pearson συσχέτισης και

σ

-τιμή σημειώνονται με αστερίσκο (0 *** 0,01 **). Κάτω από τα διαγράμματα διασποράς οπτικοποιεί διμεταβλητή συσχέτιση μεταξύ δοκιμές διερευνήθηκε η σταθερότητα συμπεριλαμβανομένης μιας προσαρμοσμένης γραμμής.

Η

Συζήτηση

1) πραγματοποιείται μια επισκόπηση της βιβλιογραφίας σχετικά με τη συμμόρφωση των κατευθυντήριων γραμμών MIQE κατά την εκτέλεση των RT-qPCR πειράματα εντοπισμό σύνολα γονιδίων αναφοράς, 2) αξιολόγησε την απόδοση των αλγορίθμων για την κατάταξη των γονιδίων αναφοράς με σταθερότητα την έκφρασή τους? και 3) προσδιόρισε μια σειρά κατάλληλων και πιο αξιόπιστη γονίδια αναφοράς για την επιλογή μας των ανθρώπινων καρκινικών κυτταρικών σειρών διαφορετικής προέλευσης.

ανασκόπηση της βιβλιογραφίας μας αποκάλυψε ότι η συμμόρφωση με τις κατευθυντήριες γραμμές MIQE ήταν μόνο μερική. Ουσιώδεις πληροφορίες [5], όπως η ακεραιότητα του RNA, το ποσό του συνολικού RNA στην αντίδραση, ποσό cDNA, το φάσμα της αραίωσης για πρότυπες καμπύλες, και την αποτελεσματικότητα της qPCR συχνά λείπει από τις δημοσιεύσεις, η οποία δεν είναι σύμφωνη με τις κατευθυντήριες γραμμές MIQE . Στενότερη δυνατή η συμμόρφωση με τις κατευθυντήριες γραμμές για την εκτέλεση της RT-qPCR καθώς και την αναφορά αυτών των πληροφοριών στις δημοσιεύσεις συμβάλλει στη βελτίωση του πειραματικού σχεδιασμού μελέτης και εξασφαλίζει την επαναληψιμότητα και την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων της μελέτης. Διαφορετικά, ελάχιστες διαφορές ανιχνεύθηκαν σε στοχευμένη γονιδιακή έκφραση μπορεί να είναι ένας πιθανός αποτέλεσμα των μεταβολών στη γονιδιακή έκφραση αναφοράς.

δείξαμε ότι ανάστροφες μεταγραφάσες που παρέχονται από διαφορετικούς κατασκευαστές οδηγούν σε μεταβολές σε κύκλους ποσοτικοποίησης (Cq έως 3). Ως εκ τούτου, μπορεί να είναι χρήσιμο να εξετάσουμε διάφορα RTS και να δοκιμάσουν διαφορετικά σύνολα αστάρι, ολίγο dT ή τυχαία 6 καταναλωτές ή και τα δύο σε συνδυασμό πριν από τα πειράματα επιχείρηση. Τα ευρήματά μας είναι επίσης σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες όπου οι αποδόσεις μεταγραφής μεταβάλλεται μέχρι και 100 φορές μεταξύ διαφορετικών αντίστροφες μεταγραφάσες σε ένα γονίδιο- τρόπο που εξαρτάται [20], [21]. Βρήκαμε στη βιβλιογραφία και επιβεβαιώθηκε στη μελέτη μας ότι διαφορετικές στρατηγικές αστάρωμα RT είναι ζωτικής σημασίας για την ποσοτική μέτρηση της γονιδιακής έκφρασης [21]. Επιπλέον, παρατηρήσαμε στη δική μας πειράματα που δεν RT είναι ανώτερη από άλλες RTS και ως εκ τούτου, κανένα συμπέρασμα δεν μπορεί να γίνει για την επιλογή του RT εκκίνησης? Δηλαδή, δεν μπορεί να ληφθεί απόφαση επί της οποίας αστάρι είναι καλύτερο από το άλλο.

Η χρήση στατιστικών αλγορίθμων για μετρήσεις σταθερότητα εξετάζεται κριτικά, γιατί όλοι αυτοί οι αλγόριθμοι βασίζονται στην υπόθεση ότι κανένας από τους μελετήθηκαν τα γονίδια αναφοράς δείχνουν συστηματική μεταβολή στο προφίλ έκφρασης σε όλα τα δείγματα [22]. Επιπλέον, ανασκόπηση της βιβλιογραφίας μας έδειξε ότι στις περισσότερες μελέτες έχουν εφαρμοστεί μόνο μία ή δύο αλγορίθμους. Η μελέτη μας αποκάλυψε σημαντικές διαφορές στη συσχέτιση μεταξύ των εφαρμοσμένων αλγορίθμων. Επιπλέον, παρά τη σχετικά υψηλή συσχέτιση (r = 0,9) μεταξύ του geNorm και των Normfinder αλγορίθμων, η εφαρμογή αυτών των δύο αλγορίθμων που παραδίδεται πανομοιότυπα κατάταξη στο μόνο 5 από τα 12 γονίδια αναφοράς διερευνηθεί. Αυτό παρουσιάζει ένα μειονέκτημα που μπορεί να οδηγήσει σε ψευδώς επιλογή των γονιδίων αναφοράς, η οποία μπορεί να έχει αρνητικό αντίκτυπο στην ποιότητα και την αξιοπιστία των δεδομένων. Συνιστούμε, επομένως, ότι περισσότερα από δύο αλγόριθμοι θα πρέπει να εφαρμόζονται για την επιλογή των γονιδίων αναφοράς.

Σας έχουν χρησιμοποιήσει στο παρελθόν απέδειξαν και δημοσιεύθηκε ζεύγη εκκινητών για την ανίχνευση των επιπέδων μεταγραφής των υποθετικών γονιδίων αναφοράς σε μια πισίνα του κανονικού και του καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Σε γενικές γραμμές, σχεδόν όλα τα γονίδια αναφοράς που πραγματοποιήθηκαν σε έναν κατάλληλο τρόπο και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για μελλοντικές μελέτες που χρησιμοποιούν κυτταρικές γραμμές. Επιπλέον, με βάση τα αποτελέσματα σε ενδο- και δια-δοκιμασίας διακύμανσης όλα τα γονίδια αναφοράς διερευνώνται μπορούν να χρησιμοποιηθούν για περαιτέρω έρευνες. Παρ ‘όλα αυτά, ανάμεσα σε όλες τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν βρήκαμε ότι

HSPCB

,

RRN18S

, και

RPS13

είναι τα πιο σταθερά εκφράζονται τα γονίδια που υποδηλώνει την καταλληλότητά τους ως γονίδια αναφοράς για μελλοντικές μελέτες στο πλαίσιο αυτό πειραματική διάταξη. Έρευνες σχετικά παχύ έντερο και φυσιολογικό, καθώς και κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών αποκάλυψε την αναμενόμενη διαφορές μεταξύ των επιλεγμένων γονιδίων αναφοράς και ως εκ τούτου θα πρέπει να εξετάζεται σε μελλοντικές μελέτες. Αποδεικνύει ότι τα γονίδια αναφοράς θα πρέπει να επιλέγονται προσεκτικά για κάθε πειραματική διάταξη.