Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία θανάτου από όλες τις γυναικολογικούς καρκίνους και συμβατικές θεραπείες όπως η χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, και ακτινοθεραπεία συνήθως αποτυγχάνουν να ελέγξουν προχωρημένα στάδια της νόσου. Έτσι, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για εναλλακτικές και καινοτόμες θεραπευτικές επιλογές. Εμείς λόγος που γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου με τη χρήση ενός φορέα ικανό για ειδική χορήγηση ενός γονιδίου που κωδικοποιεί ένζυμο σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών θα επιτρέψει το καρκινικό κύτταρο να μεταβολίζει ένα αβλαβές προφάρμακο σε ένα ισχυρό κυτοτοξίνη, η οποία θα οδηγήσει σε θεραπευτικές επιδράσεις. Στην παρούσα μελέτη, διερευνούμε τη χρήση ενός ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) ψευδοβίρια να παραδώσει ένα απλού έρπητα κινάσης θυμιδίνης ιού (HSV-tk) γονίδιο σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Βρήκαμε ότι ο HPV-16 ψευδοβίρια ήταν σε θέση να μολύνει προνομιακά ποντικού και ανθρώπινα κύτταρα ωοθηκών όγκου όταν χορηγούνται ενδοπεριτοναϊκώς. Επιπλέον, ενδοπεριτοναϊκή ένεση HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια που φέρει το γονίδιο HSV-tk που ακολουθείται από κατεργασία με ganciclovir οδήγησε σε σημαντικές θεραπευτικές επιδράσεις κατά του όγκου σε ποντίκια με καρκίνο των ωοθηκών που φέρουν ποντικού. Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι ο HPV ψευδοβίρια μπορεί να χρησιμεύσει ως ένα δυναμικό όχημα παράδοσης για τη γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών

Παράθεση:. Hung C-F, Τσιάνγκ AJ, Tsai Η-Η, Pomper MG, Kang Θ, Roden RR, et al. (2012) Καρκίνος των ωοθηκών Gene Therapy Χρησιμοποιώντας HPV-16 ψευδοβίρια που φέρει το γονίδιο HSV-tk. PLoS ONE 7 (7): e40983. doi: 10.1371 /journal.pone.0040983

Επιμέλεια: Ιωσήφ Najbauer, City of Hope Εθνικό Ιατρικό Κέντρο και Beckman Research Institute, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Μαρτίου 2012? Αποδεκτές: 15 Ιούνη, 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Ιουλίου του 2012

Copyright: © 2012 Hung et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου εξειδικευμένα προγράμματα της ερευνητικής αριστείας (https://trp.cancer.gov/) σε καρκίνο του τραχήλου Ρ50 CA098252, CA118790 (Roden), και CA122581 (Roden). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία θανάτου από όλες τις γυναικολογικούς καρκίνους και η έκτη πιο συχνή κακοήθεια στις γυναίκες στις Ηνωμένες Πολιτείες [1], [2]. Παρά το γεγονός ότι σημαντικές πρόοδοι έχουν σημειωθεί και στις δύο χειρουργικές και χημειοθεραπευτικά τεχνικές, τα συνολικά ποσοστά επιβίωσης 5 ετών για όλα τα στάδια του καρκίνου των ωοθηκών παραμείνει & lt? 50% [2], [3]. Οι τρέχουσες θεραπείες (χειρουργική επέμβαση, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία και) συνήθως αποτυγχάνουν να ελέγξουν προχωρημένα στάδια της νόσου. Ως εκ τούτου, οι εναλλακτικές θεραπευτικές προσεγγίσεις μπορούν να χρησιμεύσουν ως σημαντικές μεθόδους για τον έλεγχο αυτών των όγκων των ωοθηκών σε προχωρημένο στάδιο.

Μια πιθανή προσέγγιση είναι η χρήση της γονιδιακής θεραπείας αυτοκτονίας (SGT). Με SGT, το γονίδιο για ένα ξένο ένζυμο (δηλαδή ένα από έναν ιό, βακτήρια, ή ζυμομύκητα) είναι ειδικά παραδίδεται σε καρκινικά κύτταρα. παράδοσης γονιδίων ακολουθείται από συστηματική χορήγηση ενός μη τοξικού προφαρμάκου. Τα μολυσμένα καρκινικά κύτταρα είναι σε θέση να εκφράσουν την ξένη ένζυμο να μετατρέψει το προφάρμακο σε ένα δραστικό κυτταροτοξίνης, η οποία είναι σε θέση να σκοτώσει τα μολυσμένα κύτταρα. Ένα πλεονέκτημα SGT έχει πάνω από συμβατικές θεραπείες γονίδιο είναι η ικανότητά του να σκοτώσει γειτονικά κύτταρα μέσω της φαινόμενο γειτνιάσεως. Το δραστικό φάρμακο μπορεί να ξεφύγει από τα μεταχθέντα κύτταρα και διαχέεται σε γειτονικά μη μολυσμένα κύτταρα, οδηγώντας τελικά σε θάνατο τους, καθώς και. Τα κύτταρα που πεθαίνουν είναι επίσης σε θέση να προκαλέσουν τα κύτταρα φυσικοί φονείς (ΝΚ) και τα Τ κύτταρα για να προκαλέσει μια μακρινή επίδραση των παρευρισκομένων. Η ελπίδα για την προσέγγιση αυτή είναι να έχουν μεγάλη ειδικότητα για καρκινικά κύτταρα, ιδιαιτέρως τα βλαστικά κύτταρα του καρκίνου. Αυτή η προσέγγιση θα πρέπει επίσης να μειώσει τις τοξικές παρενέργειες που σχετίζονται με τις συμβατικές θεραπείες του καρκίνου λόγω της αυξημένης ειδικότητας τόσο της παράδοσης και ενεργοποίηση της κυτοτοξίνης [4].

Το πιο μελετημένο σύστημα γονίδιο /προφαρμάκου αυτοκτονία είναι ο συνδυασμός του απλού έρπητα κινάσης θυμιδίνης ιού (HSV-tk) με ganciclovir (GCV) [5]. HSV-tk, το οποίο έχει υψηλή συγγένεια για ganciclovir, καταλύει το πρώτο φωσφορυλίωση GCV που μπορεί στη συνέχεια να είναι δι- και τρι-φωσφορυλιώνεται από κυτταρικές κινάσες. Τριφωσφορυλιωμένη GCV μπορούν να ενσωματωθούν σε αναδιπλασιαζόμενο DNA, η οποία οδηγεί σε αναστολής πολυμεράσης και τελικά απόπτωσης [4] – [6]. Αυτό το σύστημα έχει δείξει κάποια επιτυχία στην κλινική, αλλά η χρησιμότητά της περιορίζεται από την εξάρτησή της από κύτταρο σε κύτταρο κόμβους επαφής και το κενό για το φαινόμενο γειτνιάσεως [4].

παλιό 5-8 εβδομάδων C57BL /6 ποντίκια προσβλήθηκαν με καρκινικά κύτταρα MOSEC (1 × 10

6 κύτταρα /ποντίκι). Μία εβδομάδα αργότερα, τα ποντίκια που έφεραν όγκο ενδοπεριτοναϊκώς ένεση με ή χωρίς HPV-16 /luc ψευδοϊοσωμάτια (20 μg HPV-16 L1 πρωτεΐνης /ποντικό, που ισοδυναμεί με 120 ng του DNA /ποντικό). Παρθένα ποντίκια μολυσμένα με ή χωρίς HPV-16 /luc ψευδοϊοσωμάτια χρησίμευσε ως μάρτυρας. Οι ποντικοί απεικονίστηκαν με μη επεμβατική απεικόνιση φωταύγειας 1 ημέρα μετά τη μόλυνση. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 2 πειράματα που εκτελέστηκαν.

Η

Για τη μελέτη αυτή, χρησιμοποιούμε ελαττωματικού αντιγραφής ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV) ψευδοϊοσωμάτια να παραδώσει το γονίδιο HSV-tk σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν πλασμιδίων DNA μπορεί να συσκευαστεί εντός της L1 ιού θηλώματος και L2 πρωτεΐνες καψιδίου για να δημιουργήσει το «ψευδοβίρια» που μπορούν να αποτελεσματικό παραδώσει το DNA σε πολλαπλές κυτταρικές γραμμές [7] – [9]. Η ενθυλάκωση προστατεύει επίσης το DNA από νουκλεάσες και παρέχει μια στοχευμένη παράδοση με μεγάλη σταθερότητα. Πολλές από τις ανησυχίες για την ασφάλεια που συνδέονται με τη χρήση ζωντανών ιικών φορέων ανακουφίζονται οι HPV ψευδοϊοσωμάτια περιέχουν ένα κατασκεύασμα DNA διαφορετική από την φυσική ιικό γονιδίωμα HPV. Υπάρχουν επίσης πάνω από 100 τύπους ψευδοϊοσωμάτια ιού θηλώματος, η οποία επιτρέπει την επαναλαμβανόμενη τόνωση τη χρήση διαφορετικών τύπων, δεδομένου ότι οι αντισώματα εξουδετέρωσης έναντι ενός τύπου δεν είναι συνήθως διασταυρούμενη αντίδραση με άλλους τύπους.

Εδώ έχουμε διερευνήσει τη χρήση του HPV ψευδοϊοσωμάτια να παραδώσει γονίδια δείκτες και τάσεις αυτοκτονίας γονίδια και για τις δύο ποντικού και ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Βρήκαμε ότι η ενδοπεριτοναϊκή ένεση της HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια οδήγησε στην προτιμησιακή μόλυνση έκτοπη και αυθόρμητα εμφανιζόμενους καρκίνους των ωοθηκών ποντικού σε ποντικούς. Προνομιακή λοίμωξη παρουσιάστηκε επίσης σε ξενομοσχεύματα ανθρώπινου ωοθηκικού όγκου των ποντικών που φέρουν όγκο. Ενδοπεριτοναϊκή ένεση του HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια που φέρει το γονίδιο HSV-tk που ακολουθείται από χορήγηση ganciclovir οδήγησε σε σημαντικές θεραπευτικές επιδράσεις κατά του όγκου σε ποντίκια που φέρουν τον καρκίνο-ποντικού-ωοθηκών. Τα δεδομένα μας δείχνουν απόδειξη της αρχής ότι ο HPV ψευδοϊοσωμάτια μπορεί να είναι χρήσιμοι φορείς για τη χορήγηση θεραπευτικών γονιδίων σε καρκίνους των ωοθηκών.

5-8 εβδομάδων γυμνοί ποντικοί εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκά με ανθρώπινα κύτταρα ωοθηκών καρκινικά ES2 (1 × 10

6 κύτταρα /ποντίκι). Μία εβδομάδα αργότερα, τα ποντίκια που έφεραν όγκο ενδοπεριτοναϊκώς ένεση με άγριου τύπου (wt) HPV-16 /Luc PSV ή μεταλλαγμένων L2 ψευδοϊοσωμάτια (mTL2) HPV-16L1mtL2-Luc (20 μg HPV-16 L1 πρωτεΐνης /ποντικό, που ισοδυναμεί με 120 ng του DNA /ποντικό). Παρθένα ποντίκια μολύνθηκαν με ννί ή mt ψευδοϊοσωμάτια HPV-16 /luc χρησίμευσαν ως μάρτυρες. Οι ποντικοί απεικονίστηκαν με μη επεμβατική απεικόνιση φωταύγειας 1 ημέρα μετά τη μόλυνση. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των 2 πειραμάτων που εκτελούνται.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε αυστηρά σύμφωνα με τις συστάσεις του Οδηγού για η φροντίδα και χρήση των πειραματόζωων των Εθνικών Ινστιτούτων Υγείας. Όλες οι διαδικασίες διεξήχθησαν με προηγούμενη έγκριση της φροντίδας των ζώων και τη χρήση επιτροπής Johns Hopkins (πρωτόκολλο MO08M446).

Ποντίκια

Η C57BL /6 και γυμνό (BALB /c ηυ /ηυ) ποντίκια ήταν αποκτήθηκε από το National Cancer Institute.

MISIIR-TAG

διαγονιδιακά ποντίκια [10] ήταν ευγενώς από το Δρ Denise Connolly στο Αντικαρκινικού Κέντρου Fox Chase. Όλα τα ζώα διατηρήθηκαν κάτω από ειδικές συνθήκες άνευ παθογόνων, και έγιναν όλες οι διαδικασίες σύμφωνα με τα εγκεκριμένα πρωτόκολλα και σύμφωνα με τις συστάσεις για την ορθή χρήση και τη φροντίδα των πειραματόζωων.

C57BL /6 ποντίκια και

MISIIR -tag

διαγονιδιακά ποντίκια εγχύθηκαν με 20 μg του HPV-16 /luc PSV με ενδοπεριτοναϊκή ένεση 10 εβδομάδες μετά τη γέννηση. εικόνες φωταύγεια ελήφθησαν 1 ημέρα μετά την ένεση HPV-16 /LUV PSV.

Top,

Εκπρόσωπος εικόνες φωταύγεια της PSV-μολυσμένα ποντίκια C57BL /6 ή

MISIIR-TAG

διαγονιδιακά ποντίκια (αριστερά) και η συγκομιδή οργάνων τους (δεξιά). Σημείωση: Λευκό βέλος δείχνει μόνο τον καρκίνο των ωοθηκών από MISRII διαγονιδιακά ποντίκια μπορεί να μολυνθεί από τον HPV-16 /Luc PSV.

Bottom,

Εκπρόσωπος ιστογράμματα της απεικόνισης φωταύγειας στο MISIIR-TAG διαγονιδιακά ποντίκια ή C57BL /6 ποντίκια. αντιπροσωπευτικά δεδομένα από 2 πειράματα που εκτελέστηκαν.

Η

τηλέφωνα Γραμμές

κύτταρα 293TT είναι ευγενική παραχώρηση J Schiller (Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI), Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH)) [11 ]. Η κυτταρική σειρά MOSEC (καρκίνος κυτταρική γραμμή ωοθηκών ποντικού) παρασκευάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Η κυτταρική σειρά ES2 (μια ανθρώπινη κυτταρική γραμμή καρκίνου των ωοθηκών) αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA. κύτταρα MOSEC /λουσιφεράσης (MOSEC-Ιυο) δημιουργήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [13].

κύτταρα MOSEC-Luc μολύνθηκαν HPV16-GFP PSV ή HPV16 /HSV-tk PSV σε συγκέντρωση 1 μg πρωτεΐνης L1 /ml για 48 ώρες. Τα μολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0 μg /ml, 0,1 μg /ml, 1 μg /ml, ή 10 μg /ml του GANCICLOVIR για 72 ώρες. Η έκφραση λουσιφεράσης εξετάστηκε από το σύστημα IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των 2 πειραμάτων που εκτελούνται.

Η

πλασμίδια

Τα πλασμίδια που κωδικοποιούν HPV16 L1 L2 (pShell16) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. J Schiller (NCI). Η σημειακή μετάλλαξη HPV16L1 mTL2 κατασκεύασμα περιγράφεται στην προηγούμενη μελέτη μας [14]. Η παραγωγή του πλασμιδίου λουσιφεράσης που εκφράζουν (pcDNA3-λουσιφεράση) και το πλασμίδιο που εκφράζει GFP-(pcDNA3-GFP) έχει περιγραφεί προηγουμένως [15], [16]. Το πλασμίδιο pORF-HSVtk αγοράστηκε από InvivoGen.

HPV ψευδοβίρια Παραγωγή

HPV16-GFP, HPV16-Luc (λουσιφεράση), HPV16-tk (HSVtk Herpes Simplex Virus-κινάση της θυμιδίνης) ψευδοϊοσωμάτια ήταν γίνονται χρησιμοποιώντας τις μεθόδους όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Εν συντομία, τα κύτταρα 293TT συνεπιμολύνθηκαν με πλασμίδια έκφρασης HPV pShell16 και τα πλασμίδια της επιλογής (όπως GFP, λουσιφεράση ή HSVtk) χρησιμοποιώντας Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό Dulbecco (PBS) (Invitrogen) συμπληρωμένο με 9,5 mM ΜαΟΙ

2 και μίγμα αντιβιοτικό-αντιμυκητιασικό (DPBS-Mg) (Invitrogen). Τα κύτταρα εναιωρήθηκαν σε DPBS-Mg συμπληρωμένο με 0,5% Brij58, 0,2% Benzonase (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ, USA), και 0,2% Πλασμίδιο Safe (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, USA) σε & gt? 100 × 10

6 κύτταρα /ml και επωάζονται στους 37 ° C για 24 ώρες για την ωρίμανση καψιδίου. Μετά την ωρίμανση, το κυτταρικό λύμα ψύχθηκε σε πάγο για 10 λεπτά. Η συγκέντρωση άλατος του προϊόντος λύσης κυττάρου ρυθμίστηκε σε 850 mM και επωάζεται σε πάγο για 10 λεπτά. Το προϊόν λύσης στη συνέχεια διαυγάζεται με φυγοκέντρηση, και το υπερκείμενο επιστρώθηκε πάνω σε μία κλίση Optiprep. Η κλίση περιστράφηκε επί 4,5 ώρες στους 16 ° C σε 40 000 r.p.m. σε στροφείο SW40 (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA, USA). Η καθαρότητα του HPV ψευδοϊοσωμάτια αξιολογήθηκε με τρέξιμο των κλασμάτων σε ηλεκτροφόρηση θειικού-πολυακρυλαμιδίου δωδεκύλ κλίση νατρίου 4-15% γέλη. Το έγκλειστο πλασμίδιο DNA ποσοτικοποιείται με εκχύλιση ενθυλακωμένο DNA από Optiprep παρατάξεις που ακολουθείται από ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR συγκρίσεις με σειριακές αραιώσεις του γυμνού DNA. Οι συγκεντρώσεις των πλασμιδίων (GFP, λουσιφεράση, ή HSVtk) στις ψευδοϊοσωμάτια προσδιορίσθηκαν να είναι περίπου 6.2 ng DNA ανά 1 μα πρωτεΐνης L1.

In vitro

Μόλυνση Κυττάρων Όγκου από HPV16 ψευδοϊοσωμάτια

MOSEC ή κύτταρα ES2 απλώθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο και αναπτύχθηκαν όλη τη νύκτα. Τα κύτταρα μολύνθηκαν με HPV-16 /Luc PSV (1 μg L1 πρωτεΐνη /ml) για 72 ώρες. Η λουσιφερίνη (15 μg /ml) προστέθηκε και επωάστηκε για 10 λεπτά. Ένα χρόνο ολοκλήρωσης των 10 sec χρησιμοποιήθηκαν για την απόκτηση φωταύγεια εικόνα από το σύστημα IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA).

Χαρακτηρισμός των όγκων μόλυνση από HPV 16 ψευδοϊοσωμάτια σε ποντίκια

C57BL /6 ποντίκια (5 ανά ομάδα) εγχύθηκαν ενδοπεριτοναϊκώς με 1 χ 10

6 κύτταρα MOSEC /ποντικό. Μία εβδομάδα αργότερα, τα ποντίκια που έφεραν όγκο ενδοπεριτοναϊκώς ένεση με HPV-16 /Luc PSV σε δόση 20 μg HPV-16 L1 πρωτεΐνης /ποντικό (ισοδύναμο με 120 ng του DNA /ποντικό). εικόνες φωταύγεια καταγράφηκαν την ημέρα μετά από την HPV-16 ένεση /Luc PSV. Ένα χρόνο ολοκλήρωσης των 2 λεπτών χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση της φωταύγειας της εικόνας.

Για τον χαρακτηρισμό της μόλυνσης των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών με HPV-16 /Luc PSV, γυμνοί ποντικοί προκλήθηκαν με ανθρώπινα κύτταρα ωοθηκών καρκινικά ES2 σε ένα δόση του 1 × 10

6 κύτταρα /ποντίκι. Μία εβδομάδα αργότερα, τα ποντίκια που έφεραν όγκο ενδοπεριτοναϊκώς ένεση με άγριου τύπου (wt) HPV-16 /Luc PSV ή μεταλλαγμένων (mt) HPV-16L1mtL2-Luc PSV σε δόση 20 μg HPV-16 L1 πρωτεΐνης /ποντικό (ισοδύναμο έως 120 ng του DNA /ποντικό). Παρθένα ποντίκια χωρίς όγκους μολύνθηκαν με wt ή mt HPV-16 /Luc PSV χρησίμευσαν ως μάρτυρες. εικόνες φωταύγεια ελήφθησαν την ημέρα μετά την ένεση HPV-16 /Luc PSV. Τα ποντίκια ενέθηκαν με 0.2 ml 15 mg ml σκαθάρι λουσιφερίνη /(άλας καλίου? Promega). Μετά από 10 λεπτά, οι ποντικοί απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Ένα χρόνο ολοκλήρωσης 30 δευτερόλεπτα χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση φωταύγεια εικόνα.

In vitro

διαμεσολαβείται από HPV16-ΤΚ ψευδοϊοσωμάτια και Ganciclovir

κύτταρα MOSEC-Luc κυτταροτοξικότητα μολύνθηκαν HPV 16 GFP PSV ή HPV16-ΤΚ PSV (1 μg L1 πρωτεΐνη /ml) για 48 ώρες. Τα μολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων. Τα μολυσμένα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 0 μg /ml, 0,1 μg /ml, 1 μg /ml, ή 10 μg /ml του GANCICLOVIR για 72 ώρες και η έκφραση λουσιφεράσης εξετάστηκε από IVIS 200 σύστημα (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA ).

In vivo

κυτταροτοξικότητα διαμεσολαβείται από HPV16-ΤΚ ψευδοϊοσωμάτια και Ganciclovir

Ποντίκια ενδοπεριτοναϊκή ένεση με 1 × 10

6 MOSEC-Luc κύτταρα /ποντίκι σε ημέρα 1. η δραστικότητα λουσιφεράσης εξετάστηκε την ημέρα 2 ως ένδειξη τον αριθμό των όγκων στο ποντίκι. Τα ποντίκια ενέθηκαν με 0.2 ml 15 mg ml σκαθάρι λουσιφερίνη /(άλας καλίου? Promega). Μετά από δέκα λεπτά, οι ποντικοί απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Ένα χρόνο ολοκλήρωσης των 2 λεπτών χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση φωταύγειας της εικόνας. Οι ποντικοί εγχύθηκαν με HPV16-GFP PSV (20 μg πρωτεΐνης L1) ή HPV16-ΤΚ PSV (20 μg πρωτεΐνης L1) την ημέρα 3. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή καθημερινά με ganciclovir (50 mg /kg) ή PBS από την ημέρα 5 έως την ημέρα 18. οι ποντικοί απεικονίστηκαν ξανά με μη επεμβατική απεικόνιση φωταύγεια κατά την ημέρα 20.

Αποτελέσματα

ενδοπεριτοναϊκή ένεση HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια οδηγεί σε Προνομιακή μόλυνση Κυττάρων ποντικού καρκίνου των ωοθηκών σε ποντικούς που φέρουν όγκο

αρχικά εξετάστηκε αν η HPV-16 ψευδοβίρια που φέρει το γονίδιο της λουσιφεράσης (HPV-16 /Luc PSV) ήταν ικανός να μολύνει το κυτταρική σειρά καρκίνου ποντικού ωοθηκών, MOSEC,

in vitro

. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1, HPV-16 /Luc PSV ήταν σε θέση να μολύνει κύτταρα όγκου MOSEC

in vitro

. Για να αποδειχθεί εάν ο HPV-16 /Luc PSV μπορούν επίσης να μολύνουν το καρκινική κυτταρική σειρά ποντικού ωοθηκών σε ποντίκια που φέρουν όγκο, πρώτα ενδοπεριτοναϊκή ένεση ποντίκια με κύτταρα όγκου MOSEC. Τα ποντίκια που έφεραν όγκους ενδοπεριτοναϊκώς ένεση με HPV-16 /Luc PSV μία εβδομάδα αργότερα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, ενώ οι ποντικοί χωρίς όγκους δεν έδειξαν καμία δραστηριότητα λουσιφεράσης, τα ποντίκια που φέρουν όγκο ενδοπεριτοναϊκώς ένεση με HPV-16 /Luc PSV επέδειξαν σημαντική δραστικότητα λουσιφεράσης. Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το HPV ψευδοβίρια μολύνει προνομιακά τα κύτταρα του όγκου σε ποντικούς που φέρουν όγκο.

ενδοπεριτοναϊκή ένεση HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια οδηγεί σε Προνομιακή Μόλυνση Κυττάρων Ανθρώπινου καρκίνου των ωοθηκών σε Tumor-γυμνούς ποντικούς που φέρουν

Θα εξεταστεί περαιτέρω αν η HPV-16 /Luc PSV ήταν σε θέση να μολύνει την ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών ES2. Όπως φαίνεται στην Εικόνα S2, κύτταρα μολυσμένα με ES2 HPV-16 /Luc PSV καταδειχθεί δραστικότητα λουσιφεράσης, υποδηλώνοντας ότι HPV-16 /Luc PSV ήταν ικανοί να μολύνουν ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου των ωοθηκών

in vitro

. Έχουμε χαρακτήρισε επίσης τη

in vivo

μολυσματικότητα του HPV-16 /luc PSV σε γυμνούς ποντικούς που φέρουν όγκους ES2 ανθρωπίνων ωοθηκών να προσδιοριστεί αν η μολυσματικότητα του ιού HPV ψευδοϊοσωμάτια είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική παράδοση γονιδίων σε κύτταρα όγκου ωοθήκης από HPV ψευδοϊοσωμάτια. Είναι πλέον σαφές ότι η HPV L2 ελάσσονα πρωτεΐνη καψιδίου είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική μόλυνση των κυττάρων από τον ιό HPV ψευδοϊοσωμάτια [14], [17]. Έτσι, έχουμε απασχολούνται HPV-16 /Luc PSV με μία απλή μετάλλαξη αμινοξέος στη HPV L2 (HPV16L1mtL2-Luc PSV) που καταργεί την μολυσματικότητα του ψευδοϊοσωμάτια [14]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, μόνο γυμνούς ποντικούς που φέρουν όγκους ανθρώπινου ωοθηκικού επέδειξαν σημαντική φωταύγεια σε σύγκριση με τα γυμνά ποντίκια μη-φέροντες όγκο. Επιπλέον, τα ποντίκια μόνο φέρουν όγκο μολυνθεί από HPV-16 /luc PSV αλλά όχι μεταλλαγμένη HPV-16 /L1mtL2- luc PSV έδειξε σημαντική φωταύγεια (Εικ. 2). Έτσι, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια μπορεί επίσης κατά προτίμηση να μολύνει ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

in vivo

. Επιπλέον, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η ανέπαφη HPV L2 είναι απαραίτητη για την αποτελεσματική χορήγηση ενθυλακωμένο γονιδίων σε κύτταρα όγκου ωοθήκης από HPV ψευδοϊοσωμάτια.

HPV-16 /luc PSV Κατά προτίμηση μολύνει ωοθηκών όγκοι σε

MISIIR-tag

διαγονιδιακό ποντίκι

Εξετάσαμε περαιτέρω την προνομιακή μόλυνση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών από τον ιό HPV ψευδοϊοσωμάτια στο

MISIIR-tag

διαγονιδιακό ποντίκι, ένα αυθόρμητα συμβαίνουν μοντέλο ωοθηκών όγκου ποντικού. Αυτό διαγονιδιακό ποντίκι, το οποίο εκφράζει την μετατροπή περιοχή του SV40 υπό τον έλεγχο του Mullerian ανασταλτική γονίδιο υποδοχέα προαγωγό ουσία τύπου II, έχει δειχθεί να αναπτύξει διμερείς όγκους των ωοθηκών. Έτσι, η αυθόρμητη μοντέλο καρκίνου των ωοθηκών σε

MISIIR-tag

διαγονιδιακά ποντίκια περισσότερο μοιάζει με ανθρώπινο καρκίνο των ωοθηκών από ένα μοντέλο μεταμόσχευσης, όπως μοντέλο όγκου MOSEC. Η

MISIIR-tag

διαγονιδιακό ποντίκι έχει αναφερθεί ότι αναπτύσσουν αυθόρμητα ωοθηκών καρκίνωμα εντός 6-13 εβδομάδων από τη γέννηση [10]. Στο εργαστήριό μας, όλα τα

MISIIR-tag

διαγονιδιακά ποντίκια (από μια νέα γραμμή που αποκτήθηκαν από τον Δρ Connolly) ανέπτυξαν όγκους των ωοθηκών εντός 4 μηνών από τη γέννηση. Εμείς εγχέεται HPV-16 /luc PSV 10 εβδομάδες μετά τη γέννηση και βρήκαμε ότι HPV-16 /Luc PSV θα μπορούσε επίσης να μολύνουν κατά προτίμηση την αυθόρμητα συμβαίνουν καρκίνου των ωοθηκών στο

MISIIR-tag

διαγονιδιακά ποντίκια (Εικ. 3). Επιπλέον, παρατηρήσαμε ότι τα ζωτικά όργανα, συμπεριλαμβανομένων των πνευμόνων, της καρδιάς, του στομάχου, σπλήνα και τους νεφρούς δεν είχαν μολυνθεί. Επιπλέον, καμία δραστηριότητα λουσιφεράσης παρατηρήθηκε στις φυσιολογικές ωοθήκες από ποντικούς C57BL /6 εγχύθηκαν με HPV-16 /luc pSV. Έτσι, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια μπορούν να μολύνουν εκλεκτικά τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών σε έναν αυθόρμητα συμβαίνουν μοντέλο ωοθηκών όγκου ποντικού.

Η μόλυνση των HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια που φέρει το γονίδιο HSV-tk ακολουθούμενη από κατεργασία με Ganciclovir οδηγεί σε

in vitro

κυτταροτοξικότητα των μολυσμένων κυττάρων

Η προτιμησιακή μόλυνση HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών επιτρέπει την ευκαιρία να μεταφέρει ειδικά θεραπευτικά DNA σε κύτταρα όγκου ωοθήκης για τον έλεγχο των όγκων των ωοθηκών. Επειδή η αρχική χορήγηση του HPV ψευδοϊοσωμάτια μπορεί να μην είναι σε θέση να μολύνει όλα τα κύτταρα όγκου ωοθήκης, είναι σημαντικό να εξετάσει μια στρατηγική που επιτρέπει στους καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μολυσμένα όχι άμεσα να γίνει επίσης ευαίσθητα. Ως εκ τούτου, επιλέξαμε το σύστημα HSV-tk /ganciclovir, δεδομένου ότι είναι η πιο ευρέως μελετηθεί σύστημα γονίδιο αυτοκτονίας θεραπεία και πάνω από δύο δεκαετίες προσπαθειών να χρησιμοποιήσει το σύστημα ως αντικαρκινική θεραπεία έχει δείξει διάφορους βαθμούς επιτυχίας. Για να αποδειχθεί αν HPV-16 /HSV-tk PSV μπορεί να μολύνει τα κύτταρα όγκου ωοθήκης και τα καθιστούν ευαίσθητα στην θανάτωση από αγωγή με ganciclovir, εμείς μολυσμένα κύτταρα MOSEC-Luc με HPV16-GFP PSV ή HPV16 /HSV-tk PSV για 48 ώρες. Τα μολυσμένα κύτταρα στη συνέχεια σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις ganciclovir και λουσιφεράσης έκφραση των μολυσμένων κυττάρων μετρήθηκε με τη χρήση του συστήματος IVIS 200. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, τα καρκινικά κύτταρα MOSEC-Luc μολυνθεί με PSV HPV-16 /HSV-tk που ακολουθείται από κατεργασία με ganciclovir οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο των μολυσμένων κυττάρων

in vitro.

Αυτό δεν παρατηρήθηκε σε κύτταρα που έχουν μολυνθεί με HPV-16 /GFP. Παρατηρήσαμε επίσης ότι υψηλότερες συγκεντρώσεις ganciclovir οδήγησε σε πιο κυτταρικό θάνατο. Παρόμοια αποτελέσματα παρατηρήθηκαν όταν παρόμοιες δοκιμασίες διεξήχθησαν με την ανθρώπινη κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών ES2 (βλέπε σχήμα S3).

ενδοπεριτοναϊκή ένεση HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια που φέρει το γονίδιο HSV-tk ακολουθούμενη από κατεργασία με Ganciclovir οδηγεί σε σημαντική αποτελέσματα κατά του όγκου σε μυοειδή καρκίνο των ωοθηκών ποντικών που φέρουν

περαιτέρω αποφασιστική αν MOSEC ποντίκια που φέρουν όγκο μολυνθεί με PSV HPV-16 /HSV-tk που ακολουθείται από κατεργασία με ganciclovir θα μπορούσε επιδεικνύουν θεραπευτικά αποτελέσματα κατά των όγκων. Οι ποντικοί ενέθηκαν με καρκινικά κύτταρα MOSEC-Luc και στη συνέχεια κατεργάζεται με HPV-16 /HSV-tk PSV ή HPV-16 /GFP PSV χρησιμοποιώντας αγωγή όπως περιγράφεται στην Εικόνα 5. Οι ποντικοί στη συνέχεια έλαβαν θεραπεία με ganciclovir και ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα απεικόνισης φωταύγειας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 5, τα ποντίκια που φέρουν όγκο σε επεξεργασία με PSV HPV-16 /HSV-tk που ακολουθείται από κατεργασία με ganciclovir εμφάνισαν σημαντικά καλύτερα θεραπευτικά αποτελέσματα κατά των όγκων από τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με HPV-16 /GFP PSV που ακολουθείται από κατεργασία με ganciclovir. Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν HPV-16 ψευδοβίρια μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να παραδώσει αποτελεσματικά το γονίδιο HSV-tk σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών για να καταστήσει τα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών πιο ευάλωτα σε αγωγή με ganciclovir.

C57BL /6 ποντίκια (5 ανά ομάδα) ενδοπεριτοναϊκή ένεση με 1 χ 10

6 κύτταρα MOSEC-Luc ανά ποντίκι την ημέρα 1. η δραστικότητα λουσιφεράσης εξετάστηκε την ημέρα 2 ως ένδειξη του αριθμού των όγκων στα ποντίκια. Οι ποντικοί εγχύθηκαν HPV16-GFP PSV (πρωτεΐνη L1 20 μg) ή HPV16 /HSV-tk PSV σε δόση πρωτεΐνης L1 (20 μg /ποντικό) κατά την ημέρα 3. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή καθημερινά με ganciclovir σε μια δόση των 50 mg /kg ή PBS από την ημέρα 5 έως την ημέρα 18. Οι ποντικοί απαθανατίστηκε από μη επεμβατικές τεχνικές απεικόνισης φωταύγεια την ημέρα 20. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των 2 πειραμάτων που εκτελούνται.

Η

Συζήτηση

Η επιτυχής απασχόλησης του γονιδίου HSV-tk για γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών χρησιμοποιώντας HPV ψευδοϊοσωμάτια υποδηλώνει ότι άλλα κατάλληλα υποψήφια γονίδια μπορούν επίσης να απελευθερώνονται με HPV ψευδοβίρια σε όγκους των ωοθηκών για γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών. Αρκετές υποψήφια γονίδια για συνδυασμούς ενζύμου-προφαρμάκου για γονιδιακή θεραπεία αυτοκτονίας έχουν αναφερθεί συμπεριλαμβανομένης αποαμινάσης κυτοσίνης [18], [19], νιτρορεδουκτάση [20], καρβοξυλεστεράση [21], του κυτοχρώματος Ρ450 [22] και φωσφορυλάση νουκλεοσιδίου πουρίνης [23]. Όπως και HSV-tk, τα ένζυμα που κωδικοποιούνται από αυτά τα γονίδια μπορεί να μετατρέψει τα μη τοξικά προφάρμακα σε φάρμακα ικανά να μπλοκάρουν τη σύνθεση του DNA, με αποτέλεσμα την ενδεχόμενη κυτταρικό θάνατο καθώς και τα αποτελέσματα των παρευρισκομένων να σκοτώσει επιπλέον κύτταρα γειτονικές όγκου.

Για μελλοντικές κλινικές μετάφραση, θα είναι σημαντικό να εξεταστεί ανησυχίες για την ασφάλεια τόσο του συστήματος HSV-tk /GCV και το όχημα παράδοσης. Ωστόσο, η γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου με τη χρήση HSV-tk έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς. Πολλές κλινικές δοκιμές με τη χρήση αυτής της προσέγγισης έχουν διεξαχθεί σε ασθενείς με γλοιώματα και δεν σοβαρές ανεπιθύμητες ενέργειες αναφέρθηκαν (για ανασκόπηση βλέπε [24], [25]). Από την άλλη πλευρά, η παραγωγή του HPV ψευδοβίρια ως οχήματα παράδοσης DNA θα απαιτούσε πιθανώς περαιτέρω εξελίξεις για να βελτιωθεί το προφίλ ασφαλείας του. Η τρέχουσα κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιείται για την παραγωγή των ψευδοϊοσωμάτια περιέχει SV40 μεγάλο Τ αντιγόνο, το οποίο είναι ένα ογκοπρωτεΐνη, και ως εκ τούτου θέτει ορισμένα πιθανά προβλήματα ασφαλείας. Μια εναλλακτική προσέγγιση που χρησιμοποιούν μαγιά για την παραγωγή ψευδοϊοσωμάτια έχει περιγραφεί [26]. Η μαζική παραγωγή των HPV ψευδοϊοσωμάτια πιθανότατα θα απαιτήσει επίσης αποτελεσματική τυποποιημένα πρωτόκολλα για τη δημιουργία μεγάλων τίτλων μολυσματικών ψευδοϊοσωμάτια HPV για κλινική μετάφραση.

Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε προτιμησιακή μόλυνση του ποντικού και ανθρώπινων όγκων των ωοθηκών με HPV-16 ψευδοβίρια. Τα ευρήματά μας συμφωνούν με προηγούμενες μελέτες από τους Roberts et al. χρησιμοποιώντας ένα γυμνό μοντέλο ποντικού για περιτοναϊκή διάχυση της ανθρώπινης καρκινικής κυτταρικής γραμμής ωοθηκών, SHIN3 [27]. Βρήκαν επίσης ότι οι HPV ψευδοβίρια χορηγείται ενδοπεριτοναϊκά μολυσμένους ιστούς των ωοθηκών όγκου με υψηλή εξειδίκευση, ενώ παρακάμπτοντας τις κανονικές περιτοναϊκή επιφάνειες ιστού. Ωστόσο, διαφορετικοί τύποι HPV ψευδοβίρια μπορεί να αποδείξει διαφορετικά τροπισμών όγκου ή /και του ιστού. Για παράδειγμα, Cerio κ.ά., έχουν δείξει ότι ένα HPV-16, αλλά όχι HPV-45, pseudovirus θα μπορούσε να μολύνει τα ανθρώπινα κύτταρα των ωοθηκών των όγκων SWA-G

in vitro

[28]. δεδομένα τους δείχνουν ότι η μόλυνση pseudovirus ανθρώπινων όγκων μπορεί να είναι HPV τύπου και όγκου-ειδικά. Έτσι, είναι σημαντικό να προσδιοριστούν περαιτέρω τους σωστούς τύπους του HPV ψευδοβίρια για μελλοντική γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου.

Οι μηχανισμοί για την προτιμησιακή μόλυνση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών από τον ιό HPV ψευδοϊοσωμάτια παραμένουν ασαφείς. Στη μελέτη μας, δείξαμε ότι ένα ανέπαφο L2 είναι απαραίτητη για την μολυσματικότητα του HPV-16 ψευδοβίρια σε όγκους των ωοθηκών (βλέπε σχήμα 2). HPV είσοδο στα κύτταρα-στόχους έχει αποδειχθεί να ξεκινήσει από τον πρώτο δεσμεύεται σε ηπαρίνη σουλφονωμένου πρωτεογλυκάνης (HSPG) παράγοντες προσκόλλησης κυτταρικής επιφάνειας. Τα ιικά σωματίδια HPV στη συνέχεια να υποβληθεί μία διαμορφωτική μεταβολή που εκθέτει το Ν-τελικό άκρο της πρωτεΐνης L2 ελάσσονα καψιδική να φουρίνη διάσπασης [29], [30]. Η πρωτεόλυση της L2 εκθέτει ένα προηγουμένως αποφραχθεί επιφάνεια του L1 που δεσμεύεται με απροσδιόριστη επί του παρόντος υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας σε κύτταρα, τα οποία πιστεύεται ότι είναι υπεύθυνη για την εσωτερικοποίηση των σωματιδίων (για ανασκόπηση βλέπε [31]). Έχει επίσης δειχθεί ότι οι περισσότερες κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών ρυθμίζουν προς τα πάνω έκφραση φουρίνης [32]. Έτσι, είναι κατανοητό ότι η προς τα πάνω ρύθμιση της φουρίνης έκφρασης μπορεί να συμβάλει στην προτιμησιακή μόλυνση του όγκου των ωοθηκών με HPV ψευδοϊοσωμάτια. Μπορούμε επίσης να αποκλείσουμε την πιθανότητα ότι η προτιμησιακή μόλυνση είναι ένα κατασκεύασμα της την δίοδο του καρκινικών κυττάρων

in vitro

αφού παρατηρήθηκε προτιμησιακή μόλυνση στο αυθόρμητα συμβαίνουν μοντέλο όγκου ωοθηκών (βλέπε Σχήμα 3). Θα είναι σημαντικό να χαρακτηριστούν περαιτέρω οι μηχανισμοί για την προτιμησιακή μόλυνση των κυττάρων του όγκου των ωοθηκών με HPV ψευδοϊοσωμάτια. Οι πληροφορίες αυτές θα είναι χρήσιμες για τη βελτίωση της ειδική απελευθέρωση του γονιδίου ενδιαφέροντος σε κύτταρα ωοθηκών όγκου χρησιμοποιώντας HPV ψευδοϊοσωμάτια.

Περιληπτικά, βρήκαμε ότι ενδοπεριτονιακή ένεση του HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια οδηγεί σε προτιμησιακή μόλυνση ποντικού και ανθρώπου των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα σε ποντίκια που φέρουν όγκο. Επιπλέον, η γονιδιακή θεραπεία του καρκίνου με τη χρήση του HPV ψευδοϊοσωμάτια μεταφέρουν HSV-tk ήταν ικανό να στοχεύουν ειδικά τους όγκους των ωοθηκών, με αποτέλεσμα ισχυρή θεραπευτική αντικαρκινική δράση κατά των όγκων των ωοθηκών. Θα είναι σημαντικό να προσδιοριστούν περαιτέρω οι πλέον κατάλληλοι υποψήφιοι γονιδιακή θεραπεία και θεραπευτικές αγωγές για μελλοντικές μελέτες για την κλινική μετάφραση.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Χαρακτηρισμός της μόλυνσης των κυττάρων του όγκου MOSEC από τον HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια

in vitro

. κύτταρα MOSEC σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5000 κυττάρων /φρεάτιο της νύχτας πριν από τη μόλυνση. Τα σπαρμένα κύτταρα MOSEC στη συνέχεια μολύνθηκαν με HPV-16 /Luc PSV (1 μg L1 πρωτεΐνη /ml) για 72 ώρες και η έκφραση λουσιφεράσης εξετάστηκε από το σύστημα IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). εικόνες φωταύγεια κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών MOSEC (κορυφή). Bar γραφική παράσταση που απεικονίζει τις συνολικές μετρήσεις φωτονίων για κάθε φρεάτιο (κάτω). Σημείωση: HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια μπορεί να μολύνει αποτελεσματικά τον καρκίνο των ωοθηκών MOSEC ποντίκι

in vitro

. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των 2 πειραμάτων που εκτελούνται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0040983.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Χαρακτηρισμός τη μόλυνση ES2 ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών από τον HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια

in vitro

. ανθρώπινα κύτταρα ωοθηκών καρκινικά ES2 σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων σε πυκνότητα 5000 κύτταρα /φρεάτιο της νύχτας πριν από τη μόλυνση. Τα σπαρμένα κύτταρα ES2 στη συνέχεια μολύνθηκαν με HPV-16 /Luc PSV (1 μg L1 πρωτεΐνη /ml) για 72 ώρες και η έκφραση λουσιφεράσης εξετάστηκε από IVIS 200 σύστημα (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). εικόνες φωταύγεια κυτταρική σειρά καρκίνου των ωοθηκών ES2 (κορυφή). Bar γραφική παράσταση που απεικονίζει τις συνολικές μετρήσεις φωτονίων για κάθε φρεάτιο (κάτω). Σημείωση: HPV-16 ψευδοϊοσωμάτια μπορεί να μολύνει αποδοτικά ανθρώπινου καρκίνου των ωοθηκών ES2 in vitro. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των 2 πειραμάτων που εκτελούνται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0040983.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

In vitro

κυτταροτοξικότητα διαμεσολαβείται από ψευδοϊοσωμάτια HPV16-tk και γκανσικλοβίρη. κύτταρα ES2-Luc μολύνθηκαν HPV16-GFP PSV ή HPV16 /HSV-tk PSV σε συγκέντρωση 1 μg πρωτεΐνης L1 /ml για 48 ώρες. Τα μολυσμένα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 0 μg /ml, 0,1 μg /ml, 1 μg /ml, ή 10 μg /ml του GANCICLOVIR για 72 ώρες. Η έκφραση λουσιφεράσης εξετάστηκε από το σύστημα IVIS 200 (Xenogen Corp., Alameda, CA, USA). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά των 2 πειραμάτων που εκτελούνται

doi:. 10.1371 /journal.pone.0040983.s003

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Katherine Liu ( JHMI) για την προετοιμασία του χειρογράφου.