Αφηρημένο

Ο στόχος της παρούσας μελέτης ήταν να διερευνήσει το μοτίβο έκφρασης και κλινικοπαθολογικών σημασία της MTA3 σε ασθενείς με μη μικροκυτταρικό καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC). Το προφίλ έκφρασης του MTA3 σε ιστούς NSCLC και των παρακείμενων noncancerous ιστούς των πνευμόνων ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημεία. MTA3 υπερεκφράστηκε σε 62 από 108 (57,4%) δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του πνεύμονα και συσχετίστηκαν με το στάδιο ρ-ΤΝΜ (ρ & lt? 0,0001), κομβικών μετάσταση (p = 0,0009) και κακή πρόγνωση (ρ & lt? 0,05). Επιπλέον, η εξάντληση της έκφρασης MTA3 με μικρά παρεμβαλλόμενα RNA ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών στις καρκινικές κυτταρικές γραμμές Α549 και Η157 πνεύμονα. Επιπλέον, η εξάντληση MTA3 που προκαλείται διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 /S όριο. Ανάλυση Western blotting αποκάλυψε ότι η knockdown του MTA3 μείωσε τα επίπεδα πρωτεΐνης της κυκλίνης Α, κυκλίνη D1 και ρ-Rb. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι MTA3 παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη NSCLC

Παράθεση:. Li Η Sun L, Xu Υ, Li Ζ, Luo W, Tang Ζ, et al. (2013) Η υπερέκφραση του MTA3 συσχετίζεται με την εξέλιξη του όγκου σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα. PLoS ONE 8 (6): e66679. doi: 10.1371 /journal.pone.0066679

Επιμέλεια: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu », Ιταλία

Ελήφθη: 24 Νοεμβρίου του 2012? Αποδεκτές: 9, Μαΐου 2013? Δημοσιεύθηκε: 19 Ιουνίου 2013

Copyright: © 2013 Li et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30972967) και Εξειδικευμένες Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό Πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης (Αρ 20092104110018) και το Πρόγραμμα για Liaoning εξαιρετικά ταλέντα στο Πανεπιστήμιο. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος του πνεύμονα είναι μία από τις κύριες αιτίες των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο και η συχνότητα της αυξάνεται [1], [2]. Η πλειονότητα των διαγνώσεων καρκίνου του πνεύμονα είναι καρκίνοι του πνεύμονα μη-μικρού κυττάρου (NSCLCs). Παρά το γεγονός ότι τρεις θεραπευτικές μεθόδους (χειρουργική εκτομή, χημειοθεραπεία, ακτινοθεραπεία) έχουν καθοριστεί, η μακροπρόθεσμη επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα είναι ακόμη γενικά κακή [3]. Μια ποικιλία σύνθετων γενετικών, επιγενετικών και μικροπεριβάλλον παράγοντες διαδραματίζουν σημαντικούς ρόλους στην επιβίωση και αποικισμό των καρκινικών κυττάρων σε καινούργιες τοποθεσίες [4], [5]. Βελτιώσεις στην κατανόηση μοριακών διαδικασιών που εμπλέκονται στην πνευμονική καρκινογένεση έχει οδηγήσει σε νέες θεραπευτικές επιλογές με μικρά μόρια θεραπευτική και τα εμβόλια που αποδεικνύουν την ενθάρρυνση της δυναμικό. Το καλύτερο ορισμό της παθογένειας του καρκίνου του πνεύμονα, χρήσιμο βιοδείκτες και νέων θεραπευτικών στόχων είναι απαιτητικές εργασίες.

MTA3 βρέθηκε αρχικά ως μέλος μιας οικογένειας μικρών πρωτεϊνών (συμπεριλαμβανομένων MTA1, MTA2 και MTA3), ότι όλα χρησιμεύουν ως υπομονάδες του συμπλόκου χρωματίνη αναδιαμόρφωση /NuRD Mi-2 [6] – [13]. Οι εκθέσεις των MTA3 σε ανθρώπινους καρκίνους ήταν αρκετά περιορισμένη αρχικά. MTA3 αναφέρθηκε να συμμετέχουν στην ανάπτυξη των λεμφοκυττάρων Β, σε κυτταρικές σειρές πλασμακυτώματος, η υπερέκφραση BCL6 και MTA3 μειωτικά γονίδια κυτταρική διαφοροποίηση στο πλάσμα [14]. Από τότε, ωστόσο, η έκφραση της MTA3 έχει βρεθεί να μειωθεί σε καρκίνο του μαστού, καρκίνο του ενδομητρίου και των ωοθηκών [15] – [17]. MTA3 αυξορρύθμιση αποτρέπει ΕΜΤ με άμεση καταστολή

Σαλιγκάρι

έκφρασης, με τον τρόπο αυτό προς τα πάνω ρύθμιση των επιπέδων της πρωτεΐνης Ε-καδερίνης στον καρκίνο του μαστού [13]. MTA3 καταστέλλει επίσης Wnt4 μεταγραφή και έκκριση, αναστέλλοντας τα γονίδια Wnt-στόχου σε επιθηλιακά κύτταρα μαστού [18]. Μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε ότι MTA3 διευκολύνει G2 /M εξέλιξη στα πολλαπλασιαζόμενα κοκκιώδη κύτταρα ποντικού [19]. Επιπλέον, MTA3 αναφέρθηκε ως ένα ανεξάρτητο και δυσμενή προγνωστικό δείκτη της μήτρας καρκίνωμα μη endometriod [20]. Αυτές οι μελέτες έχουν προτείνει διαφορετικούς ρόλους των MTA3 σε διάφορους τύπους ανθρώπινων καρκίνων. Ωστόσο, δεν έχει εξεταστεί η έκφραση της πρωτεΐνης του MTA3 σε πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα και η σχέση της με κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες. Ως εκ τούτου, οι βιολογικοί ρόλοι των MTA3 σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα είναι ακόμα ασαφής. Προκειμένου να αντιμετωπιστούν τα παραπάνω ερωτήματα, εξετάσαμε την έκφραση της πρωτεΐνης MTA3 σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ιστών με ανοσοϊστοχημεία. Επιπλέον, διερευνήσαμε τη συσχέτιση των MTA3 με τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

Ασθενείς και δείγματα

Αυτή η μελέτη διεξήχθη με την έγκριση της τοπικής επιτροπή δεοντολογίας στο China Medical University. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και όλες οι κλινικές έρευνες που διεξήχθησαν σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. 108 περιπτώσεις των δειγμάτων NSCLC ελήφθησαν από την Πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου κατά τη διάρκεια της περιόδου 2005 έως 2008. Η ιστολογική διάγνωση και βαθμού διαφοροποίησης των όγκων καθορίστηκαν μέσω της αξιολόγησης των αιματοξυλίνη και τομές ιστών ηωσίνη-χρωματισμένο, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές για την ταξινόμηση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας. Όλα τα 108 δείγματα επαναξιολογούνται σε σχέση με την ιστολογική υποτύπους τους, την κατάσταση διαφοροποίησης, και τα στάδια όγκου. Για τα δείγματα NSCLC, πλακώδες καρκίνωμα και το αδενοκαρκίνωμα εντοπίστηκαν σε 44 και 64 των 108 περιπτώσεων, αντίστοιχα. Λεμφαδενικές μεταστάσεις παρατηρήθηκαν σε 43 ασθενείς. Το σύστημα σταδιοποίησης ΤΝΜ-p της Διεθνούς Ένωσης κατά του Καρκίνου (7η έκδοση) χρησιμοποιήθηκε για την ταξινόμηση των δειγμάτων σε στάδια Ι (n = 47), ΙΙ (n = 36), ΙΙΙ (n = 25).

κυτταρικές γραμμές

Α549 και Η157 κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen), 100 IU /ml πενικιλλίνη (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA), και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη ( Sigma). Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μια στείρα πιάτα καλλιέργειας ιστού και περάστηκαν κάθε 2 ημέρες χρησιμοποιώντας 0.25% θρυψίνη (Invitrogen).

Ανοσοϊστοχημεία

χειρουργικά δείγματα όγκου μονιμοποιήθηκαν με 10% ουδέτερη φορμαλίνη, ενσωματωμένο σε παραφίνη και 4 μm πάχους τομές παρασκευάζονται. Η ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας τη μέθοδο συμπλόκου αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (Ultra Sensitive TM, Maixin, Fuzhou, Κίνα). Οι τομές αποπαραφινοποιήθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε βαθμιαίες σειρά αλκοόλης και βράζεται σε 0,01 Μ κιτρικού ρυθμιστικού (ρΗ 6,0) για 2 λεπτά σε ένα αυτόκλειστο. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείσθηκε χρησιμοποιώντας υπεροξείδιο του υδρογόνου (0,3%), η οποία ακολουθήθηκε από επώαση με φυσιολογικό ορό κατσίκας για να μειωθεί η μη ειδική πρόσδεση. Οι τομές ιστού επωάσθηκαν με ένα πολύκλωνο αντίσωμα κουνελιού MTA3 (1:150 αραίωση) (Proteintech, Chicago, IL, USA). ανοσοσφαιρίνη ποντικού χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος. Η χρώση με το σύνολο των πρωτογενών αντισωμάτων πραγματοποιήθηκε σε θερμοκρασία δωματίου για 2 ώρες. Βιοτινυλιωμένο κατσίκας IgG ορού αντι-ποντικού, ή IgG βιοτινυλιωμένο κατσίκας αντι-κουνελιού ορό (έτοιμο προς χρήση) (Maixin, Fuzhou, Κίνα) χρησιμοποιήθηκε ως δευτερεύοντα αντισώματα. Μετά την πλύση, οι τομές επωάστηκαν με συζευγμένη με υπεροξειδάση χρόνου στρεπταβιδίνη-βιοτίνη, που ακολουθείται από 3,3′-τετραϋδροχλωρική διαμινοβενζιδίνη για την ανάπτυξη της αντίδρασης της υπεροξειδάσης. Αντιχρωματισμός των τμημάτων έγινε με αιματοξυλίνη, και στη συνέχεια αιθανόλη αφυδάτωση πραγματοποιήθηκε πριν από την τοποθέτηση.

Δύο ανεξάρτητοι ερευνητές εξέτασαν όλες τις διαφάνειες των όγκων τυχαία. Πέντε απόψεις εξετάστηκαν ανά διαφάνεια, και 100 κύτταρα παρατηρήθηκαν ανά προβολή στα 400 × μεγέθυνση. Η ανοσοχρώση των MTA3 βαθμολογήθηκε σε μια ημι-ποσοτική κλίμακα με αξιολόγηση σε αντιπροσωπευτικές περιοχές των όγκων με ένα υψηλότερο ποσοστό ένταση και κυττάρων ανοσοχρώσης από τα κύτταρα ελέγχου. Πυρηνική χρώση των καρκινικών κυττάρων θεωρήθηκε θετική ανοσοχρώση. Η ένταση της πυρηνικής χρώσης MTA3 επίσης βαθμολογείται ως 0 (καμία χρώση), 1 (ασθενής), ή 2 (σήμανση). βαθμολογίες ποσοστό ορίστηκαν ως 1 (1-25% θετική), 2 (26-50%), 3 (51-75%), και 4 (76-100%). Οι βαθμολογίες κάθε δείγματος όγκου πολλαπλασιάζονται για να δώσουν ένα τελικό σκορ από το 0 έως 8 και η συνολική έκφραση της MTA3 προσδιορίστηκε ως είτε αρνητικοί ή χαμηλή έκφραση (-) με σκορ & lt? 4 ή υπερέκφραση (+) με σκορ ≥4 .

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR (SYBR Green Μέθοδος)

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιώντας SYBR Green PCR κύριο μείγμα (Applied Biosystems) σε ένα συνολικό όγκο 20 μΐ επί 7900HT Fast Σύστημα PCR πραγματικού χρόνου (Applied Biosystems) ως εξής: 95 ° C για 30 s, 40 κύκλοι των 95 ° C για 5 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 30 s. Ένα βήμα διαχωρισμού διεξήχθη για να παραχθεί μια καμπύλη τήξης για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα της ενίσχυσης. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο αναφοράς. Τα σχετικά επίπεδα της έκφρασης του γονιδίου αντιπροσωπεύθηκαν ως γονίδιο ΔCt = Ct -Ct αναφοράς, και η πτυχή αλλαγή της γονιδιακής έκφρασης υπολογίσθηκε από την 2

-ΔΔCt μέθοδο. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν εις τριπλούν. Οι αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: MTA3 εμπρός, 5′-CCCACCCAGTCAGAAGAAGA-3 ‘, αντίστροφη MTA3, 5′-TTGGACTCCCAGTGTTTCG-3′? β-ακτίνη προς τα εμπρός, 5’-ATAGCACAGCCTGGATAGCAACGTAC-3 ‘, β-ακτίνη αντίστροφη, 5′-CACCTTCTACAATGAGCTGCGTGTG-3′? Σαλιγκάρι προς τα εμπρός, 5’-CCTCAAGATGCACATCCGAAGCCA-3 ‘, σαλιγκάρι αντίστροφη, 5′-AGGAGAAGGGCTTCTCGCCAGTGT-3′? Γυμνοσάλιαγκα προς τα εμπρός, 5’-AGATGCATATTCGGACCCAC-3 ‘, Slug αντίστροφη, 5′-CCTCATGTTTGTGCAGGAGA-3’.

Western Blot Ανάλυση

Σύνολο πρωτεΐνες από κυτταρικές σειρές εξήχθησαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης (Thermo Fisher Επιστημονική, Rockford, IL) και ποσοτικοποιούνται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο Bradford. Πενήντα μικρογραμμάρια πρωτείνης διαχωρίστηκαν με SDS-PAGE (12%). Μετά τη μεταφορά, οι φθοριούχο πολυβινυλιδένιο (PVDF) μεμβράνες (Millipore, Billerica, ΜΑ, USA) επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 4 ° C με τα ακόλουθα αντισώματα: MTA3 (1:1000? Proteintech, Chicago, IL, USA), βήτα-ακτίνη ( 1:500? Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), κυκλίνη Α (1:1000), κυκλίνη Β (1:1000), κυκλίνη D1 (1:1000), CDK2 (1:1000), CDK4 (1:1000 ), CDK6 (1:1000), και ρ-Rb (1:2000) (Cell Signaling Technology, Boston, MA, USA). Μετά την επώαση με υπεροξειδάση συζευγμένο αντι-ποντικού IgG και αντι-κουνελιού IgG (Santa Cruz Biotechnology) στους 37 ° C για 2 ώρες, οι δεσμευμένες πρωτεΐνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ECL (Thermo Fisher Scientific) και ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας bioimaging Systems (UVP Inc., Upland , CA, USA). Τα σχετικά επίπεδα πρωτεΐνης υπολογίστηκαν με βάση β-ακτίνης ως μάρτυρας φόρτωσης.

μικρό παρεμβαλλόμενο RNA Θεραπεία

Τα siRNAs να MTA3 (siRNAa, 5′-CAGUGUAGAUUAUGUGCAATT-3 ‘και siRNAb, 5 αρνητικό siRNAs ελέγχου (5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘) «-AGAUAAGCAUGCUAAAGAATT-3’) και αγοράστηκαν από Genepharma (Genepharma, Σαγκάη, Κίνα). Για επιμολύνσεις, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκα 24 h πριν από το πείραμα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τα siRNA χρησιμοποιώντας DharmaFECT 1 (0.20 μί /πηγάδι? ThermoFisher Scientific) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα επίπεδα mRNA και πρωτεΐνης αξιολογήθηκαν 48 ώρες μετά την επιμόλυνση.

Δοκιμή κυτταρικού πολλαπλασιασμού και Αποικίας Δοκιμασία Σχηματισμού

Η δοκιμασία κυτταρικού πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκε με τη χρήση κυττάρων Μετρώντας διάλυμα Kit-8 (Dojindo, Gaithersburg, MD ) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μια συγκέντρωση 5 × 10

3 κύτταρα /100 μl /φρεάτιο σε 96 φρεατίων πλάκες καλλιέργειας και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 10 μΙ κυττάρων Μετρώντας Kit-8 διάλυμα /φρεάτιο κατά την διάρκεια της τελευταίας 4 ώρες καλλιέργειας. Η οπτική πυκνότητα του φρεατίου μετρήθηκε στα 450 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη μικροπλακός. Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, τα κύτταρα φυτεύτηκαν σε τρία πιάτα κυτταρικής καλλιέργειας 6-cm (1.000 ανά πιάτου για Α549 και κυτταρικές γραμμές Η157) και επωάστηκαν για 12 ημέρες. Οι πλάκες πλύθηκαν με PBS και βάφτηκαν με Giemsa. Αποικίες με περισσότερα από 50 κύτταρα μετρήθηκαν.

Κυτταρικού Κύκλου Ανάλυση

Τα κύτταρα (500.000) σπάρθηκαν σε 6-cm πιάτα καλλιέργειας ιστού. Δώδεκα ώρες αργότερα, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με τις αναφερόμενες ποσότητες των siRNAs. Τα κύτταρα συγχρονίστηκαν μετά ασιτία ορού για 20 ώρες και τα χρονικά σημεία που λαμβάνονται σε 24 ώρες μετά την επώαση σε 10% ορό μέσα για να προσδιοριστεί αποτελέσματα επί του κυτταρικού κύκλου. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, σταθεροποιήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη, πλύθηκαν με αλατούχο φωσφορικό ρυθμιστικό διάλυμα (PBS) και χρωματίστηκαν με 5 mg ml ιωδιούχου προπιδίου /σε PBS συμπληρωμένο με RNase Α (Roche, Indianapolis, ΙΝ) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δεδομένα συλλέχθηκαν με τη χρήση της ροής BD Calibur κυτταρομετρητή.

Στατιστική Ανάλυση

SPSS έκδοση 16.0 για Windows χρησιμοποιήθηκε για όλες τις αναλύσεις. Η Chi-squared test χρησιμοποιήθηκε για να εξετάσει πιθανές συσχετίσεις μεταξύ της έκφρασης MTA3 και κλινικοπαθολογοανατομικές παράγοντες. Η μέθοδος Kaplan-Meier χρησιμοποιήθηκε για να εκτιμηθεί η πιθανότητα επιβίωσης του ασθενούς, καθώς και οι διαφορές στην επιβίωση των υποομάδων ασθενών συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας δοκιμασία log-rank Mantel του. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνετε άλλα δεδομένα. Η τιμή p βασίστηκε σε δύο όψεων στατιστική ανάλυση, και η P & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

1.. Η υπερέκφραση του MTA3 πρωτεΐνες στη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ιστοί

Αναλύσαμε την πρωτεΐνη έκφραση MTA3 σε 108 δείγματα NSCLC και των αντίστοιχων φυσιολογικών ιστών τους με ανοσοϊστοχημεία. έκφραση πρωτεΐνης MTA3 παρατηρήθηκε στα πυρηνικά διαμερίσματα των καρκινικών κυττάρων, ενώ η κανονική βρογχικό επιθήλιο εμφάνισε αρνητικό ή χαμηλή χρώση (Σχήμα 1Α-Ρ). Ερευνήσαμε τη σχέση μεταξύ της συνολικής έκφρασης MTA3 και κλινικές παραμέτρους. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, καμία στατιστική διαφορά βρέθηκε μεταξύ MTA3 υπερέκφραση και τα χαρακτηριστικά της γήρανσης (p = 0,1404), το φύλο (p = 0.8683), την κατάσταση του όγκου (ρ = 0,1556), η διαφοροποίηση (p = 0,1985) και τύπος όγκου (p = 0,0604). Ωστόσο, οι ασθενείς με υψηλή έκφραση MTA3 έδειξαν αυξημένη λεμφαδενικών μεταστάσεων (p = 0,0009) και είχε ένα προχωρημένο στάδιο NSCLC (p & lt? 0,0001). Αναλύσαμε περαιτέρω τη σχέση μεταξύ της έκφρασης πρωτεΐνης MTA3 και την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα και βρήκαν ότι MTA3 υπερέκφραση συσχετίζεται με μία μείωση στη συνολική επιβίωση (ρ & lt? 0,05) (Σχήμα 2Α). MTA3 υπερέκφραση συσχετίζεται με την κακή επιβίωση του σταδίου Ι ασθενών (ρ & lt? 0,05), αλλά όχι από ασθενείς με σταδίου ΙΙ-ΙΙΙ NSCLC (ρ = 0,17) (Σχήμα 2 Β, C)

Α.. Αρνητική χρώση σε φυσιολογικό βρογχικό επιθήλιο σε μη καρκινικά πνευμονικού ιστού. B. Αρνητικός μάρτυρας χρησιμοποιώντας ανοσοσφαιρίνη κουνελιού. Γ Ασθενής χρώση MTA3 στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Δ χρώση Ασθενής MTA3 σε περίπτωση ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα. Ε χρώση Θετική MTA3 σε περίπτωση αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. χρώση ΣΤ Θετική MTA3 σε περίπτωση ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα.

Η

Α. Το συνολικό ποσοστό επιβίωσης ήταν σημαντικά χαμηλότερη στους ασθενείς με θετική έκφραση MTA3 από ό, τι σε ασθενείς χωρίς. B. Το ποσοστό επιβίωσης σε ασθενείς με σταδίου Ι NSCLC. Γ Το ποσοστό επιβίωσης σε ασθενείς με σταδίου ΙΙ-ΙΙΙ NSCLC.

Η

2. MTA3 εξάντληση αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό στον καρκίνο του πνεύμονα Κυτταρικές Γραμμές

Η έκφραση του MTA3 αναλύθηκε μέσω στύπωσης Western και σε πραγματικό χρόνο PCR σε ένα πάνελ από καρκίνο του πνεύμονα κυτταρικών σειρών (Σχήμα 3 Α, Β). Βρήκαμε ότι το επίπεδο της έκφρασης MTA3 σε Η157 και Α549 κύτταρα ήταν υψηλότερη από ό, τι άλλες κυτταρικές lines.To διερευνήσει τη βιολογική λειτουργία του MTA3 στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα, χρησιμοποιήσαμε siRNA να knockdown

MTA3

έκφραση τόσο Η157 και Α549 κυτταρικές γραμμές. Δύο siRNAs MTA3 (α και β), στοχεύοντας σε διαφορετικές

MTA3

ακολουθίες, αξιολογήθηκαν. Η siRNAa ήταν πιο αποτελεσματικό στη μείωση του

MTA3

έκφραση? έτσι το χρησιμοποιήσαμε για περαιτέρω μελέτες (Εικόνα 3 C, D). Για να επιβεβαιωθεί η ικανότητα των siRNAa να ρυθμίζουν προς τα κάτω MTA3 (και ως εκ τούτου λειτουργίες μεταγραφική καταστολή του) εξετάσαμε επίσης την έκφραση του MTA3 κατάντη γονίδια TARGET

Σαλιγκάρι

και

Slug

. Όπως ήταν αναμενόμενο, η θεραπεία με MTA3 siRNAa ρυθμίζεται αυξητικά την έκφραση του mRNA του

Σαλιγκάρι

(Σχήμα 3Ε). CCK-8 δοκιμασία έδειξε ότι η εξάντληση MTA3 μειωμένη κυτταρική proliferaion στις δύο κυτταρικές σειρές. Ανάλυση σχηματισμού αποικίας έδειξε ότι η εξάντληση των MTA3 σε Η157 και Α549 κυττάρων οδήγησε σε σημαντική μείωση του αριθμού και του μεγέθους των εστιών (έλεγχος Α549 vs MTA3si: 275 ± 7 vs 81 ± 10? Η157 έλεγχο vs MTA3si: 476 ± 10 vs 276 ± 32), γεγονός που υποδηλώνει ότι MTA3 ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα (Σχήμα 4).

επίπεδα Α και Β Έκφραση MTA3 αναλύθηκε με στύπωμα Western και σε πραγματικό χρόνο PCR σε ένα πάνελ κυτταρικών γραμμών καρκίνου του πνεύμονα. Η ανάλυση στυπώματος Western Γ δύο αποτελεσματικότητας MTA3 siRNA σε καρκινικά κύτταρα. Δ πραγματικό χρόνο PCR ανάλυση των δύο αποδόσεων MTA3 siRNA σε καρκινικά κύτταρα. επεξεργασία Ε MTA3 siRNA υπερέκφραση του mRNA σαλιγκάρι.

Η

Α. CCK-8 δοκιμασία διεξήχθη μετά τη θεραπεία MTA3 siRNA. Η μείωση της απορρόφησης παρατηρήθηκε (ρ & lt? 0,05 την ημέρα 5 και για τις δύο Α549 και Η157). B. Αξιολόγηση της κλωνογονικού δυνατότητες των MTA3 εξαντλημένο καρκινικά κύτταρα. Οι αριθμοί των αποικιών μετρήθηκαν. Ο αριθμός των αποικιών που σχηματίστηκαν από τα κύτταρα σε επεξεργασία με MTA3 siRNA ήταν πολύ μικρότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου (ρ & lt? 0,05). Στήλες, σημαίνει? μπαρ, SD. * P & lt?. 0.05

Η

3. Η εξάντληση των MTA3 μειωτικά κυκλίνη και Κυκλίνη D1 έκφραση σε κύτταρα πνεύμονα Cancer

κυτταρικού κύκλου αναλύσεις διεξήχθησαν σε Α549 και Η157 κύτταρα με ή χωρίς MTA3 knockdown, και διαπίστωσαν ότι το ποσοστό των κυττάρων στη φάση G1 ήταν αυξημένη σε κύτταρα με MTA3 knockdown, ενώ το ποσοστό των κυττάρων στη φάση S μειώθηκε σε αυτά τα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (έλεγχος Α549 vs MTA3si: G1 φάση: 62,59% ± 0,9 έναντι 79,71% ± 1,5? S φάση: 31,27% ± 0,52 έναντι 15,21% ± 0,88? ελέγχου Η157 vs MTA3si: G1 φάση: 53.83% ± 1,4 έναντι 64.61% ± 1.8? S φάση: 32.64% ± 0,8 έναντι 18,59% ± 0,48). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εξάντληση των MTA3 επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην G1 /S όριο. Δεν υπήρχε σημαντική μεταβολή στο ποσοστό των κυττάρων G2 φάση (Σχήμα 5). Για τη διερεύνηση της υποκείμενης μηχανισμός διακοπή του κυτταρικού κύκλου, εξετάσαμε τα επίπεδα των πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον κύκλο χρησιμοποιώντας κύτταρα συλλέγονται στο ίδιο χρονικό σημείο τα κύτταρα που χρησιμοποιήθηκαν στην ανάλυση του κυτταρικού κύκλου. Δοκιμάσαμε τις επιδράσεις της MTA3 knockdown στα επίπεδα κυκλίνης Α, κυκλίνη D1, κυκλίνη Β, CDK2, CDK4, CDK6 και ρ-Rb. Ανάλυση Western blotting αποκάλυψε ότι η knockdown του MTA3 μειώνει τα επίπεδα πρωτεΐνης της κυκλίνης Α, κυκλίνη D1 και ρ-Rb έκφρασης (Σχήμα 6). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της έκφρασης MTA3 επάγει διακοπή του κυτταρικού κύκλου στη μετάβαση G1-S, καταστολή της ανάπτυξης του καρκίνου του πνεύμονα.

Το ποσοστό φάση G1 ήταν αυξημένη σε κύτταρα με MTA3 knockdown (Η157 και Α549, ρ & lt ? 0,05), ενώ τα ποσοστά της φάσης S (Η157 και Α549, σ & lt?. 0,05) μειώθηκε σε αυτά τα κύτταρα σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου

η

ανάλυση Western blot από μια σειρά παραγόντων που σχετίζονται με τον κυτταρικό κύκλο έδειξαν τα επίπεδα της πρωτεΐνης της κυκλίνης Α, D1 και π-Rb μειώθηκαν μετά την φίμωση MTA3 σε Η157 και Α549 κύτταρα, ενώ δεν υπήρξε καμία σημαντική αλλαγή της κυκλίνης Β, CDK2, CDK4 και έκφραση CDK6.

η

Συζήτηση

η ρύθμιση προς τα κάτω της MTA3 αναφέρθηκε σε καρκίνο του μαστού, καρκίνο του ενδομητρίου και των ωοθηκών [15] – [17], ενώ η προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης MTA3 έχει εμπλακεί σε ανθρώπινη χοριακή καρκίνο [21]. MTA3 υπερέκφραση χρησιμεύει ως προγνωστικός δείκτης για την αξιολόγηση της επιβίωσης των ασθενών με καρκίνο της μήτρας μη endometriod [20]. Ωστόσο, το πρότυπο έκφρασης του MTA3 καθώς και ο συσχετισμός της με κλινικά και παθολογικοί παράγοντες δεν είχαν ακόμη οριστεί στον ανθρώπινο καρκίνο του πνεύμονα. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι η έκφραση της πρωτεΐνης MTA3 σε ανθρώπινους ιστούς πνεύμονα είναι υψηλότερη από τις αντίστοιχες φυσιολογικούς ιστούς των πνευμόνων. Υπήρξε μια στενή συσχέτιση μεταξύ σταδίου MTA3 ανοδική ρύθμιση pTNM και κομβικά μετάσταση. Σημαντικά, ήμασταν σε θέση να αποδείξει ότι MTA3 συσχετίζεται με την κακή επιβίωση των ασθενών με καρκίνο του πνεύμονα. Αυτό ήταν σύμφωνα με προηγούμενα δεδομένα τα οποία έχει προταθεί ότι MTA3 παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη του καρκίνου του πνεύμονα. Για την επικύρωση ο πιθανός ρόλος των MTA3 στην ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα, ελέγξαμε πρώτο επίπεδο έκφρασής του σε διάφορες κυτταρικές σειρές και χρησιμοποιήθηκαν Α549 και Η157 κύτταρα (με σχετικά υψηλά επίπεδα MTA3) για περαιτέρω μελέτες. Χρησιμοποιήσαμε siRNA να knockdown έκφραση MTA3 σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. Βρήκαμε μια μειωμένη ικανότητα σχηματισμού ικανότητα πολλαπλασιασμού και των αποικιών στις δύο κυτταρικές σειρές μετά MTA3 νοκ ντάουν. Έτσι, η μελέτη μας υποδηλώνει ότι

MTA3

λειτουργεί ως ογκογονίδιο στην ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα.

Μια μελέτη rencent ανέφερε ότι t την εξάντληση των ενδογενών MTA3 σε πρωτογενή κύτταρα κοκκιώδη ποντίκι μειώνει σημαντικά κυκλίνης Β1 και κυκλίνης έκφραση B2, επιβραδύνει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και increaseds το ποσοστό κυττάρων σε G2 /M, το οποίο θα μπορούσε να αντιστραφεί με τη συν-έκφραση εξωγενών MTA3 [19]. Οι περισσότεροι πολλαπλασιαστικής παράγοντες επηρεάζουν την ανάπτυξη των κυττάρων, επηρεάζοντας την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Έτσι χρησιμοποιήσαμε ανάλυση του κυτταρικού κύκλου και βρέθηκε μια αύξηση στην MTA3 ανεπάρκεια κυττάρων στην φάση G1 και μία μείωση στη φάση S σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου. Η αναστολή της G1 στην S μετάβαση στην εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου μπορεί να εξηγήσει τους μηχανισμούς πίσω από επιδράσεις MTA3 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του πνεύμονα.

Για να βρείτε τους πιθανούς μηχανισμούς της MTA3 στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, εξετάσαμε την επίδραση της MTA3 νοκ ντάουν σε έναν αριθμό μορίων του κυτταρικού κύκλου που σχετίζονται. Ελέγξαμε την έκφραση των κυκλινών (Α, Β, και D1), CDK2, CDK4, CDK6 και ρ-Rb. Βρήκαμε ότι τα επίπεδα κυκλίνη, D1 και ρ-Rb μειώθηκαν μετά MTA3 knockdown. Η κυκλίνη D1 αλληλεπιδρά με Cdk4 /6 για να σχηματίσει ένα σύμπλοκο που φωσφορυλιώνει Rb και ρυθμίζει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω ελέγχου της προόδου μέσω του σημείου περιορισμό κατά την G1 φάση του κυτταρικού κύκλου [22]. Η κυκλίνη D1 υπερεκφράζεται σε μία ποικιλία καρκίνων και σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων [23] – [25]. Η κυκλίνη Α απαιτείται για το κύτταρο να προχωρήσει μέσα φάση S [26]. Η κυκλίνη Β είναι ένα μιτωτικής κυκλίνης και συσσώρευση του βρίσκεται μόνο κατά τη μετάβαση G2-M [27]. Ετσι, αποτελέσματα που δείχνουν μας μειωμένα επίπεδα κυκλίνης Α, D1, και ρ-Rb συσχετίζονται με τις μειωμένα επίπεδα κυττάρων στην S και G2 φάση και τα αυξημένα επίπεδα των κυττάρων στην G1 φάση μετά MTA3 knockdown, υποδηλώνοντας MTA3 διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.

Εν κατακλείδι, η παρούσα μελέτη βρέθηκε δείχνει ότι MTA3 υπερεκφράζεται σε NSCLC και συσχετίζεται με προχωρημένο στάδιο και κακή πρόγνωση. Η μελέτη μας δείχνει επίσης ότι η υπερέκφραση του MTA3 μπορεί να προωθήσει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου.

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς ήθελα να ευχαριστήσω τον Δρ Qingchang Li για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια του.