Αφηρημένο

STC1 είναι μια ορμόνη γλυκοπρωτεΐνη που εμπλέκονται στην ασβεστίου /φωσφορικού (Pi) ομοιόσταση. Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι STC1 είναι σφικτά συνδεδεμένες με την ανάπτυξη του καρκίνου. Όμως, η λειτουργία του STC1 στον καρκίνο δεν είναι πλήρως κατανοητός. Εδώ, βρήκαμε ότι STC1 ρυθμίζεται προς τα κάτω στο Clinical ιστούς του καρκίνου του τραχήλου σε σύγκριση με τον παρακείμενο φυσιολογικό τραχηλικό ιστούς (15 περιπτώσεις). Στη συνέχεια, η έκφραση του STC1 χτυπήθηκε κάτω από παρεμβολή RNA σε κύτταρα του τραχήλου του καρκίνου CaSki και τη χαμηλή έκφραση ανάπτυξη προωθείται κυττάρου, μετανάστευση και εισβολή. Βρήκαμε επίσης ότι STC1 υπερέκφραση ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την εισβολή του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, STC1 υπερέκφραση ευαισθητοποιημένα κύτταρα CaSki στα ναρκωτικά. Περαιτέρω, δείξαμε ότι το ΝΡ-κΒ πρωτεΐνη ρ65 συνδέεται απ ‘ευθείας με την υποστηρικτής STC1 και ενεργοποίησαν την έκφραση του STC1 σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι STC1 ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή μέσω της ενεργοποίησης p65 του NF-κΒ στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Guo F, Li Υ, Γουάνγκ J, Li Υ, Li Υ, Li G (2013 ) Stanniocalcin1 (STC1) αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και την διείσδυση των κυττάρων του καρκίνου του τραχήλου. PLoS ONE 8 (1): e53989. doi: 10.1371 /journal.pone.0053989

Επιμέλεια: Soumitro Pal, Νοσοκομείο Παίδων της Βοστόνης & amp? Ιατρική Σχολή του Χάρβαρντ, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 18, Ιούλ 2012? Αποδεκτές: 5 Δεκεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 Ιαν 2013

Copyright: © 2013 Guo et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Νο 30672352) και το Project Καινοτομίας Μεταπτυχιακή Εκπαίδευση της Κεντρικής Νοτίου Πανεπιστημίου (Νο 2.340 έως 74.334.000.006). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Stanniocalcin1 (STC1) είναι μια ορμόνη γλυκοπρωτεΐνης που εμπλέκονται στην ασβεστίου /φωσφορικού (Pi) ομοιόσταση, η οποία αρχικά ανακαλύφθηκε σε μια εκκριτική ορμόνη των σωμάτια Stannius, ένας ενδοκρινής αδένας του οστεώδη ψάρια [1]. Η STC1 θηλαστικών εκφράζεται ευρέως σε διάφορους ιστούς, συμπεριλαμβανομένων της καρδιάς, των πνευμόνων, του ήπατος, των επινεφριδίων, των νεφρών, των ωοθηκών, του προστάτη, του παχέος εντέρου και του σπλήνα [2] – [5]. STC1 παίζει ρόλο στην ποικιλόμορφη φυσιολογικών και παθολογικών διαδικασιών, συμπεριλαμβανομένης της εγκυμοσύνης, θηλασμού, αγγειογένεση, οργανογένεση, οξειδωτικό στρες, εγκεφαλική ισχαιμία, και την απόπτωση [6] – [10]. Ένα ανθρώπινο ορθόλογο του STC1 ψαριών βρέθηκε από διαφορική εμφάνιση mRNA των γονιδίων που σχετίζονται με τον καρκίνο [11]. STC1 αρχικά κλωνοποιήθηκε σε μια οθόνη για τα γονίδια σχετίζονται με τον καρκίνο. Πολυάριθμες γραμμές μελέτες έδειξαν ότι αλλαγμένη έκφραση STC1 μπορεί να έχει ένα ρόλο στην καρκινογένεση και την ανάπτυξη. Αυξημένη έκφραση του γονιδίου STC1 έχει βρεθεί σε ηπατοκυτταρικό, του παχέος εντέρου, οξεία λευχαιμία, και μυελώδη καρκινώματα του θυρεοειδούς, ωστόσο, μειωμένη έκφραση της έκφρασης STC1 βρέθηκε σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών [12] και του μαστού – [19]. Όμως, η σχέση μεταξύ του διαφορικά έκφραση STC1 σε όγκο συγκριτικά με φυσιολογικό ιστό και η βιολογική λειτουργία της χρειάζεται περαιτέρω διερεύνηση. Μερικοί μελέτη έδειξε ότι η έκφραση STC1 συμμετείχε στον σχηματισμό αγγειακού συστήματος του όγκου, και μπορεί να επάγει STC1 προσαρμοστική απόκριση στην υποξία με κανονισμό HIF σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα [20], [21]. Έχει αναφερθεί ότι αναστολέα απακετυλασών επαγόμενη κυτταρική απόπτωση περιλαμβάνει την ενεργοποίηση STC1 [22].

Παρά τη βελτίωση των γνώσεων STC1, δεν είναι ιδιαίτερα γνωστή λειτουργία του STC1 στην εξέλιξη του καρκίνου. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε το ρόλο της γονιδιακής έκφρασης STC1 στον ανθρώπινο καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Βρήκαμε ότι STC1 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στο Clinical ιστούς του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Στη συνέχεια, βρήκαμε ότι STC1 χαμηλή έκφραση προωθείται κυτταρική ανάπτυξη, τη μετανάστευση και εισβολή. Βρήκαμε επίσης ότι STC1 υπερέκφραση ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την εισβολή του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Επιπλέον, STC1 υπερέκφραση ευαισθητοποιημένα κύτταρα CaSki στα ναρκωτικά. Τα δεδομένα αυτά υποστήριξε την προ-αποπτωτική λειτουργία του STC1. Περαιτέρω, δείξαμε ότι η πρωτεΐνη ρ65 του ΝΡ-κΒ συνδέεται απ ‘ευθείας με την υποστηρικτής STC1 και ενεργοποίησαν την έκφραση του STC1 σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα.

Αποτελέσματα

STC1 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στο Clinical Ιστοί καρκίνου του τραχήλου

Για να διερευνήσουν το ρόλο της STC1 στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, εξετάσαμε πρώτα το επίπεδο έκφρασης mRNA σε 15 ζεύγη ταιριάζουν τραχήλου της μήτρας ιστών με RT-PCR. Το επίπεδο έκφρασης του mRNA σε STC1 τραχήλου καρκινικούς ιστούς μειώθηκε σε σύγκριση με τα γειτονικά κανονικές τιμές (Σχήμα 1Α και Β). Στη συνέχεια, η ανάλυση ανοσοϊστοχημείας αποκάλυψε ότι το επίπεδο πρωτεΐνης STC1 ήταν χαμηλή σε καρκινικούς ιστούς, και ενώ η αύξηση σε παρακείμενες φυσιολογικούς ιστούς, υποδεικνύοντας πιθανό ρόλο της στην εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας (Σχήμα 1 C και D).

(Α ) Το επίπεδο έκφρασης του mRNA STC1 σε καρκινικούς (Τ) και γειτονικό φυσιολογικό (Ν) συμφωνημένα τραχήλου ιστούς εξετάστηκε με RT-PCR. GAPDH χρησίμευσε ως μάρτυρας φόρτωσης. (Β) Box γράφημα οικόπεδο έδειξαν τα ποσοτικά αποτελέσματα της έκφρασης STC1 mRNA σε όλα τα ζεύγη των δειγμάτων (

σ

& lt? 0,05). επίπεδο (Γ) Πρωτεΐνη του STC1 στον όγκο και φυσιολογικούς ιστούς εξετάστηκαν με ανάλυση ανοσοϊστοχημείας. Μέγεθος bar: 100 μm. (Δ) ανάλυση Ποσότητα πρωτεϊνικό επίπεδο έκφρασης STC1. Η ένταση της αντιδραστικότητας βαθμολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τριών επιπέδων (

σ

& lt? 0,05). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών πειραμάτων διαχωρίζονται. Μια τιμή της P & lt?. 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Η

κάτω ρύθμιση των STC1 Προώθησε CaSki κύτταρα ανάπτυξη και την εισβολή

Για να μελετηθεί η βιολογική λειτουργία της STC1, δημιουργήσαμε φορέα RNAi που περιέχουν siRNA STC1 που στοχεύουν ειδικά σε σταθερά γκρεμίσουμε την ενδογενή έκφραση της STC1 σε κύτταρα CaSki. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α, σε σύγκριση με τον έλεγχο (CaSki /NC), κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA -STC1 είχαν σημαντικά μειωμένα επίπεδα STC1 mRNA ή πρωτεΐνης.

(Α) Γκρεμίζω του STC1 σε κύτταρα CaSki. CaSki κύτταρα επιμολύνθηκαν με STC1 στόχευση siRNA, και knockdown αποδοτικότητα δείχθηκε με RT-PCR και κηλίδωση Western. δοκιμασίες (Β) ΜΤΤ έδειξαν ότι η επίδραση της μειωμένης STC1 στην κυτταρική ανάπτυξη CaSki. Μετά από μία περίοδο 7 ημερών, η ανάπτυξη των κυττάρων CaSki /siRNA ήταν πολύ πιο γρήγορα από ό, τι τα κύτταρα CaSki /NC (*

ρ

& lt? 0,05). δοκιμασίας (C) σχηματισμός αποικιών κατέδειξε τον μεγάλο αριθμό των αποικιών των κυττάρων από κύτταρα CaSki /siRNA σε σύγκριση με κύτταρα CaSki /NC (

ρ

& lt? 0,05). (D) δοκιμασίες επουλωτικές των πληγών έδειξε την επίδραση του STC1 για τη μετανάστευση των κυττάρων CaSki. CaSki /κύτταρα siRNA μετανάστευσαν ταχύτερα σε σύγκριση με τα κύτταρα CaSki /NC (αριστερό πάνελ). Η σχετική απόσταση μετανάστευση κυττάρων CaSki υπολογίστηκε (δεξί πάνελ) (

ρ

& lt? 0,05). Μέγεθος bar: 100 μm. δοκιμασίες εισβολή (Ε) Matrigel έδειξε την επίδραση του STC1 στην εισβολή των κυττάρων CaSki. Ο αριθμός των κυττάρων CaSki /siRNA στην επιφάνεια του φίλτρου ήταν μεγαλύτερο από κύτταρα CaSki /NC (αριστερό πάνελ) (

ρ

& lt? 0,05). Η μέση τιμή της εισέβαλαν κυττάρων δείχνεται στο δεξιό πάνελ. Μέγεθος bar: 100 μm. (F) Οι καμπύλες ανάπτυξης των ξενομοσχευμάτων προσδιορίστηκαν με τον όγκο του όγκου (αριστερό πάνελ) (*

ρ

& lt? 0,05). Οι ρυθμοί ανάπτυξης των ξενομοσχευμάτων αποτιμήθηκαν κατ ‘όγκο του όγκου /ημέρα (δεξιά πλευρά) (*

σ

& lt? 0,05). CaSki /siRNA ή CaSki /NC κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς. (G) Στο τέλος της πειραματικής περιόδου, οι τελικές ξενομοσχεύματος όγκοι φαίνονται. (Η) RT-PCR ανέλυσε την έκφραση της STC1 σε αντιπροσωπευτικές όγκους ξενομοσχεύματος. (Ι) Αντιπροσωπευτικές εικόνες ιστολογικών επιθεώρηση των όγκων ξενομοσχεύματος. Τα τμήματα του ξενομοσχεύματος όγκων βάφτηκαν με Η &? Ε. Μέγεθος Bar: 20 μm. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών πειραμάτων διαχωρίζονται. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών πειραμάτων διαχωρίζονται. Μια τιμή της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Η

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της μειωμένης STC1 στην κυτταρική ανάπτυξη CaSki από προσδιορισμούς ΜΤΤ.. Μετά από μία περίοδο 7 ημερών, η ανάπτυξη των κυττάρων CaSki /siRNA ήταν πολύ πιο γρήγορα από ό, τι τα κύτταρα CaSki /NC, και σημαντικά υψηλούς αριθμούς κυττάρων CaSki /siRNA παρατηρήθηκαν από την ημέρα 4 (Σχήμα 2Β). Ένα παρόμοιο πρότυπο προωθούν αποτέλεσμα της μειωμένης έκφρασης STC1 σε κύτταρα CaSki επιτεύχθηκε σε δοκιμασία σχηματισμού αποικιών (Σχήμα 2C). Κατά συνέπεια, η υψηλή δραστικότητα και ένας μεγάλος αριθμός κυτταρικών αποικιών από κύτταρα CaSki /siRNA απέδειξε ότι τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης STC1 προωθούνται κυτταρικής ανάπτυξης in vitro.

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή είναι σημαντική διαδικασία της ανάπτυξης του όγκου και τη μετάσταση. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της STC1 για τη μετανάστευση των κυττάρων CaSki με την πληγή δοκιμασία επούλωσης στο σχήμα 2D. Μετά την επώαση των φυσικώς τραυματίες κυττάρων για 48 ώρες, τα κύτταρα CaSki /siRNA μετανάστευσαν ταχύτερα σε σύγκριση με κύτταρα CaSki /NC. Περαιτέρω ανάλυση των επιπτώσεων της STC1 για CaSki κύτταρα εισβολή αποκάλυψε ότι κάτω ρύθμιση των STC1 ενίσχυσε την εισβολή των κυττάρων in vitro, προσδιορίζεται με δοκιμασία Matrigel εισβολής (Σχήμα 2Ε). Η σημαντικά μεγαλύτερη απόσταση της μετανάστευσης και του μεγάλου αριθμού των κυττάρων CaSki /siRNA στην επιφάνεια του φίλτρου έδειξε ότι κάτω ρύθμιση STC1 ενίσχυσε τη μετανάστευση και την εισβολή ικανότητα των κυττάρων CaSki in vitro.

Για να καθοριστεί περαιτέρω ο ρόλος του STC1 σε ογκογονικότητα και την ανάπτυξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, τα κύτταρα CaSki /NC CaSki /siRNA ή ενέθηκαν υποδόρια σε γυμνά ποντίκια. Η ανάπτυξη του όγκου παρακολουθήθηκε επί 40 ημέρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2F, STC1 όγκοι knockdown προκύψει νωρίτερα και αναπτύχθηκε γρήγορα σε σύγκριση με τους όγκους ελέγχου. Στο τέλος της πειραματικής περιόδου, τα τελικά βάρη των STC1 νοκ ντάουν όγκων (1.417 ± 0.169 g) βρέθηκαν να είναι σημαντικά υψηλότερο από ό, τι οι έλεγχοι (0,478 ± 0,115 g) (Σχήμα 2G). RT-PCR του STC1 σε αντιπροσωπευτικές όγκους ξενομοσχεύματος υποδεικνύεται ότι μειωμένη έκφραση STC1 είχαν διατηρηθεί καθ ‘όλη την πειραματική πορεία του χρόνου (Σχήμα 2Η). Η &? Ε χρώση των όγκων knockdown STC1 έδειξε μία κυτταροπλασματική υψηλό λόγο πυρήνα /, μεγάλο, και βαθιάς χρωματισμένων πυρήνων σε σύγκριση με όγκους ελέγχου (Σχήμα 2I). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα αποδεικνύεται ότι η προς τα κάτω ρύθμιση των STC1 προωθείται in vivo την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος όγκου.

Η υπερέκφραση του STC1 ανέστειλε τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την εισβολή των CaSki κύτταρα

Δεδομένου ότι η ρύθμιση προς τα κάτω των STC1 προωθείται κύτταρα CaSki ανάπτυξη in vitro ή in vivo, υποθέσαμε ότι STC1 μπορεί ανέστειλε CaSki ανάπτυξη κυττάρων. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, κύτταρα CaSki διαμολύνθηκαν με πλασμίδιο που κωδικοποιεί STC1. Συγκρίνοντας με τον έλεγχο (CaSki /NC), κύτταρα (CaSki /STC1) επιμολυσμένα με πλασμίδιο που κωδικοποιεί STC1 είχαν αυξημένα επίπεδα STC1 mRNA ή πρωτεΐνης (Σχήμα 3Α). προσδιορισμοί ΜΤΤ έδειξαν ότι η ανάπτυξη των κυττάρων CaSki /STC1 ήταν πολύ πιο αργή από κύτταρα CaSki /NC (Σχήμα 3Β). δοκιμασία σχηματισμού αποικίας έδειξε ότι μια μικρή ποσότητα του κυτταρικού αποικιών από κύτταρα /STC1 CaSki επέδειξε χαμηλή δραστικότητα (Σχήμα 3C). δοκιμασία Matrigel εισβολή αποκάλυψε ότι πάνω ρύθμιση του STC1 μετρίασε την εισβολή των κυττάρων in vitro (Σχήμα 3D).

(Α) Η υπερέκφραση του STC1 σε κύτταρα CaSki. STC1 φορέας έκφρασης μορφομετατράπηκε σε κύτταρα CaSki, και αυξημένη έκφραση του STC1 δείχθηκε με RT-PCR και κηλίδωση Western. δοκιμασίες (Β) ΜΤΤ έδειξαν ότι η ανάπτυξη των κυττάρων CaSki /STC1 ήταν πολύ πιο αργή από κύτταρα CaSki /NC (*

ρ

& lt? 0,05). δοκιμασία σχηματισμού (C) Colony έδειξε ότι μια μικρή ποσότητα του κυτταρικού αποικιών από κύτταρα /STC1 CaSki επέδειξε χαμηλή δραστικότητα (

ρ

& lt? 0,05). δοκιμασία εισβολής (D) Matrigel έδειξε ότι πάνω ρύθμιση του STC1 μετρίασε την εισβολή των κυττάρων in vitro. Μέγεθος bar: 100 μm. (Ε) STC1 υπερεκφράζεται όγκοι εμφανίστηκαν αργότερα εξελίχθηκε σε σύγκριση με τον έλεγχο των όγκων (*

σ

& lt? 0,05). (F) στο τέλος της πειραματικής περιόδου, οι τελικές βάρη των STC1 υπερεκφράζεται όγκοι βρέθηκαν να είναι χαμηλότερες από τους ελέγχους. (G) RT-PCR του STC1 σε όγκους ξενομοσχεύματος υποδεικνύεται ότι η αυξημένη έκφραση STC1 είχαν διατηρηθεί καθ ‘όλη την πειραματική χρονική πορεία. (H) Η &? Ε χρώση STC1 υπερεκφράζεται όγκων έδειξε χαμηλή κυτταροπλασματική αναλογία πυρήνα /, και περιορίζεται στις φωλιές καρκίνο σε σύγκριση με τον έλεγχο των όγκων. Μέγεθος Bar: 20 μm. Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών πειραμάτων διαχωρίζονται. Μια τιμή της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Η

Στη συνέχεια, CaSki /STC1 ή CaSki /NC κύτταρα εγχέονται υποδόρια σε γυμνά ποντίκια.. STC1 υπερεκφράζεται όγκοι εμφανίστηκαν αργότερα και μεγάλωσε αργά σε σύγκριση με όγκους ελέγχου (Σχήμα 3Ε). Στο τέλος της πειραματικής περιόδου, τα τελικά βάρη των STC1 υπερεκφράζεται όγκων (0,285 ± 0,057 g) ήταν χαμηλότερα από τους ελέγχους (0.523 ± 0.154 g) (Σχήμα 3F). RT-PCR του STC1 σε ξενομοσχεύματος όγκους υποδεικνύεται ότι η αυξημένη έκφραση STC1 είχαν διατηρηθεί καθ ‘όλη την πειραματική πορεία του χρόνου (Εικόνα 3G). Η &? Ε χρώση STC1 υπερεκφράζεται όγκων έδειξαν μία χαμηλή αναλογία πυρηνικής /κυτταροπλασματικής, και περιορίζεται στις φωλιές καρκίνο σε σύγκριση με τον έλεγχο των όγκων (Σχήμα 3Η). Συλλογικά, αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η αυξητική ρύθμιση του STC1 ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή κυττάρων CaSki in vitro ή in vivo.

STC1 ευαισθητοποιημένων CaSki κύτταρα να Drugs

Προηγούμενα αποτελέσματα έδειξαν ότι μπορεί να αναστέλλει STC1 κυτταρικό πολλαπλασιασμό των κυττάρων CaSki. Η σισπλατίνη, θαψιγαργίνη και ραπαμυκίνη είναι φάρμακα που συνδέονται με τα κύτταρα της ανάπτυξης και της απόπτωσης. Η σισπλατίνη με βάση συνδυασμό χημειοθεραπείας έχει ευρέως χρησιμοποιηθεί στην θεραπεία των όγκων, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του τραχήλου [23]. Θαψιγαργίνη ως αποπτωτικό παράγοντα μπορεί να εμφανίζουν ουσιαστικά τον έλεγχο του όγκου βασίζεται στην ικανότητα να αναστέλλουν την ενδοκυτταρική sarco- /endoplasmtic αντλία ασβεστίου [24], [25]. Ο στόχος της ραπαμυκίνης στα θηλαστικά είναι μια σερίνη /θρεονίνη πρωτεΐνη κινάση της σηματοδοτικής οδού ΡΙ3Κ /ΑΚΤ οποία παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στον έλεγχο του καρκίνου κυτταρική ανάπτυξη, τον μεταβολισμό και την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου [26]. Στη συνέχεια, τα κύτταρα CaSki υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με με ή χωρίς σισπλατίνη (0, 1, 2, και 3 mg /L), θαψιγαργίνη (0, 1, 3, 6, και 9 μΜ), ή ραπαμυκίνη (0, 0,01, 0,1, 0,5 και 1 mg /L) για 96 ώρες ή 72 ώρες, αφαιρώντας δείγματα κάθε 24 ώρες για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. Βρήκαμε ότι η ανάπτυξη των κυττάρων CaSki ήταν αργή με την ενίσχυση του χρόνου και της συγκέντρωσης των φαρμάκων (Σχήμα 4Α-C). Για να καθοριστεί εάν η έκφραση του STC1 αυξημένης που προκαλείται από φάρμακα retard ανάπτυξη κυττάρων, CaSki /STC1 ή CaSki /NC υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορα φάρμακα, όπως η σισπλατίνη, θαψιγαργίνη και ραπαμυκίνη. Η ανάπτυξη των κυττάρων /STC1 CaSki ήταν βραδύτερη με την αύξηση του χρόνου σε σύγκριση με τα κύτταρα CaSki /NC όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με σισπλατίνη, θαψιγαργίνη ή ραπαμυκίνη (Εικ. 4D-F). Αυτά τα δεδομένα κατέδειξαν ότι η υπερέκφραση του STC1 ενίσχυσε την ευαισθησία των κυττάρων CaSki σε φάρμακα.

(Α) Επίδραση της σισπλατίνης επί CaSki ανάπτυξη κυττάρων. CaSki κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με με ή χωρίς σισπλατίνη (0, 1, 2, και 3 mg /L) για 96 ώρες, αφαιρώντας δείγματα κάθε 24 ώρες για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. (Β) Επίδραση των θαψιγαργίνη για CaSki ανάπτυξη των κυττάρων. CaSki κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με με ή χωρίς θαψιγαργίνη (0, 1, 3, 6, και 9 μΜ) για 72 ώρες, αφαιρώντας δείγματα κάθε 24 ώρες για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. (C) Επίδραση της ραπαμυκίνης για CaSki ανάπτυξη των κυττάρων. CaSki κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με με ή χωρίς ραπαμυκίνης (0, 0,01, 0,1, 0,5 και 1 mg /L) για 72 ώρες, αφαιρώντας δείγματα κάθε 24 ώρες για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων. (D) STC1 ευαισθητοποιημένα κύτταρα CaSki να σισπλατίνη. CaSki /STC1 ή CaSki /NC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σισπλατίνη (2 mg /L) για 96 ώρες. προσδιορισμοί ΜΤΤ ανίχνευσε την ανάπτυξη των κυττάρων του CaSki /STC1 ή κύτταρα CaSki /NC στο πρόσωπο της σισπλατίνης (*

ρ

& lt? 0,05). κύτταρα (Ε) STC1 ευαισθητοποιημένων CaSki να θαψιγαργίνη. CaSki /STC1 ή CaSki /NC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θαψιγαργίνη (3 μΜ) για 72 ώρες. προσδιορισμοί ΜΤΤ ανίχνευσε την ανάπτυξη των κυττάρων του CaSki /STC1 ή κύτταρα CaSki /NC στο πρόσωπο του θαψιγαργίνη (*

ρ

& lt? 0,05). (F) STC1 ευαισθητοποιημένα κύτταρα CaSki με την ραπαμυκίνη. CaSki /STC1 ή CaSki /NC κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ραπαμυκίνη (0.5 mg /L) για 72 ώρες. προσδιορισμοί ΜΤΤ ανίχνευσε την ανάπτυξη των κυττάρων του CaSki /STC1 ή κύτταρα CaSki /NC στο πρόσωπο της ραπαμυκίνης (*

ρ

& lt? 0,05). Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM τριών πειραμάτων διαχωρίζονται. Μια τιμή της P & lt?. 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Η

Απευθείας Σύνδεση του NF-κΒ p65 πρωτεΐνης σε STC1 υποστηρικτής Περιφέρειας του τραχήλου της μήτρας καρκινικά κύτταρα και ρυθμίζεται η έκφραση της STC1

Η πυρηνικός παράγοντας-κάπα Β (ΝΡ-κΒ) οικογένεια των μεταγραφικών παραγόντων ρυθμίζει την έκφραση πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμού και εισβολής γονιδίων. NF-κΒ οδός παίζει έναν κεντρικό ρόλο στην ανάπτυξη καρκίνων και καρδιαγγειακής νόσου. Ο υποκινητής του STC1 περιέχει πολλαπλές θέσεις σύνδεσης ρ65 ΝΡ-κΒ [27]. Για να ξεκινήσετε την περαιτέρω διερεύνηση των μηχανισμών μεταξύ της συσχέτισης των STC1 και p65, οι θέσεις πρόσδεσης δοκιμάστηκαν σε κύτταρα CaSki από χρωματίνης Συνανοσοκατακρήμνιση. Η περιοχή (-GGGACAAACC-) βρέθηκε να συνδέεται με το ΝΡ-κΒ ρ65 (Εικ. 5Α). Για να καθοριστεί εάν η έκφραση STC1 σε κύτταρα CaSki συσχετίστηκε με ΝΡ-κΒ, η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ ανιχνεύθηκε. Συνοδευτικά με αυξημένη δραστικότητα της PARP και κασπάσης-3, η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ ρ65 και STC1 αυξήθηκε επίσης όταν τα κύτταρα CaSki υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θαψιγαργίνη (Εικ. 5Β). TNFα ενεργοποιεί αποπτωτικά μονοπάτια κατόπιν ταυτόχρονης επαγωγής του ΝΡ-κΒ. Για να καθοριστεί εάν η έκφραση του STC1 ομοίως αυξήθηκε σε ΤΝΡα-επαγόμενη απόπτωση, τα κύτταρα CaSki υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενο χρόνο του TNFa. Η έκφραση του ΝΡ-κΒ ρ65 αυξήθηκε και η δραστηριότητα των STC1 και κασπάσης-3 ενισχύεται σε απόκριση σε ΤΝΡα (Σχ. 5C). Διθειοκαρβαμιδική πυρρολιδίνη (PDTC) είναι ένας αποτελεσματικός αναστολέας της ενεργοποίησης του ΝΡ-κΒ και καταστέλλει εξαρτώμενη ΝΡ-κΒ μεταγραφής των προ-σε fl ammatory κυτοκινών και χημειοκινών [28]. Όταν τα κύτταρα CaSki υποβλήθηκαν σε αγωγή με PDTC, η δραστικότητα του ΝΡ-κΒ ρ65 μειώθηκε και η έκφραση του STC1 κάτω-ρυθμίζονται με αυξανόμενο χρόνο της PDTC (Σχ. 5D). Επιπλέον, μετά την knockdown του p65 διεξήχθη με επιμόλυνση siRNA που στοχεύει ρ65 ΝΡ-κΒ, η υποκυτταρική έκφραση του p65 και STC1 σε κύτταρα CaSki αναλύθηκε (Σχήμα 5Ε). Η έκφραση της ρ65 σε κυτταρόπλασμα και στον πυρήνα τόσο μειωμένη, και ενώ ο ένας στον πυρήνα μειωθεί σημαντικά. Η έκφραση STC1 κάτω-ρύθμισης στον πυρήνα βρέθηκε επίσης μετά το νοκ ντάουν του p65. Το νοκ ντάουν του p65 προκάλεσε η έκφραση της p65 και STC1 τόσο μειώνεται σε επίπεδο mRNA (Σχήμα 5F).

(Α) Οι θέσεις δέσμευσης των STC1 δοκιμάστηκαν σε κύτταρα CaSki από χρωματίνης Συνανοσοκατακρήμνιση. Η θέση βρέθηκε να συνδέεται με ΝΡκΒ ρ65. (Β) Κηλίδωση Western ανιχνεύθηκαν τη δραστηριότητα της PARP, κασπάσης-3, STC1, και ΝΡ-κΒ ρ65 σε κύτταρα CaSki. CaSki κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με θαψιγαργίνη (3 μΜ) για 12 ώρες. (Γ) Western στύπωμα ανιχνεύθηκε η δραστικότητα του p65, STC1, και της κασπάσης-3 σε κύτταρα CaSki. CaSki κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αυξανόμενο χρόνο του TNFa (10 mg /L) επί 2,5 ώρες. (D) Western στύπωμα ανιχνεύεται η δραστικότητα των ρ65 και STC1 σε κύτταρα CaSki. CaSki κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με PDTC (10 μΜ) για 60 λεπτά. (Ε) Υποκυτταρική δραστηριότητα της ρ65 και STC1 σε κύτταρα CaSki αναλύθηκε με κηλίδωση Western. CaSki κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA knockdown του p65 για 72 ώρες. (F) Η έκφραση της ρ65 και STC1 σε CaSki ανιχνεύθηκε με RT-PCR στο επίπεδο του mRNA. CaSki κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA knockdown του p65 για 48 ώρες. (G) Σχηματική αναπαράσταση κάποιων ευρημάτων σε αυτό το έργο.

Η

Συζήτηση

Υπάρχουν αυξανόμενες ενδείξεις ότι STC1 είναι στενά συνδέονται με την ανάπτυξη του καρκίνου. Όμως, η έκφραση της STC1 ποικίλει σε διαφορετικούς ιστούς, ακόμα και για τον ίδιο ιστό σε διαφορετικό επίπεδο (mRNA ή πρωτεΐνης), και ως εκ τούτου η λειτουργία του STC1 μπορεί να δείξει τη διαφορά [29]. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι STC1 ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων. STC1 ρυθμίζεται προς τα κάτω στο Clinical ιστούς του καρκίνου του τραχήλου, η οποία υποδεικνύεται STC1 εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας. Στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας, η χαμηλή έκφραση του STC1 θα μπορούσε να προκαλέσει την ανάπτυξη του όγκου. Στη συνέχεια, βρήκαμε ότι STC1 χαμηλή έκφραση προωθείται κυτταρική ανάπτυξη, τη μετανάστευση και εισβολή μετά την προς τα κάτω ρύθμιση STC1 με παρεμβολή RNA σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα. Περαιτέρω, βρήκαμε επίσης ότι η υπερέκφραση STC1 ανέστειλαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και εισβολή του τραχήλου της μήτρας καρκινικών κυττάρων. Επιπλέον, STC1 υπερέκφραση ευαισθητοποιημένα κύτταρα CaSki στα ναρκωτικά. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την επιλογή που STC1 μπορεί να αναστέλλει την εξέλιξη του όγκου για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας. Η απώλεια της λειτουργίας του STC1, οι οποίες αναστέλλουν την ανάπτυξη και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων, μπορεί να οδηγήσει έως την εξέλιξη του όγκου στον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Ο υποκινητής του γονιδίου STC1 περιέχει HIF και θέση δέσμευσης NF-κΒ. Έχει αναφερθεί ότι HIF-1α συνδεδεμένο με το γονίδιο υποκινητή και p300 STC1 απαιτήθηκε για μια παραγωγική αλληλεπίδραση με HIF-1 και την προς τα πάνω ρύθμιση STC1 mRNA και έκφρασης πρωτεΐνης [30]. Chen et al βρήκαν ότι STC1 μπλοκαριστεί μερικώς ενεργοποίηση του ΝΡ-κΒ σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά στεφανιαίας αρτηρίας κύτταρα ΤΝΡ-α-θεραπεία [31]. Law et al ανέφεραν ότι ιστονών υπερ-ακετυλίωση και η πρόσληψη των ενεργοποιημένων NFκB τόνωσε τη γονιδιακή έκφραση STC1 σε ΗΤ29 κύτταρα [22]. Η σχέση μεταξύ STC1 και NF-κΒ είναι διαφορετική σε διαφορετικό τύπο ιστούς. Δείξαμε ότι η NF-κΒ πρωτεΐνη p65 συνδέεται άμεσα με την υποστηρικτής STC1 και ρυθμίζεται η έκφραση της STC1 του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. Τα αποτελέσματα αυτά έχουν τη δυνατότητα κλινικές επιπτώσεις. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η ενίσχυση της έκφρασης των STC1 θα πρέπει να είναι μια καλή στρατηγική για να αναστέλλουν τον πολλαπλασιασμό των όγκων και την εισβολή και, επίσης, θα μπορούσε να είναι μια εφικτή συνδυασμένη θεραπεία με χημειοθεραπευτικά φάρμακα για τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

Από πάνω από αυτά τα αποτελέσματα, έχουμε υποβάλει η μοντέλο για STC1 μεσολάβηση ανασταλτική της εξέλιξης του όγκου (Σχήμα 5): Μετά την ενεργοποίηση του ρ65 ΝΡ-κΒ, αυξημένη έκφραση STC1. Η αυξημένη έκφραση STC1 μειώθηκε την εξέλιξη του όγκου, και κατά συνέπεια η ευαισθησία των καρκινικών κυττάρων του τραχήλου της μήτρας με αυξημένη έκφραση STC1 στο φάρμακο χημειοθεραπείας αυξήθηκε. Έτσι, περαιτέρω μελέτες είναι να φωτιστούν βαθιά τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στην STC1 μεσολάβηση αναστολής της εξέλιξης του όγκου και να διερευνήσει περαιτέρω τι άλλα μόρια λαμβάνουν μέρος στην εξέλιξη.

Υλικά και Μέθοδοι

Δείγματα και ανοσοϊστοχημεία

οι περιπτώσεις καρκίνου του τραχήλου της μήτρας και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών ελήφθησαν σε συνδυασμό με πρωτόκολλα εγκεκριμένα από την Δευτεροβάθμια Xiangya Νοσοκομείο της Κεντρικής Νοτίου Πανεπιστημίου. Κλινικοπαθολογικοί χαρακτηριστικά από τους 15 ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας ήταν έδειξε στον Πίνακα S1. Παραφίνης τομές αποπαραφινώθηκαν με ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν σε διαβαθμισμένη αλκοόλη. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση σε υπεροξείδιο του υδρογόνου 3% σε RT για 10 λεπτά. Η μη ειδική δέσμευση παρεμποδίστηκε με PBST που περιέχει 10% ορό κατσίκας επί 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. STC1 αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology) προστέθηκε σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα και επωάστηκε στους 4 ° C όλη τη νύκτα. Μετά από τρεις πλύσεις, τα πλακίδια επωάστηκαν με Envision (ϋΑΚΟ) για 40 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Διαμινοβενζιδίνη χρησιμοποιήθηκε ως χρωμογόνο. Οι τομές με αιματοξυλίνη, αφυδατώνονται, και τοποθετημένα. Αξιολόγηση των ανοσοϊστοχημικών διαφάνειες έγινε με ένα μικροσκόπιο Nikon Eclipse E800 στα 200 × μεγέθυνση. Η ένταση της αντιδραστικότητας βαθμολογήθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα τριών επιπέδων: 0-3 (0 = καμία χρώση, χρώση 3 = 100%). Το ανοσοδραστικό σκορ του δείγματος προσδιορίστηκε με το ποσοστό των θετικών κυττάρων. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Xiangya της Ιατρικής Σχολής, την Κεντρική Νότια Πανεπιστήμιο.

Η αντίστροφη μεταγραφή-PCR (RT-PCR)

RNA που απομονώθηκε από τους ιστούς και τα κύτταρα αντίστροφα μεταγραφεί και ενισχύεται με τη χρήση της αντίστροφης ONE-STEP μεταγραφή-PCR System (Fermentas). Primer αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον Πίνακα S2. Μετά από θέρμανση στους 95 ° C για 1 λεπτό, PCRs εκτέθηκαν σε 30 κύκλους (GAPDH, 25 κύκλοι) στους 95 ° C για 30 s, 60 ° C για 30 s, και 68 ° C για 1 λεπτό και 30 δευτερόλεπτα με τελική επέκταση στους 68 ° C για 10 λεπτά. Η ολοκληρωμένη τιμή πυκνότητας (IDV) της κάθε ζώνης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Gel-Pro Image Analyzer (Bio-Rad, Hercules, Calif), και οι αναλογίες των τιμών IDV υπολογίστηκαν για να αξιολογήσει τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του mRNA.

Cell Culture

CaSki ανθρώπινου κολπικού καρκινικά κύτταρα διατηρούνται από το εργαστήριο μας και καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco-τροποποιημένο μέσο Eagle (DMEM? Gibco) συμπληρωμένο με 10% ορό βόειου μόσχου (BCS) (Gibco). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν στους 37 ° C σε ατμόσφαιρα με υγρασία αέρα με 5% CO2.

Vector Κατασκευή και κυττάρων Η επιμόλυνση

Για να γκρεμίσουμε έκφραση STC1, χρησιμοποιήσαμε pRNAT-U6.1 /Neo φορέας που κωδικοποιεί μια μικρή φουρκέτα RNA κατευθύνονται εναντίον του γονιδίου-στόχου σε κύτταρα CaSki. Οι αλληλουχίες στόχοι για STC1 ήταν 5′- TTAGTCCAGGAAGCAATAGTA -3 ‘(CaSki /siRNA). Χρησιμοποιήσαμε αρνητικός έλεγχος καθολική ως αρνητικός έλεγχος (CaSki /NC).

Για την επιμόλυνση του πλασμιδίου φορέα έκφρασης που κωδικοποιεί τον ανθρώπινο STC1 η αλληλούχιση του DNA που περιέχει το STC1 ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης που πλευρίζεται από θέσεις περιορισμού HindIII-XhoI ενισχύθηκε με PCR από κύτταρα CaSki. Primer ακολουθίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν λογική 5′-GAAAGCTTATGCTCCAAAACTCAG -3 »και αντίθετης φοράς 5′-TTCTCGAGTTATGCACTCTC ATGG -3 ‘. Το προκύπτον θραύσμα εισήχθη εντός HindIII /XhoI -precut pcDNA3.1 (+) (Invitrogen) για τη δημιουργία pcDNA3.1- STC1. Η επιθυμητή αλληλουχία επιβεβαιώθηκε με άμεση αλληλούχιση του DNA.

Για την επιμόλυνση, του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 70% συρροή και επιμολύνονται σε μέσο ελεύθερο ορού για 6 ώρες με Lipofectamine 2000 (Invitrogen) και φορέα. Μετά από 48 ώρες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, ακολουθούμενη από περιορισμένη αραίωση σε πλάκες των 96 φρεατίων για τη δημιουργία ξεχωριστών κλώνων κυττάρων. Τρεις εβδομάδες αργότερα, τα επίπεδα έκφρασης STC1 σε κυτταρικούς κλώνους που είχαν μολυνθεί με φορείς, χαρακτηρίστηκαν για την πρωτεΐνη STC1 και mRNA.

ΜΤΤ και Σχηματισμού Αποικίας

ΜΤΤ δοκιμασία διεξήχθη όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [32]. Για την δοκιμασία σχηματισμού αποικίας, κύτταρα σε 100 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες των 60 mm, όπου καλλιεργήθηκαν σε 10% FBS DMEM στους 37 ° C 5% CO2 για 3 εβδομάδες. Οι αποικίες των κυττάρων πλύθηκαν δύο φορές με PBS, σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη για 15 λεπτά και χρωματίστηκαν με Gimsa για 30 λεπτά. Ξεχωριστοί κλώνοι με περισσότερα από 50 κύτταρα μετρήθηκαν. αποδοτικότητα σχηματισμού Κλώνος για μεμονωμένες τύπο κυττάρων υπολογίστηκε, σύμφωνα με τον αριθμό των αποικιών /αριθμός εμβολιασμένων κυττάρων χ 100%.

μονόφυλλο επούλωση τραυμάτων και εισβολή Δοκιμασίες

Για μονοστιβάδα επούλωσης τραυμάτων δοκιμασίας, κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 10% FBS DMEM σε πλάκες 60 mm. Αφού τα κύτταρα έφθασαν υπο-συρροή, τα κύτταρα μονοστιβάδας τραυματίστηκαν με απόξεση από τα κύτταρα και στη συνέχεια αναπτύχθηκαν σε μέσο για 48 ώρες. Η μετανάστευσαν απόσταση των κυττάρων CaSki παρακολουθήθηκε και απεικονίζεται κάτω από ένα μικροσκόπιο. Οι αποστάσεις της κυτταρικής μετανάστευσης υπολογίστηκαν αφαιρώντας την απόσταση μεταξύ των άκρων της βλάβης στις 48 ώρες από την απόσταση που μετράται σε 0 h. Η σχετική απόσταση μεταναστευτική των κυττάρων μετράται με την απόσταση του κυττάρου μετανάστευση /της απόστασης που μετράται σε 0 h. Για την ανίχνευση εισβολής, τα κύτταρα σε 10

4 /φρεάτιο σπάρθηκαν στα ανώτερα θαλάμους σε 200 μL FBS-DMEM χωρίς και τα κατώτερα φρεάτια πληρώθηκε με 500 μL 10% FBS DMEM για την επαγωγή κυτταρικής μετανάστευσης. Μετά την επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα στην επιφάνεια του φίλτρου μονιμοποιήθηκαν με 4% φορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με 0.5% κρυσταλλικό ιώδες, και εξετάστηκαν κάτω από ένα μικροσκόπιο. Κύτταρα σε τουλάχιστον έξι τυχαία μικροσκοπικά πεδία (200 Χ) μετρήθηκαν.

Ανάλυση Western Blot

Τα κύτταρα πλύθηκαν με ψυχρό φυσιολογικό ορό ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και λύθηκαν σε ρυθμιστικό Laemmli (62,5 mM Tris-HCl, ρΗ 6.8, 2% SDS, 10% γλυκερόλη, 50 mM διθειοθρεϊτόλη και 0.01% κυανό βρωμοφαινόλης) για 5 λεπτά στους 95 ° C. Τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με SDS /PAGE και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνη διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου. Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με ειδικά αντισώματα με ένα δευτερεύον στάδιο ανίχνευσης. Οι ανοσοαντιδραστικές πρωτεΐνες αποκαλύφθηκαν από ένα κιτ ECL. στύπωμα Western διεξήχθη χρησιμοποιώντας τα ακόλουθα αντισώματα: αντι-ΡΑΚΡ αντίσωμα κουνελιού αντι-STC1 αντίσωμα (Santa Cruz Biotechnology), αντι-φωσφο-NF-κΒ αντίσωμα ρ65 κονίκλου (Cell Signaling Technology), Rabbit (Cell Signaling Technology), αντι κουνελιού εξετάστηκε -Caspase-3 αντίσωμα (Τεχνολογία Σηματοδότησης Κυττάρου).

In vivo όγκων ανάπτυξης Δοκιμασία

η επίδραση της STC1 για την ανάπτυξη των όγκων καρκίνου του τραχήλου in vivo. Κύτταρα σε 5 × 10

6 ανά ποντικό εγχύθηκαν παλιά υποδορίως σε 4 εβδομάδες Balb /c γυμνά ποντίκια (n = 4 ανά ομάδα, Σαγκάη Εργαστήριο Κέντρο Ζώων, Σαγκάη, Κίνα). Τα πειραματικά ζεύγη έγιναν σε διαφορετικά ποντίκια. Η ανάπτυξη και η ανάπτυξη των συμπαγών όγκων παρακολουθήθηκαν με μέτρηση του μεγέθους του όγκου με τη χρήση ενός παχυμέτρου κατά τυφλό τρόπο κάθε πέντε ημέρες για μια περίοδο 40-ημερών. Ο όγκος του όγκου υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας τον τύπο: Όγκος όγκου (mm

3) = πλάτος (mm)

2 χ μήκος (mm) χ 0,5 [33]. Στο τέλος του πειράματος, όλοι οι ποντικοί θυσιάστηκαν και επιμέρους βάρη των όγκων μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντίβαρο του.

χρωματίνης Ανοσοκαταβύθιση Δοκιμασίες

δοκιμασία ChIP διεξήχθη χρησιμοποιώντας το κιτ δοκιμασίας ChIP σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Upstate Biotechnology, Lake Placid, ΝΥ) και αντίσωμα έναντι του ΝΡ-κΒ ρ65 (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA). Χρωματίνης εκκινητές ανοσοκαθίζηση σχεδιάστηκαν για να ενισχύσουν ένα θραύσμα που περιέχει προαγωγέα STC1. Οι αλληλουχίες εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν φαίνονται στον Πίνακα S2.

Στατιστική Ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράστηκαν ως μέση τιμή ± SEM. Η διαφορά μεταξύ των ομάδων προσδιορίσθηκε με ανάλυση ANOVA και η σύγκριση μεταξύ των δύο ομάδων αναλύθηκε με t-test του Student χρησιμοποιώντας το GraphPad Prism έκδοση λογισμικού 4.0 (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Μια τιμή της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1..

κλινικοπαθολογικοί χαρακτηριστικά από τους 15 ασθενείς με καρκίνο του τραχήλου της μήτρας.

doi: 10.1371 /journal.pone.0053989.s001

(DOC)

Πίνακας S2.

Primer για RT-PCR.

doi: 10.1371 /journal.pone.0053989.s002

(DOC)