Αφηρημένο

Ο υποδοχέας ανδρογόνων (AR) παραμένει συμβάλλει σημαντικά στη νεοπλασματική εξέλιξη του καρκίνου του προστάτη (ΚΓΠ). CaP εξέλιξη αυτή συνδέεται με διάφορες σωματικές AR μεταλλάξεων αλλαγές που προσδίδουν από τις δραματικές ιδιότητες AR κέρδος-of-λειτουργίας. Μία από τις πιο κοινές σωματικές μεταλλάξεις εντοπίστηκαν είναι Thr877-to-Ala (T877A), που βρίσκεται στην περιοχή σύνδεσης προσδέματος, που καταλήγει σε ένα υποδοχέα ικανό αδιάκριτη σύνδεση και την ενεργοποίηση από μια ποικιλία των στεροειδών ορμονών και συνδετών, συμπεριλαμβανομένων οιστρογόνα, προγεστίνες, γλυκοκορτικοειδή, και αρκετές αντι-ανδρογόνα. Σε μια προσπάθεια για περαιτέρω προσδιορισμό σωματικών μεταλλαγμένο AR κέρδος-of-λειτουργία ιδιότητες, ως συνέπεια της promiscuous δέσμευσης συνδέτη, αναλάβαμε μια προσέγγιση ανάλυσης πρωτεομική /δικτύου για το χαρακτηρισμό της πρωτεΐνης interactome του μεταλλαγμένου T877A-AR σε κύτταρα LNCaP υπό οκτώ διαφορετικές συνδέτη ειδικές επεξεργασίες (διυδροτεστοστερόνη, μιβολερόνη, R1881, τεστοστερόνη, οιστραδιόλη, προγεστερόνη, δεξαμεθαζόνη, και οξική κυπροτερόνη). Κατά την επέκταση της ανάλυσης των πολλαπλών-συνδετήρα σύμπλοκα μας του μεταλλαγμένου T877A-AR παρατηρήσαμε σημαντικό εμπλουτισμό συγκεκριμένων συμπλοκών μεταξύ κανονικής και πρωτογενείς όγκους του προστάτη, οι οποίες επιπλέον συσχετίζεται με γνωστή κλινική έκβαση. Περαιτέρω ανάλυση ορισμένων συμπλόκων μεταλλαγμένων T877A-AR έδειξε συγκεκριμένες προτιμήσεις του πληθυσμού διάκριση πρωτοβάθμια προστάτη ασθένειας μεταξύ λευκών (μη-ισπανόφωνοι) έναντι Αφρικής και της Αμερικής άνδρες. Επιπλέον, αυτά τα σύμπλοκα AR-πρωτεΐνη σχετιζόμενη με τον καρκίνο κατέδειξε προγνωστική επιβίωση αποτελέσματα ειδικά για καπάκι, και όχι για του μαστού, του πνεύμονα, λέμφωμα ή καρκίνων μυελοβλάστωμα. Η μελέτη μας, από τα στοιχεία σύζευξης που παράγονται από πρωτεομική μας στην ανάλυση του δικτύου των κλινικών δειγμάτων, βοήθησε να καθορίσει πραγματική και τα νέα βιολογικά μονοπάτια στα πολύπλοκα συστήματα συγκρότημα AR κέρδος-of-λειτουργία

Παράθεση:. Zaman Ν, Γιαννόπουλος PN , Chowdhury S, Bonneil Ε, Thibault Ρ, Wang Ε, et al. (2014) πρωτεομικής-Μαζί-Δίκτυο Ανάλυση T877A-ανδρογόνων υποδοχέων Interactomes Μπορεί Προβλέψτε Κλινική καρκίνο του προστάτη Αποτελέσματα μεταξύ Λευκό (μη-ισπανόφωνοι) και Αφρο-Αμερικανός ομάδων. PLoS ONE 9 (11): e113190. doi: 10.1371 /journal.pone.0113190

Επιμέλεια: Mohammad Saleem, Hormel Ινστιτούτο, το Πανεπιστήμιο της Μινεσότα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 10, 2014? Αποδεκτές: τέταρτης Σεπτεμβρίου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 19 Νοεμ, 2014

Copyright: © 2014 Zaman et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα πρωτεομική στοιχεία που παρουσιάζονται στο χειρόγραφο, θα αναρτηθούν στην βάση δεδομένων μας AR υποδοχέα (https://androgendb.mcgill.ca/) ως ένα αρχείο excel, μαζί με τις συμπληρωματικές Αριθμητικά /τραπέζια που σχετίζονται με αυτό το χειρόγραφο.

Χρηματοδότηση: η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (https://www.cihr-irsc.gc.ca) επιδότηση λειτουργίας MOP-106477 (MT, MP, EW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σημαντικές εξελίξεις στη γονιδιωματική μεθοδολογία αλληλούχισης επέτρεψαν μια καλύτερη εκτίμηση της έκτασης των σωματικών μεταλλάξεων δεδουλευμένων κοινά νεοπλάσματα [1], [2]. Πιο σημαντική είναι η συνειδητοποίηση ότι οι όγκοι σημαντικά ποικίλλουν γενετικά από τον ένα ασθενή στον άλλο και μέσα σε ένα μοναδικό ασθενή υπάρχει εκτεταμένη ενδο-ογκική ετερογένεια και ενδονεοπλαστική ανομοιογένεια [3], [4], [5]. Ένας σημαντικός αριθμός από αυτές τις γενετικές αλλαγές είναι εσφαλμένου νοήματος μεταλλάξεις που προκαλούν νέα αύξηση του κύκλου λειτουργίας ιδιότητες που καθιστούν ένα συγκεκριμένο γονίδιο δυναμική στην καρκινική εξέλιξη και αναφέρονται ως μεταλλάξεις οδηγού. Μια καλύτερη κατανόηση αυτών των νέων ιδιοτήτων θα οδηγήσει σε καλύτερη ερμηνεία της ογκογένεσης, αλλά αυτό είναι δύσκολο οφείλεται σε μεγάλο αριθμό διαφορετικών μεταλλάξεων, η απρόβλεπτη φύση του κέρδους-of-λειτουργία ιδιότητες που σχετίζονται με σωματικές μεταλλάξεις, την πιθανή εκτεταμένη αλληλεπίδραση των διαφόρων σωματικές μεταλλάξεις και οι επακόλουθες διαδικασίες επιλογής που άρχισαν από το μικροπεριβάλλον ή από την ίδια θεραπεία. Τέτοια συγκρότημα «συστήματα» απαιτεί μια πιο σφαιρική προσέγγιση «-ωματικής» και ανάλυση του δικτύου, όχι την κλασική προσέγγιση μόνο γονίδιο, για να συγκεντρώσει περισσότερες κρίσιμες πληροφορίες που σχετίζονται με νεοπλασματικές εξέλιξη.

Σύμφωνα με το νέο ορίζεται μεταλλάξεων τοπίο όγκων, καρκίνου του προστάτη (CaP), έχει επίσης εκτεταμένες γενετικές αλλοιώσεις που κυμαίνονται από απλές μεταλλάξεις εσφαλμένου νοήματος, αντίγραφο παραλλαγή αριθμός, παραλλαγές ματίσματος, γενετικές αναδιατάξεις και σύντομες αλλοιώσεις DNA σε ένα μεγάλο αριθμό γονιδίων [1], [2], [6] , [7], συμπεριλαμβανομένου του υποδοχέα ανδρογόνων (

AR)

γονίδιο. Δεν είναι απροσδόκητο ότι AR μεταλλάξεις μπορεί να προσθέσει στο ρεπερτόριό της πρωτεΐνης των ισχυρών νέων λειτουργιών [8], [9] και αυτά αύξηση του κύκλου λειτουργίας χαρακτηριστικά μπορούν να επιτρέψουν το AR να λειτουργήσει σε μια παρεκκλίνουσα τρόπο. Ένας αριθμός των σωματικών μεταλλάξεων CaP AR, ειδικά η πιο συχνά εμφανιζόμενων CaP AR μετάλλαξη, Thr877Ala (T877A), έχουν μοναδικές κέρδος-of-λειτουργία ιδιότητες: μπορούν να δεσμεύουν διάφορες κατηγορίες των στεροειδών αδιάκριτα (π.χ. οιστρογόνα, προγεστίνες, γλυκοκορτικοειδή) με επακόλουθη μετενεργοποίηση ή να υπερδραστηριοποιημένο από συνήθεις συνδετήρες [10]. Classic θεραπείες αντι-ανδρογόνα [π.χ. φλουταμίδη, οξική κυπροτερόνη (CPA) ή βικαλουταμίδη] έχουν δημιουργήσει, μέσα από πίεση επιλογής, συγκεκριμένες σωματικές AR μεταλλάξεις, π.χ. Trp741Cys (W741C) και His874Tyr, με αποτέλεσμα την ανατρεπτική ΑΕ που είναι πλήρως ενεργά με αυτά τα φάρμακα [11]. Ακόμη και η επόμενη γενιά των αντι-ανδρογόνων φαρμάκων παραδειγματικά με enzalutamide (MDV-3100) προκάλεσε ειδικές AR μεταλλάξεων [12], [13]. Η παρατήρηση αυτή συσχετίζεται επίσης με μια δραματική πτώση στα επίπεδα του PSA μετά την αντι-ανδρογόνα απόσυρση [11]. Οι μεταλλάξεις T877A-AR, το οποίο είναι επίσης παρούσα σε προστάτη καρκινική κυτταρική γραμμή LNCaP, έχει αναφερθεί από διάφορα άτομα να εμφανιστούν σε 25 έως 33% των ανθεκτικών ευνουχισμού-όγκους ανδρογόνο-ανεξάρτητων ή [11], [14], [15] , [16].

Πρόσφατα, το δικό μας έργο υποδηλώνει σαφώς ότι η λειτουργία AR εκτείνεται πέρα ​​από την κλασική ρόλο της ως παράγοντας μεταγραφής και περιλαμβάνει τις νέες ιδιότητες του RNA splicing, μεθυλίωση του DNA, την αλληλεπίδραση του πρωτεασώματος και της μετάφρασης πρωτεϊνών στο πολυριβοσωματίων ίδιοι [17]. Επιπλέον, η μεγάλη λειτουργική ποικιλομορφία των συστατικών του AR συμπλοκών εξηγεί την περίπλοκη φύση της πρωτεΐνης-πρωτεΐνης αλληλεπιδράσεις που σχετίζονται με τη δημιουργία της κατάλληλης AR βιολογικής παραγωγής. Αυτές οι λειτουργίες μυθιστόρημα AR μπορεί να μεσολαβεί κυτταρικές διεργασίες και να προσφέρουν νέες περιοχές στις οποίες μεταλλάξεις σωματικών AR CaP θα μπορούσε να «επιδοθούν» και την προώθηση CaP ογκογένεση.

Σε μια προσπάθεια να περιγράψει νέα αύξηση του κύκλου λειτουργίας ιδιότητες που σχετίζονται με μεταλλαγμένο CaP ΑΕ , έγινε μια ανάλυση πρωτεομική-συζευγμένο δίκτυο. Πολλαπλές έρευνες φασματοσκοπία πρωτεωμική μάζας διεξήχθησαν με σκοπό να χαρακτηρίσει πλήρως την πρωτεϊνική σύνθεση του T877A-AR «σύμπλοκα» (interactome) κάτω από διαφορετικές κατηγορίες ορμόνης /συνδετήρα συνθήκες που αντικατοπτρίζει την ασυδοσία δέσμευσης συνδέτη που συνδέεται με T877A. Κριτικά, μεταλλαγμένο ΑΕ πώμα μπορεί να έχει τη δική του μοναδική ικανότητα να υφίστανται και να καθορίσει νέες αλληλεπιδράσεις. Η σύζευξη των δεδομένων που παράγονται από πρωτεομική μας οθόνη με ανάλυση συστημική βιολογία ήταν πολύ χρήσιμη στον καθορισμό πραγματική και τα νέα βιολογικά τελικά σημεία AR πολύπλοκα συστήματα, μέσα από την προοπτική της κλινικής νόσου.

Υλικά και Μέθοδοι

Οι κυτταρικές σειρές

Οι κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη LNCaP ελήφθη από την American Type Culture Collection (ATCC), Rockville MD.

καλλιέργεια κυττάρων, στεροειδείς ορμόνες, συνδέτες και τα πειράματα διέγερσης

LNCaP κυτταρική σειρά καλλιεργήθηκε σε RPMI 1640 μέσο συμπληρωμένο με FBS (10%), στους 37 ° C, 5% CO

2 σε πλαστικές φιάλες καλλιέργειας Τ-75. Μόλις συρροή, το μέσο αλλάχθηκε σε RMPI συμπληρωμένο με 10% ξυλάνθρακα-δεξτράνης απογυμνωμένο FBS και επωάστηκαν για επιπλέον 24 ώρες. Την επόμενη ημέρα, το μέσο άλλαξε σε φρέσκο ​​RMPI /ξυλάνθρακα-δεξτράνης απογυμνωμένο FBS όλη τη νύκτα για μελέτες ορμόνης /διέγερσης συνδέτη για μία περίοδο 18 ώρας. Τα στεροειδή ορμόνες χρησιμοποιήθηκαν στις ακόλουθες τελικές συγκεντρώσεις, 10 ηΜ διυδροτεστοστερόνη (DHT), 10 ηΜ μιβολερόνη (ΜΒ), 10 ηΜ R1881, 10 ηΜ τεστοστερόνη + 10 μΜ finasteride, 10 ηΜ 17β-οιστραδιόλη, 10 ηΜ προγεστερόνη, 10 ηΜ δεξαμεθαζόνη, και 100 ηΜ οξική κυπροτερόνη (CPA).

καθαρισμός συγγένειας και κηλίδωση Western

ολόκληρο κυτταρολύματα

LNCaP παρασκευάστηκαν με τη μέθοδο ψύξης-απόψυξης με ρυθμιστικό 1Χ PDG που περιέχει την κατάλληλη ορμόνη /συνδετήρα [18] . Τα προϊόντα λύσης στη συνέχεια μεταφέρθηκαν για α-AR συν-ανοσοκαθιζήσεις [AR (Ν20), Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA] για όλη τη νύχτα στους 4 ° C. Ένα 50% Πρωτεΐνη Α Sepharose πολτός προστέθηκε σε κάθε δείγμα και επωάστηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 90 λεπτά. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (50 mM Tris-HCl ρΗ 8,0, 150 mM NaCl, 1% Tween 20) και επαναιωρήθηκαν σε 100 μL 1X SDS ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης πηκτώματος. Τα δείγματα μετουσιώθηκαν με βρασμό, και διαχωρίστηκαν σε 10% SDS-πολυακρυλαμιδίου πριν από κηλίδωση αργύρου σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (BioRad) ή μεταφορά σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης για ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας μονοκλωνικά AR αντίσωμα (441) (NeoMarkers, Fremont, CA) .

η φασματομετρία μάζας και πεπτίδιο σύγκριση

TCEP (τρις (2-καρβοξυαιθυλ) φωσφίνη) προστέθηκε στα δείγματα πρωτεΐνης να φτάσει στην συγκέντρωση 5 mM. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 ° C για 30 λεπτά. Ένα μg θρυψίνης προστέθηκαν και τα δείγματα σε πέψη όλη τη νύχτα στους 37 ° C, στη συνέχεια ξηραίνεται κάτω σε ένα SpeedVac και επαναδιαλύεται σε 50 μΐ ACN 5% /μυρμηκικό οξύ (FA) 0,2%.

Όλοι MS αναλύσεις ήταν πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματόμετρο υβρίδιο μάζης LTQ-Orbitrap με μία πηγή νανοηλεκτροψεκασμού ιόντος (ThermoFisher, San Jose, CA) σε συνδυασμό με ένα Eksigent νανο-LC αντλία 2D (Dublin, CA) εξοπλισμένο με ένα Finnigan AS αυτόματο δειγματολήπτη (Thermo Fisher, San Jose, CA ). Είκοσι μΙ από κάθε δείγμα εγχύθηκε σε μία προστήλη C18 (0,3 mm i.d. χ 5 mm) και τα δείγματα διαχωρίστηκαν σε μια αναλυτική στήλη C18 (150 μm i.d. χ 100 mm) χρησιμοποιώντας ένα σύστημα Eksigent nanoLC-2D. Μια 76-λεπτών βαθμίδα από (Α /Β) 10-60% (Α: μυρμηκικό οξύ 0,2%, Β: ακετονιτρίλιο /0,2% μυρμηκικό οξύ) χρησιμοποιήθηκε για την έκλουση των πεπτιδίων με ρυθμό ροής ορίζεται σε 600 ηΙ /λεπτό. Η συμβατική MS φάσματα (scan έρευνα) αποκτήθηκαν σε λειτουργία το προφίλ σε ανάλυση 60.000 στα m /z 400. Κάθε πλήρες φάσμα MS ακολούθησαν τρία φάσματα MS /MS (τέσσερις εκδηλώσεις scan), όπου οι τρεις πιο άφθονο πολλαπλώς φορτισμένα ιόντα επελέγησαν για αλληλούχιση MS /MS. Πειράματα Tandem MS διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας προκαλούμενη από σύγκρουση διάσπαση στην παγίδα γραμμική ιόν.

Οι συγκρίσεις του πεπτιδίου αφθονία στα διάφορα πειραματικά παραδείγματα επετεύχθησαν χρησιμοποιώντας ετικέτας χωρίς ποσοτικούς πρωτεομική [19], [20]. Εν συντομία, οι πρώτες αρχεία δεδομένων από το λογισμικό Xcalibur μετατράπηκε σε αρχεία χάρτη πεπτιδίου που αντιπροσωπεύουν όλα τα ιόντα, σύμφωνα με τις αντίστοιχες τιμές m /z, χρόνος κατακράτησης, η έντασή τους και την κατάσταση φόρτισης. αφθονία πεπτίδιο κατόπιν αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας τις «αιχμής top» τιμές έντασης. Εντάσεις των πεπτιδίων που εκλούεται σε διάφορα κλάσματα αθροίζονται μαζί, και μόνο ένας συντελεστής διακύμανσης (CV) που επιτρέπει την μέγιστη μετάδοση ιόν θεωρήθηκε για τον υπολογισμό της έντασης πεπτίδιο. Ομαδοποίηση των πεπτιδικών χαρτών σε διάφορα σύνολα δειγμάτων πραγματοποιήθηκε με την έναρξη Mascot πεπτίδιο που σχετίζεται με τη χρήση ιεραρχικής ταξινόμησης με συγκεκριμένες ανοχές (+/- 15 ppm της μάζας του πεπτιδίου και +/- 1 λεπτό του πεπτιδίου χρόνος κατακράτησης). Κανονικοποίηση του χρόνου κατακράτησης διεξήχθη σχετικά με την αρχική σύμπλεγμα πεπτιδίου χρησιμοποιώντας μια δυναμική και μη γραμμική διόρθωση που περιορίζει την κατανομή του χρόνου κατακράτησης σε λιγότερο από 0,1 λεπτά κατά μέσο όρο. αλλαγές αναπαραγωγιμότητα σε αφθονία σε όλη συνθήκες προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα δύο-ουρά homoscedastic

t-test

για δείγμα αναπαράγεται για τον εντοπισμό συστάδες πεπτίδιο με

p-τιμές

& lt? 0.1 με φορές οι αλλαγές είναι μεγαλύτερη από 7 πρότυπο αποκλίσεις. Πεπτίδιο συμπλέγματα που πληρούν αυτά τα κριτήρια επιλογής επιθεωρήθηκε με το χέρι για να επικυρώσει την αναγνώριση και τις αλλαγές στην αφθονία. αναλύσεις έκφρασης διεξήχθησαν σε πρωτεΐνες που προσδιορίζονται από τουλάχιστον δύο διαφορετικές αλληλουχίες πεπτιδίων. Οι τιμές έκφρασης και η σχετική τυπική απόκλιση αποκτήθηκαν από το μέσο όρο των διαφορών έντασης και οι τυπικές αποκλίσεις των τεσσάρων πιο έντονη πεπτίδιο τρίδυμα μετά την αφαίρεση των απομακρυσμένων πεπτίδιο συμπλέγματα. Ομαλοποιημένη πρωτεομικά δεδομένα μπορούν να βρεθούν στον Πίνακα S1.

Σύνολα για την κατασκευή του δικτύου και την έκφραση του γονιδίου ανάλυση

Όλα αλληλεπιδρούν AR δόθηκαν αναγνωριστικά γονίδιο NCBI. πληροφορίες ανθρώπινη αλληλεπίδραση πρωτεΐνης συντάχθηκε από διάφορες πηγές δεδομένων και βάσεων δεδομένων σχολιασμού, όπως βάση δεδομένων του δικτύου Βιομοριακών Αλληλεπίδραση (BIND), η βάση δεδομένων των πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν (DIP), ανθρώπινη πρωτεΐνη Βάση Δεδομένων Αναφοράς (HPRD), άθικτο, και Μοριακής βάση δεδομένων αλληλεπίδρασης (ΜΕΝΤΑ), τα περισσότερα από τα οποία περιέχουν την επιμέλεια στοιχεία αλληλεπίδρασης και δεδομένων υψηλής απόδοσης. Έχουμε δημιουργήσει μια μεταδεδομένα των πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων με τη συγχώνευση αυτών των δεδομένων με το δικό μας το χέρι σε επιμέλεια του δικτύου των ανθρωπίνων σηματοδότησης που περιέχει 4.000 πρωτεΐνες και 22.000 σχέσεις σηματοδότησης [21], [22], [23].

Ένα δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης κατασκευάστηκε για κάθε ορμόνη που χρησιμοποιούν χειροκίνητα επιμέλεια δίκτυο αλληλεπίδρασή μας δίκτυο ανθρώπινη σηματοδότησης και της πρωτεΐνης-to-πρωτεΐνη. Το μόνο που θεωρούνται πρωτεΐνες που ήταν ≥2.5 φορές η αφθονία κατάσταση ορμόνη (σήμα) έναντι της αφθονίας ελέγχου του οχήματος από το σύνολο δεδομένων MS, πρέπει να θεωρούνται σημαντικά παρόντες. Στο δίκτυο, ένας κόμβος και σύνδεσμος αντιπροσωπεύουν την πρωτεΐνη και η αλληλεπίδραση, αντίστοιχα. Για να βρείτε τα εξαιρετικά διασυνδεδεμένο περιοχές του δικτύου, για κάθε ορμόνη, που σημείωσε κάθε ζεύγος αλληλεπίδρασης με βάση τον αριθμό των γειτονικών κόμβων που έχουν στο κοινό. Αυτό μας έδωσε μια μήτρα με όλες τις βαθμολογίες μεταξύ όλων των ζευγών αλληλεπίδραση. Ιεραρχική ομαδοποίηση εφαρμόστηκε στη μήτρα και μια ελάχιστη βαθμολογία υπολογίζεται με βάση την πυκνότητα του διαμερίσματος που μας επιτρέπει να εντοπίσει τα ιδιαίτερα διασυνδεδεμένων περιοχών (clusters) για καθένα από τα δίκτυα των ορμονών.

Στη συνέχεια, χρησιμοποιήσαμε αυτά τα συμπλέγματα πρωτεϊνών και προσδιορίζονται GO-όρους (https://www.geneontology.org/) που σχετίζονται σημαντικά με κάθε μία από τις συστάδες πρωτεΐνης (τιμή-ρ & lt? 0,05, υπερ-γεωμετρικού). Χρησιμοποιήσαμε επίσης Γονιδιακή Ρύθμιση Ανάλυσης εμπλουτισμού (GSEA) ορίζεται μονοπάτια και εκτελούνται GSEA εάν το 25% των γονιδίων του συμπλέγματος πρωτεϊνών ήταν στην οδό. Για τις οδούς και GO-όροι που ήταν σημαντικά από τα αποτελέσματα GSEA (τιμή p & lt? 0.05), κάναμε επίσης ανάλυση επιβίωσης. Χρησιμοποιήσαμε γονιδίων που σχετίζονται με αυτούς τους GO-όρους και εκτελούνται GSEA χρησιμοποιώντας GSE21034 [24].

εκχυλίσεις RNA και ανάλυση μικροσυστοιχιών

LNCaP κύτταρα διεγέρθηκαν με πάνελ συνδέτες, όπως περιγράφεται παραπάνω, και το ολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας TRIZOL (Invitrogen, Carlsbad, CA). RNA δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Κεμπέκ Γονιδιώματος Κέντρο Καινοτομίας (Πανεπιστήμιο McGill, Μόντρεαλ, Καναδάς), για την ανάλυση μικροσυστοιχιών με Illumina Ανθρωπίνων HT-12 Έκφραση Beadchip v4 (Illumina, San Diego, CA). Πρώτες δεδομένα υπέστησαν επεξεργασία χρησιμοποιώντας R [22], [25].

Δύο παγκόσμια θερμικούς χάρτες έγιναν. Ο πρώτος θερμικός χάρτης περιλαμβάνει το πιο διαφορικά εκφραζόμενο γονίδιο για κάθε ορμόνη χρησιμοποιώντας t-test (ρ-τιμή & lt? 0,05), όπου κάθε ορμόνη συγκρίνεται έναντι όλων των άλλων. Η δεύτερη θερμικός χάρτης περιλαμβάνει τα 10, 20, 50 και 100 γονίδια με τη μεγαλύτερη διακύμανση. Το t-test βρίσκει τις πιο διαφορικά εκφρασμένα γονίδια που είναι ειδικά για κάθε ορμόνη, ενώ η διακύμανση μας βοηθά να παρατηρήσουμε τα γονίδια που εκφράζονται διαφορικά σε πολλές ορμόνες. ανάλυση GSEA διεξήχθη χρησιμοποιώντας GSE21034 [24], από τα 10, 20, 50 και 100 γονίδια που έδειξαν την υψηλότερη διακύμανση.

Progression and Survival Analysis

προφίλ γονιδιακής έκφρασης, τα δεδομένα επιβίωσης των ασθενών, και δημογραφικές πληροφορίες για τα 267 κλινικά δείγματα προστάτη (29 κανονικό, 181 πρωτογενείς και μεταστατικούς όγκους 37) ελήφθησαν από GSE21034 [24]. Του μαστού, του πνεύμονα, του λεμφώματος και μυελοβλάστωμα σύνολα δεδομένων ελήφθησαν από το Ινστιτούτο Broad (https://www.broadinstitute.org/cgi-bin/cancer/datasets.cgi) [26]. Εξετάσαμε τις μετα-ριζική προστατεκτομή προγνωστικό αξίες ενός υποδικτύου με βάση τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης των πρωτοπαθών όγκων, και πραγματοποιείται ανάλυση Kaplan-Meier από την εφαρμογή του τεστ Cox-Mantel log-rank χρησιμοποιώντας R όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22], [25]. Εάν η p-τιμή είναι μικρότερη από 0,05, το υποδίκτυο θεωρήθηκε ως στατιστικά σημαντική για την ταξινόμηση των όγκων σε μη μεταστατικό και μεταστατικούς όγκους. Εμείς στρωματοποιημένη επαναλαμβανόμενες εναντίον μη επαναλαμβανόμενα καρκίνου CaP με βάση τα ακόλουθα κριτήρια: PSA (≥4 ng /mL), Gleason (≥7), Tumor Στάδιο (≥3) και σε συνδυασμό (PSA + Gleason + Tumor)

.

δομή Προετοιμασία για MD προσομοίωση

Η δομή κρυστάλλου της DHT (1I38) και CPA (2OZ7) δεσμεύεται να T877A μεταλλαγμένο AR-LBD και τεστοστερόνης (2AM9) και R1881 (1E3K) συνδεδεμένο με άγριου τύπου AR- LBD είναι διαθέσιμες στην Τράπεζα δεδομένων Πρωτείνης (ΠΠ). Τα συμπλέγματα των διαφόρων συνδετήρες που συνδέονται με την T877A μεταλλαγμένο AR-LBDs ήταν ακόμη έτοιμη για προσομοιώσεις MD χρησιμοποιώντας Xleap [27] στο AMBER10 [28]. Η γενικευμένη δυναμικό πεδίο AMBER (καμάκι) και ff99SB [29] παράμετροι που χρησιμοποιούνται για οκτώ διαφορετικούς συνδετήρες. Το συγκρότημα ήταν διαλυμένες σε ένα ακρωτηριασμένο οκτάεδρο TIP3P [30] κουτί νερό. Η απόσταση μεταξύ του τοιχώματος του κουτιού και του πλησιέστερου άτομο της διαλυμένης ουσίας ήταν 12,0 Α, και το πιο κοντινό απόσταση μεταξύ διαλυμένης ουσίας και διαλύτη άτομα ήταν 0,8 Α. Αντίθετα ιόντα (Cl

-) προστέθηκαν για να διατηρηθεί η ηλεκτρική ουδετερότητα του συστήματος. Κάθε σύστημα ελαχιστοποιούνται, για πρώτη φορά από την εφαρμογή αρμονική περιορισμούς με δύναμη σταθερές των 10 kcal /mol /a

2 σε όλα τα άτομα διαλυμένης ουσίας? δευτερόλεπτο, με θέρμανση από 100 έως 300 Κ πάνω από 25 ps στο κανονικό σύνολο (NVT)? και, τέλος, με εξισορρόπηση για να ρυθμίσετε την πυκνότητα του διαλύτη υπό πίεση 1 atm πάνω από 25 ps στο σύνολο (NPT) προσομοίωση ισοθερμικό-ισοβαρή. Οι αρμονικές περιορισμών στη συνέχεια σταδιακά μειώνεται στο μηδέν με τέσσερις γύρους των 25 ps NPT προσομοιώσεις. Μετά από πρόσθετη προσομοίωση 25-ps, ένα τρέξιμο παραγωγής 15 ns λήφθηκε με στιγμιότυπα συλλέγονται κάθε 1 ps. Για όλες τις προσομοιώσεις, χρησιμοποιήθηκαν 2 fs χρονικό βήμα και 9 ένα μη συνδεδεμένο cut-off. Το σωματίδιο ματιών Ewald μέθοδο [31] χρησιμοποιήθηκε για τη θεραπεία ηλεκτροστατική μεγάλου βεληνεκούς και ομολόγων μήκη που αφορούν ομόλογα για άτομα υδρογόνου περιορίζεται από SHAKE [32].

Αποτελέσματα

Συγκριτική δίκτυο χαρακτηρισμό T877A -AR συγκροτήματα: μελέτες interactome και γονιδιακής έκφρασης

η ικανότητά μας να συλλάβει τόσο συνδέτη-δεσμεύεται και unliganded πλήρους μήκους άγριου τύπου AR με χρωματογραφία συγγένειας υπό φυσιολογικές συνθήκες έχει ήδη μας επέτρεψε να ακολουθήσει μια προσέγγιση πρωτεωμικής προκειμένου να χαρακτηρίζουν τα συστατικά των συμπλοκών AR άγριου τύπου. Αυτό έγινε με υποβολή αυτών των συμπλοκών να τρυπτική πέψη που ακολουθείται από φασματομετρία μάζας (MS) για την εκχώρηση ταυτοποίηση πρωτεϊνών, στην πραγματικότητα δημιουργεί interactomes AR αρχίζει με την δέσμευση συνδέτη [33]. Για δεδομένα MS μας, μία ποσοτική μέθοδος ετικέτας χωρίς έχει τώρα εφαρμοστεί στις διάφορες πειραματικά παραδείγματα (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) [19], [20], η οποία μας επέτρεψε να ληφθούν δεδομένα που σχετίζονται με την ταυτοποίηση πρωτεϊνών, μαζί με την αφθονία, έτσι επιτρέποντας άμεσες συγκρίσεις μεταξύ των συνθηκών διέγερσης.

Ο στόχος της διαφορικής συνθήκες ορμόνης διέγερσης θα μας επιτρέψει να διαπιστωθεί αν η αιτιολογία της νόσου της μετάλλαξης T877A-AR εξαρτάται από την κατάσταση συνδετήρα και συν-παράγοντα. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε LNCaP κύτταρα που εκφράζουν ενδογενώς τη μετάλλαξη T877A-AR για το χαρακτηρισμό των συνδέτη promiscuous σύμπλοκα πρωτεΐνης interactome υπό διαφορετικές ορμονικές συνθήκες, με σκοπό να αναδείξει τις πιθανές ξεχωριστά σύμπλοκα που μπορεί να συνδέεται με την εξέλιξη της νόσου. LNCaP κύτταρα διεγέρθηκαν με τα ακόλουθα ορμόνες, τέσσερα ανδρογόνα: DHT, μιβολερόνη (ΜΒ), R1881, ή η τεστοστερόνη (παρουσία του finasteride (για την πρόληψη της μετατροπής της τεστοστερόνης σε DHT), ή 17β-οιστραδιόλη, προγεστερόνη, δεξαμεθαζόνη, ή το αντι-ανδρογόνο κυπροτερόνη οξικός (CPA), μόνο ή με μη συνδέτη ελέγχου /αλκοόλης-όχημα. Hormone διεγείρεται σύμπλοκα T877A-AR ανοσοκαθαρίστηκαν με ένα Ν-τερματικό αντίσωμα ειδικό AR, το οποίο δεν θα παρεμβαίνει με συνδέσεως ορμόνης προς το συνδετήρα AR που δεσμεύουν τον τομέα. τα εκλούσματα από όλες τις πειραματικές συνθήκες αναλύθηκαν με LC-MS /MS. για να αυξηθεί η συχνότητα του δείγματος μας για ανίχνευση πεπτιδίου σε ανάλυση MS μας, κάθε πειραματική συνθήκη εκτελέστηκε τέσσερις φορές. δεδομένα πρωτεομική μας είναι μια συλλογή από μόνο πλήρως χαρακτηρισμένες πρωτεΐνες, με πλήρη γονίδιο οντολογία και τη λειτουργία.

δεδομένα Ποσοτική MS, για καθεμία από τις οκτώ συνθήκες ορμόνη διέγερσης, χρησιμοποιήθηκε για τη δημιουργία ενός χάρτη αλληλεπίδραση πρωτεΐνης (Εικόνα 1Α). Ο χάρτης δίκτυο αλληλεπίδραση πρωτεΐνης, επιτρέπει την μια οπτική ανάλυση της σχέσης της αλληλεπίδρασης του κάθε πρωτεΐνης με το μεταλλαγμένο AR. Το πιθανότερο είναι ότι δεν είναι όλα πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν άμεσα με το μεταλλαγμένο AR, αλλά μπορεί μέσω ενδιάμεσων πρωτεϊνών. Περαιτέρω οντολογικές ταξινόμηση λειτουργία (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) βασίζεται σε αυτή την αλληλεπίδραση χάρτη δικτύου, με απαιτητικούς σημαντικές συστάδες πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν με βάση τον αριθμό των συνδέσεων αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Από τις οκτώ ορμόνης διέγερσης λίστες πρωτεΐνη T877A-AR, μπορούμε στη συνέχεια εφαρμόζονται συστημικά ιεραρχική ανάλυση συστάδων για τις πειραματικές συνθήκες. Ιεραρχική ομαδοποίηση θερμότητα χάρτες που απεικονίζουν την ομαδοποίηση των μεταξύ σύνολό αγωνιστή T877A-AR και ανταγωνιστή πειραματικές θεραπείες τότε δημιουργείται (Εικόνα 1Β). Μεταξύ των διαφορετικών πειραματικών συνθηκών (ορμονικές θεραπείες), μια συγκριτική ανάλυση του δικτύου εφαρμόστηκε [21], [22], [23], και παρόλο που τέσσερα διαφορετικά ανδρογόνα χρησιμοποιήθηκαν (DHT, τεστοστερόνη, MB και R1881), τα πρωτεομική προφίλ αυτών ανδρογόνων συνδέτες δεν διαχωρίζουν μεταξύ τους, και παρατηρήσαμε ότι η προγεστερόνη και δεξαμεθαζόνη AR συγκροτήματα έχουν πρωτεομική προφίλ που μοιάζουν με R1881 και MB, αντίστοιχα. Επιπλέον, η σύνθετη αλληλεπίδραση πρωτεΐνης για AR-οιστραδιόλης-διεγείρονται συγκροτήματα ήταν πιο παρόμοιο με το AR-DHT interactome απάντηση.

Α. Ποσοτικοποιημένους δικτύου πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεων της DHT διεγερμένα κύτταρα LNCaP. Η αξία της κάθε πρωτεΐνης, που ορίζεται από την ετικέτα χωρίς ποσοτικούς MS μας, διακρίνεται τόσο από το χρώμα και το μέγεθος, και υπο-ακολουθών αλληλεπιδράσεις μεταξύ πρωτεϊνών. Το AR ορίζεται από τον μαύρο κύκλο. Για να προσδιοριστεί η σχέση μεταξύ της αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης και τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης, ιεραρχική συσταδοποίηση των κυττάρων LNCaP ορμόνης διεγερμένα πολλαπλών πάνελ διεξήχθη. B. Η αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών προσδιορίζονται με φασματομετρία μάζας. C. Οι περισσότεροι εξέφρασαν μεταβλητά γονίδια κατά τη διέγερση προσδέματος. Αν και έχει προταθεί ότι όλες οι ορμόνες που χρησιμοποιούνται είναι σε θέση να ενεργοποιήσουν εξαρτώμενων από ανδρογόνα γονιδίου μεταγραφής με τον μεταλλαγμένο υποδοχέα T877A-AR, υπάρχουν διαφορές μεταξύ σύμπλοκα πρωτεΐνης AR και πρότυπα έκφρασης γονιδίου AR. Αυτή η ανάλυση διασποράς δείχνει ότι ακόμη και τα συνθετικά ανδρογόνα όπως Mibolerone (MB) και R1881, έχουν παρόμοια προφίλ γονιδιακής έκφρασης, συμπλέγματα πρωτεϊνών-αλληλεπίδρασή τους είναι πιο παρόμοια με δεξαμεθαζόνη (ΡΕΧ) και προγεστερόνης (PGR), αντίστοιχα, από το να είναι είτε φυσικά ανδρογόνα τεστοστερόνης και DHT. Επιπλέον, ακόμη και τα φυσικά ανδρογόνα (DHT και η τεστοστερόνη) μπορεί να διαχωρίζονται με συμπλέγματα πρωτεϊνών τους. Αυτό θα σήμαινε ότι υπάρχουν λειτουργίες για το AR πέρα ​​γονίδιο διενεργοποίηση. Οι τιμές πρωτεϊνών και γονιδιακή έκφραση δίνεται ως λόγος των ποσοτικοποιημένων πρωτεΐνης κάθε διέγερση εναντίον διέγερση ελέγχου του οχήματος.

Η

Προχωρήσαμε επίσης να χαρακτηρίσει τα πρότυπα γονιδιακής έκφρασης της πολυ-πίνακα ορμόνη διεγερμένα κύτταρα LNCaP. Η ανάλυση των πιο μεταβλητά εκφρασμένων γονιδίων μεταξύ των συνθηκών ορμόνη έδωσε ένα ιεραρχικό μοντέλο ομαδοποίησης που ήταν πολύ διαφορετικό από το προφίλ πρωτεΐνης-αλληλεπίδραση T877A-AR (Σχήμα 1 C). Σαφέστατα, έχουμε και πάλι παρατηρήθηκε ότι οι διαφορετικές ανδρογόνα που χρησιμοποιούνται σε αυτά τα προφίλ διέγερση δεν διαχωρίζουν μεταξύ τους, και ότι τα συνθετικά ανδρογόνα, όπως R1881 και ΜΒ, δεν έχουν τις ίδιες AR-διεγερμένα προφίλ μετενεργοποίηση όπως τα φυσικά προσδέματα όπως η τεστοστερόνη και DHT. Επιπλέον, οι λειτουργικές οντολογικές ιδιότητες μεταξύ πρωτεΐνης-αλληλεπίδρασης εναντίον προφίλ γονιδιακής έκφρασης των διαφορικών συνδέτη μας διεγερμένα κύτταρα φαίνεται επίσης να είναι πολύ διαφορετική. Διακρίνοντας την επίδραση στην εξέλιξη της νόσου από αυτά τα προφίλ ήταν ιδιαίτερου ενδιαφέροντος.

Για να διαπιστωθεί στατιστικά σημαντικές βιολογικές λειτουργίες, υλοποιήσαμε την ενσωμάτωση των γονιδίων Οντολογικές (GO) /μονοπάτια όρους χρησιμοποιώντας DAVID (βάση δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη ανακάλυψη, https://david.abcc.ncifcrf.gov/). Χρησιμοποιώντας τα δεδομένα αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης από όλες τις συνθήκες διέγερσης συνδέτη, οι μεγάλες οντολογικές λειτουργίες είναι: RNA ροΙ II εξαρτώμενη μεταγραφή, βιοσύνθεση πρωτεΐνης, με συστατικά του μεταφραστικού μηχανισμού (έναρξης μετάφρασης, παράγοντες επιμήκυνσης, ριβοσωμικές πρωτεΐνες και άλλες ρυθμιστικές πρωτεΐνες), RNA μεταβολισμού (ειδικά RNA splicing), την επιδιόρθωση του DNA (μέσω αλληλεπίδρασης με τα μέλη του συμπλέγματος επιδιόρθωσης του DNA), και τα μονοπάτια του πρωτεασώματος /ουβικιτινίωση (βλέπε πίνακα S2). Σε αντίθεση, το πρότυπο έκφρασης γονιδίου που εξαρτάται από συνδέτη οντολογικές κατηγορίες περιλαμβάνονται οδών που εμπλέκονται στην αντιγραφή του DNA, βιοσύνθεση στεροειδών /στερόλη, και την απόπτωση (βλέπε πίνακα S3). Έτσι, αν και το AR είναι κλασικά περιγράφεται ως παράγοντας μεταγραφής, το προφίλ πρωτεώματος της θα δείχνουν ότι το AR είναι ικανές για λειτουργίες πέρα ​​από αυτό που είχε αρχικά περιγραφεί σαν ένας ενεργοποιητής γονίδιο.

Δομική ανάλυση της αυξητικής δέσμευση στον T877A -AR

για να διερευνήσει τις πιθανές μηχανισμούς με τους οποίους συνδετήρες σύνδεσης με το μεταλλαγμένο AR δημιουργηθούν διαφορετικές σειρές AR πρωτεϊνών που αλληλεπιδρούν, πήραμε τη λεπτομερή διαμόρφωση του υποδοχέα, με τη χρήση 15 ns μοριακής δυναμικής (MD) μελέτες προσομοίωσης (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) από τα οκτώ διαφορετικούς συνδέτες χρησιμοποιούνται. Χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα σύνδεσης WILMA (Σχήμα 2), λάβαμε δομικά δεδομένα του μεταλλαγμένου AR δεσμεύονται με προγεστερόνη, το οιστρογόνο, δεξαμεθαζόνη και MB. Τα δομικά στοιχεία του μεταλλαγμένου AR με την τεστοστερόνη, DHT, R1881 και οξική κυπροτερόνη είναι ήδη διαθέσιμα και ως εκ τούτου, οι δομές αυτές χρησίμευσαν ως σημεία εκκίνησης για τις μελέτες προσομοίωσης MD.

πρόγραμμα σύνδεσης χρησιμοποιήθηκε WILMA να εξετάσει τις διαρθρωτικές μεταβολές του πεδίου σύνδεσης συνδετήρα της μετάλλαξης T877A, κατά την σύνδεση προς ρίζας συνδέσεως. Εικονογραφημένη είναι η μέση δομή των T877A-AR υποκαταστάτη μετάλλαξη πεδίο σύνδεσης με οκτώ διαφορετικούς συνδετήρες. Α τεστοστερόνη, Β DHT, Γ R1881, Δ MB, Ε οιστρογόνων (EST), ΣΤ προγεστερόνης (PGR), Γ CPA, Η δεξαμεθαζόνη (ΡΕΧ). Ένα κόκκινο κουτί αναδεικνύει τις αλλαγές στο α έλικα 11 βρόχο κατά τη σύνδεση σε κάθε συνδέτη ορμόνη.

Η

Mutant AR MD προσομοιώσεις πραγματοποιήθηκαν πάνω από 15 ns τρεξίματα παραγωγής. Για να επιθεωρήσει την τοπική ευελιξία του κάθε συμπλόκου πρωτεΐνης /ορμόνης, υπολογίσαμε τις διακυμάνσεις ρίζα-μέση τετραγωνική απόκλιση (RSMD) ατόμων ραχοκοκαλιά της κάθε υπόλειμμα αμινοξέος για κάθε μεταλλάκτη συγκρότημα AR. Στη μελέτη των σφαιρικών διαμορφώσεις πρωτεΐνης, μία μετρά συνήθως την ομοιότητα στην τρισδιάστατη δομή η RMSD των κεντρικών ατόμων άνθρακα σε αμινοξέα, μετά τη βέλτιστη άκαμπτο υπέρθεση σώμα. Οι πιο σημαντικές διακυμάνσεις αντιστοιχούν σε περιοχές βρόχο μεταξύ α3 /α4, α9, α10 /α11 και α11 /α12 και τις έλικες Α11 και Α12 ίδιοι του LBD του AR (Σχήμα 3). Μπορεί να φανεί ότι ο βρόχος μεταξύ α9, α10 και α11 είναι η πιο εύκαμπτη περιοχή σε όλα τα συμπλέγματα (Σχήμα 3Β). Μεταξύ των οκτώ διαφορετικά συνδεδεμένα σύμπλοκα προσδέματος AR, ο τεστοστερόνης-οιστραδιόλης και συμπλέγματα δεσμευμένου επιδεικνύουν την υψηλότερη ευελιξία, με μερικά υπολείμματα βρόγχο ο οποίος έχει διακυμάνσεις RMSD τόσο υψηλές όσο 2.4 Å. Αν και αυτές οι βρόχοι είναι απομακρυσμένα από την θύλακα σύνδεσης ορμόνης, αυτά είναι εκτεθειμένα στην επιφάνεια και μπορεί να εξυπηρετεί ένα ρόλο ως πιθανές θέσεις σύνδεσης με άλλους εταίρους πρωτεΐνη.

A. Υπέρθεση μέσος δομές όλων των συμπλοκών οκτώ συνδετήρα που συνδέεται υποδοχέα. Β Περιφέρειες της T877A AR-LBD βρόχο μεταξύ Helixα9 και Helixα10 έδειξε μέγιστη ευελιξία. Γ Διευρυμένη άποψη του Helix α11 και α12 Helix περιοχές T877A AR-LBD συνδέεται με οκτώ διαφορετικούς συνδέτες που μελετήθηκαν στη μελέτη αυτή. Κατάλοιπα α11 και α12 και βρόχο μεταξύ τους έδειξαν μεγαλύτερη ευελιξία σε σύγκριση με άλλες περιοχές του υποδοχέα, όπου βρίσκεται T877A. Χρώμα αντιστοιχεί στις παρακάτω υποκαταστάτες:. Πράσινη – τεστοστερόνη, Cyan- DHT, κίτρινο-R1881, ροζ-MB, ρόζ-EST, γκρι-PGR, Orange-CPA, Purple-DEX

Η

Το άλλο σημαντικές διαφορές που παρατηρήθηκαν μεταξύ των μεταλλαγμένων AR σύμπλοκα είναι οι θέσεις του α11 και 12, τα οποία είναι γνωστό ότι είναι κρίσιμης σημασίας για την υπαγόρευση αλληλεπιδράσεις συνδέσεως ορμόνης και συν-ενεργοποιητή. Κατάλοιπα α11 και α12 και το βρόχο μεταξύ τους έδειξαν μεγαλύτερη ευελιξία (Σχήμα 3C). Η μετάλλαξη T877A-AR βρίσκεται στην α11 επιτρέπει μια πιο ευρύχωρη τσέπη ορμόνη-δεσμευτική και θα φιλοξενήσει στεροειδών με διαφορετικές επεκτάσεις εντός του δακτυλίου D.

Η εξέταση της φύσης και του μεγέθους του διαλύτη προσβάσιμη περιοχή επιφάνειας (SASA ) πρωτεϊνών είναι ένα σημαντικό εργαλείο για τη μέτρηση πιθανών τάση αλληλεπίδρασης με τις γειτονικές πρωτεΐνες. Υπολογίσαμε το μέσο όρο SASA με κάθε συγκρότημα AR από το 15 ns MD τροχιά. Δεν μεγάλες διαφορές παρατηρήθηκαν μεταξύ των υπολογιζόμενων SASAs διαφορετικών AR μεταλλαγμένων συγκροτήματα, τα οποία κυμαίνονταν από 12.124 έως 12.390 Å

2. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι οι διαφορές ως επί το πλείστον σχετίζονται με τις περιοχές α11-α12 του AR-LBD, όπου βρίσκεται η μετάλλαξη T877A. Επομένως, αποφασίσαμε να συγκρίνουμε τη δυναμική μεταξύ των οκτώ διαφορετικά σύμπλοκα, ειδικά σε αυτήν την περιοχή, με τη χρήση μητρών RMSD (Πίνακας 1). Οι μήτρες, οι οποίες κατ ‘ουσίαν συλλάβει ακραίες κινήσεις, αποκαλύπτουν περιοχές υψηλής ελαστικότητας, ιδιαίτερα για CPA και δεξαμεθαζόνη, σε σύγκριση με άλλα AR-συνδετήρα σύμπλοκα.

Η

υπολογιστική μοντελοποίηση έχει επίσης πραγματοποιηθεί για μια σειρά άλλων AR σωματικές μεταλλάξεις εις το πεδίο σύνδεσης συνδετήρα (LBD), και δείχνουν ευαισθησία σε ένα ευρύ φάσμα προσδεμάτων ορμονών, συμπεριλαμβανομένων, AR-W741L [34], -L701H [35], [36], [37], [38] , -H874Y [39], [40], [41] και -F876L [13]. Προσδιορισμός της δομής LBD μεταξύ AR-WT και -H874Y (παρούσα σε 22Rv1 κύτταρα), όταν συνδέεται με τεστοστερόνη, παρουσία του Ν-τερματικού πεπτιδίου FXXLF μοτίβο ή το πεπτίδιο συνενεργοποιητή TIF2, διαπιστώθηκε ότι όλες οι δομές ήταν σύμφωνα με την κανονική πυρηνικό υποδοχέα LBD φορές [41]. Επιπλέον, οι -H874Y DHT και R1881 ήταν σύμφωνα με τις δομές -T877A και -W741L LBD συνδέεται με στεροειδές και nosteroid συνδέτες [34], [42]. Τα διπλά AR-μεταλλαγμένες κυτταρικές σειρές MDA-PCA-2α και MDA-PCa-2b, διαθέτουν την L701H και T877A σωματικών μεταλλάξεων, αυτά τα κύτταρα δείχνει παρόμοια μετενεργοποίησης AR και LBD δομικές ιδιότητες στο ενιαίο AR-T877A μεταλλαγμένα κύτταρα LNCaP σε ένα ευρύ φάσμα στεροειδών συνδετών και αντι-ανδρογόνα, αλλά και δείχνουν αυξημένη ευαισθησία στεροειδή κορτιζόλης [35], [36].