Αφηρημένο

Ιστορικό

Μεταθετά στοιχεία (ΝΠ) περιλαμβάνει σχεδόν το 45% του συνόλου του γονιδιώματος και αποτελούν μέρος των εξελιγμένων ρυθμιστικά συστήματα του δικτύου που ελέγχουν αναπτυξιακές διαδικασίες σε φυσιολογικές και παθολογικές καταστάσεις. Τα μηχανήματα γονίδιο ρετροϊικών /ρετρομεταθετόνιου αποτελείται κυρίως από Long διάσπαρτα στοιχεία για πυρηνικούς (γραμμές-1) και τα Ανθρώπινα ενδογενείς ρετροϊούς (HERVs) λόγω κώδικα για τα δικά τους ενδογενή ανάστροφης μεταγραφάσης (RT). Είναι ενδιαφέρον, RT τυπικά εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα σε καρκινικά κύτταρα. Πρόσφατες μελέτες αναφέρουν ότι RT αναστολή από μη νουκλεοσιδικούς αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφάσης (NNRTIs) προκαλεί αναστολή της ανάπτυξης και της διαφοροποίησης των κυττάρων

in vitro

και ανταγωνίζεται ανάπτυξη ανθρώπινων όγκων σε ζωικό μοντέλο. Στην παρούσα μελέτη θα αναλύσει την αντικαρκινική δράση του Abacavir (ABC), ένα νουκλεοσιδικό αναστολέα της αντίστροφης μεταγραφής (NRTI), στις καρκινικές κυτταρικές σειρές PC3 και LNCaP του προστάτη.

Κύρια Ευρήματα

ABC μειώνει σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη, μετανάστευση διεργασίες και εισβολή, επιβραδύνει σημαντικά την εξέλιξη της φάσης S, προκαλεί γήρανση και θάνατο κυττάρου σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Σε συμφωνία με αυτές τις παρατηρήσεις, ανάλυση μικροσυστοιχιών σε κύτταρα PC3 δείχνει ότι ABC επάγει ειδική και δοσοεξαρτώμενη αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση, περιλαμβάνει πολλαπλές κυτταρικές οδούς. Αξίζει να σημειωθεί ότι, από ποσοτική Real-Time PCR βρήκαμε ότι τα επίπεδα LINE-1 ORF1 και ORF2 mRNA ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα με κατεργασία ABC.

Συμπεράσματα

Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν τις δυνατότητες του ABC ως αντικαρκινικά παράγοντα ικανό να επάγει αντι-πολλαπλασιαστική δραστηριότητα και να προκαλέσει γήρανση σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Αξίζει να σημειωθεί, δείχνουμε ότι ABC προκαλεί up-ρύθμιση του LINE-1, γεγονός που υποδηλώνει την εμπλοκή των στοιχείων αυτών στα παρατηρούνται κυτταρικές αλλαγές

Παράθεση:. Carlini F, Ridolfi Β, Molinari Α, Παρίση C, Bozzuto G , Toccacieli L, et al. (2010) Η αντίστροφη μεταγραφή αναστολέας Abacavir Δείχνει Αντικαρκινική Δραστηριότητα στον καρκίνο του προστάτη Γραμμές κυττάρων. PLoS ONE 5 (12): e14221. doi: 10.1371 /journal.pone.0014221

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 19, Φλεβάρη του 2010? Αποδεκτές: 15 του Νοέμβρη του 2010? Δημοσιεύθηκε: 3 Δεκ, 2010

Copyright: © 2010 Carlini et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν που παρέχονται από από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας της Ρώμης (ISS), Ricerca Finalizzata 2004, το πρόγραμμα Συνεργασία ISS /ΝΙΗ-ΗΠΑ και Ricerca Corrente την περίοδο 2007-2008, ISS. Άλλες χρηματοδοτήσεις είναι από το Υπουργείο Παιδείας και Έρευνας, Regione Campania, Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC) και τα διδακτορικά προγράμματα: «Παθολογία των κυττάρων Μεταγωγή σήματος» (OMVG) του Δευτέρου Πανεπιστημίου της Νάπολης και «Τοξικολογία, Ογκολογίας και μοριακής Παθολογίας »του Πανεπιστημίου του Κάλιαρι (MR). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο καρκίνος είναι μια πολύπλοκη ασθένεια και ακραία μεταβλητότητα του φαινοτύπου του δεν μπορεί να περιγραφεί εξαντλητικά και να εξηγηθεί αποκλειστικά από τις αλληλεπιδράσεις γονιδίων-περιβάλλοντος. Απροσδόκητα, η ολοκλήρωση του ανθρώπινου γονιδιώματος αποκαλύπτει ότι η πραγματική πολυπλοκότητα του γονιδιώματος έχει μικρή σχέση με τον αριθμό και ετερογένεια των γονιδίων του.

Μόνο το 2% των ανθρώπινων κωδικών γονιδίωμα για τις πρωτεΐνες, ενώ το 45% αποτελείται από μεταθετά στοιχεία (ΝΠ) [1]. Τα ΝΠ, αρχικά πιστεύεται ότι είναι απλή ενδοκυτταρικά παράσιτα, ονομάστηκαν εγωιστικό ή «junk» DNA, μέχρι την περαιτέρω έρευνα αποκάλυψε πώς αυτό το τεράστιο ποσό των αλληλουχιών μη κωδικοποίησης πρωτεΐνης κλίμακες με οργανισμούς πολυπλοκότητα, παίζει έναν κρίσιμο ρόλο ως μέρος της ρυθμιστικής εργαλειοθήκη του γονιδιώματος, με μεταβολή έκφρασης γονιδίου και την εξέλιξη γονιδίωμα οδήγηση, καθώς και την ανάπτυξη ενός οργανισμού [2] – [10]. ΝΠ μπορούν να διαχωριστούν σε δύο μεγάλες κατηγορίες: DNA-τρανσποζόνια (2,8%) και ρετροτρανσποζόνια (42,2%). DNA-τρανσποζόνια ενισχύουν χωρίς ενδιάμεσο RNA, ενώ ρετροτρανσποζόνια βασίζονται σε μια μεταγραφή RNA ότι η αυτο-αναπαράγεται με τη βοήθεια μιας αντίστροφης μεταγραφάσης (RT).

RTs κωδικοποιείται από το Long διάσπαρτες Πυρηνική Στοιχείο-1 (LINE-1 ) and Human ενδογενείς ρετροϊούς (HERVs) βρέθηκαν να σχετίζονται με παθολογικές και φυσιολογικές διεργασίες. Ειδικότερα, τα υψηλά επίπεδα έκφρασης RT βρέθηκαν στα γεννητικά κύτταρα, έμβρυα, αδιαφοροποίητα και μετασχηματισμένα κύτταρα, ενώ σε διαφοροποιημένα μη παθολογικούς ιστούς είχαν μόλις εκφραστεί, υποδηλώνοντας μια άμεση συσχέτιση με την πολλαπλασιαστικό δυναμικό του κυττάρου [11] – [17 ].

Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι μια κατηγορία μη-νουκλεοσίδιο αναστολείς RT (NNRTIs), που χρησιμοποιείται ευρέως στη θεραπεία του AIDS, αναστέλλει την ενδογενή δραστικότητα RT σε έναν αριθμό γραμμών ποντικού και ανθρώπου των καρκινικών κυττάρων, μειώνοντας την κυτταρική ρυθμού ανάπτυξης και επαγωγή διαφοροποίησης [18] – [20]. Επιπλέον, οι ίδιες βιολογικές επιδράσεις αναπαραχθεί σε πειράματα παρεμβολής RNA με ειδικές

si

RNA κατευθύνονται εναντίον LINE-1 και HERV-K. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν σαφώς ότι και οι δύο κατηγορίες ρετροστοιχείων συνδέονται σε ένα λειτουργικό δίκτυο, που εμπλέκονται στην κυτταρική ανάπτυξη και ογκογένεση, αλλά με διακριτή ιεραρχική ρόλους, όντας LINE-1 είναι σε θέση να ελέγχουν την έκφραση HERV-K [21]. Αυτές οι μελέτες υποδεικνύουν ότι η ενδογενής μη τελομερές RT μπορεί να αντιπροσωπεύει μία νέα στόχου στην ανάπτυξη θεραπευτικών αντικαρκινικών παραγόντων.

NNRTIs προσδένονται σε ένα υδρόφοβο θύλακα, κοντά στη δραστική θέση RT. Ο δεσμευτικός επάγει μία διαμορφωτική αλλαγή στην πρωτεΐνη, που επηρεάζουν τη συγγένειά του για το υπόστρωμα και, κατά συνέπεια, την αναστολή της ενζυμικής δραστικότητας RT. NNRTIs ταξινομούνται ως αλλοστερικός μη ανταγωνιστικοί αναστολείς RT.

Μία άλλη κατηγορία αναστολέων αντιρετροϊκή που στοχεύουν RT αντιπροσωπεύεται από τα νουκλεοσιδικοί αναστολείς της ανάστροφης μεταγραφής (NRTIs). Σε σύγκριση με το NNRTIs, έχουν ένα διαφορετικό μηχανισμό δράσης. Η NRTIs είναι νουκλεοτιδικές ανάλογα που αναστέλλουν την αντίστροφη μεταγραφή με το να ενσωματωθεί στο πρόσφατα συντεθεί ιικό DNA (cDNA) και την πρόληψη της περαιτέρω επιμήκυνση του. Αυτά ταξινομούνται ως μη-αλλοστερικοί ανταγωνιστικοί αναστολείς του υποστρώματος. Μεταξύ αυτών, αβακαβίρη (ABC) χρησιμοποιείται με επιτυχία σε συνδυασμό με άλλα αντι-ιικά φάρμακα για τη θεραπεία της λοίμωξης HIV. Είναι μετατρέπεται από κυτταρικά ένζυμα στη δραστική carbovir triphosphorilated μορφή, ένα ανάλογο του dGTP. Όσον αφορά άλλους NRTIs, ABC δείχνει μια πολύ χαμηλή συγγένεια για τις κυτταρικές DNA πολυμεράσες [22]. Επιπλέον, Jones et al. [23] κατέδειξε με

in vitro

LINE-1 δοκιμασία ρετρομετάθεση που NRTIs έχουν την ικανότητα να καταστέλλουν LINE-1 ρετρομετάθεση, αναφέροντας την επιδεκτικότητα του LINE-1 RT σε αυτή την κατηγορία φαρμάκων.

Με βάση αυτές τις αποδείξεις, ερευνήσαμε την αντικαρκινική δράση του ABC για την ορμόνη που εξαρτάται LNCaP και ορμονοάντοχου κυτταρικές γραμμές καρκίνου προστάτη PC3. Αυτά τα μεταστατικά κύτταρα γενικά υποτίθεται ότι αντιπροσωπεύει πρώιμο και όψιμο στάδια του καρκίνου του προστάτη, αντίστοιχα. Μέχρι τώρα, ο καρκίνος του προστάτη αποτελεί την πιο κοινή noncutaneous καρκίνος στον άνθρωπο στις Ηνωμένες Πολιτείες [24]. Η θεραπεία στήριγμα είναι η κατάλυση των ανδρογόνων, αλλά μετά από μια αρχική καλή απάντηση η νόσος εξελίσσεται σε ορμονοάντοχου καρκίνο του προστάτη [25]. Νέες λεπτομέρειες θεραπεία που απαιτείται για την πρόληψη ή τη θεραπεία αυτού του πιο θανατηφόρος μορφή καρκίνου του προστάτη.

Εδώ αποδεικνύουμε ότι ABC προκαλεί μια σημαντική μείωση στο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων και μια καθυστέρηση του κυτταρικού κύκλου σε φάση S. Ένα υψηλό ποσοστό των γηρασμένων κυττάρων παρατηρήθηκαν και πολλοί από αυτούς είχαν δεσμευθεί στο θάνατο. Λίγες ώρες έκθεσης ABC μείωσε σημαντικά το δυναμικό της μετανάστευσης και της εισβολής σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Επιπλέον, μια ανάλυση έκφρασης του γονιδιώματος σε επίπεδο σε κύτταρα PC3 αποκάλυψε μια γονιδιακή ρύθμιση δοσοεξαρτώμενη. Αξίζει να σημειωθεί, ABC ήταν σε θέση να ρυθμίζουν LINE-1 έκφρασης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιεργειών και θεραπείες

Ο ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη κυτταρικές γραμμές PC3 (ATCC CRL-1435) και LNCaP (ATCC CRL-1740) και το μη-μετασχηματισμένο ανθρώπινο κυτταρική γραμμή ινοβλαστών WI-38 (ATCC CCL-75) καλλιεργήθηκαν σύμφωνα με τις συστάσεις ATCC. Abacavir καθαρίστηκε από εμπορικά διαθέσιμα δισκία Ziagen (GlaxoSmithKline, Research Triangle Park, NC 27709) με εκχύλιση με μεθανόλη και ο βαθμός καθαρισμού αξιολογήθηκε με HPLC. Για πειράματα φάρμακο, ABC διαλύθηκε σε FBS μέσο ελεύθερο και χρησιμοποιήθηκε σε συγκέντρωση 15 ή 150 μΜ. Drug περιέχει φρέσκο ​​μέσο αλλάχθηκε κάθε 48 ώρες. Για τα πειράματα συγχρονισμός κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 2 μg /ml aphidicolin επί 18 ώρες, στη συνέχεια πλύθηκε δύο φορές με PBS και κυκλοφόρησε σε φρέσκο ​​μέσο, ​​το οποίο περιέχει ή όχι ABC.

RT Δοκιμασία Δραστηριότητα

RT δοκιμασίες δραστηριότητας πραγματοποιήθηκαν με μία μικρή τροποποίηση της μεθόδου που περιγράφεται από τον Mangiacasale et.al [18]. Κύτταρα (5 × 10

5-10

6) λύθηκαν σε 40 μΐ ρυθμιστικό λύσης παγωμένο (10 mM Tris-HCl ρΗ 7.5, 1 mM MgCl

2, 1 mM EGTA, 0,1 mM PMSF , 5 mM β-μερκαπτοαιθανόλη, 0,5% CHAPS, 10% γλυκερόλη). Μετά από τρεις κύκλους ψύξης-απόψυξης και-, τα κύτταρα επωάστηκαν για 30 λεπτά σε πάγο και υποβλήθηκε σε φυγοκέντρηση για 30 λεπτά σε 14 r.p.m. 000 στους 4 ° C. δραστικότητα RT ελέγχθηκε χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ThermoScript RT-PCR (Invitrogen) σε 20 μΐ αντιδράσεων που περιέχουν 10 ng του MS2 φάγων RNA (Roche Diagnostics) και 30 pmol του MS2 αντίστροφου εκκινητή (βλέπε παρακάτω) και αντικαθιστώντας την εμπορική RT με εκχύλισμα ελεύθερο κυττάρων ( 24 μg ολικής πρωτεΐνης). Τα μίγματα αντίδρασης επωάστηκαν στους 55 ° C για 1 ώρα που ακολουθείται από 5 λεπτά στους 85 ° C. Ένας όγκος 1 μΙ

Escherichia coli

RNaseH (2 υ /μΙ) προστέθηκε σε κάθε δείγμα και επωάστηκαν περαιτέρω στους 37 ° C για 20 λεπτά. Αντιδράσεις ελέγχου στήθηκαν παραλείποντας κυτταρικό εκχύλισμα (αρνητικός έλεγχος), ή την προσθήκη 1 μΐ ThermoScript RT (Invitrogen) (15 U /μl, θετικός έλεγχος). Ένας όγκος 2 μΙ από κάθε αντίδρασης αναμίχθηκε με 30 pmol το καθένα από τα εμπρός (5′-TCCTGCTCAACTTCCTGTCGAG-3 ‘) και ανάστροφα (5′-CACAGGTCAAACCTCCTAGGAATG-3’) MS2 εκκινητές και ενισχύθηκε με PCR χρησιμοποιώντας την Platinum PCR SuperMix (Invitrogen). Οι συνθήκες PCR είχαν ως εξής: 94 ° C για 2 λεπτά, ακολουθούμενη από 30 κύκλους των 94 ° C για 30 s, 58 ° C για 30 s και 72 ° C για 30 s. Το προϊόν ενίσχυσης είναι ένα 112-bp DNA που εκτείνονται θραύσμα θέσεις 21-132 στο 5 ‘άκρο του MS2 RNA (GenBank V00642). PCR προϊόντα κλασματώθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης 1,5%.

Κυτταρικού Πολλαπλασιασμού Προσδιορισμός

PC3, LNCaP κύτταρα και WI-38 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 20.000 ανά φρεάτιο σε πλάκες 12 φρεατίων, καλλιεργημένα για 24 ώρες και στη συνέχεια κατεργάζεται με ABC σε συγκέντρωση 15 ή 150 μΜ. Σε 0, 24, 48, 72 και 96 ώρες ο αριθμός των trypan blue-εξαιρουμένων κύτταρα μετρήθηκαν σε θάλαμο Burker. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν τρεις φορές εις τριπλούν.

Κύκλου Κυττάρου Ανάλυση

Κατεργασμένα και μη κατεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και εκπλύθηκαν με παγωμένο PBS. χρώση του DNA πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της δοκιμής κύκλου DNA κιτ αντιδραστηρίου (Becton & amp? Dickinson) ™ PLUS. Τα κύτταρα στη συνέχεια αναλύθηκαν σε FACScan κυτταρόμετρο ροής (Becton & amp? Dickinson).

Γήρανση Προσδιορισμός

Ποσοστό γηρασμένων κυττάρων μετρήθηκε με ανίχνευση δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης σε ρΗ 6 με ανίχνευση της Calbiochem Γήρανση Εργαλειοθήκη. Τα δεδομένα ποσοτικοποιούνται από περισσότερες από 500 μετρήσεις κυττάρων σε τρία ανεξάρτητα πειράματα.

μικροσκόπιο φθορισμού

για μορφομετρική ανάλυση των πυρήνων, κατεργασμένα και μη κατεργασμένα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 3% παραφορμαλδεΰδη και επωάστηκαν με Hoechst 33258 διαλύματος (1 μg /ml) για 30 λεπτά στους 37 ° C. Για την χρώση των πυρηνίσκων, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες 12 mm σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά με μεθανόλη στους -20 ° C για 10 λεπτά, επωάστηκαν με αντιπυρηνικά ορό από μία αυτοάνοση ασθενή (ευγενική προσφορά του Dr. Maria Antonietta Amendolea) και στη συνέχεια επωάστηκαν με μια κατσίκα φλουορεσκεΐνη-συνδεδεμένη αντι-ανθρώπινη IgG (Bio-Rad). Τα δείγματα αναλύθηκαν με μία κάμερα CCD Nikon εφοδιασμένο Optiphot μικροσκόπιο (Tokyo, Japan). Η μορφομετρική ανάλυση εκτελέστηκε με την Εικόνα J 1.37 λογισμικού (Wayne Rasband, ΝΙΗ, USA). Για την ανάλυση του Student στατιστική t-τεστ εφαρμόσθηκε.

Μικροσκοπία Σάρωσης Ηλεκτρονίου (SEM)

κατεργασμένα και ακατέργαστα κύτταρα PC3 σταθεροποιήθηκαν με 2% γλουταραλδεϋδη σε 0.1 Μ κακοδυλικό ρυθμιστικό ρΗ 7.4 σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά, μετα-σταθεροποιήθηκαν με 1% ΟΣΟ

4 στο ίδιο ρυθμιστικό, αφυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης σειράς αιθανόλης, κρίσιμο σημείο αποξηράνθηκε με CO

2 και το χρυσό επικαλυμμένο με επιμετάλλωση. Τα δείγματα εξετάστηκαν με ένα Cambridge Stereoscan 360 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (Cambridge Instruments Ltd, Cambridge, UK).

μετανάστευση των κυττάρων και εισβολή δοκιμασίες

Οι ανιχνεύσεις πραγματοποιήθηκαν με μια τροποποίηση της μεθόδου που περιγράφεται από τον Albini και οι συνεργάτες του [26]. Για τις δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή, φιλτράρει χρησιμοποιήθηκαν 8,0 μm πόρου (Falcon). Κύτταρα, συλλέχθηκαν και αιωρήθηκαν σε RPMI σε μία συγκέντρωση 1 10

6 κύτταρα /ml, προστέθηκαν σε κάθε φίλτρο × και 3 ml RPMI που περιέχει 10% FBS προστέθηκαν στο καλά κάτω από το ένθετο. Για φίλτρα δοκιμασία εισβολή επικαλύφθηκαν με Matrigel ™ (Sigma) αραιωμένο σε 1 mg /ml σε μέσο RPMI χωρίς ορό. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C για 18 ώρες. Στη συνέχεια, η εσωτερική πλευρά του φίλτρου σκουπίστηκε με ένα υγρό μάκτρο για την απομάκρυνση των κυττάρων, ενώ η εξωτερική πλευρά του ενθέτου ξεπλύθηκε με PBS και βάφτηκαν με 0.25% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma) για 10 λεπτά. Τα φίλτρα στη συνέχεια προβάλλονται με μια κάμερα CCD Nikon εξοπλισμένη Optiphot μικροσκόπιο (Τόκιο, Ιαπωνία) και το ποσοστό της περιοχής που καταλαμβάνεται από μετανάστευσαν ή εισβάλλοντας κυττάρων αναλύθηκε με λογισμικό Optilab (Graftek Mirmande, Γαλλία).

Microarray Analysis

Το ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας RNase Kit (Qiagen). Για κάθε δείγμα, 500 ng RNA συντέθηκαν σε βιοτινυλιωμένη cRNA χρησιμοποιώντας Illumina RNA Amplification Kit (Ambion, Inc., Austin, ΤΧ). RNA και cDNA συγκέντρωση προσδιορίστηκε με ένα φασματοφωτόμετρο Nanodrop (NanoDrop, Wilmington, Delaware, USA) και την ποιότητα του αξιολογήθηκε με ένα Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Milano, Italy). Από κάθε δείγμα, τεχνικά αντίγραφα παρήχθησαν και 750 ng cRNA υβριδοποιήθηκαν επί 18 ώρες για να HumanRef-8 BeadChips Έκφραση v2 (Illumina Inc., San Diego, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. αρχεία Ένταση φορτώθηκαν στον 3.0.19.0 λογισμικό Illumina BeadStudio και κανονικοποιημένο με το μέσο όρο της αλγόριθμο. Τεχνική επαναλήψεις εκάστου δείγματος ομαδοποιούνται μαζί και τα γονίδια με τιμή-ρ & lt ανίχνευση? 0,05 θεωρήθηκαν ως ανιχνευθεί. Γονίδια με Diff Δείκτη του ± 40 (p-value 0.0001) θεωρήθηκαν ως διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια. δεδομένων των μικροσυστοιχιών είναι MIAME συμβατό και τα ανεπεξέργαστα δεδομένα έχουν κατατεθεί στη βάση δεδομένων ArrayExpress (https://www.ebi.ac.uk/microarray-as/ae), με τον αριθμό Προσχώρησης:. E-TABM-532

Ingenuity Διαδρομή Ανάλυση 7 (Ingenuity Systems®, www.ingenuity.com) χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η βιολογική σχέση των διαφορικά εκφρασμένων γονιδίων. Οι βιολογικές λειτουργίες αξιολογήθηκαν σύμφωνα με τις οδηγίες του λογισμικού. ακριβής δοκιμασία του Fisher χρησιμοποιήθηκε για να υπολογιστεί μια τιμή ρ προσδιορισμό της πιθανότητας ότι κάθε βιολογική λειτουργία εκχωρηθεί σε αυτό το σύνολο δεδομένων οφείλεται στην τύχη και μόνο. Ένα GO (Gene Ontology) εμπλουτισμός ανάλυση πραγματοποιήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας λογισμικό DAVID [27], [28].

Δοκιμασία RT και Ποσοτικοποίηση της LINE-1 Έκφραση mRNA

Ολικό RNA απομονώθηκε από κύτταρα μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων με 15 και 150 μΜ ABC από 24, έως 120 ώρες. RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ϋΝάση TURBO (Ambion) για την απομάκρυνση μολυσματικών γενωμικού DNA. cDNAs συντέθηκαν από το TaqMan High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (ΡΕ Applied Biosystems). Σχετική ποσοτικοποίηση αντιδράσεις PCR πραγματοποιήθηκαν με τη χημεία TaqMan. LINE-1 μεταγραφές ανιχνεύτηκαν με τη χρήση προσαρμοσμένων εκκινητών και FAM-MGB-ανιχνευτές για LINE-1 ORF1 και ORF2 (ΡΕ Applied Biosystems), σχεδιάστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό Αστάρια Express (Πίνακας S1). Η βάση δεδομένων ακολουθία LINE-1 που χρησιμοποιούνται στην παρούσα εργασία είναι το L1base (https://l1base.molgen.mpg.de) [29]. Ο αριθμός της γραμμής 1-αλληλουχίες στοχεύονται από ανιχνευτές αναφέρονται στον Πίνακα S1. Κάθε αντίδραση διεξήχθη σε τελικό όγκο 25 μL που περιέχει 1 μί cDNA και 12.5 μι TaqMan® καθολική PCR Master Mix (Applied Biosystems). Εκτελέστηκαν ενισχύσεις ξεκινώντας με ένα στάδιο ενεργοποίησης 2 λεπτά για AmpErase UNG σε 50 ° C, 10 min βήμα πρότυπο μετουσίωσης στους 95 ° C, που ακολουθείται από 40 κύκλους στους 95 ° C για 15s και 60 ° C για 1 λεπτό. Προ-ανέπτυξε αντιδραστήριο Δοκιμασία TaqMan για GAPDH (4310884E) χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενή έλεγχο. Έλλειψη ενίσχυσης από μη μεταγραφεί αντίστροφα RNA επιβεβαιώθηκε να αποκλείσει γενωμικού ενίσχυση του DNA. Οι διαφορές στην έκφραση των γονιδίων υπολογίστηκαν με πρότυπες 2

-ΔΔCt μέθοδο. Για t τεστ ανάλυσης του Student στατιστική εφαρμόστηκε.

Αποτελέσματα

Abacavir αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων, επηρεάζει την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου και προκαλεί γήρανση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη

Κατ ‘αρχάς, θα αξιολογηθούν ενδογενή δραστικότητα RT σε ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του προστάτη και σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα ελέγχου WI-38. Τα κύτταρα εκχυλίσματα χρησιμοποιήθηκαν ως πηγή RT για την αντίστροφη μεταγραφή ενός συνθετικού RNA. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, η δραστικότητα RT βρέθηκε στο PC3 και LNCaP κύτταρα, ενώ σε WI-38 κύτταρα δραστηριότητα RT ήταν σε ένα μη ανιχνεύσιμο επίπεδο.

δραστικότητα (Α) Ενδογενής RT ανιχνεύθηκε σε PC3, LNCaP και WI -38 κύτταρα όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους? (+) Θετική αντίδραση ελέγχου με εμπορική RT. (Β) Ο καρκίνος του προστάτη και φυσιολογικό ανθρώπινο ινοβλαστών WI-38 κύτταρα κατεργάστηκαν με ABC σε συγκέντρωση 15 και 150 μΜ και καλλιεργήθηκαν στα ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων? μπαρ, ± SD.

Η

Για να αναλυθεί η επίδραση του ABC στο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τα κύτταρα αναπτύχθηκαν με την παρουσία του φαρμάκου σε συγκεντρώσεις 15 και 150 μΜ. Μία αναστολή ανάπτυξης εξαρτώμενη από τη δόση παρατηρήθηκε σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Β). Στα 15 μΜ ABC μια σημαντική μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης, αποκαλύφθηκε μετά από 72 και 96 ώρες της θεραπείας σε PC3 και LNCaP αντίστοιχα. Η συγκέντρωση 150 μΜ παρεμπόδισε έντονα την ανάπτυξη στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Β). Η κυτταροτοξικότητα του ABC εξετάστηκε επίσης σε μη μετασχηματισμένα κύτταρα WI-38. Είναι ενδιαφέρον, δεν βρήκαμε μια σημαντική μείωση της ανάπτυξης των κυττάρων με 15 μΜ ABC, ενώ η 150 μΜ συγκέντρωση ABC που προκαλείται μόνο το 20% της αναστολής της ανάπτυξης των κυττάρων μετά από 120 ώρες (Εικόνα 1Β).

Για να διερευνηθεί αν ABC θα μπορούσε επηρεάσουν την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου, τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη υποβλήθηκαν σε αγωγή με 150 μΜ ABC και αναλύθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία μέχρι και 120 ώρες. Σε κύτταρα PC3 πολύ ψηλά συσσώρευση κυττάρων στη φάση S, παρατηρήθηκε μετά από 18 και 24 ώρες της θεραπείας (56,3 και 78,6% αντίστοιχα). Η αύξηση αυτή ακολουθείται από Επαυξημένης του G2 κύτταρα /Μ το οποίο έγινε 23,4 έως 26,9% του συνολικού πληθυσμού κατά 96 και 120 ώρες θεραπείας (Σχήμα 2Α, Β). κύτταρα κατεργασμένα LNCaP παρουσίασαν κατά κύριο λόγο η συσσώρευση φάση S φθάνοντας 40,5 – 54,3% μετά από 48 και 72 ώρες της θεραπείας, αλλά δεν παρατηρήθηκε G2 /M φάση αύξησης. Μάλλον, συσσώρευση φάσης S φαίνεται να παραμένει σταθερή με την πάροδο του χρόνου (Σχήμα 2Α). Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η μεταβολή φάσης S, τα κύτταρα συγχρονίστηκαν σε πρώιμη φάση S με την έκθεσή τους σε αναστολέα aphidicolin σύνθεση DNA. Μετά την απελευθέρωση από το μπλοκ aphidicolin, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 150 μΜ ABC και αναλύθηκαν για τη διανομή του κυτταρικού κύκλου σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Σχήμα 2C, δείχνει ότι 3 ώρες μετά την απελευθέρωση δύο συγχρονισμένα κύτταρα ελέγχου είχε μετακινηθεί προς το στάδιο της μεσαίας S, εκπροσωπούμενη από την κεντρική κορυφή του γραφήματος, ενώ ABC επεξεργασμένα κύτταρα παρουσίασαν εμφανή καθυστερήσει την εξέλιξη μέσω της S φάσης. Μετά από 18 ώρες, ένα μεγάλο μέρος των κυττάρων PC3 αγωγή ήταν ακόμη παρούσα στο τέλος S και G2 /M φάση, ενώ LNCaP, όπως αναμενόταν, έδειξαν μια τάση να συσσωρεύονται σε φάση S (Σχήμα 2C). Αξιοσημείωτο, ABC ήταν σε θέση να επιμηκύνει την εξέλιξη της φάσης S επίσης εάν προστίθενται στη φάση της μέσης S, 3 ώρες μετά την απελευθέρωση μπλοκ aphidicolin (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Όλα μαζί αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν την υπόθεση ότι το ABC θα μπορούσε να επηρεάσει ειδικά την αντιγραφή του DNA.

(Α) κατανομή κυτταρικού κύκλου των PC3 και LNCaP κύτταρα εκτέθηκαν σε 150 μΜ ABC. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν στα δεικνυόμενα χρονικά σημεία, επωάστηκαν με ιωδιούχο προπίδιο και το περιεχόμενο DNA αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση έχει αναφερθεί. (ΝΔ, δεν γίνεται). Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά πέντε ανεξάρτητα πειράματα. (Β) Ένα αντιπροσωπευτικό πείραμα από πρόοδο του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα κατεργασμένα PC3. Τα βέλη υποδεικνύουν τη συσσώρευση των κυττάρων στην φάση G2 /M. (C) PC3 και LNCaP κύτταρα συγχρονισμένα σε πρώιμη φάση S με aphidicolin και του κυτταρικού κύκλου διανομής αναλύθηκε σε θεραπεία (150 μΜ ABC) και μη επεξεργασμένα κύτταρα.

Η

Σε συνδυασμό με την αναστολή του πολλαπλασιασμού, μια σημαντική αύξηση της κυτταρικό θάνατο σε περίοδο 6 ημερών παρατηρήθηκε με 150 μΜ ABC (Σχήμα 3Α, Β). Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον αυτά τα φαινόμενα που συνδέονται με την επαγωγή της απόπτωσης ή γήρανση, καρκίνου του προστάτη κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 150 μΜ ABC για 5 ημέρες και αξιολογείται κάθε 24 ώρες για αννεξίνη εξωτερίκευσης, πυρηνική συμπύκνωση /τον κατακερματισμό και δραστικότητα β-γαλακτοσιδάσης σε ρΗ 6. Δεν παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση αννεξίνης θετικών κυττάρων ή αποπτωτικών πυρήνων παρατηρήθηκε στα δείγματα που κατεργάζονται σε οποιοδήποτε χρονικό σημείο (τα δεδομένα δεν δείχνονται) ενώ η δραστηριότητα β-γαλακτοσιδάσης συνδέονται γηρασμό σημαντικά επάγεται από ABC και αυξήθηκε με το χρόνο, φθάνοντας περίπου το 80% και το 50% των θετικών κυττάρων μετά από 5 ημέρες θεραπείας σε PC3 και LNCaP αντίστοιχα (Σχήμα 3C, D). Επιπλέον, η σύγκριση μεταξύ κυτταρική γήρανση και την κινητική του κυτταρικού θανάτου που υποδηλώνει ότι οι δύο φαινόμενα που σχετίζονται έντονα. Αντιθέτως, δεν παρατηρήσαμε κυτταρικό θάνατο ούτε διαφορές στο επίπεδο γήρανση σε WI-38 κύτταρα ελέγχου που έλαβαν θεραπεία με 150 μΜ ABC, σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α και Β) 5 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων με 150 μΜ ABC. Μετά από 0, 2, 4 και 6 ημέρες προσκολλημένα και επιπλέοντα κύτταρα συλλέχθηκαν και επαναιωρήθηκαν σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει 0.2% κυανού τρυπανίου για την καταμέτρηση των βιώσιμων και του θανάτου των κυττάρων. (Γ και Δ) δραστηριότητα β-γαλακτοσιδάσης αξιολογήθηκε σε PC3 και LNCaP κύτταρα σε επεξεργασία με 150 μΜ ABC και αναλύθηκε σε διαφορετικά χρονικά σημεία.

Η

μορφολογικές αλλαγές του PC3 κατεργασμένων κυττάρων

PC3 κύτταρα αναλύθηκαν περαιτέρω σε μορφολογικό επίπεδο. Σύμφωνα με μεταβολή του κυτταρικού κύκλου και επαγωγή γήρανση, διάφορες κυτταρικές μορφολογικές αλλαγές παρατηρήθηκαν μετά την έκθεση στο φάρμακο σε δύο δόσεις. Κατά τη σάρωση κύτταρα PC3 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σε επεξεργασία με 15 μΜ ABC εμφανίζεται ήδη μια πιο πεπλατυσμένο σχήμα (Σχήμα 4Α α, δ) και ένα εμπόδιο στη διαδικασία διαίρεση μετά από 48 ώρες έκθεσης (Σχήμα 4Α b, e). Επιπλέον, τα επεξεργασμένα κύτταρα PC3 δείχνουν την απώλεια της επιφάνειας μικρολαχνών που υποδηλώνουν μια επίδραση του φαρμάκου για την οργάνωση του κυτταροσκελετού (Σχήμα 4Α c, f). Σε πυρηνικό επίπεδο, μορφολογική ανάλυση τονίζει την παρουσία της bilobate και διευρυμένη πυρήνες, με αύξηση του πυρηνικού τομέα να γίνει εμφανής σε 48 ώρες επώασης με 15 μΜ ABC και 24 ώρες μετά τη θεραπεία με 150 μΜ ABC (Εικόνα 4Β). Μορφομετρικών και στατιστική ανάλυση έδειξε ότι η πυρηνική περιοχές σχεδόν διπλασιαστεί σε 48 ώρες με 150 μΜ ABC (Πίνακας S2). Σε πυρηνισκικός επίπεδο τροποποιήσεις σημαντική δομή βρέθηκαν στα κύτταρα εκτέθηκαν για 72 ώρες και για τις δύο δόσεις ABC. Περαιτέρω, τα κύτταρα PC3 επεξεργασία πυρηνίσκους φαίνονται λιγότερο συμπαγής και σε ορισμένες περιπτώσεις διάσπαρτα σε σχέση με τον έλεγχο (Σχήμα 4C).

(Α) SEM εικόνα απεικονίζουν τροποποίηση που συμβαίνουν σε κύτταρα PC3 σε επεξεργασία με 15 μΜ ABC στις 48 ώρες. (Β) Μορφολογικές αλλαγές και μορφομετρική ανάλυση των πυρήνων χρωματίστηκαν με Hoechst. Δόσεις και χρονικά σημεία που υποδεικνύονται. (C) ανοσοφθορισμού των πυρηνίσκοι βάφονται με αντι-πυρήνα ανθρώπινο ορό.

Η

Abacavir Αναστέλλει τη Μετανάστευση και την εισβολή

Από PC3 και LNCaP κύτταρα είναι μεταστατικά προέλευσης και διαθέτουν τα μεταναστευτικά και εισβολής δυναμικό , ερευνήσαμε την επίδραση του ABC στις διαδικασίες κινητικότητα και εισβολή. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε επικοινωνούντα δοχεία υπό την παρουσία ή απουσία 15 ή 150 μΜ ABC, και αφέθηκαν να μεταναστεύσουν για 18 ώρες στους 37 ° C. Μία δοσοεξαρτώμενη μείωση της περιοχής που καταλαμβάνεται από μεταναστεύουν και εισβάλλουν κυττάρων παρατηρήθηκε μετά τη θεραπεία ABC (Εικόνα 5Α, Β). Η μετανάστευση των κυττάρων ήταν σημαντικά μειωμένη σε καρκινικά κύτταρα του προστάτη κατά 15 και 150 μΜ δόσεις ABC (ρ & lt? 0.001). εισβολή κυττάρων Matrigel ανεστάλη σημαντικά μόνο στην υψηλότερη δόση ABC (Σχήμα 5Β).

PC3 και LNCaP κύτταρα σπάρθηκαν επί της μεμβράνης με την παρουσία ή απουσία του Matrigel και επωάστηκαν με 15 και 150 μΜ ABC για 18 ώρες. (Α) αντιπροσωπευτική εικόνα της που μεταναστεύουν και εισβάλλουν κύτταρα PC3 βάφονται με κρυσταλλικό ιώδες. (Β) Ποσοστό της μετανάστευσης και της εισβολής μειωθεί σε σχέση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα αναλύονται από το λογισμικό Optilab. (*) Αντιστοιχεί στο p & lt?. 0.001, που υπολογίζεται από τη δοκιμασία Mann-Whitney

Η

γονιδιακής έκφρασης Τροποποίηση Induced από Abacavir σε κύτταρα επεξεργασμένα PC3

Στην προσπάθεια να βρεθεί μια υπογραφή γονιδιακής έκφρασης βασίζονται οι μορφολογικές και λειτουργικές αλλαγές που παρατηρήθηκαν σε ABC επεξεργασμένα κύτταρα PC3, τέσσερα βιολογικά αντίγραφα τόσο αγωγή και κύτταρα ελέγχου αναλύθηκαν σε μια πλατφόρμα Illumina microarray 48 ώρες μετά την αγωγή.

η ανάλυση των στοιχείων έδειξε ότι μικροσυστοιχιών 192 γονίδια έξω του 12605 ανιχνευθεί και 3246 έξω από 12930, εκφράστηκαν διαφορικά (ρ & lt? 0,0001). στα 15 και 150 μΜ συγκεντρώσεις ABC αντίστοιχα, οι περισσότερες από τις οποίες προέκυψαν τα πάνω ρυθμισμένα (Σχήμα 6Α και Πίνακας S3)

(Α) συνοψίζοντας διάγραμμα των εκφράζονται και διαφορικά εκφρασμένων αριθμούς γονίδιο που προκύπτουν από ανάλυση μικροσυστοιχιών (τέσσερις βιολογικές επαναλήψεις για κάθε κατάσταση). (Β) Σύγκριση των top-ten βιολογικές λειτουργίες στους 15 και 150 ABC μΜ που λαμβάνονται από την ανάλυση του ΜΠΒ. Στον άξονα γ η στατιστική σημαντικότητα, που εκφράζεται ως -log /p-value, αναφέρεται. p-τιμή κατωφλίου = 0,05 (κίτρινη γραμμή). Ο αριθμός των γονιδίων που εμπλέκονται σε κάθε λειτουργία έχει αναφερθεί στην κορυφή κάθε ράβδου. διάγραμμα (Γ) Venn δείχνει το κλάσμα κοινά γονίδια εκφράζονται διαφορικά σε κύτταρα PC3 στα 15 και 150 μΜ ABC.

Η

Μια ανάλυση της λειτουργίας των διαφορικά εκφραζόμενων γονιδίων πραγματοποιήθηκε με τη χρήση συστήματος Ingenuity Pathways Ανάλυσης (ΙΡΑ) (Σχήμα 6Β). Είναι ενδιαφέρον ότι η συγκριτική ανάλυση των δέκα πρώτες βιολογικές λειτουργίες δείχνει ότι οι μεγάλες κυτταρικές λειτουργίες επηρεάζονται από την αγωγή ήταν οι ίδιες για τις δύο συγκεντρώσεις, υποδεικνύοντας μια ειδική και εξαρτώμενη από τη δόση επίδραση του φαρμάκου. Οι λειτουργίες που περιγράφονται στο Σχήμα 6Β είναι συνεπείς και αντιπροσωπευτικών και των δύο μορφολογικές και λειτουργικές αλλαγές που παρατηρούνται σε φαινοτυπικές επίπεδο: ανάκτηση των οδών κυτταρικού θανάτου, μεταβολές του κυτταρικού κύκλου και ρυθμό πολλαπλασιασμού, μεταβολές της κυτταρικής μορφολογίας. Άλλες επηρέασε σημαντικά τις λειτουργίες ήταν «RNA μετα-μεταγραφική Τροποποιήσεις», «γονιδιακής έκφρασης» και «DNA Replication, ανασυνδυασμός και επιδιόρθωση». Τα γονίδια συγκεντρωμένα στις διάφορες λειτουργίες που αναφέρονται στον πίνακα S4.

Τα σύνολα δεδομένων που λαμβάνονται σε δύο δόσεις διαδοχικά σε σύγκριση με ένα διάγραμμα Venn και 144 γονίδια είχαν ως αποτέλεσμα να μοιράζεται μεταξύ των δύο καταλόγων (Σχήμα 6C, Πίνακας S5 ). Μεταξύ αυτών, η πιο εκπροσωπείται Γονιδιακή Οντολογία (GO) όρους ταυτοποιήθηκαν με τη χρήση του «Λειτουργική Διάγραμμα σχολιασμού» εργαλείο DAVID συμπεριλαμβανομένων και των τριών κατηγοριών: βιολογικές διεργασίες, κυτταρικά συστατικά και Μοριακής λειτουργίες. Λειτουργική συστάδες σχολιασμό είχαν οριστεί για κάθε κατηγορία, με σκορ εμπλουτισμό κυμαίνονται 1,33 – 8,63 (Πίνακας 1). Είναι ενδιαφέρον, ο Συνήγορος του Πολίτη «κυτταρικό συστατικό» κατηγορία που εντοπίζεται 20 γονίδια που όλα ανήκουν στα πυρηνικά διαμερίσματα και συγκεκριμένα στην πυρηνική μέρος, αναδιαμόρφωσης χρωματίνης συγκρότημα και το χρωμόσωμα όρους (Πίνακας 2).

Η

Abacavir ρυθμίζει LINE -1 mRNA έκφραση

Λόγω των αποδεικτικών στοιχείων που υποστηρίζουν μια σχέση μεταξύ της δραστηριότητας RT, LINE-1 έκφρασης και του καρκίνου του επαναπρογραμματισμού των κυττάρων [18] – [21], αποφασίσαμε να ερευνήσουμε την επίδραση του ABC για την έκφραση αυτής της κατηγορίας της ρετροτρανσποζόνια. Συγκεκριμένα, LINE-1 αποτελούνται από ένα 5 ‘UTR (μη μεταφραζόμενη περιοχή), δύο ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης (ORF1 και ORF2) και ένα 3’ UTR τερματισμό σε μια πολυ (Α) ουρά. ORF1 κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη με ικανότητα σύνδεσης RNA ενώ ORF2 κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη με ενδονουκλεάση και αντίστροφης μεταγραφάσης λειτουργίες [7]. Τα cDNA που λαμβάνονται από κύτταρα καρκίνου προστάτη, μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων με τις δύο δόσεις ABC και συλλέχθηκαν σε 24, 48, 72, 96 και 120 ώρες, ενισχύθηκαν με πραγματικού χρόνου PCR με εκκινητές και ανιχνευτές που αναγνωρίζουν διατηρημένες περιοχές LINE-1 ORF1 και ORF2 ακολουθίες κωδικοποίησης. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, μία δόση και χρονο-εξαρτώμενη αύξηση του επιπέδου έκφρασης mRNAs παρατηρήθηκε είτε σε PC3 και LNCaP κυττάρων για αμφότερα ORF1 και μεταγραφές ORF2, υποδεικνύοντας ότι LINE-1 θα μπορούσε να παίξει ένα ρόλο στις μοριακές και λειτουργικές αλλαγές που παρατηρήθηκαν κατά την ABC θεραπεία.

Σχετικά επίπεδα των μεταγραφών LINE-1 mRNA (ORF1 και ORF2) σε PC3 και LNCaP κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με 15 και 150 μΜ ABC σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέση τιμή ± SD. Οι (*) και (**) σύμβολα υποδηλώνουν μια σημαντική διαφορά σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, με την αξία AP & lt? 0.05 και & lt?. 0.01 αντίστοιχα

Η

Συζήτηση

Ένας μεγάλος αριθμός αποδεικτικών στοιχείων επιβεβαίωσε τη σχέση μεταξύ υψηλού επιπέδου ενδογενούς έκφρασης RT και μετασχηματίζεται /φαινοτύπου καρκινικών κυττάρων [11], [17]. Προηγούμενες μελέτες με αλλοστερικές RT αναστολείς, NNRTIs, υποδηλώνουν ότι LINE-1-κωδικοποιείται RT μπορεί να θεωρηθεί ως νέο μοριακό στόχο στη θεραπεία του καρκίνου.

Σε αυτή την εργασία δείχνουν την αντικαρκινική δραστικότητα του αβακαβίρη, ένα νουκλεοσιδικό αντίστροφης μεταγραφής αναστολέα (NRTI) επί PC3 και κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου προστάτη LNCaP του μεταστατικού προέλευσης. Επιπλέον, αναφέρουμε για πρώτη φορά ότι η θεραπεία ABC μπορούν να διαμορφώσουν την έκφραση του mRNA LINE-1.

ABC μείωσε σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη, προκαλεί μια καθυστέρηση στην πρόοδο φάση S του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. Αυτή η επιβράδυνση οδηγεί σε μια συνακόλουθη σύλληψη στη G2 /M φάση στα κύτταρα PC3, ενώ LNCaP κύτταρα συσσωρεύεται στην S φάση. Η επίδραση επί του κυτταρικού κύκλου έγινε εμφανής λίγες ώρες μετά τη θεραπεία και κύτταρα εισέρχονται προοδευτικά σε κατάσταση γήρανσης. Η εμφάνιση του γηρασμού που σχετίζονται με μορφολογικές αλλαγές και η έκφραση SA-β-gal αυξήθηκε σταδιακά σε PC3 και LNCaP κύτταρα φθάνοντας το 80% και 50% αντίστοιχα σε 5 ημέρες με προκύπτουσα κυτταρικό θάνατο.

Αντίθετες μετανάστευση καρκινικών κυττάρων και εισβολή είναι ένα κεντρικό θέμα στον καρκίνο του προστάτη. Είναι γνωστό ότι η παρουσία της μετάστασης μειώνει πιθανότητα ασθενούς επιβίωσης και ότι οι επιλογές θεραπείας διαθέσιμες σήμερα σπάνια είναι σε θέση να θεραπεύσει μεταστατικό μορφές. Εδώ αναφέρουμε ότι μαζί με την επίδραση στην κυτταρικού κύκλου, ABC μειώνει το δυναμικό εισβολή και τη μετανάστευση των PC3 και LNCaP κύτταρα.

Με βάση τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων PC3, παρέχουμε προκαταρκτικές γνώσεις σχετικά με τη σχέση μεταξύ της θεραπείας ABC