PLoS One: ινοβλαστών-Προέρχεται Εξωσώματα Συμβολή στην χημειοαντίσταση μέσω του Καρκίνου Αστάρωμα βλαστοκύτταρα σε παχέος Cancer


Αφηρημένο

αντίσταση χημειοθεραπεία σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) μπορεί να σχετίζεται με την παρουσία του καρκίνου βλαστικών κυττάρων ( ΚΕΠ), αλλά ο υποκείμενος μηχανισμός (ες) παραμένουν ασαφείς. Καρκίνωμα που σχετίζονται με ινοβλάστες (CAFS) είναι στενά συνδεδεμένος στην επανεμφάνιση του όγκου, και με στόχο να αυξάνει την χημειο-ευαισθησία. Ερευνήσαμε κατά πόσο οι ινοβλάστες θα μπορούσε να αυξήσει ΚΕΠ προκαλώντας έτσι την αντίσταση χημειοθεραπεία. ΚΕΠ απομονώθηκαν από ασθενή είτε προερχόμενα ξενομοσχεύματα ή κυτταρικές σειρές CRC με βάση την έκφραση του CD133. Πρώτον, ΚΕΠ βρέθηκαν να είναι εγγενώς ανθεκτικοί σε κυτταρικό θάνατο που επάγεται από χημειοθεραπεία. Επιπλέον, ινοβλαστών προερχόμενο ρυθμισμένο μέσο (CM) προωθείται ποσοστό, κλωνογονικότητας και την ανάπτυξη του όγκου του ΚΕΠ (δηλαδή, CD133 + και TOP-GFP +) κατά την αγωγή με 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) ή οξαλιπλατίνη (ΟΞΟ). Περαιτέρω έρευνες επέδειξαν ότι εξωσώματα, απομονωθεί από CM, πήρε ομοίως τα παραπάνω αποτελέσματα. Αναστολή της έκκρισης εξωσωμάτων μειώθηκε το ποσοστό, κλωνογονικότητας και ανάπτυξης όγκου των ΚΕΠ. Συνολικά, τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι, εκτός από τη στόχευση ΚΕΠ, νέες θεραπευτικές στρατηγικές μπλοκάροντας την έκκριση CAFS ακόμη και πριν θα πρέπει να αναπτυχθεί σε χημειοθεραπεία να αποκτήσουν καλύτερη κλινικά οφέλη σε προχωρημένο CRCs

Παράθεση:. Hu Υ, Γιαν C, Mu L, Χουάνγκ Κ, Li Χ, Tao D, et al. (2015) ινοβλαστών-Προέρχεται Εξωσώματα Συμβολή στην χημειοαντίσταση μέσω του Καρκίνου Αστάρωμα βλαστοκύτταρα στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (5): e0125625. doi: 10.1371 /journal.pone.0125625

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Χριστόφορος Heeschen, ισπανικό Εθνικό Κέντρο Καρκίνου (CNIO), Ισπανία

Ελήφθη: 4 Ιαν του 2015? Αποδεκτές: 24, Μάρτη 2015? Δημοσιεύθηκε: 4 Μάη του 2015

Copyright: © 2015 Hu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (. αρ 81172065, 81272660), Πρόγραμμα για New Century εξαιρετικά ταλέντα στο Πανεπιστήμιο (Αρ NCET-12- 0208), Επιστημονικό Ίδρυμα Ερευνών για το επιστρεφόμενο Overseas κινέζικα Υποτρόφων, Υπουργείο Εθνικής Παιδείας (Αρ JYBHG201002), τα Θεμελιώδη Κονδυλίων Έρευνας για τις Κεντρικές πανεπιστήμια (HUST, No.01-18-540005), Tongji Νοσοκομείο ταμεία για τις επέστρεψε στο εξωτερικό επιστήμονες και Εξαιρετική Νέων Επιστημόνων (2012yq004) (όλα με JCQ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μία από τις κύριες αιτίες των θανάτων που σχετίζονται με τον καρκίνο σε όλο τον κόσμο, και η θνησιμότητα του έχει αυξηθεί σταθερά τα τελευταία [1] δεκαετίες. Χημειοθεραπείες δεν έχουν βελτιωθεί δραματικά κλινική έκβαση των ασθενών με υποτροπιάζοντα ή μεταστατικό CRC. Η καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν την αντίσταση στην CRC είναι επιτακτική ανάγκη για την ανάπτυξη πιο αποτελεσματικών θεραπευτικών προσεγγίσεων που μπορεί να ωφελήσει τους ασθενείς CRC.

CRC είναι ετερογενής, εκδηλώνεται διαφοροποιημένα κυτταρική μορφολογία και ιστοπαθολογικές παρουσιάσεις. Πειραματική απόδειξη για την ύπαρξη καρκίνου του βλαστικά κύτταρα (ΚΕΠ) σε CRC δείχθηκε πρόσφατα χρησιμοποιώντας πρωτογενή δείγματα ανθρώπινου όγκου CRC [2, 3]. Τα ΚΕΠ υπέθεσε να είναι εγγενώς ανθεκτικά στη χημειοθεραπεία. Περιοδική CRCs κατά την χημειοθεραπεία συχνά εμπλουτισμένα για τα κύτταρα που εκφράζουν δείκτες CSC όπως ABCB5 [2, 4]. Παρ ‘όλα αυτά, οι υποκείμενοι μηχανισμοί δεν έχουν ακόμη καθοριστεί.

καρκίνωμα που σχετίζονται με ινοβλάστες (CAFS) είναι που συμμετέχει άμεσα στην συντήρηση και την εξέλιξη του όγκου. CAFS επίσης αναφερθεί ότι παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ευαισθησίας του όγκου σε μια ποικιλία από χημειοθεραπείες, και η στόχευση τους δραματικά μειώνει την χημειοαντίσταση [5, 6]. Εδώ, πρέπει πρώτα να επιβεβαιωθεί ότι η χημειοθεραπεία κατά προτίμηση στοχεύει μη-ΚΕΠ λόγω κύτταρο αυτόνομη αντίσταση των ΚΕΠ, και περαιτέρω αποκαλύψει ότι CAFS προνομιακή ΚΕΠ και την αύξηση της αντίστασης στα φάρμακα κατά τη χημειοθεραπεία μέσω ΚΠΑ που προέρχονται εξωσώματα.

Υλικό και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

δείγματα ιστού παχέος αδενοκαρκίνωμα ελήφθησαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργικές επεμβάσεις στο εσωτερικό της Tongji Νοσοκομείο Tongji Medical College, Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλα τα ερευνητικά θέματα και όλα τα πρωτόκολλα έχουν εγκριθεί από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Tongji Νοσοκομείο, Tongji Medical College, Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας (IRB ID: 20141106) και διεξήχθησαν σύμφωνα με τις αρχές της Διακήρυξης του Ελσίνκι .

αντίσωμα και αντιδραστήρια

μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού αντι-ανθρώπινα CD133 και αντισώματα ποντικού αντι-ανθρώπινο EpCAM αγοράστηκαν από τη Miltenyi Biotec (Έδρα, Germany). Αντι-α-SMA αντίσωμα ελήφθη από την Dako (Δανία). Αντι-FAP αγοράστηκε από την Abcam (Cambridge, UK) και αντι-βιμεντίνης αγοράστηκε από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Anti-Wnt3A και αντι-β-ακτίνης αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Alexa Fluor 488-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-IgG ποντικού λήφθηκε από Jackson ImmunoResearch (Pennsylvania, USA). GW4869, 5-φθοριοουρακίλη (5-FU) και η οξαλιπλατίνη (ΟΞΟ) αγοράστηκαν από τη Sigma (St. Louis, USA). Matrigel ελήφθη από B.D. (Franklin Lakes, NJ).

Κυτταρικές γραμμές και κυτταροκαλλιέργεια

Ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου κόλου (SW620) και ανθρώπινα κύτταρα ινοβλαστών που λαμβάνονται από κανονικούς ιστούς κόλου (18Co) αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas VA). ινοβλάστες Cancer σχετιζόμενη (CAFS) απομονώθηκαν από ορθοκολικό δείγματα καρκίνου. κύτταρα SW620, κύτταρα 18Co και CAFS που προέρχονται από πρωτοπαθείς όγκους καλλιεργήθηκαν σε μέσα DMEM (Invitrogen, California, USA) συμπληρωμένο με 10% (τεχνολογίες Life, ΝΥ, USA) FBS σε ένα C υγροποιημένο επωαστή 37 ° με μία ατμόσφαιρα 5% CO

2 και 95% αέρα.

Παρασκευή αιωρήματα μονών κυττάρων από όγκους

Πρωτογενής ορθοκολικούς όγκους ή ξενομοσχεύματος όγκοι κιμά εντελώς με το μέγεθος του 1 χιλιοστού

3 και κατόπιν εναιωρήθηκε σε μέσου DMEM /F12 (Invitrogen, California, USA) που περιέχει 1,5 mg /ml κολλαγενάση ⅳ (Invitrogen, California, USA), 20ug /ml υαλουρονιδάση (Sigma, St. Louis, USA), 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη (τεχνολογίες Life, ΝΥ , USA) και 1.25mg /ml αμφοτερικίνη Β (Sigma, St. Louis, USA) στους 37 ° C για 1 ώρα. Μετά την πέψη, οι ιστοί πλύθηκαν με PBS και διηθείται διαμέσου ενός πλέγματος 40 μm (BD Falcon, CA, USA). Για την εξάλειψη των ερυθρών αιμοσφαιρίων, τα κύτταρα επωάστηκαν με κόκκινο αίμα ρυθμιστικό λύσης κυττάρου (eBioscience, California, USA) σε πάγο για 10 λεπτά και πλύθηκαν δύο φορές με PBS. Τα κύτταρα κατόπιν επαναιωρήθηκαν σε PBS για πειράματα.

Απομόνωση CAFS και καθιέρωση των όγκων ξενομοσχεύματος CRC (XhCRC)

Για την απομόνωση CAFS, μονά κύτταρα που λαμβάνονται από μια γυναίκα ασθενή με ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα Duke Β καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ με 10% FBS. Μετά επωάστηκαν για 3 ώρες, τα μη προσκολλημένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS μακριά, αφήνοντας προσκολλημένα κύτταρα που αποτελούνταν κυρίως από μακροφάγα, επιθηλιακά κύτταρα και ινοβλάστες. Μετά από καλλιέργεια για αρκετές ημέρες, τα μακροφάγα και τα επιθηλιακά κύτταρα πέθαναν, αφήνοντας τα κύτταρα που ήταν παρόμοια με ινοβλάστη και σταθερά α-SMA, βιμεντίνη και FAP θετική. Πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών χρησιμοποιήθηκαν για πειράματα έως δίοδο 10. Για να διαπιστωθεί μοντέλο όγκου ξενομοσχεύματος CRC, μοναδικό κύριο ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα που προέρχονται από μια γυναίκα ασθενή με ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα Duke C εμφυτεύθηκαν σε διμερείς πλάτες των θηλυκών NOD /SCID ποντίκια.

ενεργοποιούμενη με φθορισμό διαλογή κυττάρων (FACS) και ο καθαρισμός του CD133

+/- κύτταρα CRC

Ο FACS διεξήχθη σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή χρησιμοποιώντας ένα FACS Aria II κυττάρων Sorter (BD, Biosciences, CA , ΗΠΑ). Για να διαχωρίσετε CD133

+ και CD133

– κύτταρα /lo στα κύτταρα SW620, κύτταρα σημάνθηκαν με αντισώματα PE /APC-συζευγμένο αντι-ανθρώπινο CD133. Σε γενικές γραμμές, μόνο η κορυφή (CD133

+) και κάτω (CD133

– /lo) 10-20% των κυττάρων καθαρίστηκαν έξω. Για το διαχωρισμό CD133

+ και CD133

– /lo κύτταρα σε ξενομοσχεύματα, XhCRC όγκοι διαχωρίστηκαν σε μεμονωμένα κύτταρα όπως περιγράφεται παραπάνω και στη συνέχεια βάφτηκαν με αντι-ανθρώπινο αντι-ανθρώπινου EpCAM CD133 και ΡΕ-συζευγμένο ποντικού ΑΡΟ-συζευγμένο ποντικού αντισώματα, και EpCAM

+ CD133

+ και EpCAM

+ CD133

– /κύτταρα lo CRC καθαρίστηκαν από

κυτταρικός θάνατος ανάλυση

Ο κυτταρικός θάνατος του. ΚΕΠ και μη-ΚΕΠ αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας την καταμέτρηση των κυττάρων Kit-8 (Dojindo, Ιαπωνία). Εν συντομία, τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλήρες μέσο σε 3000 κύτταρα /φρεάτιο σε πλάκες 96 φρεατίων. Μετά από 12 ώρες μετά τη σπορά, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 5-FU (1 μΜ) ή OXA (1 μΜ). Και 72 ώρες αργότερα, 10 μΐ διάλυμα CCK-8 προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Στη συνέχεια οι πλάκες επωάστηκαν στους 37 ° C για 1 ώρα, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με σάρωση με mircoplate αναγνώστη στα 450nm.

Ρυθμισμένο μέσο παρασκευή

Οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν και καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο DMEM /F12 με 10% FBS για 24 ώρες, και στη συνέχεια πλένονται τρεις φορές με PBS και τελικά καλλιεργήθηκαν σε 3 ml μέσο ελεύθερο DMEM /F12 ορό για 2 ώρες. Ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε και διηθήθηκε μέσω φίλτρου 0,22 μm-(Merck Millipore, Massachusetts, USA) για την απομάκρυνση κυτταρικών υπολειμμάτων.

Απομόνωση και χαρακτηρισμός εξωσωμάτων απελευθερώνεται από ινοβλάστες

Τα εξωσώματα απομονώθηκαν από καλλιεργημένα ινοβλάστες χρησιμοποιώντας Σύνολο εξωσωμάτων Απομόνωση Kit (Invitrogen, California, USA). Εν συντομία, 0,5 ml του συνολικού αντιδραστηρίου απομόνωση εξωσωμάτων προστέθηκε σε κάθε 1 ml διηθούνται ρυθμισμένα μέσα και αναμιγνύεται καλά με αναστροφή. Μετά επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C, το μίγμα φυγοκεντρήθηκε στις 12.000 χ g για 70 λεπτά στους 4 ° C και όλα υπερκείμενο απομακρύνθηκε με αναρρόφηση [7]. σφαιρίδια εξωσωμάτων επαναιωρήθηκαν με μια βολική όγκο μέσου /F12 DMEM. Μία άλλη μέθοδος απομόνωσης εξωσωμάτων εκτελείται με σειριακή φυγοκέντρηση όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8]. Cellular υπερκείμενο κατ ‘αρχάς φυγοκεντρείται στα 2000 χ g για 30 λεπτά, 10.000 χ g για 40 λεπτά για να καταστρέφουν τα νεκρά κύτταρα και τα κυτταρικά υπολείμματα. Και στη συνέχεια, εξωσώματα και διαλυτά κλάσματα εξωσωμάτων-εξαντλημένο διαχωρίστηκαν με υπερφυγοκέντρηση στα 100.000 χ g στους 4 ° C για 70 λεπτά.

Η μορφολογία και το μέγεθος σωματιδίων εξωσωμάτων χαρακτηρίστηκαν μέσω ηλεκτρονικής μικροσκοπίας μετάδοσης (FEI Tecnai 20, Philips) λειτουργούν σε 160kV. πρωτεΐνες εξωσωμάτων εκχυλίστηκαν από εξωσώματα χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό διάλυμα SDS λύσης (250ηΜ Tris-HCL, ρΗ 7,4, 2,5% SDS). Οι πρωτεΐνες φορτώθηκαν σε πηκτώματα SDS-πολυακρυλαμιδίου 10%, μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μεμβράνες νιτροκυτταρίνης. Αντισώματα ποντικού αντι-ανθρώπινο CD81 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA, κλώνος: 1.3.3.22, 1: 100) χρησιμοποιήθηκαν για την ανοσοκηλίδωση. πρωτεϊνικές ζώνες έγιναν ορατές χρησιμοποιώντας Σούπερ σήματος West Femto μέγιστη ευαισθησία του υποστρώματος (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ).

Η αναστολή της απελευθέρωσης εξωσωμάτων

Για να αξιολογηθούν περαιτέρω τα αποτελέσματα εξωσωμάτων, εξωσωμάτων την απελευθέρωση αποκλείστηκε από καλλιέργεια με 10 μΜ GW4869, ενός ειδικού αναστολέα της ουδέτερης σφιγγομυελινάσης 2 (nSMase2) [9]. Μετά από επώαση για 24 ώρες, το μέσο που περιείχε GW4869 απορρίφθηκε και τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS για 3 φορές. Τότε μέσο φρέσκο ​​ϋΜΕΜ /F12 προστέθηκε, και ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε όπως περιγράφηκε ανωτέρω.

Σφαίρα-σχηματισμός δοκιμασία

Βασικές διαδικασίες για δοκιμασία σφαίρα σχηματισμό έχουν περιγραφεί προηγουμένως [10]. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε πρότυπο μέσο σχηματισμού σφαίρας [DMEM /F12 (Invitrogen, California, USA) συμπληρωμένο με 1 χ Β27 υποκατάστατο ορού (Invitrogen, California, USA), 20 ng /ml ανθρώπινο ανασυνδυασμένο επιδερμικό αυξητικό παράγοντα και 20 ng /ml βασικό ινοβλαστικό αυξητικό παράγοντα (Sigma, St. Louis, USA). κύτταρα CRC απλώθηκαν στους 300 ~ 500 κύτταρα /φρεάτιο σε 24 φρεατίων πλάκες εξαιρετικά χαμηλής προσκόλλησης (Corning, Massachusetts, USA) με ή χωρίς τη χορήγηση της 5-FU (1 μΜ) ή OXA (1 μΜ). Για δοκιμασίες σειριακής σφαίρα-σχηματισμό, οι πρώτες σφαίρες γενεά συλλέχθηκαν, αναλυτικά με 0.025% θρυψίνη /ΕϋΤΑ, διηθείται μέσω πλέγματος 40-μm και επανα-επιστρώθηκαν όπως παραπάνω. Αυτή η διαδικασία επαναλήφθηκε για 3 γενιές. Όταν υποβάλλονται σε χημειοθεραπεία, ή /και CM /εξωσώματα, χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ή /και CM (200 μΐ) /εξωσώματα (ίσο με 200 μΐ CM) προστέθηκαν κάθε 2 ημέρες. Μετά από 5 ~ 14 ημέρες, σφαίρες με διάμετρο ≥ 50 μm βαθμολογήθηκαν και εμφανίζονται ως κλωνογενοποιήσεως (%) στα αριθμητικά στοιχεία.

μελέτη των ζώων

πρωτόκολλα των ζώων εγκρίθηκαν από το Πανεπιστήμιο επιτροπή για την χρήση και τη συντήρηση της ζώα (UCUCA) σε Tongji Medical College, Huazhong Πανεπιστήμιο Επιστήμης και Τεχνολογίας. Σε όλα τα πειράματα, η βιωσιμότητα των κυττάρων επιβεβαιώθηκε με trypan δοκιμή αποκλεισμού του μπλε και τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μΐ μίγματος PBS /Matrigel (1: 1 όγκο), ακολουθούμενη από την ένεση στον υποδόριο ιστό του αριστερού και του δεξιού πίσω περιοχή χρησιμοποιώντας ένα 27-gauge βελόνα. κύτταρα SW620 υποδορίως εμφυτεύθηκαν σε ποντικούς 4-εβδομάδων θηλυκά ποντίκια BALB /c-nu, και τα κύτταρα XhCRC εμφυτεύθηκαν σε 4-εβδομάδων θηλυκούς NOD ποντίκια /SCID. Τέσσερις έως πέντε ποντίκια εμβολιάστηκαν ανά ομάδα. CM (200μ) ή εξωσώματα (ίση με 200 μΐ CM) στη συνέχεια εγχύθηκε υποδορίως κάθε 2 ημέρες. Ταυτόχρονα, όλοι οι ποντικοί ενδοπεριτοναϊκή ένεση με ένα χημειοθεραπευτικό παράγοντα, 5-FU (100 mg /kg σωματικού βάρους) ή OXA (10 mg /kg σωματικού βάρους) μία φορά την εβδομάδα. Οι όγκοι παρακολουθήθηκαν, και οι όγκοι του όγκου εξετάστηκαν κάθε τρεις ημέρες. Μετά θανατώθηκαν, οι όγκοι αφαιρέθηκαν από ποντικούς και ζυγίστηκαν για να αξιολογηθεί η ανάπτυξη του όγκου. Για τον περιορισμό δοκιμασίες αραίωσης, 100.000, 10.000, 1.000 και 100 καθαρίζεται CD133

+ και CD133

– κύτταρα /lo CRC εμφυτεύθηκαν inimmunodeficient ποντίκια. Ογκογενή συχνότητα και η στατιστική σημαντικότητα αξιολογήθηκε με το Extreme Περιορισμός Ανάλυση αραίωσης (ΕΛΔΑ) «limdil» λειτουργία (https://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/index.html).

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού περιγράφηκε προηγουμένως [11] .CAFs ή κύτταρα XhCRC καλλιεργήθηκαν σε καλυπτρίδες 0,17-mm ή γυάλινο πυθμένα τρυβλία Petri σε μονοστρωματική τη διάρκεια της νύχτας. Τα κύτταρα στερεώθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη (PFA) επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και ακολουθεί αποκλεισμός σε 5% (w /v) λευκωματίνη βόειου ορού (BSA) σε ρυθμιστικό PBS για 1 ώρα. Πρωτογενή αντισώματα αραιώθηκαν σε 1:50 σε 5% BSA. Μετά επωάστηκε όλη τη νύκτα στους 4 ° C, τα κύτταρα στη συνέχεια ξεπλύθηκαν τρεις φορές με PBS και ακολούθησε επώαση με Alexa Fluor 488 συζευγμένο με δευτερογενή αντισώματα (αραιωμένα 1:50 σε 5% BSA) για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, ϋΑΡΙ (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη, Sigma) χρησιμοποιήθηκε για την οπτικοποίηση πυρήνες κυττάρων για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Διαφάνειες εξετάστηκαν κάτω από ένα συνεστιακό μικροσκόπιο (FV1000, Όλυμπος).

Dil-επισημασμένο εξωσώματα μεταφέρει

Καθαρίστηκε εξωσώματα που προέρχεται από τα κύτταρα 18Co επισημάνθηκαν με λιπόφιλες βαφές fluoescentcarbocyanine με Dil σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Santa Cruz Biotecnology, CA, USA) .18Co-εξωσώματα αιωρήθηκαν σε 100 μΐ PBS και επωάζονται με 1 μΐ Dil για 15 λεπτά στους 37 ° C, πλύθηκαν δύο φορές για να απομακρυνθεί η περίσσεια χρωστικής, και επωάστηκαν με κύτταρα SW620 στους 37 ° C όλη τη νύκτα.

λεντοϊών δοκιμασίες δημοσιογράφος

TCF /LEF δημοσιογράφος οδηγεί την έκφραση της GFP (TOP-GFP) lentivirus αγοράστηκε από την ΟΣΚ Ιατρική Βιοτεχνολογία Εταιρείας, Σαγκάη της Κίνας. κύτταρα SW620 μολύνθηκαν με TOP-GFP lentivirus σε ΜΟΙ = 25 για 72 ώρες. Για δοκιμασίες σχηματισμού σφαίρας, TOP-GFP

+ και TOP-GFP

– κλάσματα διευθετηθεί με FACS και τοποθετήθηκαν σε πλάκες εξαιρετικά χαμηλής προσκόλλησης, όπως περιγράφεται παραπάνω. Για να αξιολογηθούν οι επιπτώσεις της CM /εξωσωμάτων για Wnt δραστικότητα του CD133

+ κλασμάτων, 50000 CD133

+ SW620 κύτταρα μολύνθηκαν με TOP-GFP φακοϊό και επιστρώθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, που ακολουθείται από CM /εξωσώματα θεραπεία ή συν χημειοθεραπεία. Μετά από 3 ημέρες επώασης, η έκφραση της TOP-GFP αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής.

Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± SD. Σε γενικές γραμμές, μη ζευγαρωμένα δύο ουρών του Student

t-test

ή αμφίδρομη δοκιμή ANOVA πραγματοποιήθηκε σε IBM SPSS Statistics 18 να συγκρίνει τις διαφορές μεταξύ των μέσων των διαφόρων ομάδων θεραπείας. Ένα

P

-τιμή & lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

CD133 προσδιορίζει ΚΕΠ σε μια κυτταρική γραμμή CRC και ξένου μοσχεύματος που προέρχεται από πρωτοπαθή όγκο παχέος εντέρου τον καρκίνο

ΚΕΠ είναι ένα σπάνιο πληθυσμό μέσα σε καρκίνο του παχέος εντέρου που παρουσιάζουν αυτο-ανανέωση και την ογκογόνο ικανότητα [12]. Η χρήση του CD133, έναν κατασκευαστή επιφάνεια, για να εμπλουτίσουν ΚΕΠ είναι απαραίτητη για το διαχωρισμό ογκογόνων και μη ογκογόνων κυττάρων [2]. Αρχικά ιδρύθηκε ξενομοσχεύματος όγκοι (XhCRC) που προέρχεται από μια γυναίκα ασθενή με ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα Duke C σε θηλυκά NOD ποντίκια /SCID. Όταν ξενομοσχεύματος όγκοι μεγάλωσαν, οι όγκοι που μεταποιείται σε ενιαίο αναστολές των κυττάρων, και στη συνέχεια διευθετηθεί δύο πληθυσμούς κυττάρων (δηλαδή, EpCAM

+ CD133

+ και EpCAM

+ CD133

– /lo) με βάση την έκφραση της επιθηλιακής δείκτη (δηλαδή, EpCAM) και του υποτιθέμενου δείκτη CSC (δηλαδή, CD133) (Εικ 1Α) .Το καθαρότητα του EpCAM

+ CD133

+ και EpCAM

+ CD133

– /κυττάρων lo ήταν τόσο & gt? 96% (Σχήμα 1Β). Για να επιβεβαιωθεί ότι η EpCAM

+ CD133

+ κύτταρα εμπλουτίσουν ΚΕΠ, πραγματοποιήσαμε τον περιορισμό δοκιμασίες αραίωσης. Όπως αναμενόταν, η EpCAM

+ CD133

+ κύτταρα κατέδειξαν υψηλότερη ικανότητα όγκο παραγωγής (

P

& lt? 0.001) (Σχήμα 1 C). Ομοίως, καθαρίζεται CD133

+ SW620 κύτταρα, μια ευρέως χρησιμοποιούμενη CRC κυτταρική σειρά, επίσης, ξεκίνησε περισσότερο (

P

& lt? 0.001) (Σχήμα 1C). Συνεπής με LDAs, αναλύσεις σειριακό σφαίρα-σχηματισμό έδειξε ότι καθαρισμένο EpCAM

+ CD133

+ κυττάρων ήταν σε θέση να περνιούνται για τουλάχιστον τρεις γενιές και έδειξε μια αυξημένη ικανότητα σφαίρα-πολλαπλασιασμού, ενώ EpCAM

+ CD133

– /lo κύτταρα σχηματίζονται πολύ λιγότερο σφαίρες σε 1

o γενιάς (

P

& lt? 0.001) και EpCAM

+ CD133

– /lo κυττάρων ξεκίνησε σφαίρες ματαιώθηκε από 2

γενιά o (Σχήμα 1δ και 1ε). Επιπλέον, καθαρισμένη CD133

+ SW620 κύτταρα, επίσης παρουσίασε μια προοδευτική αύξηση της ικανότητας σφαίρα-πολλαπλασιαστικό σε σύγκριση με το CD133

– /lo SW620cells (

P

& lt? 0.001) (Σχήμα 1F και 1G ). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι CD133

+ κύτταρα CRC κατείχε μακροπρόθεσμη κλωνογονικότητας στις δύο ξενομοσχεύματος όγκους και SW620 κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι CD133

+ κύτταρα CRC, σε πειραματικές μας σύστημα, μπορεί να εμπλουτίσει για υποθετική ΚΕΠ. Για λόγους απλότητας, από εδώ και πέρα, αναφερόμαστε σε EpCAM

+ CD133

+ ή CD133

+ και EpCAM

+ CD133

– /lo ή CD133

– /lo κύτταρα, όπως τα ΚΕΠ και μη-ΚΕΠ, αντίστοιχα

(Α) Σχηματική CD133 CD133

+ και -. κύτταρα /lo όγκου διαλογής από διαχωρισμένο ορθοκολικού όγκου ξενομοσχεύματος με FACS. (Β) Ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα της μετα-διαλογής ανάλυση των ταξινομημένων CD133

+ και CD133

-. Κύτταρα /lo XhCRC (C) ογκογενή συχνότητα CD133

+ και CD133

– /κύτταρα lo CRC σε ποντικούς με ανοσοανεπάρκεια (ΓΔ) Serial δοκιμασίες σχηματισμού σφαίρας για καθαρισμένη CD133

+ και CD133

– /loCRC κύτταρα (δηλαδή, XhCRC και SW620). Σφαίρες καταμετρήθηκαν (D, F) και οι αντιπροσωπευτικές εικόνες εμφανίζονται (Ε, Ζ) .Scale μπαρ, 100 μm ***

P

& lt.? 0.001.

Η

ΚΕΠ έκθεμα κύτταρο-αυτόνομη χημειοαντίσταση

Όπως έχουν τα ΚΕΠ έχουν αναφερθεί να είναι σχετικά ανθεκτικά στην χημειοθεραπεία [13-16], θα ανακριθεί την ανταπόκριση των ΚΕΠ και των μη-ΚΕΠ με τα συμβατικά χημειοθεραπευτικά μέσα (5-FU ή ΟΞΟ) με δοκιμασίες CCK-8 δραστικότητα. Πράγματι, τόσο XhCRC και SW620 κύτταρα, που προκαλείται από χημειοθεραπεία κυτταρικό θάνατο ήταν σημαντικά μειωμένη σε σχέση με το ΚΕΠ μη ΚΕΠ (Σχήμα 2Α,

P

& lt? 0,01 στην ομάδα 5-FU,

P

& lt? 0.001 στην ομάδα OXA, 2Β,

P

& lt? 0,001), υποδεικνύοντας ότι ΚΕΠ μπορεί να είναι εγγενώς ανθεκτικά στους χημειοθεραπευτικούς παράγοντες. Για να προσδιοριστεί η τελική κυτταρικό φαινότυπο υπεύθυνες για αυτή τη διαφορά, μπορούμε αντιμετωπίζονται χύμα κύτταρα XhCRC και SW620 με 5-FU ή ΟΞΟ για 3 ημέρες, και στη συνέχεια ανιχνεύεται το ποσοστό των κυττάρων που εκφράζουν CD133 με κυτταρομετρία ροής. Όπως ήταν αναμενόμενο, CD133

+ κυττάρων αυξήθηκε 0,5-1 φορές μετά χημειοθεραπευτική αγωγή (Σχ 1D και 1Ε), και επιπλέον, τα απομένοντα κύτταρα CRC (δηλαδή, που περιέχουν περισσότερο CD133

+ κύτταρα) έδειξε επίσης αυξημένο sphere- σχηματίζοντας ικανότητα (Σχήμα 2Ε,

P

& lt? 0,01, 2F,

P

& lt? 0.001), γεγονός που υποδηλώνει ότι η χημειοθεραπεία, πράγματι, εμπλουτίζει ΚΕΠ σε καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω της CSC-κυττάρου αυτόνομα χημειοαντίσταση.

(Α, Β) ανάλυση κυτταρικό θάνατο των ΚΕΠ και μη ΚΕΠ από XhCRC ή κύτταρα SW620 εκτιμήθηκε με δοκιμασία CCK-8 δραστικότητα κατά χημειοθεραπευτική αγωγή (5-FU ή ΟΞΟ). **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001. (C, D) Εμπλουτισμός ΚΕΠ χύμα κύτταρα από XhCRC (C) και τα κύτταρα SW620 (Δ) καθορίστηκε με ανάλυση FACS με βάση την έκφραση CD133 κατόπιν χημειοθεραπεία. ικανότητα του χύδην κυττάρων (XhCRC ή κύτταρα SW620) (Ε, F) Σφαίρα σχηματισμού προ-επεξεργασία με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες ή DMSO (Ctrl). **

P

& lt? 0,01, ***

P

& lt? 0.001.

Η

ινοβλαστών προερχόμενο ρυθμισμένο μέσο γεμάτοι SW620 ΚΕΠ συμβάλλοντας έτσι στην αντίσταση στο φάρμακο

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η μικροπεριβάλλον του όγκου μεσολαβεί αντοχή φαρμάκου [17], και ινοβλάστες καρκίνωμα που σχετίζεται (CAFS), ως σημαντική συνιστώσα της μικροπεριβάλλον, είναι βαθιά που εμπλέκονται σε χημειοθεραπευτικά αντίσταση [18, 19]. Πράγματι, μετά από χημειοθεραπεία, CAFS θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί και να διατηρείται ΚΕΠ ομαδοποιηθεί συμβάλλοντας έτσι στην αντοχή φαρμάκου [20]. Ωστόσο, μια πρόσφατη μελέτη έχει δείξει ότι CAFS, ακόμη και χωρίς την ενεργοποίηση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων, την προώθηση βλαστική ικανότητα όγκου σε καρκίνο του παχέος εντέρου [21], υποδηλώνοντας ότι CAFS μπορεί πρωταρχική κύτταρα CRC να αυξηθεί βλαστική ικανότητα όγκου πριν από τη χημειοθεραπεία, και η οποία μπορεί να συμβάλει έτσι στην θεραπευτική αντίσταση.

για να προσδιορίσετε αν ινοβλάστες προνομιακή ΚΕΠ συμβάλλοντας έτσι στην ανθεκτικότητα στα φάρμακα, συλλέξαμε ρυθμισμένο μέσο από καλλιεργημένα 18Co (18Co-CM) χωρίς τη χορήγηση των χημειοθεραπευτικών παραγόντων. Στη συνέχεια πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς σχηματισμού σφαίρας με 18Co-CM σε SW620 ΚΕΠ κατά τη χορήγηση της 5-FU ή ΟΞΟ. Όπως ήταν αναμενόμενο, 18Co-CM αντιμετωπίζονται SW620 ΚΕΠ δημιουργούνται όλο και μεγαλύτερες σφαίρες από SW620 ΚΕΠ σε μέσο ελέγχου (

P

& lt? 0.001) (Σχήμα 3Α). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση των επιπτώσεων της 18Co-CM in vivo, εμείς εμφυτεύεται 50000 ΚΕΠ υποδορίως σε διμερή πλάτες των θηλυκών ποντικών balb /c-nu (n = 5), οι οποίες ενδοπεριτοναϊκά ένεση με χημειοθεραπευτικούς παράγοντες κάθε εβδομάδα και επίσης έλαβε ένεση 18Co- CM ή μέσο ελέγχου κάθε 2 ημέρες. Σε συμφωνία με

in vitro

αποτελέσματα, 18Co-CM ποντίκια με αγωγή που εκδηλώθηκε υψηλότερη συχνότητα εμφάνισης όγκων, ταχύτερη ανάπτυξη των όγκων και των μεγαλύτερων όγκων, δείχνουν ότι 18Co-CM είναι σε θέση να προστατεύσει ξενομοσχεύματος όγκους από χημειοθεραπεία (Σχήμα 3Β και 3C). Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι οι ινοβλάστες που προέρχονται από εμπλουτισμένο μέσο χωρίς χημειοθεραπεία μπορεί προνομιακή ΚΕΠ και έτσι να προωθήσει χημειοαντίσταση στο CRC.

χωρητικότητα SW620 ΚΕΠ που έλαβαν θεραπεία με 18Co που προέρχονται CM κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας (Α) σχηματισμού σφαίρας (5-FU ή OXA). Αντιπροσωπευτικά μικροσκοπικές εικόνες. Κλίμακα μπαρ, 100 μm. (B, C) 18Co προερχόμενο ρυθμισμένο μέσο επηρεάζεται από την ανάπτυξη του όγκου SW620 ΚΕΠ σε θηλυκά ποντίκια /c-nu Balb κατεργάζεται με OXA. Οι καμπύλες ανάπτυξης όγκου που φαίνεται στο C, που φαίνεται στο D είναι τα βάρη των όγκων και εικόνες στο τέλος των πειραμάτων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD? *

P

& lt? 0.1? **

P

& lt? 0,05? ***

P

& lt? 0.001.

Η

ΚΠΑ που προέρχονται από ρυθμισμένο μέσο γεμάτοι XhCRC ΚΕΠ και προωθείται χημειοαντίσταση

Για να διερευνήσουν κατά πόσον CAFS προνομιακή ΚΕΠ απομονωθεί από ξενομόσχευμα ασθενή προερχόμενο (XhCRC) συμβάλλοντας έτσι στην αντοχή στα φάρμακα. Πρέπει πρώτα διαχωρίστηκαν και καλλιεργήθηκαν πρωτογενείς καρκίνωμα που συνδέεται με ινοβλάστες (CAFS) από μια γυναίκα ασθενή με ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα Duke Β, και ανοσοχρώση επιβεβαίωσε ότι αυτά τα κύτταρα ήταν θετικά για τους δείκτες ινοβλαστών όπως βιμεντίνη [22], α-SMA [23] και FAP [ ,,,0],24] και αρνητικές για τα επιθηλιακά EpCAM κυτταρικό δείκτη [25] (Εικόνα 4Α). Εμείς στη συνέχεια συλλέγονται προσαρμοσμένο μέσο από καλλιεργημένα CAFS (ΚΠΑ-CM) και εκτελούνται δοκιμασίες σφαίρα-σχηματισμό με CAF-CM ή τον έλεγχο μέσο XhCRC ΚΕΠ. Συμφωνεί με ευρήματα σε SW620 ΚΕΠ, ΚΠΑ-CM προώθησε επίσης την ικανότητα σφαίρα δημιουργίας της XhCRC ΚΕΠ και τους προστάτευε από τη χημειοθεραπεία (5-FU ή OXA) (Σχήμα 4C,

P

& lt? 0.001 σε 5-FU ομάδα ,

P

& lt? 0,01 στην ομάδα OXA). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η χημειοθεραπεία μπορούσε όχι μόνο να προκαλέσουν καρκίνο κυτταρικής απόπτωσης αλλά επίσης μεταβάλλει μικροπεριβάλλον του όγκου σε στερεούς όγκους [20, 26]. Για να αξιολογηθεί το κατά πόσον η χημειοθεραπεία κάνει κάποιες διαφορές στις επιδράσεις που προκαλούν όγκο του CAFS, υποβάλλαμε σε αγωγή CAFS με 5-FU /οξα- ή DMSO για 12 ώρες, και μετά από ξέπλυμα χημειοθεραπευτικούς παράγοντες, ρυθμισμένο μέσο συλλέχθηκε όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

. Ωστόσο, τα δεδομένα μας αποκάλυψε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά μεταξύ CAFS χημειοθεραπεία θεραπεία και CAFS DMSO-θεραπεία, όλα τα ΚΠΑ-ΕΛΟΤ θα μπορούσε να ενισχύσει την ικανότητα σχηματισμού σφαίρας των XhCRC ΚΕΠ (Σχήμα 4D,

P

& lt? 0.001 DMSO -Cm /5-Fu έναντι του ελέγχου,

P

& lt? 0,01 OXA-CM έναντι του ελέγχου), πράγμα που σημαίνει ότι CAFS ήδη προνομιακή ΚΕΠ μέσω παρακρινή τρόπο πριν από τη χημειοθεραπεία. Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις επιπτώσεις της CAF-CM στην ανάπτυξη του όγκου των XhCRC ΚΕΠ, εμείς υποδόρια ένεση 50.000 XhCRC ΚΕΠ σε διμερές πλάτες των θηλυκών NOD /SCID ποντίκια (n = 4), η οποία έλαβε ταυτόχρονα OXA και CAF-CM. Συνεπής με το

in vitro

ευρήματα, CAF-CM-θεραπεία XhCRC ΚΕΠ δημιουργούνται ταχύτερα αναπτυσσόμενες και μεγαλύτερους όγκους σε σύγκριση με το μέσο ελέγχου (Σχήμα 4Ε και 4F). Ομοίως, κατά την αγωγή με 5-FU, CAF-CM-αγωγή XhCRC ΚΕΠ κινηθεί περισσότερο όγκους σε σύγκριση με μέσο ελέγχου (Εικ 4G).

(Α) CAFS που προέρχεται από δείγμα ασθενούς επικυρώθηκαν από θετική ανοσοχρώση για CAF δείκτες (α-SMA, βιμεντίνη και FAP) και αρνητική ανοσοχρώση για επιθηλιακά δείκτη (EpCAM). Κλίμακα μπαρ, 30 μm. (Β) XhCRC ΚΕΠ επικυρώθηκαν από θετική ανοσοχρώση για επιθηλιακών δείκτη (EpCAM) και δείκτη CSC (CD133), Κλίμακα μπαρ, 10μm. (Γ) σχηματισμού σφαίρας χωρητικότητα XhCRC ΚΕΠ σε CAFS προερχόμενα ρυθμισμένα μέσα (π.χ., 5-FU, OXA, DMSO-αγωγή CAFS). (D) σχηματισμού σφαίρας χωρητικότητα XhCRC ΚΕΠ σε επεξεργασία με CAF προερχόμενο CM κατά την διάρκεια χημειοθεραπείας (5-FU ή ΟΞΟ). Αντιπροσωπευτικά μικροσκοπικές εικόνες. Κλίμακα μπαρ, 50μm. (Ε, F) CAF προερχόμενο CM επηρεάζονται στην αύξηση του όγκου των XhCRC ΚΕΠ σε θηλυκά NOD /SCID ποντικοί που έλαβαν θεραπεία με OXA. Οι καμπύλες ανάπτυξης όγκου που φαίνεται στο Ε, που φαίνεται στο F είναι τα βάρη των όγκων και εικόνες στο τέλος των πειραμάτων. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD? *

P

& lt? 0.1? **

P

& lt? 0.05. (G) CAF που προέρχονται CM επηρεάζονται στην αύξηση του όγκου των XhCRC ΚΕΠ μεταμοσχεύθηκαν σε θηλυκά NOD /SCID ποντίκια μετά από αγωγή με 5-FU.

Η

Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν σαφώς ότι CAFS προνομιακή ΚΕΠ και έτσι να προωθήσει χημειοαντίσταση σε καρκίνο του παχέος εντέρου μέσω εκκρίνουν διαλυτό παράγοντα (ες).

ινοβλάστες που προέρχονται από εξωσώματα Prime ΚΕΠ να είναι πιο χημειοαντίσταση

Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι εξωσώματα, διαλυτούς παράγοντες που εκκρίνονται από μία ποικιλία κυττάρων , έχουν εμπλακεί στην μετάσταση και αντοχής φαρμάκου [8, 27, 28]. Υποθέσαμε ότι εξωσώματα μπορούσε επίσης να συμβάλει στην αντοχή φαρμάκου σε πειραματικό μας σύστημα. Ως εκ τούτου, πρέπει πρώτα καθαρίζεται εξωσώματα από 18Co-CM και CAF-CM, όπως περιγράφεται στο

Υλικά και Μέθοδοι

, και στη συνέχεια επιβεβαίωσε διαρθρωτικού χαρακτήρα τους, στο πλαίσιο της φάσης-αντίθεσης ηλεκτρονική μικροσκοπία (Σχήμα 5Α) και με ανοσοκηλίδωση των εξωσωμάτων πρωτεΐνης δείκτη CD81 (Σχήμα 5Β). Για να διερευνηθεί κατά πόσο ινοβλαστών-εκκρίνεται εξωσώματα μπορεί να μεταφέρει στα κύτταρα CRC, θα επισημαίνονται εξωσώματα με Dil, μια λιπόφιλη χρωστική fluorescentcarbocyanine. Παρατηρήσαμε ότι Dil-επισημασμένο εξωσώματα προέρχονται από κύτταρα 18Co παρελήφθησαν από SW620 κύτταρα μετά από 12 ώρες συν-επώασης (Εικ 5C). Εμείς στη συνέχεια κατεργάζεται ΚΕΠ με καθαρισμένο εξωσώματα αντί του CM, και διαπιστώθηκε ότι τόσο SW620 και XhCRC ΚΕΠ κατεργάζεται με εξωσώματα δημιουργούνται περισσότερες σφαίρες (

P

& lt? 0,01) (Εικ 5D και 5Ε), γεγονός που υποδηλώνει ότι εξωσώματα, οι οποίες είναι που προέρχονται από ινοβλάστες, μπορεί προνομιακή ΚΕΠ για να γίνει πιο χημειοαντίσταση. Για την περαιτέρω επιβεβαίωση ότι οι ινοβλάστες που εκκρίνεται εξωσώματα και όχι άλλα διαλυτά παράγοντες που λαμβάνουν τα παραπάνω αποτελέσματα, υιοθετήσαμε τυπική απόκλιση υπερφυγοκέντρηση, αντί Σύνολο εξωσωμάτων Κιτ απομόνωσης, να απομονώσει εξωσώματα. Παρόμοια με το κιτ-καθαρίζεται εξωσώματα, CM-pellet επεξεργασμένο SW620 ΚΕΠ σχηματίζονται περισσότερες σφαίρες σε σύγκριση με σφαιρίδια ελέγχου (

P

& lt? 0.001 στην ομάδα 5-FU,

P

& lt? 0,01 σε ομάδα OXA), και η εξωσωμάτων εξαντλημένο υπερκείμενο από 18Co-CM δεν είχε λάβει αυτό το αποτέλεσμα (

NS σφαιρίδιο ελέγχου vs υπερκείμενο

) (Σχήμα 5F). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση αν ινοβλαστών που προέρχονται εξωσώματα μεσολαβούν στην ανθεκτικότητα στα φάρμακα, θα αντιμετωπίζονται ινοβλάστες (18Co και CAFS) με GW4869, ενός ειδικού ουδέτερη σφιγγομυελινάση (nSMase) αναστολέας που μπλοκάρει την απελευθέρωση εξωσώματα, και στη συνέχεια αποκτήθηκε ο CM (δηλαδή, εξωσωμάτων-εξαντλημένο CM) . Συνεπής με τα προηγούμενα ευρήματα, εξωσωμάτων-εξαντλημένο CM μειώθηκε εντυπωσιακά χημειοαντίσταση των ΚΕΠ (Σχήμα 5G,

P

& lt? 0.001, 5Η, στην ομάδα 5-FU,

P

& lt? 0.001 σε OXA ομάδα). Επιπλέον,

in vivo

πειράματα έδειξαν επίσης ότι XhCRC ΚΕΠ, ενώ αντιμετωπίζονται με CAF που προέρχονται εξωσώματα, δημιουργούνται ταχύτερα αναπτυσσόμενη (Εικ 5Θ και 5K) και μεγαλύτερους όγκους (

P

& lt? 0,05 ) (Σχ 5J και 5L) κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας (5-FU ή ΟΞΟ). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν σαφώς ότι ινοβλάστες που προέρχονται από εξωσώματα γεμάτοι ΚΕΠ να είναι πιο ανθεκτικότητα στα φάρμακα.

(Α) Η μετάδοση ηλεκτρονικό μικροσκόπιο εικόνα των εξωσωμάτων που προέρχονται από κύτταρα 18Co και CAFS. Κλίμακα μπαρ, 100nm. (Β) Κηλίδωση Western του CD81 σε εξωσώματα. (C) Αντιπροσωπευτική μικροσκοπία κυττάρων SW620 εκτίθενται σε σημασμένο με Dil εξωσώματα για 12 ώρες. (D, E) σχηματισμού σφαίρας χωρητικότητα SW620 ή XhCRC ΚΕΠ σε επεξεργασία με 18Co /CAF προερχόμενα εξωσώματα κατά την διάρκεια χημειοθεραπείας (5-FU ή ΟΞΟ). (F) σχηματισμού σφαίρας ικανότητα των ΚΕΠ SW620 σε επεξεργασία με υπερφυγοκέντρηση καθαρισμένο 18Co προερχόμενο εξωσώματα κατά την διάρκεια χημειοθεραπείας (5-FU ή ΟΞΟ). (G, H) ινοβλάστες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 mM GW4869 (διαλύεται σε DMSO) για 24 ώρες. Το CMS που προέρχεται από GW4869 /DMSO-προεπεξεργασία ινοβλαστών προστέθηκαν στο ΚΕΠ. (Ι-ί) CAF προερχόμενο εξωσώματα επηρεάζονται στην αύξηση του όγκου των XhCRC ΚΕΠ σε θηλυκά NOD ποντίκια /SCID που έλαβαν θεραπεία με 5-FU ή ΟΞΟ. Οι καμπύλες ανάπτυξης όγκου δείχνεται στο Ι (5-FU) και Κ (ΟΞΟ), και τα βάρη των όγκων και εικόνες στο τέλος των πειραμάτων δείχνονται στο L (5-FU) και J (ΟΞΟ). Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD? *

P

& lt? 0.1? **

P

& lt? 0.05.

Η

Εξωσώματα προνομιακή ΚΕΠ μέσω Wnt σηματοδοτικό μονοπάτι

Έχει ήδη αποδειχθεί ότι η δραστηριότητα σηματοδότηση Wnt είναι ένα λειτουργικό δείκτης για τον καρκίνο βλαστικών κυττάρων και είναι ζωτικής σημασίας για τη διατήρηση βλαστική ικανότητα στο παχύ έντερο καρκίνους. Με έναν τρόπο παρόμοιο με φυσιολογική εντερική βλαστικών κυττάρων, Wnt δραστηριότητα δεν είναι απλώς ένα κύτταρο-εγγενές χαρακτηριστικό που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον καθορισμό του καρκίνου του παχέος εντέρου βλαστοκυττάρων (CSC) του πληθυσμού, αλλά επίσης ρυθμίζεται από την εξωγενή μικροπεριβάλλον [29-32] . Wnt δραστηριότητα είναι συγγενείς με τον παράγοντα παράγοντα Τ-κυττάρων /λεμφικών ενισχυτή (TCF /LEF) της οικογένειας των μεταγραφικών παραγόντων που ενεργοποιούν συγκεκριμένες Wnt γονίδια στόχους [33, 34].

Για να ανακρίνουν αν εξωσώματα προνομιακή ΚΕΠ μέσω Wnt σηματοδότηση

You must be logged into post a comment.