Αφηρημένο

Ιστορικό

τηλέφωνα δωρεάν DNA (cfDNA) κυκλοφορεί σε όλη την κυκλοφορία του αίματος, τόσο υγιείς ανθρώπους και ασθενείς με διάφορες ασθένειες και ενεργεί επί των κυττάρων. Απάντηση στην cfDNA εξαρτάται από τις συγκεντρώσεις και τα επίπεδα των ζημιών εντός cfDNA. Οξειδωμένο εξωκυτταρικό DNA δρα ως ένα σήμα το άγχος και προκαλεί μία προσαρμοστική απάντηση.

Principal Εκτίμηση

Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η οξειδωμένη εξωκυτταρικό DNA διεγείρει την επιβίωση των MCF-7 καρκινικά κύτταρα. Σημαντικά, σε κύτταρα που εκτίθενται σε οξειδωμένη DNA, η καταστολή του κυτταρικού θανάτου συνοδεύεται από αύξηση των δεικτών του γονιδιώματος αστάθειας. Βραχυπρόθεσμη έκθεση σε οξειδωμένη αποτελέσματα του DNA τόσο μονής και διπλής διαλείμματα σκέλος του DNA. Πλέον θεραπείες προκαλέσει μια αντισταθμιστική απάντηση που οδηγεί σε μείωση των επιπέδων της θρυμματισμός χρωματίνης κατά μήκος των κυτταρικών πληθυσμών. Η έκθεση σε οξειδωμένη DNA οδηγεί σε μια μείωση της δραστικότητας του NRF2 και αύξηση της δραστικότητας του ΝΡ-κΒ και STAT3. Ένα μοντέλο που περιγράφει τον ρόλο της οξειδωμένης DNA που απελευθερώνεται από τα αποπτωτικά κύτταρα στη βιολογία του όγκου προτείνεται.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Η επιβίωση των κυττάρων με ένα ασταθές γονιδίωμα μπορεί ουσιαστικά να αυξήσει την εξέλιξη της κακοήθειας. Περαιτέρω μελέτες των επιπτώσεων της εξωκυττάριας DNA σε κακοήθη και φυσιολογικά κύτταρα δικαιολογημένη

Παράθεση:. Kostyuk SV, Konkova MS, Ershova ES, Alekseeva AJ, Smirnova TD, Stukalov SV, et al. (2013) Μια έκθεση στο DNA οξειδωμένης ενισχύει τόσο Αστάθεια του γονιδιώματος και την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων. PLoS ONE 8 (10): e77469. doi: 10.1371 /journal.pone.0077469

Επιμέλεια: Roberto Amendola, ENEA, Ιταλία

Ελήφθη: May 25, 2013? Αποδεκτές: 3 Σεπ 2013? Δημοσιεύθηκε: 17 του Οκτώβρη 2013

Copyright: © 2013 Kostyuk et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από την RFBR (12-04-32081? 12-04-32074), από τις συμβάσεις αρ 14.512.11.0090 και Νο 8273 (στο πλαίσιο της πρόσκλησης Νο 2012-1.1-12-000-2008-067) της το Υπουργείο Παιδείας και Επιστημών της Ρωσίας και η Jeffress Ίδρυμα Grant Νο J-1023. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή δωρεάν κυκλοφορούντων DNA (cfDNA) θραύσματα

κυττάρων μπορεί να συλλεχθεί από το πλάσμα, τον ορό ή άλλα σωματικά υγρά των δύο υγιή άτομα και σε ασθενείς με διάφορες ασθένειες. Τις περισσότερες φορές, τα αποτελέσματα των cfDNA μελετήθηκε χρησιμοποιώντας

in vitro

μοντέλα εξωκυτταρικό DNA (ecDNA), που απομονώθηκε από υπερκείμενα άνευ κυττάρου των καλλιεργημένων κυττάρων [1], είτε ανέπαφο ή εκτεθειμένα σε διάφορους τύπους του οξειδωτικού στρες.

το οξειδωτικό στρες είναι γνωστό ότι προκαλεί κυτταρικό θάνατο. Πεθαίνοντας κύτταρα απελευθερώνουν θραύσματα των οξειδωμένων DNA στην πισίνα cfDNA. cfDNA κυκλοφορεί σε όλο το σώμα και προκαλεί δευτερογενή, συστημικές επιπτώσεις σε απομακρυσμένα όργανα και τους ιστούς. cfDNA εκχυλίζεται από το πλάσμα του αίματος των ασθενών με υψηλά επίπεδα οξειδωτικού στρες είναι γνωστό ότι επηρεάζουν την φυσιολογική δραστικότητα των ακέραιων κυττάρων [1-6]. Σε μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs), αμφότερα ecDNA συλλέγονται από τα μέσα μαζικής ενημέρωσης των πρωτογενών κυττάρων όγκου καλλιέργειες και cfDNA εκχυλίζεται από το πλάσμα των ασθενών με καρκίνο έχουν επηρεάσει την παραγωγή ROS [5]. Σε ινοβλάστες, οξειδωμένα ecDNA προκαλεί μια προσαρμοστική απόκριση που εκδηλώνεται ως μια αύξηση στην αντίσταση των κατεργασμένων κυττάρων να ακτινοβολίας και χρόνιες παράγοντες στρες [7]. Στην πραγματικότητα, τα θραύσματα ecDNA χρησιμεύουν ως σήματα στρες τόσο για την προσαρμοστική απόκριση και για φαινόμενο γειτνιάσεως που αναπτύσσονται σε απόκριση σε χαμηλή δόση ακτινοβολίας σε πολλούς τύπους καλλιεργημένων κυττάρων [1,8-15].

Προηγούμενο

in vitro μελέτες

προφίλ τις διάφορες επιδράσεις της cfDNA /ecDNA σε καλλιεργημένα πρωτογενή κύτταρα, συμπεριλαμβανομένων των ανθρώπινων endotheliocytes [2,3], τα μεσεγχυματικά βλαστικά κύτταρα (MSCs) [5,6], λεμφοκύτταρα [8-10,12] και ινοβλάστες [7], καθώς και καρδιομυοκύτταρα αρουραίου [4] και οι νευρώνες [16]. Ωστόσο, καμία μελέτη μέχρι τώρα έχουν περιγραφεί οι επιπτώσεις της ecDNA επί κυττάρων όγκου, παρά την προφανή συνάφεια του μοντέλου αυτού στη θεραπεία των ανθρώπινων κακοηθειών, ιδιαίτερα λόγω της αφθονίας των δημοσιευμένων παρατηρήσεις που δείχνουν μία αύξηση στις συγκεντρώσεις cfDNA στην κυκλοφορία των ασθενών με καρκίνο [17-25]. Τα καρκινικά κύτταρα διαφέρουν από τα φυσιολογικά κύτταρα από τα αυξημένα επίπεδα της ROS? τα επίπεδα οξείδωσης στο DNA του όγκου είναι επίσης υψηλότερα ότι στο φυσιολογικό ιστό. Πράγματι, τόσο η ακτινοβολία και η χημειοθεραπεία οδηγούν στην οξειδωτική θάνατο μεγάλου αριθμού των καρκινικών κυττάρων, θεωρητικά, με αποτέλεσμα μια μαζική απελευθέρωση του οξειδωμένου cfDNA.

Στη μελέτη αυτή, περιγράφουμε τις επιδράσεις των αυξήσεων οξείδωσης ecDNA και συγκεντρώσεις ecDNA σε διάφορα χαρακτηριστικά των οιστρογόνων (ER) και τον υποδοχέα προγεστερόνης (PR) των κυττάρων του καρκινώματος του μαστού με θετικούς MCF-7. Εδώ μπορούμε να δείξουμε ότι η οξειδωμένη ecDNA επάγουν σε αυτά τα κύτταρα ενός οξειδωτικού στρες που, από τη μια πλευρά, συνοδεύεται από μια αποτυχία να διατηρηθεί η σταθερότητα του γονιδιώματος και, από την άλλη πλευρά, οδηγεί στην ανάπτυξη της προσαρμοστικής απόκρισης που ενισχύει την κυτταρική επιβίωση .

Αποτελέσματα

Οι συγκεντρώσεις των ecDNA στα μέσα μαζικής ενημέρωσης εξαρτάται από τα κύτταρα ανέπαφα MCF-7 ήταν, κατά μέσο όρο, σε 140 ± 20 ng /mL. Επιδράσεις της gDNA και gDNA

ΟΧ αξιολογήθηκαν μετά από προσθήκη διαφόρων συγκεντρώσεων των αντίστοιχων DNA στο μέσο καλλιέργειας. Ακέραια gDNA εκχυλίζεται από πρωτογενή ανθρώπινα εμβρυϊκά ινοβλάστες (HEFs), ενώ gDNA

δείγματα ΟΧ ελήφθησαν ως αποτέλεσμα της θεραπείας της gDNA με H

2O

2, όπως περιγράψαμε πριν από [15]. Τα επίπεδα της 8- oxodG σε gDNA ήταν σε

~ 0,1 8-oxodG ανά εκατομμύριο 2′-δεοξυνουκλεοζίτες, ενώ σε gDNA

ΟΧ αυτά τα επίπεδα ήταν σε ~ 750 8-oxodG ανά εκατομμύριο 2′-δεοξυνουκλεοζιτών [5,7]. Για να εξασφαλιστεί ότι gDNA ταιριάζει gDNA

ΟΧ με μέσο μήκος των θραυσμάτων του και την κατανομή του μεγέθους τους (0,2 έως 15 kb), gDNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις DNAse Ι και του δείγματος που να ταιριάζουν gDNA επιλέχθηκε μετά από ηλεκτροφορητική αξιολόγηση σε πηκτές αγαρόζης. Συγκριτική επιδράσεις της gDNA και gDNA

θεραπείες OX μελετήθηκαν σε τελικές συγκεντρώσεις μέσα ενημέρωσης του 50 ng /mL ή 5 ng /ml, ενώ η έκθεση κυμαινόταν από 30 λεπτά έως 48 ώρες.

1. Εντοπισμός των gDNA και gDNA

ΟΧ στα κύτταρα MCF-7

Για να μάθετε τις ενδοκυτταρικές περιοχές των gDNA και gDNA

ΟΧ, ένας αριθμός ανιχνευτών DNA συντέθηκαν και διαφορικά σημασμένα. gDNA

κόκκινο και pBR322

πράσινο ανιχνευτές σημάνθηκαν χρησιμοποιώντας nick-μετάφρασης με SpectrumRed και SpectrumGreen, αντίστοιχα. Σε κύτταρα MCF-7, gDNA

κόκκινο και pBR322

πράσινη επιδεικνύουν παρόμοια κοκκοποιείται, συσσωμάτωμα χρώσης στην περιφέρεια του κυτταροπλάσματος, ορατή στο 70% περίπου των κυττάρων (Σχήμα 1А). Πιο λεπτομερής ανάλυση έδειξε ότι η ενδοκυτταρική διανομή των ιχνηθετημένων κλασμάτων DNA είναι δείγμα ειδική (Σχήμα 1В). Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με gDNA

κόκκινο και pBR322

πράσινο, ορισμένες περιοχές του κυτταροπλάσματος βάφονται τόσο με ένα, αλλά όχι τον άλλο τύπο επισημασμένου DNA. Περιοχές βάφονται με περισσότερα αλληλουχία-ποικιλόμορφη gDNA

κόκκινο είναι παρόντα σε μεγάλους αριθμούς και καταλαμβάνουν μεγαλύτερο όγκο του κυττάρου. Σε gDNA

κόκκινο χρωματισμένο κύτταρα υπήρχε επίσης μια διάχυτη χρώση κοντά στο πυρηνικό φάκελο που ήταν ορατή σε μια μεγαλύτερη μεγέθυνση (x 200). Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι τουλάχιστον κάποιοι εξωγενείς θραύσματα gDNA εισάγονται στο κύτταρο

– gDNA

κόκκινο, οι πυρήνες χρωματίστηκαν με DAPI (x40).? Β – συγχωνευθεί χρώσης των gDNA

κόκκινο και pBR322

πράσινη (x200)? С – συγχωνευθεί χρώσης των gDNA

κόκκινο-ox και FITC-συζευγμένα αντισώματα σε 8-oxodG (x200)? D – FACS ανάλυση της πρόωρης EEA1 ενδοσωμικό δείκτη? η κατανομή των κυττάρων με διαφορετικά περιεχόμενα EEA1.

Οι τελικές συγκεντρώσεις του προστιθέμενου DNA στα μέσα ενημέρωσης ήταν στα 50 ng /mL? κύτταρα επωάστηκαν με DNA για 30 λεπτά πριν από την καθήλωση σε 3% φορμαλδεΰδη. Σε περίπτωση χρώση με FITC-συζευγμένα αντισώματα σε 8-oxodG, στερεωμένα κύτταρα προκατεργάστηκαν με 0,1% Triton Х100 για διαπέραση.

Η

Για τον προσδιορισμό των ενδοκυτταρικών θέσεις για gDNA

ΟΧ, ένα σύνθετο ανιχνευτή παρήχθη με αργή επαναδιάταξη του nick-μετάφρασης επισημανθεί gDNA

κόκκινο και gDNA

OX (gDNA

κόκκινο-OX). Παρόμοια με gDNA

κόκκινο, αυτό επισημασμένο σύνθετο ανιχνευτής βρίσκεται επίσης στην περιφέρεια του κυτταροπλάσματος (Εικόνα 1С), όμως, στην περίπτωση του σύνθετου ανιχνευτή gDNA

κόκκινο-ΟΧ, ένα σημαντικό μέρος των σημειωμένα θραύσματα ήσαν βρέθηκαν μέσα στο κυτταρόπλασμα του κοντά στον πυρήνα. Για να επιβεβαιωθεί ότι αυτή η διάχυτη χρώση αντιστοιχούσε σε οξειδωμένη DNA, εμείς χρώση των κυττάρων με FITC-συζευγμένα αντισώματα σε 8-oxodG (Σχήμα 1 C). Τα στοιχεία μας δείχνουν ότι gDNA

ΟΧ εισάγεται στο κύτταρο σε σημαντικά μεγαλύτερο βαθμό από ό, τι gDNA. Μετά την είσοδο στο κύτταρο, gDNA

ΟΧ τοποθετεί στο κυτταρόπλασμα, σχηματίζοντας εστίες γύρω από τον πυρήνα.

Ενδοκυττάρωση είναι ένας από τους κοινούς τρόπους παράδοσης των εξωγενών ενώσεων στο κύτταρο. Ο σχηματισμός νέων ενδοσωμάτων συνοδεύεται από μια αύξηση στην έκφραση πρωτεΐνης πρώιμο αντιγόνο ενδόσωμα 1 (EEA1), που είναι γνωστή ως ένα πρώιμο ενδοσωμιακό βιοδείκτη [26]. Χρησιμοποιώντας FACS, αποδείξαμε ότι η έκθεση σε DNA

ΟΧ οδηγεί σε αύξηση της αναλογίας των κυττάρων που εκφράζουν υψηλά επίπεδα EEA1 (Εικόνα 1D). Οι παρατηρήσεις αυτές είναι σε συνεννόηση με οπτικά μοτίβα της ενδοκυτταρικής χρώσης για gDNA

ΟΧ.

Είναι γνωστό ότι η ενδοκυτταρική αισθητήρες είναι ικανά σύνδεσης προς θραύσματα DNA, είτε εντός του κυτταροπλάσματος (AIM2, RIG1, κεντρί) [27 ] ή εντός των ενδοσωμάτων (TLR9) [28]. Είναι ενδιαφέρον, 2-ώρες έκθεσης σε gDNA

ΟΧ διεγείρει την έκφραση του mRNA που κωδικοποιούν AIM2, TLR9 και RIG1 (Πίνακας 1). Δύο αισθητήρες DNA, AIM2 και TLR9, μελετήθηκαν σε περισσότερες λεπτομέρειες (Εικόνα 2).

Γονίδιο Σύμβολο

gDNA, 50 ng mL

gDNA

OX /, 50ng /Ml

Η 2h

48h

2 ώρες

48h

κυτταρικού κύκλου Checkpoint και κυτταρικού κύκλου σύλληψης:

CDKN2A (ρ16ΙΝΚ4)

1.8 ± 0.53.3 ± 0,3 * 1,6 ± 0,1 * 2,5 ± 0,3 *

CDKN1A (p21Cip1 /WAF1)

1.3 ± 0.32.9 ± 0,2 * 1,1 ± 0.22.2 ± 0,2 *

TP53

0,8 ± 0.41.6 ± 0,2 * 2,6 ± 0,3 * 2,1 ± 0,2 * αντι-αποπτωτικά

BCL2

1.2 ± 0.22.5 ± 0,3 * 3,3 ± 0,3 * 3,2 ± 0,2 *

BCL2A1 (Βφλ-1 /Α1)

1.3 ± 0.32.0 ± 0,3 * 5,0 ± 0.3 * 1.8 ± 0.3 *

BCL2L1 (BCL-X)

1,0 ± 0.21.9 ± 0,3 * 1,2 ± 0.31.6 ± 0,3 *

BIRC3 (γ-ΙΑΡ 1)

0,7 ± 0,33. 5 ± 0.4 * 1.8 ± 0.2 * 2.6 ± 0.4 * Διπλή Strand Break επιδιόρθωση του DNA

BRCA1

1,0 ± 0.11.0 ± 0.16.4 ± 0,6 * 2,1 ± 0,5 * υποδοχείς Cytoplasmic DNA:

AIM2

1.2 ± 0.21.3 ± 0.12.2 ± 0,2 * 2,5 ± 0,4 *

RIG1

1,5 ± 0.21.3 ± 0.22.4 ± 0,2 * 1,4 ± 0,3

STING

1.3 ± 0.21. 4 ± 0.21.0 ± 0.21.3 ± 0,3

TLR9

1,6 ± 0,2 * 1,3 ± 0.23.0 ± 0,3 * 1,2 ± 0.2Nrf2-Keap1 Διαδρομή:

NRF2 (NFE2L2)

1.4 ± 0.1 * 1.1 ± 0.12.3 ± 0,1 * 1,2 ± 0,2

KEAP1

0,9 ± 0.11.1 ± 0.13.6 ± 0,2 * 1,0 ± 0.1NFκB Διαδρομή:

MAP4K4

1.1 ± 0.21.5 ± 0.22.0 ± 0,1 * 1,1 ± 0,3

MyD88

1,0 ± 0.22.0 ± 0,2 * 3,6 ± 0,2 * 1,4 ± 0,2

NFKB1

1,6 ± 0,2 * 0,9 ± 0.21.8 ± 0,2 * 1.5 ± 0.4

TIRAP

1,0 ± 0.22.2 ± 0,2 * 2,7 ± 0,3 * 1,3 ± 0.3STAT Οικογένεια:

STAT3

1.2 ± 0.21.8 ± 0,1 * 3,0 ± 0,3 * 1,0 ± 0.2

STAT6

1.2 ± 0.21.8 ± 0,3 * 1,6 ± 0,3 * 1,1 ± 0.3MAPK και JNK /ρ38 Διαδρομή:

ΦΩΣ

1.3 ± 0.21.4 ± 0.31.4 ± 0.21.3 ± 0,3

Ιούνιος

1,6 ± 0,3 * 1,6 ± 0,2 * 2,3 ± 0,3 * 1,9 ± 0,4 *

MAPK8 (JNK1)

0,8 ± 0.21.8 ± 0,2 * 1,3 ± 0.21.3 ± 0,2 κυτοκίνες

IL10

0,8 ± 0.25.3 ± 0,5 * 1,8 ± 0,2 * 4,2 ± 0,4 *

IL6

0,8 ± 0.31.8 ± 0,2 * 2,6 ± 0,3 * 1,9 ± 0,2 *

IL8

1,7 ± 0,2 * 1,1 ± 0.23.2 ± 0,2 * 1,4 ± 0,4

TNFa

1,8 ± 0,2 * 2,2 ± 0,2 * 3,6 ± 0,2 * 2,3 ± 0,3 * κυτταρικής προσκόλλησης και κυττάρων μετανάστευση Μόρια:

ICAM1

0,9 ± 0.21.3 ± 0.22.6 ± 0,3 * 1,6 ± 0,4

PECAM1

1.3 ± 0.21.4 ± 0.21.7 ± 0,2 * 1,2 ± 0,2

sele

1,0 ± 0.11.1 ± 0.22.1 ± 0.3 * 1.0 ± 0.2

SELP

3,7 ± 0,3 * 1,5 ± 0,2 * 1,3 ± 0.21.6 ± 0,3 *

VCAM1

1,5 ± 0.31.9 ± 0,2 * 3,2 ± 0,3 * 1,3 ± 0,2

RhoA

1.3 ± 0.21.2 ± 0.21.6 ± 0,2 * 1,1 ± 0.1Growth Παράγοντες:

BMP2

1,6 ± 0,2 * 1,7 ± 0,2 * 3,0 ± 0,3 * 2,4 ± 0,2 *

BMP4

1.2 ± 0.21.9 ± 0.3 * 2.6 ± 0.4 * 1.4 ± 0.4

VEGFA

1.3 ± 0.21.8 ± 0,4 * 0,7 ± 0.31.4 ± 0.3Pluripotent βλαστικών κυττάρων γονίδια που σχετίζονται με:

Nanog

1.2 ± 0.31.4 ± 0,1 * 1,2 ± 0.21.0 ± 0,2

Oct4

1.2 ± 0.21.5 ± 0,2 * 2,5 ± 0,2 * 1.7 ± 0.1 *

GATA-4

1.1 ± 0.21.5 ± 0,2 * 1,4 ± 0.31.3 ± 0.3Table 1. Οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης επιλέξτε mRNAs μετά από έκθεση των κυττάρων MCF-7 είτε να gDNA ή gDNA

ΟΧ.

Σχετικά επίπεδα έκφρασης είναι ο μέσος όρος για τρεις βιολογικούς επαναλήψεις και τυπική απόκλιση. (*) P & lt? 0.05 – έναντι των κυττάρων ελέγχου, μη-παραμετρικές

U

-test (Mann-Whitney U-τεστ) CSV Λήψη CSV

– ενδοκυτταρικό εντοπισμό της AIM2 (FITC-συζευγμένα αντισώματα) και σημασμένο ανιχνευτή gDNA

κόκκινο-ox (x40). Β – η αναλογία των επιπέδων AIM1 [1] και TLR9 [2] – που κωδικοποιούν τα RNA με το mRNA αναφοράς επίπεδα ΤΒΡ-κωδικοποίηση κύτταρα που εκτίθενται σε gDNA ή gDNA

ΟΧ για 2 ώρες (γκρι στήλες) και 48 ώρες ( μαύρες στήλες)

Γ και Δ -. κυτταρομετρία ροής ανίχνευση AIM2 (C) και TLR9 (D) έκφραση σε MCF-7. Τα κύτταρα βάφτηκαν με AIM2 (C) ή TLR9 (D) αντίσωμα (δευτερογενές ΡΕ-συζευγμένα αντισώματα). Πάνελ D [1] και Ε [1] – κύτταρα ελέγχου οικόπεδα: FL2 έναντι SSC. R: περιφραγμένη περιοχή. Πάνελ C [2], και D [2]: διάμεση ένταση του σήματος του FL2 (R) σε κύτταρα MCF-7 (μέση τιμή για τρία ανεξάρτητα πειράματα). Πάνελ C [3] και D [3]: σχετικές αναλογίες AIM2- ή TLR9-θετικών κυττάρων στην Ε πύλες [1]. Ο φθορισμός του φόντου ποσοτικά χρησιμοποιώντας ΡΕ-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα.

* p & lt? 0,05 έναντι ομάδας ελέγχου των κυττάρων, μη-παραμετρική U-test.

Η

AIM2.

Σε κύτταρα μη συρροή MCF-7, τα επίπεδα του

AIM2

mRNA (Σχήμα 2Β) [1] και η έκφραση πρωτεΐνης (Σχήμα 2C) είναι χαμηλά. Στα κύτταρα ελέγχου, τα επίπεδα πρωτεΐνης του AIM2 συσχετίζονται με το βαθμό της συρροής. Σε μη-συρρέουσες καλλιέργειες, AIM2 εκφράζεται σε περίπου 25% των κυττάρων (Σχήμα 2C [1,3]). Στις καλλιέργειες σε συρροή, η αναλογία των κυττάρων με AIM2 αυξάνει κατά 2 φορές (Σχήμα 2C [1,3]). Αυτές οι αυξήσεις παραλληλίζονται από αυξήσεις των επιπέδων της πρωτεΐνης AIM2 ανά κύτταρο (Σχήμα 2C [2]), ενώ τα επίπεδα του AIM2 κωδικοποιούν mRNAs παραμένουν περίπου η ίδια (Σχήμα 2Β) [1]. Οι παρατηρήσεις αυτές μπορούν να εξηγηθούν από τις επικρατούσες ρύθμιση της δραστηριότητας AIM2 στο επίπεδο της μετάφρασης ή τη σταθερότητά του και όχι στο επίπεδο της μεταγραφής και περιμένουν περαιτέρω έρευνα.

Συγχωνεύεται χρώσης για FITC-συζευγμένα αντισώματα αντι-AIM2 και σημασμένο ανιχνευτή gDNA

κόκκινο-ox φαίνονται στο Σχήμα 2Α. Πολλές βάφονται περιοχές, μάλιστα, επικάλυψη, ενδεχομένως, υποδεικνύοντας μία αλληλεπίδραση μεταξύ gDNA

ΟΧ με αισθητήρες AIM2. Σε κύτταρα καλλιεργημένα MCF-7 εκτέθηκαν σε οξειδωμένη DNA, τα επίπεδα τόσο AIM2 πρωτεΐνης και του mRNA της αυξημένα (Σχήματα 2Β [1] και 2C). Σε AIM2-θετικά πληθυσμό κυττάρων, μια έκθεση είτε οξειδωμένη DNA ή γονιδιώματος DNA για 48 ώρες οδηγεί στην πτώση των επιπέδων AIM2 πρωτεΐνης ανά κύτταρο (Σχήμα 2С [2]).

TLR9.

Σε κύτταρα μη-συρρέουσες MCF-7, τα επίπεδα του TLR9 είναι χαμηλά, με περίπου 20% των κυττάρων χρωματίστηκαν (Σχήμα 2Β [2], D), σε συμφωνία με προηγούμενες μελέτες [28]. Σε συρροή MCF-7 καλλιεργειών, η αναλογία των κυττάρων που εκφράζουν πρωτεΐνη TLR9 αυξάνεται σε περίπου 40% (Σχήμα 2D) [3], μαζί με τις εντάσεις των TLR9 χρώση μεμονωμένων κυττάρων (Σχήμα 2D) [2]. Ομοίως με τα επίπεδα του AIM2 κωδικοποιήσεις mRNAs, τα επίπεδα του TLR9 κωδικοποιήσεων mRNAs παραμένουν αμετάβλητα (Εικόνα 2Β) [2]. Μετά από 2 ώρες από την έκθεση σε οξειδωμένη DNA, τα επίπεδα της αύξησης του mRNA που κωδικοποιεί TLR9, ενώ ποσότητες TLR9 πρωτεΐνης σε μεμονωμένα κύτταρα δεν αλλάζουν.

Η παρατεταμένη έκθεση των MCF-7, για να οξειδωθεί το DNA οδηγεί σε μια μείωση στην ένταση της χρώσης των μεμονωμένων κυττάρων με αντι-TLR9 αντισώματα (Εικόνα 2D) [2]. Νωρίτερα, παρόμοιου τύπου της απόκρισης gDNA και gDNA

ΟΧ παρατηρήθηκε σε καλλιεργημένα ανθρώπινα ινοβλάστες [7]. Όλα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η παρατεταμένη έκθεση σε είτε gDNA ή gDNA

ΟΧ οδηγεί στην μείωση των κυτταρικών επιπέδων των αισθητήρων DNA AIM2 και TLR9 και, ενδεχομένως, σε μερική απευαισθητοποίηση αυτών των κυττάρων σε αποτελέσματα εξωκυτταρικού DNA.

2. Η έκθεση σε gDNA

ΟΧ προκαλεί βραχυπρόθεσμα οξειδωτικό στρες

Για να μελετήσει πιθανή επιρροή της gDNA και gDNA

ΟΧ για τα ενδοκυτταρικά επίπεδα της αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS), η ROS μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας dichlorodihydrofluorescindiacetate ( H2DCFH-DA) χρωστικής που διεισδύει ταχέως κυτταρικές μεμβράνες, και παγιδεύεται στο κυτταρόπλασμα σε αποακετυλιωμένου μορφή. Μη φθορίζον DCFH μετασχηματίζει να φθορίζουν DCF από μία ποικιλία ROS ριζών και, ως εκ τούτου, εξυπηρετεί σαν ένα ευαίσθητο ενδοκυτταρικό δείκτη για το οξειδωτικό στρες [29]. Το Σχήμα 3Α απεικονίζει τα αποτελέσματα της ανάλυσης των επιπέδων ROS στα ζωντανά κύτταρα. Σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, DCF βαφή συσχετίζει διάχυτα με την επιφάνεια του κυττάρου, και μπορεί να αφαιρεθεί από τη μεμβράνη με PBS πλύση. Οι περισσότερες κοινές πηγές των ROS σε κυτταρικής μεμβράνης είναι ένζυμα της οικογένειας NOX [30]. Σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με gDNA (50 ng /mL), H2DCFH-DA λεκέ οπτικοποιεί τόσο την μεμβράνη και κάποια ποσότητα της ενδοκυτταρικής κόκκων. Το PBS πλύση δεν επηρεάζει κυτταροπλασματική χρώση των κόκκων. Πρότυπα των κόκκων DCF και επισημαίνονται gDNA

κόκκινες κηλίδες ανιχνευτή περίπου επικάλυψη (Σχήμα 3C), πιθανώς υποδεικνύει ότι η αλληλεπίδραση των gDNA με μερικά κυτταρικά συστατικά διεγείρει τη βιοσύνθεση των ROS στο χώρο της επικοινωνίας. Αυτή η παρατήρηση ευθυγραμμίζει καλά με αναφέρθηκε προηγουμένως υπόθεση ότι μπορεί να διεγείρει ecDNA κάπως άμεσα ενζυματική δράση των πρωτεϊνών ΝΟΧ [5]

А -. Μικροσκοπία με βάση την αξιολόγηση των κυττάρων MCF-7 διαδοχικά σε επεξεργασία με DNA (50 ng /mL) και H2DCFH-DA (έλεγχος, gDNA, gDNA

ox [1]) και επωάστηκαν για 30 λεπτά (x100). Εναλλακτικά, τα κύτταρα MCF-7 επωάστηκαν με DNA (50 ng /mL) για 1 ώρα που ακολουθείται από προσθήκη H2DCFH-DA και φωτογραφίας 30 λεπτά αργότερα (gDNA

ox [2]). Β – κύτταρα MCF-7 εκτέθηκαν σε gDNA

βόδι (0.5Η? 50ng /mL), διαδοχικά σε επεξεργασία με Mito-Tracker TMRM (15 λεπτά) και H2DCFH-DA (15 λεπτά) (χ200). Γ – Co-ανίχνευση του επισημασμένου ανιχνευτή gDNA

κόκκινο (50 ng /mL) και DCF μετά από 30 λεπτά επώασης. Δ – Τα αποτελέσματα του ποσοτικού προσδιορισμού του φθορισμού χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας [1]. Οι χρονικές κινητική των αποτελεσμάτων του φθορισμού σε κύτταρα διαδοχικά σε επεξεργασία με H2DCFH-DA και, τρία λεπτά αργότερα, ένα δείγμα DNA σε τελική συγκέντρωση 5 ή 50 ng /mL [2]. Το ίδιο για τα κύτταρα προκατεργάστηκαν με DNA (τελική συγκέντρωση 5 ng /mL) για μία ώρα, με επακόλουθη προσθήκη H2DCFH-DA. *) P & lt? 0,05 έναντι ομάδας ελέγχου των κυττάρων, μη-παραμετρική U-test.

Η

σε κύτταρα κατεργασμένα με gDNA

ΟΧ (50 ng /ml), ενδοκυτταρικούς κόκκους ROS παραγωγής προκύψουν γρήγορα, και οι αριθμοί τους είναι ουσιαστικά μεγαλύτερα από ότι στα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με gDNA (Σχήμα 3Α, ένθετο gDNA

ΟΧ [1]). Τα γεγονότα αυτά συνοδεύονται από αλλαγές στην μορφολογία των κυττάρων MCF-7, συμπεριλαμβανομένης της αύξησης του μεγέθους των πυρήνων και κυτταροπλασματικά φούσκωμα. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι παρατηρούμενες κυτταρικών αποκρίσεων είναι γρήγορες και βραχείας ζωής. περιγράφονται αλλαγές στα πρότυπα χρώσης και τη μορφολογία των κυττάρων δει μόνο σε περίπτωση διαδοχικές προσθήκες H2DCFH-DA και gDNA

ΟΧ για MCF-7 των μέσων ενημέρωσης. Όταν τα κύτταρα προ-επεξεργασμένο με gDNA

ΟΧ για 1 ώρα, στη συνέχεια μελετήθηκε χρησιμοποιώντας а χρωστικής H2DCFH-DA, ο αριθμός ROS-σύνθεση κόκκων παρατηρείται σε κύτταρα που ήταν χαμηλότερες και οι εντάσεις τους ήταν λιγότερο έντονο από ό, τι σε περίπτωση μη προεπεξεργασίας πρωτόκολλο (Σχήμα 3А ένθετο gDNA

ΟΧ [2]). Ακόμα πιο ενδιαφέρον, με το πρωτόκολλο προ-θεραπεία, μερικά κύτταρα σταμάτησαν βιοσύνθεση ROS καθόλου, και έγινε ακόμα λιγότερο φωτεινό τότε μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (πιο σκούρα κύτταρα που είναι λιγότερο φθορισμού από το φόντο (Σχήμα 3А ένθετο gDNA

OX (β )).

Τα παρατηρούμενα φαινόμενα επιβεβαιώθηκαν ανεξάρτητα σε μια μελέτη της κινητικής γενιάς DCF χρησιμοποιώντας ποσοτικοποίηση με μία φθορίζουσα συσκευή ανάγνωσης (Σχήμα 3D). Όταν τα κύτταρα MCF-7 υπέστησαν επεξεργασία με DNA αμέσως μετά την προσθήκη του H2DCFH-DA σε παρατηρήθηκε τα μέσα μαζικής ενημέρωσης, μια δραματική αύξηση στην ένταση του φθορισμού DCF. Αυτές οι αυξήσεις ήταν στα υψηλότερα ποσοστά αύξησης κατά τη διάρκεια των πρώτων 20 λεπτών μετά την προσθήκη του DNA στα μέσα μαζικής ενημέρωσης (συντελεστής k1) και, στη συνέχεια, με το χρόνο, αυτά τα ποσοστά πτώσης ( συντελεστής k2) (Σχήμα 3D [1], Πίνακας ένθετο) k1 και k2 συντελεστές εξαρτώνται από τον τύπο και τις συγκεντρώσεις της θεραπείας DNA:. gDNA

ΟΧ (5ng /mL) & gt? gDNA (5ng /mL) & gt? gDNA

ΟΧ (50 ng /mL) ≥ gDNA (50 ng /mL) & gt?. έλεγχος Αυτές οι επιδράσεις δεν παρατηρήθηκαν όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε προεπεξεργασία με DNA για 1 ώρα πριν από την προσθήκη του H2DCFH-DA (Σχήμα 3D) [2].

στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτών των πειραμάτων δείχνουν ότι η θεραπεία με gDNA

ΟΧ επάγει ταχέως βιοσύνθεση ROS στα κύτταρα MCF-7. Παράλληλα, η αντίστροφη διαδικασία της καταστολής της παραγωγής ROS, ή ROS απόσβεση, εκκινείται. Όπως μεγαλύτερα τα ποσά των gDNA

ΟΧ προστέθηκαν στα μέσα ενημέρωσης, η ταχύτερη ήταν η ανάπτυξη των ROS σβέσης.

Ένα μεγάλο μέρος της ενδοκυτταρικής ROS παράγεται από τα μιτοχόνδρια. Η αύξηση του οξειδωτικού μεταβολισμού στα μιτοχόνδρια μπορούν να οδηγήσουν στη διάδοση των ROS σε κυτταρόπλασμα και η επακόλουθη αύξηση της perimitochondrial ανίχνευση των ROS από DCF. Για να ελεγχθεί αυτή η υπόθεση, έχουμε διαδοχικά χρώση τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 50 ng /mL του gDNA

ΟΧ για 30 λεπτά με Mito-Tracker (TMRM κόκκινο) και DCF (Σχήμα 3Β). Η πλειοψηφία των Mito-Tracker και σήματος DCF βρίσκονταν κοντά στο άλλο, με επικαλύπτει μερικώς (κίτρινο σήμα, Σχήμα 3Β). Σε άθικτα κύτταρα, H2DCFH-DA δεν λεκιάζει τα μιτοχόνδρια (Εικόνα 3А, έλεγχος). Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι στα κύτταρα που εκτίθενται σε οξειδωμένη DNA, η πλειονότητα των ενδογενών ROS παράγονται από τα μιτοχόνδρια.

3. Η έκθεση togDNA

ΟΧ διεγείρει την αύξηση των επιπέδων της οξειδωτικής τροποποίησης των κυττάρων »το DNA

Είναι πιθανό ότι η εντατική παραγωγή των ROS παρατηρούνται αμέσως μετά την έκθεση των κυττάρων σε gDNA

ΟΧ μπορεί να οδηγήσει στην βλάβη στο κυτταρικό DNA. Για να οπτικοποιηθεί αυτή η βλάβη, σταθεροποιημένα κύτταρα MCF-7 υπέστησαν χρώση με ΡΕ-επισημασμένο αντι-8-oxodG (Σχήμα 4). Σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, σε MCF-7 καλλιέργειες που κατεργάζονται είτε με gDNA ή gDNA

ΟΧ, οι ποσότητες των χρωματισμένων κυττάρων αυξήθηκαν (Εικόνα 4Α (x20). Σε μεγαλύτερες μεγεθύνσεις, τρεις τύποι χρώσης μπορεί να είναι ανιχνεύεται (Σχήμα 4Β):. (1) – πυρηνική χρώση? (2) – κυτταροπλασματική χρώση? (3) – χρώση για μικροπυρήνες Σε μη επεξεργασμένα πληθυσμοί ελέγχου των κυττάρων MCF-7, ΡΕ-επισημασμένο αντι-8-oxodG αντισώματα κατά κύριο λόγο λεκές μικροπυρήνων. σε πληθυσμούς που έλαβαν θεραπεία με gDNA

ΟΧ, υπήρξε μια αύξηση των ποσών των κυττάρων με πυρηνική χρώση (Σχήμα 4Ε). Όπως και τα προηγούμενα πειράματά μας έδειξαν ότι gDNA

κόκκινο-OX βρίσκεται στο κυτταρόπλασμα και δεν διαπερνούν τον πυρήνα, παρατηρήθηκε χρώση των πυρήνων θα πρέπει να αποδίδεται στη ζημία του δικού του DNA των κυττάρων »

-. Τα κύτταρα βάφονται με ΡΕ-επισημασμένο αντι-8-oxodG αντισώματα και DAPI (x20) Β. – Τρεις τύποι αντι-8-oxodG διανομή κηλίδα παρατηρήθηκε σε κύτταρα επεξεργασμένα με gDNA

ΟΧ (x100). κυττάρων επωάστηκαν με δείγματα DNA για 1 ώρα, μονιμοποιήθηκαν με 3% φορμαλδεΰδη, διαποτισμένη με 0,1% Triton Χ100 και χρωματίστηκαν με αντι -8-oxodG (ΡΕ-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα). Γ – συνεντόπισης των 8-oxodG με μιτοχόνδρια. Τα κύτταρα επωάστηκαν με gDNA

ΟΧ για 0,5 ώρα, обработаны Mito-Tracker (30 ηΜ, 15 min), φωτογραφήθηκαν, κατόπιν σταθεροποιήθηκαν με 3% φορμαλδεΰδη, διαποτισμένη με 0,1% Triton Χ100, χρωματίστηκαν με αντι-8-oxodG αντισώματα (FITC-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα) και φωτογραφήθηκε ξανά. Δ – περιεκτικότητα σε 8-oxodG στα κύτταρα του DNA που εκτίθενται προ-θεραπεία με NAC (ανάλυση FACS). Τα κύτταρα επωάστηκαν με NAC (0.15 mM) για 30 λεπτά, στη συνέχεια εκτίθενται σε gDNA

ΟΧ για 1 ώρα και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας αντι-8-oxodG αντισώματα (ΡΕ-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα). Ο φθορισμός του φόντου ποσοτικά χρησιμοποιώντας ΡΕ-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα. E – σχετικές αναλογίες των πυρήνων χρωματίζονται για 8-oxodG σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου, τα κύτταρα που εκτίθενται σε gDNA, κύτταρα που εκτέθηκαν σε gDNA

ΟΧ (γκρι στήλες). Ανοιχτό γκρι στήλη απεικονίζει κύτταρα προ-αγωγή με NAC και εκτέθηκαν σε gDNA

ΟΧ. * P & lt? 0,05 έναντι ομάδας ελέγχου των κυττάρων, μη-παραμετρική U-test.

Η

Μια αύξηση των μιτοχονδριακών βιοσύνθεση του ROS σε gDNA

ΟΧ εκτεθειμένα κύτταρα αποδείχθηκε παραπάνω (Σχήμα 3В) μπορεί να οδηγήσει σε αύξηση στο επίπεδο της οξείδωσης σε μιτοχονδριακό DNA που, με τη σειρά του, μπορεί να εξηγήσει παρατηρούμενη κυτταροπλασματική χρώση για gDNA

κόκκινο-OX δείχνεται στο Σχήμα 1Γ. Σε σχήμα 4C, μπορεί κανείς να δει ότι μερικοί σημάτων 8-oxodG δεν συγχωνεύονται με gDNA

κόκκινο-OX. Σε κύτταρα προκατεργάστηκαν με αντιοξειδωτική Ν-ακετυλο-κυστεΐνη (NAC) (0.15 mM) για 30 λεπτά πριν την έκθεση σε gDNA

ΟΧ, τα επίπεδα της οξείδωσης σε κυτταρικό DNA ήταν σημαντικά χαμηλότερες σε σχέση με τα κύτταρα που δεν αντιμετωπίζονται με NAC (Σχήμα 4D και 4Ε).

4. Η έκθεση σε gDNA

ΟΧ διεγείρει την αύξηση διαλείμματα σκέλος στο κελί «το DNA

Ένα από τα καλά γνωστό χαρακτηριστικό της οξείδωσης του DNA είναι μια συσσώρευση της μονής και διπλής ρηγμάτων της έλικας DNA (SSB, και DSBs). Για τον ποσοτικό προσδιορισμό των SSB και DSBs σε MCF-7 κύτταρα εκτέθηκαν σε είτε gDNA ή gDNA

ΟΧ, χρησιμοποιήσαμε κομήτη ηλεκτροφόρηση σε αλκαλικές συνθήκες (Σχήμα 5А). καταμετρήθηκαν τρεις τύποι πυρήνων: πυρήνες με ανέπαφο DNA (Σχήμα 5А [1], τύπου Ι)? πυρήνες με κάποιο βαθμό κατακερματισμού της χρωματίνης (τύπου ΙΙ)? πυρήνες με σημαντική κατάτμηση του DNA (τύπος III). Σε περισσότερες περιπτώσεις, οι πυρήνες των μη επεξεργασμένων ελέγχου ταξινομούνται είτε ως τύπου Ι ή τύπου II, ενώ οι πυρήνες τύπου III φαίνεται κυρίως σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με gDNA

ΟΧ. Ανάλογα με το πόσο καιρό τα κύτταρα εκτέθηκαν σε gDNA

ΟΧ, οι αναλογίες του Τύπου III πυρήνων μπορεί να διαφέρουν. Το σχήμα 5Α παρουσιάζει επίσης τις κομήτη στιγμές ουρά [2] και το% ουρά του DNA [3]. Μετά από 30 λεπτά επώασης των κυττάρων MCF-7 με gDNA

ΟΧ, οι ποσότητες DNA σπάει αυξήσει δραστικά, ενώ παρόμοια μεταχείριση με gDNA οδηγεί σε μέτρια αύξηση των επιπέδων της χρωματίνης κατακερματισμού. Μετά από 2 ώρες επώασης είτε με gDNA ή gDNA

ΟΧ, οι ποσότητες DNA σπάει μείωση, και ο αριθμός τους μειώνεται σε κάτω από αυτό που βρέθηκε στις αντίστοιχες πύλη-ειδικών πληθυσμών σε μη κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου.

А – κομήτη δοκιμασία σε αλκαλικές συνθήκες [1]. – Η ψηφιακή φωτογραφία των πυρήνων με διαφορετικό βαθμό της βλάβης του DNA [2,3]? – Σωρευτική ιστογράμματα για τη στιγμή της ουράς και το ποσοστό του DNA μέσα σε ουρές. Η αξιοπιστία των διαφορών με τον έλεγχο στα λαμβανόμενα διανομές αναλύθηκε με τη βοήθεια των στατιστικών Kolmogorov-Smirnov (ο πίνακας δείχνει τις τιμές των D και α)

Β. – DsDNA διαλείμματα στα κύτταρα που εκτίθενται σε gDNA

OX (/mL, 1 ώρα 50ng) .Cells υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για χρώση ανοσοφθορισμού με αντίσωμα αντι γH2AX (x40) [1] .- Τρεις ανιχνεύονται οι τύποι των πυρήνων συμβολίζεται με τους αριθμούς: 1- πυρήνας με πολλαπλές διαλείμματα dsDNA, 2- πυρήνα με μερικά διαλείμματα dsDNA, 3- πυρήνα με άθικτο DNA [2]. – Παράδειγμα μικροπυρήνων με διαλείμματα dsDNA

С – FACS ανάλυση της γ-εστίες Α:. Εκεί κύρια κλάσματα των κυττάρων όπως είναι εμφανές σε gating περιοχές R1, R2, R3 [1], η κατανομή φθορισμού γH2AX εντάσεις [2], οι σχετικές αναλογίες των κυττάρων εντός περιοχών πύλης R1-R3 [3]. * P & lt? 0,05 έναντι ομάδας ελέγχου των κυττάρων, μη-παραμετρική U-test.

Η

Οι παρατηρήσεις που περιγράφηκαν παραπάνω ανεξάρτητα επιβεβαιωθεί χρησιμοποιώντας μια άλλη κοινή τεχνική για την απεικόνιση της ϋδΒδ, μια ανοσοχρώση με αντισώματα κατά της ιστόνης γH2AX, φωσφορυλιώνεται από σερίνη -139. Αυτή η μορφή H2AX είναι γνωστό ότι συσσωρεύονται γρήγορα στο DNA τόπους που πλαισιώνει την θέση ΟΕΔ [31]. MCF-7 κύτταρα χρωματίστηκαν με ΡΙΤΟ-συζευγμένα αντισώματα σε Ser-139 φωσφορυλιωμένη ιστόνη γН2АХ δείχνονται στο Σχήμα 5Β [1]. Βιτρώ διαφάνειες περιλαμβάνονται επίσης τρεις διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς των γН2АХ θετικών κυττάρων. Σε αυτό το πείραμα, τα κύτταρα ταξινομήθηκαν ως τύπου 1 κύτταρα όταν είχαν πολλαπλές εστίες φωσφο-γН2АХ. Τα περισσότερα από τα θετικά κύτταρα γН2АХ ταξινομήθηκαν ως τύπου 2 κύτταρα (μεταξύ 2 και 10 διακριτές γН2АХ εστίες ανά κύτταρο), και Τύπος 3 κύτταρα χωρίς σημάδια της εστιακής χρώσης φωσφο γН2АХ.

Στην χρώση αντι-γН2АХ , η συνολική ένταση φθορισμού του κυττάρου είναι ανάλογη με τον αριθμό των εστιών γН2АХ ανά κύτταρο, και, ως εκ τούτου, να ανέλθει από DSBs. Χρησιμοποιώντας FACS, τρεις περιφραγμένη περιοχές, R1 έως R3, μελετήθηκαν (Σχήμα 5C [1,2]). Κύτταρα εντός πύλη R1 έχουν μεγαλύτερη FL1 (γH2AX)? Αυτό ερμηνεύεται ως πολλαπλές DSBs (κύτταρα τύπου 1, Σχήμα 5Β). Πύλη R2 περιέχει κύτταρα με όχι πολλές γH2AX (Τύπος 2 κύτταρα). Gate R3 περιέχει το μεγαλύτερο αριθμό των κυττάρων? τα περισσότερα από αυτά τα κύτταρα είναι ανέπαφα χωρίς DSBs (Τύπος 3 κύτταρα). Σε MCF-7 καλλιέργειες, μια έκθεση σε gDNA

ΟΧ (1Η) οδηγεί σε 1,5-πτυχώσεις αύξηση του αριθμού των κυττάρων εντός πύλης R1 που παραλληλίζεται με μια μείωση στον αριθμό των κυττάρων εντός R2. Μετά από 24 ώρες έκθεσης σε gDNA

ΟΧ, οι ποσότητες των κυττάρων με πολλαπλούς DSBs μειώνεται, φθάνοντας στα επίπεδα κάτω από αυτά ότι στα μη επεξεργασμένα κύτταρα ελέγχου (Σχήμα 5C) [3]. Μια θεραπεία με gDNA προκαλεί παρόμοια, αλλά λιγότερο έντονη είδος της κυτταρικής απόκρισης ότι το μέγεθός του δεν φθάνει σημασία σε σύγκριση με μη-κατεργασμένα κύτταρα ελέγχου (ρ & gt? 0,05).

Αυτές οι παρατηρήσεις δείχνουν ότι, στα κύτταρα MCF-7, βραχυπρόθεσμη έκθεση σε gDNA

ΟΧ αποτελέσματα τόσο μονής και διπλής διαλείμματα σκέλος του DNA. Μεγαλύτερη διάρκεια της θεραπείας (μεταξύ 2 και 24 ώρες) προκαλούν κάποιο είδος της αντισταθμιστικής απόκρισης που οδηγεί σε μείωση των επιπέδων θρυμματισμός χρωματίνης κατά μήκος των κυτταρικών πληθυσμών.

Η μείωση του ποσοστού των ΟΕΔ που περιέχουν κύτταρα μετά από μικρής διάρκειας έκθεση σε οξειδωμένη ή τον έλεγχο DNA μπορεί να εξηγηθεί είτε με την επισκευή των διαλειμμάτων, είτε με απόπτωση /αποκόλληση των κατεστραμμένων κυττάρων, ή και τα δύο. Να αξιολογήσει αυτές τις δυνατότητες, έχουμε απαριθμούνται τα κύτταρα που παραμένουν στα μέσα ενημέρωσης μετά την απομάκρυνσή του από το στρώμα των κυττάρων, και τα κύτταρα απομακρύνονται από το στρώμα μετά το PBS πλύση. Σε καλλιέργειες που εκτέθηκαν σε οξειδωμένη DNA για 2 ώρες, το ποσοστό μονοκατοικιών κύτταρα παρέμειναν παρόμοιο με αυτόν καλλιέργειες που εκτέθηκαν σε γονιδιωματικό DNA και καλλιέργειες μη-επεξεργασμένα ελέγχου (περίπου 2% του συνολικού ποσού των κυττάρων σε δεδομένη καλλιέργεια). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε πειράματα που αποσκοπούν στην άμεση αξιολόγηση της απόπτωσης (βλέπε παρακάτω). Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι η μείωση του ποσοστού των κυττάρων με DSBs παρατηρείται μετά από έκθεση σε gDNA ή gDNA

ΟΧ οφείλεται σε αύξηση στην επιδιόρθωση του DNA.

5. Η έκθεση σε gDNA

ΟΧ οδηγεί σε αύξηση στο γονιδίωμά αστάθεια

μονής και διπλής διαλείμματα κλώνου DNA είναι γνωστό ότι έχει ως αποτέλεσμα την απώλεια της σταθερότητας του χρωμοσώματος που είναι ιδιαίτερα εμφανής σε ενεργά πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα [32]. Μια διεξοδική μελέτη των πυρήνων των κυττάρων που επωάστηκαν με gDNA

ΟΧ αποκάλυψε έντονη αστάθεια του χρωμοσώματος (Εικόνα 6).