Αφηρημένο

Το μη-ιντεγκρίνης υποδοχέα λαμινίνη, εδώ οριστεί το /67-kDa υποδοχέα λαμινίνη 37-kDa (LRP /LR), εμπλέκεται σε πολλές φυσιολογικά σχετικές διαδικασίες, καθώς και πολλές παθολογικές καταστάσεις. Η υπερέκφραση του LRP /LR σε διάφορες καρκινικές κυτταρικές γραμμές διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο στη μετάσταση των όγκων και την αγγειογένεση. Αυτή η μελέτη διερεύνησε κατά πόσο LRP /LR εμπλέκεται στην διατήρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας σε πνεύμονα και καρκίνο του τραχήλου κυτταρικές σειρές. Εδώ δείχνουμε μια σημαντική μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα στις προαναφερθείσες κυτταρικές γραμμές, ως αποτέλεσμα του siRNA μεσολάβηση μειορύθμιση του LRP. Αυτή η μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα οφείλεται στην αυξημένη αποπτωτική διεργασίες, που αντικατοπτρίζεται από την απώλεια των πυρηνικών ακεραιότητα και τη σημαντική αύξηση της δραστηριότητας της κασπάσης-3. Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι LRP /LR εμπλέκεται στη διατήρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας σε ογκογόνα πνεύμονα και τραχήλου της μήτρας κυττάρων μέσω της απόφραξης της απόπτωσης. Νοκ ντάουν της LRP /LR με siRNA θα μπορούσε να αποτελέσει μια εναλλακτική θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία των πνευμόνων και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας

Παράθεση:. Moodley K, Weiss SFT (2013) Ελάττωση της Λαμινίνης υποδοχέων μη-ιντεγκρίνης Μειώνει Κυτταρικής Βιωσιμότητας από επάγει απόπτωση σε πνεύμονα και καρκίνο του τραχήλου Cells. PLoS ONE 8 (3): e57409. doi: 10.1371 /journal.pone.0057409

Επιμέλεια: Elad Katz, AMS Biotechnology, Ηνωμένο Βασίλειο

Ελήφθη: 21 Νοεμ 2012? Αποδεκτές: 21 Ιαν 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαρτίου, 2013

Copyright: © 2013 Moodley, Weiss. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. NRF, Νότια Αφρική. MRC, Νότια Αφρική. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

λαμινίνες ανήκουν σε μια μεγάλη οικογένεια πρωτεϊνών εξωκυτταρικής μήτρας που εμπλέκονται σε έναν αριθμό βιολογικώς σημαντικών διεργασίες, συμπεριλαμβανομένης της διαφοροποίησης των κυττάρων, η μετανάστευση, προσκόλληση, ανάπτυξη και τη σηματοδότηση [1]. Τα αποτελέσματα της λαμινίνες συχνά μέσω της αλληλεπίδρασης τους με πρωτεΐνες λαμινίνη δέσμευσης ιντεγκρίνης και μη ιντεγκρίνης, που λειτουργούν ως υποδοχείς και σύνδεσμος λαμινίνη στην εξωκυτταρική μήτρα για ενδοκυτταρική σηματοδότηση καταρρακτών [1].

δεσμευτικός Ένα σημαντικό λαμινίνη εταίρος είναι μια πολυλειτουργική πρωτεΐνη, που ορίζεται εδώ ως υποδοχέα λαμινίνη 37-kDa /67-kDa (LRP /LR). Ο υποδοχέας λαμινίνης 67-kDa σχηματίζεται από τον πρόδρομο υποδοχέα λαμινίνης 37-kDa [2], [3]. Ο ακριβής μηχανισμός αυτής της μετατροπής είναι σήμερα ακόμη ασαφείς, ωστόσο, μερικές μελέτες έχουν δείξει ότι η μη γλυκοζυλιωμένη μορφή 37-kDa γίνεται ακυλιώνεται Ser2 μέσω της δράσης των λιπαρών οξέων? και αυτό ακυλίωση είναι ένα κρίσιμο βήμα στην μετατροπή της μορφής 37-kDa με την μορφή 67-kDa [4], [5].

LRP /LR είναι ένα μη-ιντεγκρίνης υποδοχέας κυτταρικής επιφάνειας εμφανίζουν υψηλή συγγένεια με λαμινίνη-1 [6], και έχει βρεθεί να εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα [7], [8], [9], στην επιφάνεια των κυττάρων [10], [11], στην περιπυρηνική διαμέρισμα [7], [12], [13] και στον πυρήνα [12], [13]. Σε κάθε μία από αυτές τις θέσεις, LRP /LR εμπλέκεται σε πολυάριθμες φυσιολογικές διαδικασίες που περιλαμβάνουν τη σύνθεση πρωτεϊνών [8], η ωρίμανση του 40S ριβοσωμικής υπομονάδας [8], που ενεργεί ως υποδοχέας για συστατικά εξωκυττάριας μήτρας π.χ. υδατάνθρακες και ελαστίνη [14], οι αλληλεπιδράσεις με την πρωτεΐνη κυτταρικής πριόν [13], [15] και οι ενώσεις με τις ιστόνες [12].

Εκτός από τις πολυάριθμες φυσιολογικούς ρόλους της, LRP έχει ενοχοποιηθεί σε ένα αριθμό παθολογικές διεργασίες – χρησιμεύει ως υποδοχέας για μολυσματικές πριόν [16], ορισμένα βακτήρια [17], και διάφορους ιούς [18], [19], [20]. Πιο συγκεκριμένα, ένας αριθμός τύπων καρκίνου, όπως γαστρικό [21], του παχέος εντέρου [22], του παχέος εντέρου [23], του τραχήλου της μήτρας [24], του μαστού [25], του πνεύμονα [26], των ωοθηκών [27], παγκρεατικό [28] και του προστάτη [29] καρκίνων, αποκαλύπτουν μία υπερέκφραση του 67-kDa LR στην κυτταρική τους επιφάνεια, η χρήση αντι-LRP /LR ειδικά αντισώματα μείωσαν σημαντικά την πρόσφυση και την εισβολή των καρκινικών κυττάρων

in vitro

[6 ], [30], τα βασικά συστατικά της μετάστασης. Μια ισχυρή συσχέτιση έχει επίσης αποδειχθεί μεταξύ LRP /LR και αγγειογένεση καρκίνου, με την έκφραση αυτής της πρωτεΐνης συσχετίζοντας σε αυξημένη αγγειογένεση όγκου [31]? Ανακαλύψαμε πρόσφατα ότι η LRP ότι /LR ειδικό αντίσωμα, W3, μπλοκάρει την αγγειογένεση [32].

Δεδομένου ότι η στόχευση του LRP /LR επί καρκινικών κυττάρων έχει αποδειχθεί ότι είναι επιτυχής σε σχέση με τη μείωση του όγκου της μετάστασης [6], [30], ο ρόλος αυτού του υποδοχέα στη βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων και την επιβίωση έχει γίνει ένα θέμα μεγάλου ενδιαφέροντος. Η μελέτη αυτή, ως εκ τούτου, με στόχο να αξιολογηθεί η επίδραση του siRNA μεσολάβηση νοκ ντάουν της LRP για τη βιωσιμότητα και την επιβίωση των πνευμόνων και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κυττάρων και να καθοριστούν οι πιθανές τις μηχανιστικές προσεγγίσεις των παρατηρούμενων επιπτώσεων. Πνεύμονα και του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα επιλέχθηκαν για αυτή τη μελέτη, καθώς αντιπροσωπεύουν τις δύο κορυφαίες διαγνωστεί τύπους καρκίνου σε νότιας Αφρικής άνδρες και γυναίκες, αντίστοιχα. Έχουμε δείξει σε αυτή τη μελέτη ότι το siRNA μεσολάβηση knockdown του LRP /LR σε Α549 και κύτταρα HeLa προκάλεσε σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των κυττάρων αυτών. Επιπλέον, δείχθηκε ότι αυτή η μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα ήταν ως συνέπεια των κυττάρων που υφίστανται απόπτωση.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταροκαλλιέργεια και Προϋποθέσεις

Α549 και HeLa κύτταρα ελήφθησαν από την ATCC, καλλιεργήθηκε σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagle Medium (DMEM) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS) και 1% πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και διατηρήθηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 95% αέρα και 5% CO

2.

κυτταρομετρίας ροής

η κυτταρομετρία ροής πραγματοποιήθηκε για να προσδιοριστούν τα επίπεδα της κυτταρικής επιφάνειας του LRP επί Α549 και κύτταρα HeLa. Εν συντομία, τα κύτταρα αποκολλήθηκαν, κατακρημνίσθηκαν και μονιμοποιήθηκαν σε 4% παραφορμαλδεΰδη. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν σε 30 μg /ml του πρωτογενούς LRP-ειδικό αντίσωμα IgG1-iS18 ​​στα έπη ™ θηκάρι Υγρό για 1 ώρα. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν σε Epics ™ Υγρό ελύτρου και επωάστηκαν σε 30 μg /ml αντισώματος κατσίκας αντι-κουνελιού IgG ανθρώπινης διαφημίσεις-FITC δευτερογενές αντίσωμα (Beckman Coulter) σε Epics ™ θηκάρι Fluid. Ακολούθως τα κύτταρα πλύθηκαν σε Epics ™ Υγρό ελύτρου και αναλύθηκαν.

Western Blotting

κηλίδωση Western χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των συνολικών και ρυθμίζεται προς τα κάτω τα επίπεδα πρωτεΐνης του LRP (β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης ) μετά την επιμόλυνση με siRNA-LAMR1. Εν συντομία, τα κύτταρα λύθηκαν, τα επίπεδα πρωτεΐνης ποσοτικοποιείται και 5 μg του ακατέργαστου προϊόντος λύσης κυττάρου διαχωρίστηκαν σε ένα πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 12%. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με ημίξηρη ηλεκτρο-κηλίδωση επί 45 λεπτά. Η μεμβράνη αποκλείστηκε σε 3% BSA, επωάζονται σε 1:10 000 διάλυμα του LRP-ειδικό πρωτογενές αντίσωμα IgG1-iS18 ​​σε 3% BSA σε PBS-Tween για 1 ώρα στους 4 ° C με ανακίνηση. Η μεμβράνη στη συνέχεια πλύθηκε σε PBS-Tween, επωάζονται περαιτέρω σε 1:10 000 διαλύματος δευτερεύοντος αντισώματος αντι-ανθρώπινης POD σε 3% BSA σε PBS-Tween για 1 ώρα στους 25 ° C με ανάδευση, πλένεται όπως πριν και αναλύθηκαν.

siRNA μεσολάβηση Ελάττωση της LRP

Α549 και HeLa κύτταρα επιμολυσμένα για LRP νοκ ντάουν με siRNA αγοράστηκε από Dharmacon, Cat # J-013303-08, σύμφωνα με τις οδηγίες των κατασκευαστών χρησιμοποιώντας DharmaFECT® 1 επιμόλυνσης αντιδραστήριο. Ελέγχου siRNA που χρησιμοποιούνται – Cat # D-001810-01-05

ΜΤΤ Δοκιμασία

0,6 × 10

4 Α549 και 3 × 10

3 κύτταρα HeLa σπάρθηκαν σε το. φρεάτια μιας πλάκας 96 φρεατίων. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με siRNA-SCR ή siRNA-LAMR1, όπως περιγράφεται, και αφέθηκαν να επωαστούν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 95% αέρα και 5% CO

2 για 72 ώρες. 10 μg ΜΤΤ διαλυμένο σε PBS στη συνέχεια προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο ένα αφήνεται να επωαστεί για 2 ώρες όπως προηγουμένως. Το μέσο απορρίφθηκε από κάθε φρεάτιο και τα μωβ κρυστάλλους φορμαζάνης διαλύθηκαν σε 200 μL DMSO. Η απορρόφηση του κάθε φρεάτιο μετρήθηκε στα 570 nm χρησιμοποιώντας αναγνώστη πλάκας ELISA.

μικροσκοπία ανοσοφθορισμού

4 × 10

5 Α549 και 3,5 × 10

5 κύτταρα HeLa σπάρθηκαν επάνω καλυπτρίδες στα φρεάτια μιας πλάκας 6 φρεατίων. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA-SCR και siRNA-LAMR1, όπως περιγράφεται, και επωάστηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 95% αέρα και 5% CO

2 για 72 ώρες. Οι καλυπτρίδες αφαιρέθηκαν και τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε 1% παραφορμαλδεΰδη, χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 (1:10 000 σε PBS) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού.

κασπάσης-3 ενεργοποίησης Δοκιμασία

4 × 10

5 Α549 και 3,5 × 10

5 κύτταρα HeLa σπάρθηκαν σε φρεάτια μιας πλάκας 6 φρεατίων. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA-SCR και siRNA-LAMR1, όπως περιγράφεται, και επωάστηκαν σε υγροποιημένο επωαστή στους 37 ° C με 95% αέρα και 5% CO

2 για 72 ώρες. Η δραστικότητα της κασπάσης-3 αναλύθηκε με τη χρήση της κασπάσης-3 κιτ δοκιμασίας (Sigma-Aldrich) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Στατιστική αξιολόγηση

Δεδομένα αναλύθηκαν στατιστικά με δοκιμή ενός Dunnett χρησιμοποιώντας GraphPad INSTAT. Τα αποτελέσματα θεωρήθηκαν στατιστικά σημαντικές όταν η p-τιμή ήταν μικρότερη από 0,05.

Αποτελέσματα

πνεύμονα και τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας κύτταρα οθόνης υψηλής κυτταρικής επιφάνειας Επίπεδα LRP /LR και τα συνολικά επίπεδα της LRP

Δεδομένου ότι η υπερέκφραση του LRP έχει παρατηρηθεί σε πολλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές, τα επίπεδα της κυτταρικής επιφάνειας του LRP /LR και τα συνολικά επίπεδα LRP επί Α549 και HeLa κύτταρα προσδιορίστηκε με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής και κηλίδωση Western, αντιστοίχως (Σχήμα 1). Η κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι το 83% και το 80% των Α549 και HeLa κύτταρα, αντίστοιχα, που εκφράζεται LRP /LR στην κυτταρική τους επιφάνεια (Σχήμα 1Α και 1Β), οι τιμές αυτές είναι υψηλά σε σύγκριση με το /LR επίπεδο κυτταρικής επιφάνειας LRP (57%) της κυτταρικής σειράς μη ογκογόνα, ΝΙΗ 3Τ3, (τα δεδομένα δεν φαίνονται) και επιβεβαιώνει τα αποτελέσματα που ελήφθησαν σε προηγούμενες μελέτες [30]. LRP βρέθηκε να εκφράζεται σε δύο κυτταρικές σειρές με κηλίδωση Western, επιπροσθέτως, μετέπειτα πυκνομετρική ανάλυση των λαμβανόμενων σημάτων κηλίδας Western αποκάλυψε ότι Α549 και HeLa κύτταρα εμφανίζουν παρόμοια επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης (Σχήμα 1 C).

Α) 83% των Α549 και Β) το 80% των κυττάρων HeLa που εμφανίζονται LRP /LR στην επιφάνειά τους (αριστερά και δεξιά κορυφές είναι αντιπροσωπευτικά των μη-σημασμένων κυττάρων και τα κύτταρα επωάζονται αρχικά με το αντίσωμα αντι-LRP IgG1-iS18 ​​και ακολούθως με αντι κατσίκας Κουνέλι IgG ανθρώπινο διαφημίσεις-FITC δευτερογενές αντίσωμα, αντίστοιχα). Γ) Α549 (διαδρομές 1-3) και HeLa (κανάλια 4-6) κύτταρα εκφράζουν LRP και πυκνομετρική ανάλυση απεκάλυψε μη σημαντική (ρ & gt?. 0.05) διαφορές στα συνολικά επίπεδα LRP μεταξύ των δύο κυτταρικών σειρών

Η

Προσδιορισμός του siRNA μεσολάβηση ελαττωμένη έκφραση της LRP στον πνεύμονα και καρκίνο του τραχήλου Cells

το επίπεδο έκφρασης LRP σε Α549 και HeLa κύτταρα μετά την επιμόλυνση με siRNA-LAMR1 προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας κηλίδωση Western και ποσοτικοποιείται με πυκνομετρία (Σχήμα 2). Η πυκνομετρική ανάλυση των ληφθέντων σημάτων κηλίδας Western απεκάλυψε ότι Α549 (Σχήμα 2Α) και HeLa (Εικόνα 2Β) κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA-LAMR1 εκφράζεται 80% και 60% λιγότερο LRP, αντίστοιχα, σε σύγκριση με μη επιμολυσμένα ελέγχους που τέθηκαν στο 100% .

Το επίπεδο έκφρασης του LRP σε Α549 και HeLa κύτταρα διερευνήθηκε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με siRNA-LAMR1. Η πυκνομετρική ανάλυση των σημάτων κηλίδας Western απεκάλυψε μία σημαντική (** ρ & lt? 0,01) 83% και 60% μείωση στην έκφραση της πρωτεΐνης LRP στο Α) Α549 και Β) κύτταρα HeLa, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τον έλεγχο μη-επιμολυσμένα κύτταρα (σετ 100% ).

Η

το siRNA μεσολάβηση Νοκ ντάουν της έκφρασης LRP προκαλεί σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα του πνεύμονα και τα κύτταρα του καρκίνου του τραχήλου

Η επίδραση του siRNA με τη μεσολάβηση προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης LRP για την κυτταρική βιωσιμότητα σε Α549 και HeLa κύτταρα προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα επωάστηκαν με 8 mM PCA (μία ένωση που είναι γνωστό ότι μειώνουν την κυτταρική βιωσιμότητα μέσω της επαγωγής της απόπτωσης [33]) ως θετικός μάρτυρας και επιμολύνονται με ένα μη-στόχευσης siRNA (siRNA-SCR) ως αρνητικός έλεγχος. 8 mM PCA και siRNA-LAMR1 τιμές συγκρίθηκαν με siRNA-scr αξιών, η οποία είχε οριστεί σε 100%. Τα αποτελέσματα από αυτή τη δοκιμασία δείχνουν ότι η σημαντική (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01) μείωση στη βιωσιμότητα των Α549 και HeLa κύτταρα (13% και 18%, αντίστοιχα) είναι, ως αποτέλεσμα της μειωμένης έκφρασης αυτής της πρωτεΐνης (Σχήμα 3).

Η βιωσιμότητα των Α549 και HeLa κύτταρα αναλύθηκε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με χρήση ΜΤΤ δοκιμασία. Α) Α549 και Β) κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με siRNA-LAMR1 αποκάλυψε μια σημαντική (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0,01) 13% και 18% μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα, αντίστοιχα, σε σύγκριση με siRNA-scr που είχε ρυθμιστεί σε 100% (8 mM PCA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας).

Η

Το siRNA μεσολάβηση ελαττωμένη έκφραση της LRP προκαλεί απώλεια στην Πυρηνική Μορφολογία στον πνεύμονα και τον καρκίνο του τραχήλου της μήτρας κύτταρα

Για να διερευνήσουν ένας πιθανός μηχανισμός για την παρατηρούμενη θανάτου στην κυτταρική βιωσιμότητα σε απόκριση σε LRP knockdown σε Α549 και HeLa κύτταρα, εκτιμήθηκε η πυρηνική μορφολογία των προαναφερθέντων κυττάρων. Α549 και HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA-LAMR1, επωάστηκαν με 8 mM PCA (ένα γνωστό επαγωγέα απόπτωσης [33]) ως θετικός μάρτυρας και επιμολύνθηκαν με siRNA-SCR (αρνητικός έλεγχος). Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με τη φθορίζουσα χρωστική Hoechst πυρηνικό 33324 και προβάλλονται σε ένα μικροσκόπιο ανοσοφθορισμού. Οι πυρηνικές εικόνες που λαμβάνονται για siRNA-LAMR1 συγκρίθηκαν με siRNA-SCR – οι πυρήνες εμφανίζονται στενόχωρα και οριστική απώλεια πυρηνικών μορφολογία και ακεραιότητα παρατηρείται (Σχήμα 4-λευκά βέλη). Επιπλέον, το ποσοστό των κυττάρων που εμφανίζουν μορφολογικές αλλαγές προσδιορίστηκε με μέτρηση του αριθμού των κυττάρων με και χωρίς πυρηνική μορφολογικές αλλαγές σε 3 μικρογραφίες. 56% των κυττάρων Α549 και 91% των κυττάρων HeLa εμφάνισαν πυρηνικής μορφολογικές αλλαγές σε απόκριση σε θεραπεία siRNA-LAMR1 (7% και 8% των siRNA-scr επεξεργασμένα κύτταρα Α549 και κύτταρα HeLa, αντίστοιχα, έδειξε πυρηνική μορφολογικές αλλαγές).

72 ώρες μετά την επιμόλυνση, Α549 και HeLa κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 και είδαν με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού. Κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA-LAMR1 εμφανίζουν μειωμένη πυρηνική ακεραιότητα – υποδεικνύεται με λευκά βέλη (8 mM PCA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας)

Η

siRNA μεσολάβηση Νοκ ντάουν της LRP οδήγησε σε σημαντική αύξηση στην κασπάσης-3 Δραστηριότητα. στον πνεύμονα και καρκίνο του τραχήλου Cells

Η δραστηριότητα της απόπτωσης που σχετίζεται με πρωτεΐνη τελεστή, κασπάσης-3, για την αντιμετώπιση της siRNA μεσολάβηση μειορύθμιση της έκφρασης LRP σε Α549 και κύτταρα HeLa εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ένα Η ενεργοποίηση της κασπάσης-3 χημική δοκιμή. Α549 και HeLa κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA-LAMR1, επωάστηκαν με 8 mM PCA (-α απόπτωσης επαγωγέα [33] – θετικός έλεγχος) και επιμολύνθηκαν με siRNA-SCR (αρνητικός έλεγχος). Η δραστικότητα της κασπάσης-3 από κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA-LAMR1 συγκρίθηκε με εκείνες που μορφομετατρέπονται με siRNA-SCR (που είχε οριστεί στο 100%)? Αυτά τα αποτελέσματα αποκαλύπτουν μια σημαντική (** ρ & lt? 0,01, *** ρ & lt? 0.001). αύξηση στη δραστικότητα της κασπάσης-3 σε Α549 και κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με siRNA-LAMR1 (9% και 83%, αντίστοιχα) (Εικόνα 5)

Η δραστηριότητα της απόπτωσης που σχετίζεται με πρωτεΐνη, κασπάσης-3, σε Α549 και HeLa κύτταρα αναλύθηκε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση. Α) Α549 και Β) κύτταρα HeLa επιμολυσμένα με siRNA-LAMR1 αποκαλύπτουν μια σημαντική (* ρ & lt? 0,05, ** ρ & lt? 0.001) 9% και 83% αύξηση στην δραστικότητα της κασπάσης-3, αντίστοιχα, σε σύγκριση με το siRNA-scr οποία έχει έχει οριστεί σε 100% (8 mM PCA χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας).

Η

Συζήτηση

Ο ρόλος του υποδοχέα λαμινίνης στην εξέλιξη του καρκίνου είναι ένα θέμα μεγάλου ενδιαφέροντος για πολλούς χρόνια και έχει ως εκ τούτου ερευνηθεί εκτενώς. Πολυάριθμες μελέτες έχουν εμπλέξει κυτταρική επιφάνεια LRP /LR στην εξέλιξη του καρκίνου – αυτός ο υποδοχέας υπερεκφράζεται στην επιφάνεια ενός αριθμού των καρκινικών κυτταρικών σειρών, που τους παρέχει τη δυνατότητα να εισβάλουν και μετάσταση περιβάλλοντες ιστούς [6], [30]. Δεδομένου ότι LRP /LR εμπλέκεται σε έναν αριθμό κυτταρικών διαδικασιών και βρίσκεται σε πολυάριθμες κυτταρικές θέσεις (στην κυτταρική επιφάνεια, το κυτταρόπλασμα, το περιπυρηνική διαμέρισμα και ο πυρήνας), επιπλέον ρόλοι αυτού του υποδοχέα στην πρόοδο του καρκίνου έχουν προταθεί.

Για να επιβεβαιωθεί η έκφραση του LRP /LR σε Α549 και HeLa κύτταρα, η κυτταρική επιφάνεια και τα συνολικά επίπεδα αυτής της πρωτεΐνης διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής και κηλίδωση Western, αντιστοίχως (Σχήμα 1). Τα ογκογόνα πνευμόνων και του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας κυττάρων εμφανίζεται τόσο LRP /LR στην επιφάνειά τους, και το επίπεδο αυτής της πρωτεΐνης επί της επιφάνειας αυτών των κυττάρων βρέθηκε να είναι υψηλότερο από το επίπεδο που παρατηρήθηκε στο μη ογκογόνο κυτταρική σειρά ΝΙΗ 3Τ3 (ποντικός εμβρυϊκών ινοβλαστών ). Αυτό το εύρημα επιβεβαιώνει την προηγούμενη έρευνα, και προτείνει έναν ρόλο για αυτόν τον υποδοχέα στην εξέλιξη των κυττάρων από το να είναι φυσιολογικό να γίνει καρκινικό. Επιπλέον, τα ογκογόνα πνεύμονα και του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα εκφράζουν τόσο LRP εσωτερικά, και η διαφορά στο εσωτερικό επίπεδο της πρωτεΐνης αυτής σε αυτές τις κυτταρικές σειρές είναι ασήμαντη.

Για να ερευνηθεί ο ρόλος του LRP /LR στον καρκίνο σχετίζονται /κυτταροτοξικών διεργασίες, η έκφρασή του ήταν σημαντικά μειωμένη στην ογκογόνο πνεύμονα και του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα. siRNA που κατευθύνεται έναντι LRP mRNA μορφομετατράπηκε εντός των προαναφερθέντων κυττάρων και το ποσοστό των LRP αρνητική ρύθμιση αξιολογήθηκε με πυκνομετρική ανάλυση που λαμβάνεται σημάτων κηλίδα western (Σχήμα 2). Το επίπεδο έκφρασης LRP μειώθηκε κατά 83% και 60% σε Α549 και HeLa κύτταρα, αντίστοιχα, γεγονός που δείχνει την αποτελεσματικότητα του siRNA που χρησιμοποιήθηκε.

Το αποτέλεσμα της knockdown έκφρασης LRP στην βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων , το οποίο είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της νόσου, διερευνήθηκε. LRP μειορρύθμιση βρέθηκε να συσχετίζεται με μία σημαντική μείωση της βιωσιμότητας των Α549 και κύτταρα HeLa (Εικόνα 3), υποδεικνύοντας ένα κρίσιμο ρόλο για LRP σε αυτή τη διαδικασία. Δεδομένου ότι η διατήρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας είναι επιτακτική για τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, η πρόταση ότι LRP εμπλέκεται στην διατήρηση αυτής της διαδικασίας περαιτέρω εμπλέκει την πρωτεΐνη αυτή στην ασθένεια.

Μία μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα ωστόσο επίσης παρατηρήσει μεταξύ μη επιμολυσμένα και τα δείγματα siRNA-scr σε κύτταρα HeLa (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) και το αντιδραστήριο επιμόλυνσης DharmaFECT® 1 δείχθηκε να είναι ο αιτιολογικός παράγοντας σε αυτή την μείωση (βλέπε συμπληρωματικά δεδομένα – Εικόνα S1).

προκειμένου να διερευνηθεί εάν απόπτωση (μια μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου) προκλήθηκε σε ογκογόνα πνεύμονα και του τραχήλου της μήτρας τα καρκινικά κύτταρα ως συνέπεια της LRP knockdown, και ως εκ τούτου είναι υπεύθυνη για την παρατηρούμενη μείωση στην κυτταρική βιωσιμότητα, αξιολογήσαμε πιθανές αλλαγές στην πυρηνική μορφολογία του το κύτταρο και το επίπεδο της δραστηριότητας της απόπτωσης που σχετίζεται με πρωτεΐνη τελεστή – κασπάσης-3 (βασικές διεργασίες ενδεικτική της επαγωγής απόπτωσης [34], [35], [36], [37], [38]). Η παρουσία αποπτωτικών Α549 και HeLa κύτταρα μετά την επιμόλυνση με siRNA-LAMR1 ταυτοποιήθηκαν με ορατό διαταραχές στην πυρηνική μορφολογία τους (σχήμα 4), καθώς και από τη σημαντική αύξηση της δραστηριότητας της κασπάσης-3 (Σχήμα 5).

ο ρόλος του LRP στη διατήρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας έχει αναφερθεί σε προηγούμενες μελέτες [7], επιπρόσθετα, η επαγωγή της απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα σε απόκριση προς LRP μειορρύθμιση έχει επίσης αποδειχθεί [39]. Αυτή η μελέτη έχει επιβεβαιώσει τον ρόλο του LRP στη διατήρηση της κυτταρικής βιωσιμότητας, καθώς και την επαγωγή απόπτωσης μετά την knockdown αυτής της πρωτεΐνης. Περαιτέρω, η μελέτη αυτή έδειξε ότι η επαγωγή της απόπτωσης διαμεσολαβείται τόσο από την απώλεια στην πυρηνική ακεραιότητα και σημαντικά αυξημένη δραστικότητα της κασπάσης-3 σε αυτά τα κύτταρα.

Δεδομένου ότι ο υποδοχέας λαμινίνη είναι φυσιολογικώς λειτουργικό στην περιπυρηνική διαμέρισμα [ ,,,0],7], [12], [13] και ο πυρήνας [12], [13], δεν ήταν έκπληξη το γεγονός ότι ο knockdown αυτού του υποδοχέα θα μπορούσε να επηρεάσει την ακεραιότητα του πυρήνα. Τόσο η διάσπαση των πυρηνικών μορφολογία και η αυξημένη δραστηριότητα της απόπτωσης που σχετίζεται με πρωτεΐνη, κασπάσης-3, είναι ενδεικτικά της απόπτωσης, γεγονός που υποδηλώνει έναν κεντρικό ρόλο για LRP /LR στην παρεμπόδιση αυτής της μορφής κυτταρικού θανάτου. Εντούτοις, η ποσοτικοποίηση αποκάλυψε ότι 91% των siRNA-LAMR1 επεξεργασμένα κύτταρα HeLa, αλλά μόνο το 56% των siRNA-LAMR1 επεξεργασμένα κύτταρα Α549 αποκάλυψε πυρηνικό μορφολογικές αλλαγές (7% και 8% των siRNA-scr αγωγή Α549 και HeLa κύτταρα, αντίστοιχα, αποκάλυψε πυρηνικό μορφολογική αλλαγές). Από την knockdown του LRP σε κύτταρα HeLa (60%) ήταν χαμηλότερη σε σύγκριση με κύτταρα Α549 (83%) προτείνουμε ότι LRP /LR παρεμποδίζει την απόπτωση σε μεγαλύτερο βαθμό σε τραχήλου καρκινικά κύτταρα σε σύγκριση με καρκινικά κύτταρα πνεύμονα. Δεδομένου ότι το 83% των κυττάρων HeLa αλλά μόνο το 9% των κυττάρων Α549 αποκάλυψε αυξημένη κασπάσης-3 δραστικότητα μετά από θεραπεία siRNA-LAMR1, προτείνουμε περαιτέρω ότι απόπτωσης σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα μπορεί να συμβεί κυρίως μέσω της κασπάσης-3 ανεξάρτητους μηχανισμούς όπως EndoG ή /και ΟΕΕ μεσολάβηση διεργασιών

Οι λειτουργίες του LRP /LR σε πολλαπλασιασμό του καρκίνου είναι πολυάριθμα:. αυξημένη εισβολή [6], [30], μετάσταση [6], [30] και τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό [7], καθώς και μειωμένη κυτταρική βιωσιμότητα [7] και απόπτωση [39] διαμεσολαβούνται από την πρωτεΐνη αυτή. Στόχευση LRP /LR μπορεί, συνεπώς, να αναπτυχθεί ως μια στρατηγική για να παρεμποδίσει τις προαναφερθείσες διαδικασίες που εμπλέκονται στην εξέλιξη του καρκίνου. Επιπλέον, η στόχευση LRP /LR για τη πιθανή θεραπεία αυτών των διαδικασιών έχουν επιτευχθεί σε έναν αριθμό των καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Αυτό επομένως σημαίνει ότι ένας /LR σχετίζονται θεραπεία LRP θα μπορούσε δυνητικά να χρησιμοποιηθεί για τη θεραπεία των πολυάριθμων διακριτών καρκίνων. Εντούτοις, πρέπει να τονιστεί ότι αυτός ο υποδοχέας εμπλέκεται σε πολλές φυσιολογικές διεργασίες σε φυσιολογικά κύτταρα, συμπεριλαμβανομένης της κυτταρικής ανάπτυξης, διαφοροποίησης, την κυκλοφορία και την προσάρτηση [9], [11], και η knockdown του LRP σε αυτά τα κύτταρα θα οδηγήσει σε ανεπιθύμητη ομοιοστατική διαταραχές. Η στόχευση της LRP αποκλειστικά σε καρκινικά κύτταρα είναι, επομένως, επιτακτική ανάγκη για χρήση του ως θεραπευτική εναλλακτική λύση.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Η επίδραση του siRNA-SCR και DharmaFECT® 1 αντιδραστηρίων για την κυτταρική βιωσιμότητα. Τα κύτταρα επωάστηκαν με siRNA-scr, DharmaFECT® 1 αντιδραστήριο ή και τα δύο, και 72 ώρες αργότερα, η κυτταρική βιωσιμότητα αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ. Κύτταρα μετεμβολιασμένα με siRNA-scr εμφανίζουν παρόμοια βιωσιμότητα, ενώ DharmaFECT® 1 και siRNA-scr + DharmaFECT® 1 κύτταρα επεξεργασμένα εμφανίσει ένα 8% και 9% μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων, αντίστοιχα, σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (επωάστηκαν για 72 ώρες σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% (ν /ν) FCS)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0057409.s001

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

ευχαριστούμε Uwe Reusch, Stefan Knackmuss και Melvyn Μικρή βοήθεια που παράγουν IgG 1-iS18. Θέλουμε να ευχαριστήσουμε τον Δρ Κλήμης Penny για βοήθεια με μικροσκοπία ανοσοφθορισμού.