Αφηρημένο

Ο καρκίνος που σχετίζεται ινοβλάστες (CAFS) είναι υπεύθυνες για την ανάπτυξη του όγκου, αγγειογένεση, εισβολή και μετάσταση. Μεταλλοπρωτεϊνάσης μήτρας (ΜΜΡ) -9 εκκρίνονται από το στρώμα του καρκίνου που κατοικείται από CAFS αποτελεί προϋπόθεση για την αγγειογένεση και μετάσταση του καρκίνου. έχουν Ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (ωμέγα-3 PUFA) έχουν αναφερθεί ότι έχουν αποτελέσματα κατά του όγκου επί διαφόρων τύπων κακοηθειών. Fat-1 ποντίκια, τα οποία μπορεί να μετατρέψει ωμέγα-6 προς ωμέγα-3 PUFA ανεξάρτητη της διατροφής, είναι χρήσιμα για τη διερεύνηση των λειτουργιών του ενδογενούς ωμέγα-3 PUFA. Για να εξεταστεί η επίδραση των ω-3 PUFA για ογκογένεση, κύτταρα TC-1, ένα ποντικού επιθηλιακή κυτταρική γραμμή αθανατοποιημένα με ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) ογκογονίδια, ενέθηκαν υποδορίως σε λίπος-1 ή άγριου τύπου ποντικούς. Η ανάπτυξη του όγκου και την αγγειογένεση του όγκου TC-1 ήταν σημαντικά κατέστειλε σε λίπος-1 σε σύγκριση με τους ποντικούς άγριου τύπου. cDNA microarray των όγκων που προέρχονται από ποντίκια τύπου fat-1 και άγρια ​​αποκάλυψε ότι η ΜΜΡ-9 ρυθμίζεται μειωτικά σε λίπος-1 ποντίκια. Ανοσοϊστοχημική μελέτη έδειξε ανοσολογική αντίδραση για την ΜΜΡ-9 στους ινοβλάστες στρωματικών όγκων ήταν διάχυτα θετικά στην άγριου τύπου, ενώ εστίασης σε λιπαρά 1-ποντίκια. ΜΜΡ-9 εκφράζεται σε πρωτογενείς καλλιεργημένους ινοβλάστες που απομονώθηκαν από ποντίκια λίπος-1 και άγριου τύπου αλλά δεν εκφράστηκε σε κύτταρα TC-1. Συν-καλλιέργεια των ινοβλαστών με κύτταρα TC-1 ενίσχυσε την έκφραση και τη δραστικότητα πρωτεϊνάσης της ΜΜΡ-9, αν και η δραστηριότητα της πρωτεάσης του ΜΜΡ-9 σε λίπος-1 που προέρχεται από ινοβλάστες ήταν χαμηλότερη από ότι σε ινοβλάστες άγριου τύπου. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα καταστέλλουν ΜΜΡ-9 επαγωγής και αγγειογένεση όγκου. Τα ευρήματα αυτά μπορούν να παρέχουν πληροφορίες σχετικά με τους μηχανισμούς με τους οποίους τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα ασκούν τη δράση κατά των όγκων διαμορφώνοντας μικροπεριβάλλον του όγκου

Παράθεση:. Taguchi Α, Kawana Κ, Tomio Κ, Yamashita Α, Isobe Υ, Nagasaka K, et al. (2014) Matrix Μεταλλοπρωτεϊνάσης (MMP) -9 στον Καρκίνο-Associated ινοβλάστες (CAFS) καταστέλλεται από ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα

In Vitro

και

In Vivo

. PLoS ONE 9 (2): e89605. doi: 10.1371 /journal.pone.0089605

Επιμέλεια: Zhongjun Zhou, Το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 10, Οκτωβρίου του 2013? Αποδεκτές: 22 του Ιανουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 27 Φεβρουαρίου 2014

Copyright: © 2014 Taguchi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Τόκιο IGAKUKAI (ΚΚ), την Ιαπωνία Επιστήμης και Τεχνολογίας Οργανισμού πρόδρομα Έρευνας για εμβρυϊκά Επιστήμης και Τεχνολογίας (PRESTO) (MA), το Υπουργείο Παιδείας, Πολιτισμού, Αθλητισμού, Επιστημών και Τεχνολογίας της Ιαπωνίας (MA). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Το μικροπεριβάλλον του όγκου αποτελείται από μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα, γειτονικά φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα και τον καρκίνο που σχετίζεται με ινοβλάστες (CAFS), και αναφέρεται ότι είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της ογκογένεσης [1], [2]. Ως το πιο κοινό κυτταρικού πληθυσμού που βρίσκονται στο μικροπεριβάλλον του όγκου, CAFS είναι υπεύθυνη για τη σύνθεση των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην αναδιαμόρφωση της εξωκυττάριας ουσίας (ECM), και για την έκκριση των αυξητικών παραγόντων και κυτοκινών που ρυθμίζουν τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και εισβολή [3 ], [4]. Σε μοντέλα ποντικών με καρκίνο των ωοθηκών ξενομοσχεύματος, η ρ53 /NF-κΒ πορείας στα CAFS αυξήθηκε σημαντικά in vivo την ανάπτυξη όγκου [5]. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, Zhu Υ et al. έκθεση ότι η IL-1β αυξημένο πολλαπλασιασμό των κυττάρων καρκίνου του παχέος εντέρου και εισβολή από επάνω ρύθμισης COX-2 σηματοδότηση σε CAFS [6].

Οι

Matrix-μεταλλοπρωτεϊνάσες (MMPs) συντίθενται ως προένζυμα και τυπικά ενεργοποιείται με πρωτεολυτική απομάκρυνση ενός προπεπτίδιο [7]. Οι MMPs που αναφέρθηκαν για να επηρεάσουν την εξέλιξη του όγκου, διευκολύνοντας γεγονότα καίριας σημασίας για την νεοαγγείωση και την εγκατάσταση των μακρινών μετάστασης συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, της επιβίωσης και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών, όγκου και στρωματικά κύτταρα [8], [9]. ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 εμπλέκονται ως προαπαιτούμενα για την αγγειογένεση και μετάσταση στο carcinogenesic διαδικασία. ΜΜΡ-2 εκφράζεται στις διάφορες κυτταρικές γραμμές καρκίνου [10]. Σε αντίθεση, ΜΜΡ-9 έχει πολύ περιορισμένη ή καθόλου έκφραση σε αυτά τα καρκινικά κύτταρα. Αντ ‘αυτού, η ΜΜΡ-9 είναι γνωστό ότι εκκρίνεται από ινοβλάστες καρκίνο στρωματικά και ενδοθηλιακά κύτταρα [11], [12]. ΜΜΡ-9 είναι ένα μέλος μιας οικογένειας που περιέχουν ψευδάργυρο ενδοπρωτεϊνασών που εμπλέκεται στην αποικοδόμηση της εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) και στην ανακατασκευή του αγγείου [13].

δοκοσαεξανοϊκό οξύ (DHA, 22:6n-3) και εικοσιπεντανοϊκό οξύ (ΕΡΑ, 20:5n-3) είναι αντιπροσωπευτικά μεσολαβητές της ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (ωμέγα-3 PUFA) και εξασκούν αντιφλεγμονώδεις επιδράσεις σε οξείες και χρόνιες παθολογικές φλεγμονώδεις αντιδράσεις εξουδετερώνοντας φλεγμονής [14]. Ωμέγα-3 PUFAs επίσης αναφερθεί ότι έχουν αντικαρκινική δράση βασίζεται σε in vitro και in vivo μελέτες [15] – [17]. Αρκετοί μηχανισμοί έχουν προταθεί για να εξηγήσουν τις αντικαρκινικές επιδράσεις των ω-3 PUFAs. Ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα μεταβάλλουν την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων με ρύθμιση αντιγραφής κυττάρου, παρεμβαίνοντας με συστατικά του κυτταρικού κύκλου ή με την αύξηση του κυτταρικού θανάτου μέσω νέκρωσης ή απόπτωσης [18], [19]. Ωμέγα-3 PUFAs είναι επίσης γνωστό ότι ασκούν αντι-αγγειογενετική αποτελέσματα με την αναστολή της παραγωγής πολλών αγγειογόνου μεσολαβητές συμπεριλαμβανομένων: αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF), προερχόμενο από αιμοπετάλια αυξητικό παράγοντα (PDGF), και προσταγλανδίνη Ε2 (PGE2) [20] – [24].

Διαιτητικά συμπληρώματα είναι μια παραδοσιακή προσέγγιση για την τροποποίηση θρεπτική σύνθεση των ιστών σε μελέτες σε ζώα της διατροφής. Διατροφή των ζώων δίαιτες που αλλοιώνουν συγκεκριμένες διατροφικές και μη θρεπτικών συστατικών μπορεί να βοηθήσει στη διαφοροποίηση πειραματικές ομάδες? Ωστόσο, μπορεί να είναι εξαιρετικά δύσκολο να προβλεφθεί δίαιτες που είναι ταυτόσημα σε όλες εκτός από μία μόνο ή ένα μικρό αλλά ελεγχόμενο αριθμό εξαρτημάτων. Kang et al. μηχανικής πρόσφατα ένα διαγονιδιακό ποντίκι που φέρει το γονίδιο fat-1 από το σκουλήκι

Caenorhabditis elegans

[25]. Αυτό το γονίδιο κωδικοποιεί μια δεσατουράση λιπαρού οξέος ωμέγα-3 που καταλύει την μετατροπή των ωμέγα-6 προς ωμέγα-3 PUFAs και ότι απουσιάζει στα περισσότερα ζώα, συμπεριλαμβανομένων των θηλαστικών. Υπάρχει αξιοσημείωτη διαφορά στην αναλογία PUFA ιστού ωμέγα-6 /ω-3 μεταξύ άγριου τύπου και του λίπους-1 διαγονιδιακά ποντίκια [26]. Fat-1 ποντίκια, τα οποία συνήθως παρουσιάζουν μια ισορροπημένη αναλογία ωμέγα-6 προς ωμέγα-3 PUFAs σε ιστούς και όργανα ανεξάρτητα από τη διατροφή τους, επιτρέπουν την ελεγχόμενη προσεκτικά μελετών που πρόκειται να εκτελεστεί εν απουσία του εν δυνάμει παράγοντες σύγχυσης της διατροφής. Αυτό τους καθιστά ένα χρήσιμο μοντέλο για να διερευνηθούν οι βιολογικές ιδιότητες του ενδογενούς ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα [25]. Αρκετές αναφορές χρησιμοποιώντας λίπος-1 ποντίκια απέδειξαν αντικαρκινικές επιδράσεις των ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα [27] – [30]. Σε αυτές τις έρευνες, τα ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα που ασκείται αντικαρκινικές επιδράσεις καταστέλλοντας τις φλεγμονώδεις αντιδράσεις και έκκριση PGE2 από τα καρκινικά κύτταρα. Μέχρι σήμερα, υπάρχουν λίγες μελέτες που διερευνούν τη συμμετοχή των ωμέγα-3 πολυακόρεστων λιπαρών οξέων στη βιολογία του CAFS.

Σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα μπορεί να αλλάξει μικροπεριβάλλοντα όγκου επηρεάζοντας δραστηριότητα CAF. Για να εξεταστεί αυτή η υπόθεση, ινοβλάστες που προέρχονται από ποντίκια τύπου fat-1 και άγρια ​​αξιολογήθηκαν τόσο in vitro όσο και in vivo υπό συνθήκες που επιτρέπουν την αλληλεπίδραση με TC-1 καρκινικά κύτταρα. TC-1 κύτταρα προήλθαν από το επιθήλιο του C56BL /6 ποντίκια και αθανατοποιημένα με ιό των ανθρωπίνων θηλωμάτων (HPV) τύπου 16 Ε6 και Ε7 ογκοπρωτεϊνών. Χρησιμοποιούνται συνήθως in vitro και in vivo σε μοντέλα ποντικών του καρκίνου που σχετίζονται με τον HPV [31]. Εδώ, ερευνήσαμε την εμπλοκή των ω-3 PUFA σε TC-1 ογκογένεση με σύγκριση ποντίκια τύπου fat-1 και άγρια. ιδιαίτερη έμφαση μας εμπλέκονται στη μελέτη των ινοβλαστών που σχετίζονται με όγκους. Αυτά τα μοντέλα είναι χρήσιμα στην μελέτη της CAFS επειδή τα καρκινικά κύτταρα προέρχονται από άγριου τύπου επιθήλιο ποντικού ενώ οι συνιστώσες του καρκίνου στρωματικά, συμπεριλαμβανομένων CAFS, προέρχονται από το λίπος-1 (ω-3 PUFA πλούσιο) ή άγριου τύπου (κανονική PUFAs) ποντικούς.

Υλικά και Μέθοδοι

Ζώα και δίαιτα

Fat-1 ποντίκια δημιουργήθηκαν σε C57BL /6 υπόβαθρο όπως περιγράφεται [26] και στη συνέχεια διασταυρώθηκαν (τουλάχιστον τέσσερις φορές) επάνω σε ένα C57BL /6 υπόβαθρο. Τα ζώα τράφηκαν με ειδική δίαιτα (ΑΙΝ-76Α + 10% έλαιο καρθάμου? CLEA Japan, Inc.) που περιείχε 10,3% συνολικό λίπος με σύνθεση λιπαρών οξέων του C16:0 (7,6%), C18:0 (2,7%), C18 :1n-9 (14,1%), C18:2n-6 (73,2%), C18: 3η-3 (0,3%), C20:4n-6 (& lt? 0,1%), C20:5n-3 (& lt? 0.1 %), C22: 6n-3 (& lt? 0,1%), υψηλή περιεκτικότητα σε ω-6 και χαμηλή σε λιπαρά η-3 λιπαρά οξέα, μέχρι την επιθυμητή ηλικία (6-8 εβδομάδες) για πειράματα. Για να αποφευχθεί η οξείδωση των λιπιδίων στη δίαιτα, όλα τα τρόφιμα ήταν αποθηκευμένα στο ψυγείο με αντιοξειδωτικά (Ageless? Mitsubishi Gas Chemical Inc.), και παρασκευάζεται πρόσφατα κάθε δύο ημέρες. Οι μελέτες σε ζώα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή των Ζώων του Πανεπιστημίου του Τόκιο.

όγκων δοκιμασία ανάπτυξης σε ποντίκια

TC-1 κύτταρα προέρχονται από ένα επιθηλιακό κύτταρο πρωτογενούς πνεύμονα από C56BL6 /ποντίκια και απαθανάτισε τη χρήση του HPV 16 Ε6 /Ε7 συν γ-Έχει-ras (ευγενική προσφορά από Dr. TC Wu, το Πανεπιστήμιο Johns Hopkins, Βαλτιμόρη MD ΗΠΑ) [32]. TC-1 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ (Gibco, ΝΥ, USA) που περιέχει 10% FBS, 100 U /ml πενικιλίνη, 0.1 mg /ml στρεπτομυκίνη, και 0,25 g /ml αμφοτερικίνη Β οκτώ εβδομάδων ηλικίας θηλυκοί ποντικοί ενέθηκαν με TC-1 κύτταρα 5 × 10

6 ποντικού σε εναιώρηση εντός 100 μΐ DMEM. Ο όγκος του όγκου, βασίζεται σε μετρήσεις πάχους, υπολογίστηκε σε 7 και 14 ημέρες μετά την ένεση σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: (όγκος του όγκου) = 1/2 × (η μικρότερη διάμετρος)

2 × (η μεγαλύτερη διάμετρος). Τα ποντίκια θανατώθηκαν 14 ημέρες μετά τον εμβολιασμό, οι όγκοι αποκόπηκαν και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C για μελλοντικές αναλύσεις.

cDNA μικροσυστοιχιών

Ολικό RNA από TC-1 καρκινώματα (ανωτέρω) εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας μια RNeasy MINIKIT (QIAGEN, Hilden, Germany). Για την ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών, 0,5 μg συγκεντρωμένων ολικού RNA ενισχύθηκε και σημασμένο χρησιμοποιώντας κιτ Amino Αλλυλ MessageAmpTM II mRNA Amplification (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Κάθε δείγμα του mRNA σημασμένο με Cy3 και mRNA αναφοράς επισημασμένο με Cy5 ήταν cohybridized στην GeneTM Mouse Ολίγο τσιπ 24 k (Toray Industries Inc., Tokyo, Japan) στους 37 ° C για 16 ώρες. Μετά την υβριδοποίηση, κάθε τσιπ DNA πλύθηκε και στέγνωσε. Σήματα υβριδισμού που προέρχονται από Cy3 και Cy5 σαρώθηκαν χρησιμοποιώντας Σάρωση Array Express (PerkinElmer, Waltham, ΜΑ, USA). Η σαρωμένη εικόνα αναλύθηκε χρησιμοποιώντας GenePix Pro (MDS Analytical Technologies, Sunnyvale, CA, USA). Όλα τα δεδομένα που αναλύθηκαν είχαν κλιμακωθεί από την παγκόσμια κανονικοποίηση. GEO αριθμός ένταξης είναι GSE54079.

Η ανοσοϊστοχημεία

τομές παραφίνης (4 μm) των TC-1 όγκων αποκηρώθηκαν σε ξυλόλιο και επανυδατώθηκαν μέσω διαβαθμισμένης αιθανόλης σε νερό. Αντιγόνα ανακτήθηκαν με βρασμό σε 10 mM κιτρικό ρυθμιστικό (ρΗ 6.0) για 30 λεπτά. Τα ψυχθέντα τμήματα επωάστηκαν σε διάλυμα ϋΑΚΟ REAL υπεροξειδάσης-Blocking (DAKO, Carpinteria, CA, USA) για 10 λεπτά για την απόσβεση ενδογενούς υπεροξειδάσης. Για τον αποκλεισμό μη ειδική δέσμευση, οι τομές επωάστηκαν σε διάλυμα Πρωτεΐνης Δέσμευσης ϋΑΚΟ (ϋΑΚΟ) για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Οι τομές στη συνέχεια επωάστηκαν με πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι ποντικού ΜΜΡ-9 (PAB12714, Abnova, 1:100 αραίωση) σε ϋΑΚΟ REAL αραιωτικό αντισώματος (DAKO) επί μία νύκτα στους 4 ° C. Οι πλάκες επωάστηκαν για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση, πλένεται, επωάζεται με DAB, αντίθετα με αιματοξυλίνη, αφυδατώθηκαν μέσω μιας σειράς αιθανόλης και ξυλόλιο, και τοποθετημένα. Για την αξιολόγηση του σχηματισμού μικροαγγείων όγκου, τομές όγκων χρωματίστηκαν για CD-31 χρησιμοποιώντας ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αρουραίου έναντι ποντικού CD-31 (ab56299, Abcam, Τόκιο, Ιαπωνία, 1:100 αραίωση).

RT-ποσοτική PCR ( RT-qPCR)

Ολικό RNA εξήχθη από TC-1 όγκων και καλλιεργημένες ινοβλάστες χρησιμοποιώντας ένα RNeasy MINIKIT (QIAGEN, Hilden, Γερμανία), που ακολουθείται από αντίστροφη μεταγραφή. cDNA ενισχύθηκε για 40 κύκλους σε ένα ελαφρύ Cycler 480 (Roche, Βασιλεία, Ελβετία) με τη χρήση καθολικής Probe Master Mix και τους ακόλουθους εκκινητές και η Universal Probe Library (UPL) ανιχνευτές (Roche). Τα ζεύγη εκκινητών και οι καθολικοί ανιχνευτές που αντιστοιχούν στο κάθε εκκινητή που χρησιμοποιήθηκαν σε πολλαπλασιασμούς ήταν ως ακολούθως: ποντίκι β-ακτίνη, 5′-ATTGAAACATCAGCCAAGACC-3 ‘και 5′-CCGAATCTCACGGACTAGTGT-3′ probe88? ποντίκι ΜΜΡ-9, 5’-ACGACATAGACGGCATCCA-3 ‘και 5′-GCTGTGGTTCAGTTGTGGTG-3’ probe19. Η έκφραση του ΜΜΡ-9 ομαλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας β-ακτίνης mRNA ως εσωτερικό πρότυπο. Τα επίπεδα έκφρασης υπολογίστηκαν με τη συγκριτική μέθοδο Ct χρησιμοποιώντας β-ακτίνης ως ενός ενδογενούς γονιδίου αναφοράς.

Πρωτογενής καλλιέργεια ινοβλαστών και συν-καλλιέργεια με TC-1 κύτταρα

Οι πνεύμονες απομονώθηκαν από το λίπος-1 διαγονιδιακά και φυσικού τύπου ποντίκια και πλύθηκε με αλατόνερο για να απομακρυνθούν τα κύτταρα του αίματος. Απομόνωση και καλλιέργεια των πνευμονικών ινοβλαστών πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση μεθόδων που περιγράφηκαν προηγουμένως [33]. Ιστοί πνεύμονα και αλεσμένα σε μικρά τεμάχια και επωάστηκαν σε DMEM (Gibco, ΝΥ, USA) που περιέχει κολλαγενάση τύπου Ι (0,25%? Sigma-Aldrich, St Louis, ΜΟ, USA) και deoxynuclease I (15 U /ml? TaKaRa, Τόκιο, Japan) για 120 λεπτά στους 37 ° C. Τα προκύπτοντα διεσπαρμένα κύτταρα διαχωρίστηκαν με διήθηση μέσω νάιλον κύτταρο σουρωτήρια (70 μm, BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Οι ινοβλάστες στο διήθημα συλλέχθηκαν, τοποθετήθηκαν σε δίσκους των 10 cm σε DMEM που περιείχε 10% FBS, 100 U /ml πενικιλίνη, 0.1 mg /ml στρεπτομυκίνη, και 0,25 mg /l αμφοτερικίνη Β, και επωάστηκαν για 7-10 ημέρες. Οι ινοβλάστες καθαρίστηκαν από άλλα κυτταρικό πληθυσμό με διαφορική προσκόλληση και σειριακή δίοδο.

Συρρέοντα ινοβλάστες και κύτταρα TC-1 τρυψινοποιήθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% FBS, 100 U /ml πενικιλίνη, 0.1 mg /ml στρεπτομυκίνη, και 0,25 g /ml αμφοτερικίνη Β και 1 × 10

5 κύτταρα /κύτταρα του κάθε τύπου κυττάρου ml απλώθηκαν μαζί σε 12 πλάκες καλλιέργειας καλά. Συν-καλλιέργειες επωάστηκαν στους 37 ° C 5% CO2 σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα για 24 ώρες. Ομότυπη καλλιέργειες χρησίμευσαν ως μάρτυρες.

Ζελατίνη zymography

δοκιμασίες ζυμογραφία ζελατίνης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα κιτ Ζελατίνη ζυμογραφία (Cosmobio, Sapporo, Ιαπωνία) σύμφωνα με instuctions του κατασκευαστή. υπερκείμενα καλλιέργειας κυττάρων συλλέχθηκαν και φυγοκεντρήθηκαν στις 1500 rpm για 5 λεπτά. Το υπερκείμενο χωρίς κύτταρο αναμίχθηκε με 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα δείγματος και ηλεκτροφορήθηκαν με τη χρήση προκατασκευασμένων πηκτωμάτων (10% πολυακρυλαμίδη, 0,1% ζελατίνη) στους 4 ° C για 1 ώρα. Subsequentnzymatic αντιδράσεις πραγματοποιήθηκαν στους 37 ° C όλη τη νύκτα. δραστηριότητες ζελατινάσης οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας συγκεκριμένες λύσεις χρώσης και αποχρωματίζονται σε οξικό οξύ-μεθανόλη-DH

2O (1:03:06). Για ημι-ποσοτικές αναλύσεις, ζώνες ζελατίνη zymography αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης εικόνας (ImageJ).

Η στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± SEM. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν από Φοιτητών

t-test

, ή ανάλυση Wilcoxon χρησιμοποιώντας το λογισμικό JMP. Μια τιμή της P & lt? 0,05 θεωρήθηκε σημαντική. Στους θρύλους σχήμα, αστερίσκοι δείχνουν αυτές τις συγκρίσεις με στατιστική σημαντικότητα (p & lt? 0,05).

Αποτελέσματα

Η ανάπτυξη των όγκων και την αγγειογένεση των TC-1 όγκων καταστέλλεται σε λιπαρά 1-ποντίκια

για να διερευνηθεί η επίδραση των ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα επί του τραχήλου της μήτρας ογκογένεση του καρκίνου, εμείς εγχέονται κύτταρα TC-1 υποδορίως σε λίπος-1 και τα σκουπίδια-mate άγριου τύπου C57 /BL6 ποντίκια. TC-1 τα ποσοστά σχηματισμού όγκων και η ανάπτυξη του όγκου αξιολογήθηκαν με τον αριθμό των ποντικών που σχηματίζουν όγκους και τριών διαστάσεων μεγέθη του όγκου, αντίστοιχα. Δεν υπήρχε διαφορά στα ποσοστά σχηματισμό όγκων μεταξύ του λίπους-1 και ποντικών άγριου τύπου. TC-1 μεγέθη του όγκου χαράχθηκαν για 14 ημέρες στο λίπος-1 και άγριου-τύπου μάρτυρες (Εικ. 1). ρυθμοί ανάπτυξης των όγκων ήταν σταθερά χαμηλότερα σε λίπος-1 ποντίκια σε σύγκριση με ποντικούς άγριου τύπου σε όλα τα χρονικά σημεία. Στην λίπος-1 ποντίκια, το μέγεθος του όγκου στις 14 ημέρες μετά την ένεση ήταν σημαντικά μικρότερος από ό, τι στους μάρτυρες άγριου τύπου (Εικ. 1). Αν και κυτταρική ανάπτυξη του TC-1 κύτταρα εξαρτάται από την έκφραση HPV16 Ε6 /Ε7, Ε6 και Ε7 έκφραση σε TC-1 όγκων δεν ρυθμίζεται προς τα κάτω σε λίπος-1 ποντίκια (Σχ. S1).

5 × 10

6 ποντικού σε εναιώρηση εντός 100 μΙ ϋΜΕΜ ενέθηκαν sc σε κάθε ένα από 10 ποντικούς τύπου fat-1 και άγρια. Ο όγκος του όγκου, βασίζεται σε μετρήσεις πάχους, υπολογίστηκε σε 7 και 14 ημέρες μετά την ένεση σύμφωνα με τον ακόλουθο τύπο: (όγκος του όγκου) = 1/2 × (η μικρότερη διάμετρος)

2 × (η μεγαλύτερη διάμετρος). Οι μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις που παρουσιάζονται. Οι αστερίσκοι δείχνουν αυτές τις συγκρίσεις (fat-1 έναντι του άγριου τύπου ποντίκια) με στατιστική σημαντικότητα (p & lt? 0,05).

Η

Για να οριοθετηθούν περαιτέρω οι μηχανισμοί πίσω από αυτές τις διαφορές στην ανάπτυξη του όγκου σε αυτό το μοντέλο, ιδίως όσον αφορά την ο πιθανός ρόλος των συστατικών στρωματικών σχετίζονται με τον καρκίνο που προέρχονται από ξενιστή συμπεριλαμβανομένων CAFS, έχουμε την επόμενη εξετάστηκε αν τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα τροποποιημένου αγγειογένεση σε TC-1 καρκινικά. Εκτιμήσαμε ημι-ποσοτικά όγκου πυκνότητας μικροαγγείων σε TC-1 όγκων που προέρχονται από ποντίκια τύπου fat-1 και άγρια ​​μετρώντας τον αριθμό των CD31-θετικών μικροαγγείων σε ανοσοϊστοχημική δοκιμασία (Σχ. 2Α και 2Β). CD31 ανοσοχρώση TC-1 όγκων που προέρχονται από ποντίκια τύπου fat-1 και άγρια ​​(Εικ. 2Α) απέδειξαν hypovascularity των fat-1 που προέρχεται από όγκους TC-1 σε σύγκριση με όγκους άγριου τύπου προέλευσης. Ο αριθμός των CD31-θετικών μικροαγγείων ανά πεδίο υψηλής ισχύος σε λίπος-1 ποντίκια ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ότι σε ποντικούς άγριου τύπου (σχ. 2Β). Αυτά τα in vivo δεδομένα έδειξαν ότι TC-1 ανάπτυξης όγκου και την αγγειογένεση είχαν τουλάχιστον κατασταλεί σε λίπος-1 ποντίκια σε σύγκριση με τα άγριου τύπου αν και ήταν δύσκολο να εκτιμηθεί με ακρίβεια TC-1 κυτταρικής ανάπτυξης σε λίπος-1 ποντίκια.

CD31 ανοσοχρώση της TC-1 καρκινικά προέρχονται από άγριου τύπου (WT) ποντίκια (Α) και το λίπος-1 (Β). Μπάρες δείχνουν 200 μm. Οι πυκνότητες (C) μικροαγγείου σε TC-1 όγκων εκφράζεται ως ο αντιπροσωπευτικός αριθμός επισημασμένου σκαφών σε 4 τομείς (n = 5). Οι μέσες τιμές με τυπικές αποκλίσεις που παρουσιάζονται. Οι αστερίσκοι υποδεικνύουν τις εν λόγω συγκρίσεις (λίπος-1 έναντι άγριου τύπου ποντίκια) με στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0,05).

Η

ΜΜΡ-9 ρυθμίζεται μειωτικά σε λίπος-1 ποντίκια που προέρχονται από TC-1 όγκων

Για να διερευνηθεί πιθανές διαφορές στα προφίλ γονιδιακής έκφρασης του TC-1 όγκων αυξάνεται στο δέρμα του λίπους-1 και ποντικών άγριου τύπου, τους ιστούς TC-1 καρκινικά λαμβάνεται από το λίπος-1 και ποντικών άγριου τύπου αναλύθηκαν με cDNA μικροσυστοιχίας. Δεδομένου ότι οι ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα που αναφέρθηκαν για να επηρεάσουν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και της φλεγμονής, 1 παραθέτει τα σχετικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης Πίνακας για αντιπροσωπευτικά γονίδια που συνδέονται με την ανάπτυξη του όγκου και τη φλεγμονή (Πίνακας 1). Με την εξαίρεση του EGF, τα επίπεδα έκφρασης του συνόλου σχεδόν φλεγμονωδών κυτοκινών /χημειοκινών και αυξητικούς παράγοντες σε TC-1 όγκων από το λίπος 1-ποντικοί ήταν υψηλότερες από αυτές, σε όγκους από ελέγχους άγριου τύπου. Αυτό πρότεινε ότι η αντι-φλεγμονώδης και την ανάπτυξη αντι-κυττάρου επιδράσεις των ωμέγα-3 PUFAs είναι απίθανο να είναι κεντρικής σημασίας για τις δραστηριότητες κατά του όγκου τους, τουλάχιστον σε αυτό το μοντέλο. Στη συνέχεια εξετάσαμε την έκφραση των ΜΜΡ σε αυτές τις TC-1 όγκων σε περαιτέρω διεύθυνση στρώμα που σχετίζονται με την αγγειογένεση στα μικροπεριβάλλοντα όγκου (Πίνακας 1). cDNA microarray έδειξαν ότι η έκφραση του ΜΜΡ-2 και -9 κατεστάλησαν σε λίπος-1 ποντίκια που προέρχονται από TC-1 καρκινικά ενώ εκείνα των άλλων MMPs έχουν την τάση να ρυθμίζεται προς τα πάνω σε σύγκριση με τους ελέγχους. Για την επιβεβαίωση αυτών των αποτελεσμάτων σε επίπεδο RNA, RT-qPCR για ΜΜΡ-9 διεξήχθη. επίπεδα ΜΜΡ-9 RNA σε λίπος-1 ποντικοί ήταν περίπου 60% χαμηλότερα από εκείνα σε άγριου τύπου μάρτυρες (Εικ. 3Α). TC-1 ανοσοϊστοχημεία όγκων επιβεβαίωσε αυτά τα αποτελέσματα στο επίπεδο της πρωτεΐνης. ΜΜΡ-9 ανοσοαντιδραστικότητα σε όγκους ποντικών προερχόμενα TC-1 άγριου τύπου ήταν σαφώς ισχυρότερη από λίπος 1 ποντικού προερχόμενο όγκων (Σχ. 3Β). Υψηλής ισχύος ιστοχημική ανάλυση της ΜΜΡ-9 immnoreactivity σε κύτταρα TC-1 (Σχ. 3Β, ένθετα) αποκάλυψε αμελητέα έκφραση, ενώ εκείνη των συστατικών στρωματικών συμπεριλαμβανομένων CAFS και ενδοθηλιακά κύτταρα ήταν έντονα θετικό μόνο στον άγριο τύπο που προέρχεται από όγκους TC-1 . Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι η παραγωγή των ΜΜΡ-9 σε CAFS και ενδοθηλιακά κύτταρα ήταν σαφώς κατέστειλε σε λίπος-1 ποντίκια.

Ολικό RNA εξήχθη από TC-1 όγκων, ακολουθούμενη από ανάστροφη μεταγραφή. επίπεδα ΜΜΡ-9 mRNA μετρήθηκαν με qRT-PCR. Τα επίπεδα έκφρασης της ΜΜΡ-9 ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη σαν εσωτερικό πρότυπο (n = 4 σε κάθε ομάδα). Οι αστερίσκοι δείχνουν αυτές τις συγκρίσεις (fat-1 έναντι του άγριου τύπου (WT) ποντίκια) με στατιστική σημαντικότητα (p & lt? 0,05). ΜΜΡ-9 ανοσοχρώση της TC-1 όγκων που προέρχονται από άγριου τύπου (WT) και λιπο-1 ποντικούς. Μπάρες δείχνουν 200 μm σε τομείς χαμηλής ισχύος, 50 μm σε τομείς υψηλής ισχύος.

Η

MMP-9 έκφρασης και δραστηριότητας ζελατινάσης κατεστάλησαν σε καλλιεργημένα πρωτογενή ινοβλάστες που προέρχονται από το λίπος 1-ποντίκια

Για να μιμηθεί το μικροπεριβάλλον του καρκίνου στρωματικά in vitro, έχουμε συν-καλλιεργούνται ινοβλάστες που απομονώθηκαν από το λίπος-1 και ποντικών άγριου τύπου με κύτταρα TC-1. Χρησιμοποιήσαμε ιστούς των πνευμόνων από ποντίκια λίπος-1 και άγριου τύπου ως πηγές για ινοβλάστες, και η μεθοδολογία διαφορικής προσκόλλησης για την απομόνωση τους. Όλες οι ινοβλάστες περάστηκαν 3-4 φορές πριν από τη χρήση σε πειράματα. Baseline ΜΜΡ-9 επίπεδα έκφρασης σε πρωτογενείς ινοβλάστες από το λίπος 1-ποντικοί ήταν περίπου 60% χαμηλότερα από εκείνα από άγριου τύπου προερχόμενο ινοβλάστες (Σχ. 4Α). Τα υπερκείμενα καλλιέργειας από κάθε στοιχειώδες υπότυπο ινοβλαστών συλλέχθηκαν και υποβλήθηκαν σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου για να εξετάσει τις διαφορές σε δραστηριότητες ζελατινάσης ΜΜΡ (Σχ. 4Β). Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, ΜΜΡ-2 ανιχνεύθηκε αλλά ΜΜΡ-9 δεν ήταν τόσο λίπος-1 και άγριου τύπου ινοβλαστών

(Α) Πρωτογενείς ινοβλάστες που απομονώθηκαν από πνεύμονες ποντικών καλλιεργήθηκαν. Ολικό RNA από ινοβλάστες μεταγράφηκε ανάστροφα και τα επίπεδα ΜΜΡ-9 mRNA μετρήθηκαν με qRT-PCR. Τα επίπεδα έκφρασης της ΜΜΡ-9 ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη σαν εσωτερικό πρότυπο. Τα δεδομένα είναι ο εκπρόσωπος του τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του μαθητή

t-test

. Οι αστερίσκοι δείχνουν αυτές τις συγκρίσεις (fat-1 έναντι του άγριου τύπου (WT) ποντίκια) με στατιστική σημαντικότητα (p & lt? 0,05). (Β) Ζελατίνη zymography: Υπερκείμενο από πρωτογενείς καλλιέργειες ινοβλαστών συλλέχθηκαν και διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση. δραστηριότητες ζελατινάσης έγιναν ορατές με πρότυπες τεχνικές χρώσης.

Η

Στη συνέχεια, αυτές οι πρωτογενείς ινοβλάστες συν-καλλιεργήθηκαν με κύτταρα TC-1 για να εξετάσει την ενεργοποίηση των ινοβλαστών μετά εργαστηριακή έκθεση σε καρκινικά κύτταρα

11. Οι ινοβλάστες και τα κύτταρα TC-1 συν-καλλιεργήθηκαν για 24 ώρες και ΜΜΡ-9 μεταγραφή μετρήθηκε με RT-qPCR. Οι ινοβλάστες από το λίπος-1 και από ποντικούς άγριου τύπου αυξημένη αποδειχθεί MMP-9 έκφραση κατά την έκθεση σε TC-1 κύτταρα (Σχ. 5Α). Σε ινοβλάστες που προέρχονται από το λίπος 1-ποντικούς, η έκταση της επαγωγής ΜΜΡ-9 ήταν χαμηλότερη από ότι σε ινοβλάστες από ποντικούς άγριου τύπου (Σχ.5). ΜΜΡ-9 δεν εκφράστηκε σε TC-1 κύτταρα ομοτυπική, συνεπής με ανοσοϊστοχημική δεδομένα από μας in vivo μοντέλο. Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε ότι η ΜΜΡ-9 δεν εκφράστηκε στα κύτταρα TC-1 με τη χρήση ενός μοντέλου transwell συν-καλλιέργειας (Εικ. S2). Ως εκ τούτου, ΜΜΡ-9 στην κατάσταση συν-καλλιέργεια δεν προέρχονται από κύτταρα TC-1, αλλά από ινοβλάστες. ΜΜΡ-2 δραστικότητα ζελατινάσης ανιχνεύθηκε σε όλες τις συνθήκες καλλιέργειας κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των κυτταρικών καλλιεργειών ομοτυπική TC-1, και δεν αλλοιώνεται από συνθήκες συν-καλλιέργειας (Σχήμα 5Β, 5D). ΜΜΡ-9 δραστηριότητες ζελατινάση ήταν, ωστόσο, ανιχνεύσιμη σε ινοβλαστών-TC-1 κυττάρων συν-καλλιέργειες, αν και ΜΜΡ-9 δραστηριότητα ζελατινάσης που περιλαμβάνουν λίπος-1 ινοβλάστες ήταν σαφώς καταστέλλεται σε σύγκριση με ινοβλάστες άγριου τύπου (Σχήμα 5Β, 5C), και πάλι την υποστήριξη η έννοια ότι η ΜΜΡ-9 έκφραση και η δραστικότητα ζελατινάσης καταστέλλονται από ενδογενή ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα σε CAFS προέρχονται από το λίπος-1 ποντίκια.

(Α) Μεμονωμένες ινοβλάστες συνκαλλιεργήθηκαν με TC-1 κύτταρα για 24 ώρες και τα επίπεδα έκφρασης της ΜΜΡ-9 στους ινοβλάστες μετρήθηκαν με RT-qPCR. Τα επίπεδα έκφρασης της ΜΜΡ-9 ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη σαν εσωτερικό πρότυπο. Τα δεδομένα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του μαθητή

t-test

. Οι αστερίσκοι δείχνουν αυτές τις συγκρίσεις (fat-1 έναντι του άγριου τύπου (WT) ποντίκια) με στατιστική σημαντικότητα (p & lt? 0,05). «Ν.Δ.» δηλώνει «δεν ανιχνεύεται». (Β) Ζελατίνη zymography: Υπερκείμενα από καλλιέργειες ομοτυπική ινοβλαστών και ινοβλαστών /TC-1 συν-καλλιέργειες συλλέχθηκαν και διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση. δραστηριότητες ζελατινάσης έγιναν ορατές με πρότυπες τεχνικές χρώσης. (C, D) για ημι-ποσοτικές αναλύσεις, ταινίες ζελατίνης ζυμογραφία αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό ανάλυσης εικόνας. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του μαθητή

t-test

. Οι αστερίσκοι δείχνουν αυτές τις συγκρίσεις (fat-1 έναντι του άγριου τύπου WT) ποντίκια () με στατιστική σημαντικότητα (p & lt? 0,05).

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε τη συμμετοχή καθορισμένων διατροφικών παραγόντων (ωμέγα-3 και ωμέγα-6 PUFA) στην ογκογένεση χρησιμοποιώντας TC-1 κύτταρα HPV-θετικών και προτείνει ένα νέο μηχανισμό κατά του όγκου για τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, που εξαρτάται από τις δραστηριότητες του CAFS. έχουν Ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν δειχθεί ότι καταστέλλουν την επίπτωση και την ανάπτυξη του καρκίνου σε διάφορους τύπους καρκίνων [18], [19], [27]. Πολλές μελέτες έχουν δείξει ότι τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν αυτά τα αποτελέσματα μέσω της αντι-φλεγμονώδεις αποκρίσεις άμεσα ή /και έμμεσα [25] – [27], καθώς και μέσω επαγωγής κυττάρου όγκου απόπτωση ή /και καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων του όγκου [18], [19 ]. Ωστόσο, έχουν υπάρξει λίγες εκθέσεις σχετικά με τις επιπτώσεις των ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα σε CAFS. Οι CAFS ενοχοποιηθεί για τη διευκόλυνση της ανάπτυξης αρκετών όγκων με την άμεση διέγερση του πολλαπλασιασμού των καρκινικών κυττάρων και ενισχύοντας την αγγειογένεση [34], [35]. Στόχευση γονιδίων και μονοπατιών σηματοδότησης που μεσολαβούν αλληλεπίδραση CAFS και ογκο-μικροπεριβάλλον θεωρούνται απαραίτητα για την ανάπτυξη νέων και αποτελεσματικών θεραπειών του καρκίνου [36], [37]. Σε αυτή τη μελέτη, με τη χρήση λίπους 1-ποντικούς και TC-1 κύτταρα όγκου, ήμασταν σε θέση να διευκρινιστεί η επίδραση των ω-3 PUFA πλούσια CAFS επί ογκογένεση.

Πολλά μόρια, συμπεριλαμβανομένων των παραγόντων ανάπτυξης, κυτοκινών, και MMPs, παίζουν διεγερτικές και ανασταλτικές ρόλους στην προαγωγή αγγειογένεσης [21]. Ερευνήσαμε γονίδιο έκφραση κυτοκινών που σχετίζονται με αγγειογένεση, οι αυξητικοί παράγοντες και MMPs στα TC-1 όγκων λίπους-1 και ποντικών άγριου τύπου με cDNA μικροσυστοιχίας. Τα επίπεδα έκφρασης όλων σχεδόν των φλεγμονωδών κυτοκινών /χημειοκινών και αυξητικούς παράγοντες σε TC-1 όγκων από το λίπος 1-ποντικοί ήταν υψηλότερες από εκείνες σε όγκους από ελέγχους άγριου τύπου. Σε αντίθεση, τα επίπεδα EGF και ΜΜΡ-2 και -9 έκφραση σε λίπος-1 ποντίκια ήταν χαμηλότερες από αυτές σε ποντικούς άγριου τύπου. Από τα κάτω ρύθμιση του EGF σε TC-1 όγκων από το λίπος-1 ποντίκια είχε προβλεφθεί για την προώθηση της TC-1 κυτταρικού πολλαπλασιασμού αλλά το μέγεθος του όγκου σε λίπος-1 ποντίκια ήταν σημαντικά μικρότερος από ό, τι στους μάρτυρες άγριου τύπου, υποθέτουμε ότι οι διαφορές στη παραγωγή ΜΜΡ μεταξύ λίπος-1 και ποντικών άγριου τύπου μπορεί να είναι υπεύθυνη για την καταστολή της ανάπτυξης του όγκου TC-1. in vitro δεδομένα μας επαλήθευσε ότι η ΜΜΡ-9 που προέρχονται από CAFS ενεργοποιείται από την έκθεση των κυττάρων TC-1 ρυθμίζεται προς τα κάτω στα ποντίκια λίπος-1. Οι MMPs που αναφέρθηκαν για να επηρεάσουν την εξέλιξη του όγκου, διευκολύνοντας γεγονότα καίριας σημασίας για την νεοαγγείωση και για τη δημιουργία μακρινές μεταστάσεις συμπεριλαμβανομένου του πολλαπλασιασμού, της επιβίωσης και τη μετανάστευση των ενδοθηλιακών, όγκου και στρωματικά κύτταρα [8], [9]. Οι αναστολείς ΜΜΡ μειώνουν την αγγειογένεση, τον αριθμό όγκου, και την ανάπτυξη του όγκου, όπως κάνει η γενετική εκτομή της ΜΜΡ-9 [38]. Σε αντίθεση με το ΜΜΡ-2, η οποία εκφράζεται ιδιοσυστατικώς, ΜΜΡ-9 επίπεδα είναι συνήθως χαμηλή και έκφραση ενζύμου προκαλείται από κυτοκίνες που διεγείρουν το ΝΡ-κΒ [8], [39]. Επιπλέον, αυξημένα επίπεδα της ΜΜΡ-9 ορού και ιστών αναφερθεί ότι συσχετίζεται με την εισβολή καρκίνου και μετάσταση [40]. Στον καρκίνο του μαστού, η δραστικότητα ΜΜΡ-9 έχει εντοπισθεί γύρω CAFS και CAFS συν-καλλιεργήθηκαν με καρκινικά κύτταρα που εκκρίνουν ΤΟΡ-β, ΤΝΡ-α, και άλλες κυτοκίνες, αυξάνουν την παραγωγή της ΜΜΡ-9 [11], συνάδει με μας in vitro δεδομένα. Σε δεδομένα μας, η καταστολή της MMP-9 θα συμβάλει στην συνοδεύσει υπο-αγγειογένεση στο συστατικό στρωματικά όγκου σε λίπος-1 του όγκου.

Αρκετοί παράγοντες μεταγραφής, συμπεριλαμβανομένου ενεργοποιητή πρωτεΐνη-1 (ΑΡ-1), Sp- 1, και ΝΡ-κΒ, αναφέρεται ότι εμπλέκονται σε μεταβολές στην MMP-9 έκφραση μετά από έκθεση σε διάφορες κυτοκίνες [41] – [43]. Αντιστρόφως, αρκετές αναφορές έχουν δείξει ότι τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα έχουν ένα ανασταλτικό αποτέλεσμα επί της οδού των ΝΡ-κΒ όταν ενεργοποιείται από διάφορα ερεθίσματα [43] – [47]. Τα δικά μας δεδομένα δείχνουν ότι η ενεργοποίηση του μονοπατιού ΝΡ-κΒ κατόπιν συν-καλλιέργεια με TC-1 κύτταρα μπορεί να κατασταλεί με αυξημένο επίπεδο ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα σε ινοβλαστών που λαμβάνονται από λίπος-1 ποντίκια.

Στα πειράματά μας , θα χρησιμοποιείται με συνέπεια πρωτογενών ινοβλαστών που είχαν περάστηκαν 3-4 φορές μόνο. Παρ ‘όλα αυτά, η ανάλυση των λιπιδίων μεσολαβητής των ινοβλαστών αποκάλυψε ότι εκείνα που προέρχονται από το λίπος 1-ποντίκια παρήγαγαν μεγαλύτερες ποσότητες ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα, συμπεριλαμβανομένων EPA προερχόμενο μεταβολιτών σε σχέση με εκείνα που προέρχονται από άγρια ​​ελέγχους τύπου (Fig.S3), επιβεβαιώνοντας ότι οι καλλιεργημένοι ινοβλάστες διατήρησε το χαρακτηριστικό για να κάνουν τα ωμέγα-3 πλούσια σε PUFA περιβάλλον.

TC-1 δεδομένων μικροσυστοιχιών όγκων έδειξε ότι διάφορες φλεγμονώδεις κυτοκίνες /χημειοκίνες και αυξητικούς παράγοντες είχαν υπερεκφράζεται σε λιπαρά-1 ποντίκια. Ωστόσο, τα δεδομένα έδειξαν επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε αμφότερες κύτταρα TC-1 και των συστατικών του στρωματικά, συμπεριλαμβανομένων των ινοβλαστών, ενδοθηλιακών και κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος. Ως εκ τούτου, τα επίπεδα έκφρασης του κάθε κυτοκίνης /χημειοκίνης εξαρτώνται από πρωτογενείς τους πηγές παραγωγής. ΜΜΡ-9 που παράγεται από ινοβλάστες που προέρχονται από το λίπος-1 ποντίκια, αλλά όχι από κύτταρα TC-1. Ως εκ τούτου, η καταστολή του μονοπατιού ΝΡ-κΒ από αυξημένα επίπεδα ωμέγα-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα σε λίπος-1 που προέρχεται από συστατικά στρωματικά μπορεί να έχει μια ειδική και ισχυρή επίδραση στην ΜΜΡ-9 επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με τις άλλες φλεγμονώδεις κυτοκίνες /χημειοκίνες. Από την άλλη πλευρά, μια προηγούμενη μελέτη αποδεικνύει ότι τα ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα ενεργοποιούν κύτταρα ΝΚ και να αυξήσει αναλογίες των ενεργοποιημένων κυττάρων CD8 +? αυτό ακολουθείται από ενισχυμένη κατά του όγκου αποτελέσματα [48]. Ως εκ τούτου, τα ωμέγα-3 PUFAs μπορεί να ασκήσει τις δύο αντι-φλεγμονώδεις και προ-φλεγμονώδεις επιδράσεις στα κύτταρα του ανοσοποιητικού.

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι μια ω-3 PUFA πλούσια μικροπεριβάλλον μπορεί να καταστείλει την έκκριση ΜΜΡ-9 από CAFS και ότι αυτό σχετίζεται με την επακόλουθη όγκου υπο-αγγειογένεση. Αυτή η μελέτη προτείνει μια νέα αντικαρκινική επίδραση των ω-3 πολυακόρεστα λιπαρά οξέα με τη διαμόρφωση μικροπεριβάλλον του όγκου ειδικά σε CAFS.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Σχήμα S1.

επίπεδα έκφρασης των Ε6 και Ε7 mRNA σε TC-1 καρκινικά. Ολικό RNA εξήχθη από TC-1 όγκων, ακολουθούμενη από ανάστροφη μεταγραφή. επίπεδα Ε6 και Ε7 mRNA μετρήθηκαν με qRT-PCR. Τα επίπεδα έκφρασης του Ε6 και Ε7 mRNA ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη σαν εσωτερικό πρότυπο. Οι εκκινητές Ε6 ήταν προς τα εμπρός, 5′-TGCACAGAGCTGCAAACAAC -3 ‘, και να αντιστραφεί, 5′-AGCATATGGATTCCCATCTC -3’. Οι εκκινητές Ε7 ήταν προς τα εμπρός, 5′-TTTGCAACCAGAGACAACTGA -3 ‘, και να αντιστραφεί, 5′-GCCCATTAACAGGTCTTCCA -3’

doi:. 10.1371 /journal.pone.0089605.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2 .

MMP-9 mRNA δεν επάγεται από κύτταρα TC-1 με συν-καλλιέργεια με ινοβλάστες.