Αφηρημένο

Η διάσπαση και πολυαδενυλίωση ειδικού συντελεστή 4 (CPSF4), μέλος των σύνθετων CPSF, διαδραματίζει βασικό ρόλο στην mRNA πολυαδενυλίωσης και mRNA 3 ‘άκρα ωρίμανση. Ωστόσο, είναι δυνατόν το ρόλο της στην παθογένεση του καρκίνου του πνεύμονα είναι άγνωστη. Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την βιολογικός ρόλος και η κλινική σημασία του CPSF4 της αύξησης του καρκίνου του πνεύμονα και την επιβίωση και θα διευκρινιστούν υποκείμενων μοριακών μηχανισμών της. Βρήκαμε ότι CPSF4 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και του ιστού του όγκου, αλλά δεν ήταν ανιχνεύσιμη σε 8 φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς. Βρήκαμε επίσης ότι CPSF4 υπερέκφραση συσχετίστηκε με κακή συνολική επιβίωση σε ασθενείς με αδενοκαρκινώματα πνεύμονα (

P

& lt? 0.001). αναλύσεις πολυμεταβλητή επιβίωση αποκάλυψε ότι υψηλότερη έκφραση CPSF4 ήταν ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για τη συνολική επιβίωση των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Καταστολή της CPSF4 με siRNA αναστέλλει τον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων πολλαπλασιασμό, σχηματισμό αποικιών, και απόπτωση. μελέτες μηχανισμό αποκάλυψαν ότι τα αποτελέσματα αυτά επιτεύχθηκαν με ταυτόχρονη διαμόρφωση πολλαπλών οδών σηματοδότησης. Knockdown έκφρασης CPSF4 με siRNA ανέστειλε αξιοσημείωτα τη φωσφορυλίωση της ΡΙ3Κ, ΑΚΤ και ERK1 /2 και πρωτεΐνες JNK. Σε αντίθεση, η έκτοπη έκφραση της CPSF4 είχε τα αντίθετα αποτελέσματα. Επιπλέον, CPSF4 knockdown επάγεται επίσης την διάσπαση της κασπάσης-3 και caspse-9 πρωτεϊνών. Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι CPSF4 διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα και η επιβίωση και μπορεί να είναι ένας πιθανός προγνωστικός βιοδεικτών και θεραπευτικός στόχος για αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα

Παράθεση:. Chen W, Guo W, Li Μ, Shi D, Tian Υ, Li Ζ, et al. (2013) Προς τα πάνω ρύθμιση διάσπαση και πολυαδενυλίωση Ειδικά παράγοντα 4 σε αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα και τον κρίσιμο ρόλο του για Cancer Cell επιβίωση και πολλαπλασιασμό. PLoS ONE 8 (12): e82728. doi: 10.1371 /journal.pone.0082728

Επιμέλεια: Chunhong Yan, Γεωργία Regents του Πανεπιστημίου, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 25, Σεπτεμβρίου, 2013? Αποδεκτές: 5 Νοέμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Δεκεμβρίου 2013

Copyright: © 2013 Chen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από κονδύλια από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (81272195, 81071687, 81071687, 81372133), το κράτος «863 Πρόγραμμα» της Κίνας (SS2012AA020403), το κράτος «973 Πρόγραμμα» της Κίνας (2014CB542005), το Ίδρυμα διδακτορικά προγράμματα του Υπουργείου Παιδείας της Κίνας (20110171110077), και το Χημείο του κράτους Βασικά Ογκολογίας στη Νότια Κίνα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς δηλώνουν δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων

Εισαγωγή

πρωτοπαθή καρκίνο του πνεύμονα είναι η κύρια αιτία των θανάτων από καρκίνο που σχετίζονται με όλο τον κόσμο [1]. Μη μικροκυτταρικός καρκίνος του πνεύμονα (NSCLC) είναι μια σημαντική μορφή καρκίνου του πνεύμονα και τη συχνότητά του έχει αυξηθεί τις τελευταίες δεκαετίες. Novel εικόνα για τη βιολογία του NSCLC έχουν βελτιωθεί έκβαση για ορισμένους ασθενείς [2], [3], ωστόσο, το συνολικό ποσοστό επιβίωσης 5 ετών για ασθενείς με NSCLC δεν έχει βελτιωθεί σημαντικά [4]. Ως εκ τούτου, υπάρχει επείγουσα ανάγκη για περαιτέρω κατανόηση των μοριακών μηχανισμών στην ογκογένεση του καρκίνου του πνεύμονα και για τον εντοπισμό νέων θεραπευτικών στόχων για τη βελτίωση της πρόγνωσης των ασθενών

διάσπαση και πολυαδενυλίωση Ειδικές παράγοντα 4 (CPSF4?. Εναλλακτικά γνωστή ως CPSF30 ή NEB1) ανακαλύφθηκε αρχικά ως βασικό συστατικό των μηχανημάτων επεξεργασίας 3 ‘άκρο της κυτταρικής προ-mRNA. Η πρωτεΐνη είναι ένα μέλος της συγκρότημα CPSF, η οποία αναφέρθηκε για να συμμετάσχουν mRNA 3 ‘άκρα ωρίμανση και διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην πολυαδενυλίωση του mRNA με άλλα μέλη του συμπλόκου CPSF [5] – [9]. Έχει προταθεί ότι αυτά mRNA 3 ‘άκρα παράγοντες ωρίμανσης συμπεριλαμβανομένων CPSF4 ίσως συνδέουν καταστολή όγκου [10], [11]. Σε αντίθεση, άλλες μελέτες εντοπίζουν ότι ένας πιθανός ογκογόνο ρόλο αυτών mRNA 3 ‘άκρα παράγοντες επεξεργασίας σε πολλαπλούς ανθρώπινους καρκίνους [12] – [15]. Σε κύτταρα μολυσμένα με ιό της γρίπης, CPSF4 πρωτεΐνη αλληλεπίδρασε με ιό NS1 πρωτεΐνη και ανέστειλαν 3 ‘άκρο διάσπαση και πολυαδενυλίωση του ξενιστή προ-mRNAs [16]. CPSF4 πρωτεΐνη λειτουργικά αλληλεπιδράσει με ογκοκατασταλτικό Cdc73 και ρυθμίζεται η μεταγραφή συγκεκριμένων γονιδίων INTS6 σε HeLa κυττάρων [10]. Αν και η λειτουργία του CPSF4 έχει εξεταστεί σε διάφορα συστήματα μοντέλων, εν δυνάμει ρόλο της σε όγκους δεν έχει ερευνηθεί πλήρως λόγω έλλειψης δεδομένων όσον αφορά την έκφραση CPSF4 και την ανάπτυξη των κυττάρων του όγκου.

Σε αυτή τη μελέτη, διερευνήσαμε την έκφρασης και η κλινική σημασία των CPSF4 στο αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα και να διερευνηθούν οι ρόλοι της και τους μηχανισμούς για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό. Δείξαμε ότι CPSF4 υπερεκφράζεται σε ένα υποσύνολο αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα, η οποία συσχετίζεται με κακή συνολική επιβίωση. Εξόντωση CPSF4 σε καρκίνους του πνεύμονα οδηγεί σε μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων, πολλαπλασιασμό και αυξημένη απόπτωση σε κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα με υψηλά ενδογενή επίπεδα CPSF4. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι CPSF4 μπορεί να είναι ένας πιθανός προγνωστικός βιοδεικτών και θεραπευτικός στόχος για αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα.

Αποτελέσματα

CPSF4 εκφράζεται έντονα σε κυτταρικές σειρές πνεύμονα αδενοκαρκινώματα και ιστούς όγκου

εξέτασε πρώτα την έκφραση της πρωτεΐνης σε CPSF4 αδενοκαρκινώματα κυτταρικές σειρές πνεύμονα με κηλίδωση Western. Οι κυτταρικές σειρές πνεύμονα αδενοκαρκινώματα εξέφρασαν τα υψηλά επίπεδα των πρωτεϊνών CPSF4 σε σύγκριση με την ΗΒΕ (Εικ. 1Α). Διαπιστώσαμε επίσης την έκφραση της πρωτεΐνης CPSF4 στον πνευμονικό ιστό αδενοκαρκινώματα και 8 φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς (καρδιά, πνεύμονες, ήπαρ, τους νεφρούς, τον εγκέφαλο, τη σπλήνα, τις ωοθήκες και των όρχεων) με δοκιμασία ανοσοϊστοχημείας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Β, μια θετική χρώση CPSF4 παρατηρήθηκε στον πυρήνα του καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα, ενώ χρώση CPSF4 δεν μπορούσε να ανιχνευθεί σε όλα τα 8 φυσιολογικούς ιστούς, γεγονός που υποδηλώνει ότι CPSF4 μπορούσε να είναι μια δυνητική βιοδείκτη για αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα.

(Α) Η έκφραση της CPSF4 σε ανθρώπινο φυσιολογικό ΗΒΕ πνεύμονα και διάφορες κυτταρικές γραμμές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα αναλύθηκε με στύπωμα Western. (Β) Η έκφραση του CPSF4 σε 8 φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς και τους ιστούς των πνευμόνων αδενοκαρκίνωμα ανιχνεύθηκε με ανοσοϊστοχημική χρώση. (Μεγέθυνση, χ 200). ADC, αδενοκαρκίνωμα.

Η

CPSF4 υπερέκφραση συνδέεται με κακή πρόγνωση των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα

Για τη διερεύνηση της κλινικοπαθολογική σημασία της CPSF4 σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα, θα πραγματοποιηθεί ανοσοϊστοχημική χρώση σε μια μικροσυστοιχία ιστού . CPSF4-θετική χρώση παρατηρήθηκε στον πυρήνα του καρκίνου του πνεύμονα κύτταρα, αλλά κηλίδωση ήταν αρνητική σε παρακείμενες μη-κακοήθεις ιστούς του πνεύμονα (Εικ. 2Α και 2Β).

(Α) Αντιπροσωπευτικά παραδείγματα για ισχυρές, μέτριες, ασθενείς και αρνητική έκφραση CPSF4 στους ιστούς αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα. Άνω πάνελ, × 40? κάτω πάνελ, × 400, από την περιοχή του πλαισίου σε ανώτερο πίνακα αντίστοιχα. (Β) Σύγκριση των επιπέδων έκφρασης CPSF4 μεταξύ ιστών αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και των παρακείμενων μη-κακοήθεις ιστούς του πνεύμονα με ανοσοϊστοχημεία στον ίδιο ασθενή. Αντιπροσωπευτικές εικόνες ζευγών ιστών αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και των παρακείμενων μη-κακοήθεις ιστούς των πνευμόνων αποδείχθηκε (μεγέθυνση, χ 400). Ανάλυση καμπύλη (C) ROC χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί το σκορ αποκοπής για υψηλή έκφραση CPSF4 πρωτεΐνης σε ιστούς αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Η ευαισθησία και ειδικότητα για OS απεικονίσθηκαν?

σ

= 0,002. (Δ) κατά Kaplan-Meier ανάλυση της συνολικής επιβίωσης με υψηλή ή χαμηλή έκφραση CPSF4 (

σ

& lt? 0,001, δοκιμασία log-rank). ανάλυση (Ε) Kaplan-Meier για τη συνολική επιβίωση των αρσενικών και θηλυκών ασθενείς με υψηλή έκφραση CPSF4 (

σ

= 0.56).

Η

Για να αναπτύξουν μια λογική βαθμολογία αποκοπής της CPSF4 για περαιτέρω ανάλυση επιβίωσης, θα υποβάλλονται κάθε βαθμολογία IHC με την ανάλυση της καμπύλης ROC σε σχέση με την έκβαση των ασθενών. Όπως φαίνεται στο (Σχ. 2C), οι βαθμολογίες αποκοπής CPSF4 IHC για το OS ήταν 5,0. Έτσι, η έκφραση του CPSF4 σε κάθε δείγμα στη συνέχεια ταξινομούνται είτε ως υψηλού επιπέδου (βαθμολογία & gt? 5) ή χαμηλό επίπεδο (βαθμολογία ≤ 5). Τα κλινικοπαθολογοανατομικών χαρακτηριστικά των 150 ασθενών με αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα φαίνεται στον Πίνακα 1Α. Βρήκαμε ότι το ποσοστό έκφρασης υψηλού CPSF4 ήταν υψηλότερη σε ασθενείς με μεταγενέστερο Ν ταξινόμηση (P = 0.033, Chi-Square test) (Πίνακας 1). Δεν υπήρχε σημαντική συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης CPSF4 και άλλων κλινικοπαθολογική παράμετροι, όπως το φύλο του ασθενούς, την ηλικία (≥60 vs. & lt? 60 ετών), Τ ταξινόμηση (Ρ & gt? 0,05, Πίνακας 1). αναλύσεις επιβίωσης έδειξε ότι η υψηλή έκφραση του CPSF4 συσχετίζεται σημαντικά με το μικρότερο συνολικό χρόνο επιβίωσης σε ασθενείς με αδενοκαρκινώματα πνεύμονα (Ρ & lt? 0,001, δοκιμασία log-rank? Σχ. 2D). Επιβίωση αναλύσεις, επίσης, έδειξε ότι δεν υπήρχε σημαντική διαφορά στο συνολικό χρόνο επιβίωσης μεταξύ ανδρών και γυναικών ασθενών με υψηλά επίπεδα CPSF4 (P = 0.56, δοκιμασία log-rank? Σχήμα 2Ε).

Η

Επίσης. χρησιμοποίησε μια μονοπαραγοντική ανάλυση για την αξιολόγηση των ενώσεων μεταξύ πρόγνωση του ασθενούς και αρκετές κλινικοπαθολογική παράγοντες, συμπεριλαμβανομένης της έκφρασης CPSF4 (υψηλή έναντι χαμηλή), το φύλο (αρσενικό έναντι των γυναικών), ηλικίας (≥60 εναντίον & lt? 60 ετών), το στάδιο pt (το μέγεθος του όγκου? Τ3-Τ4 εναντίον Τ1-Τ2) και το στάδιο ρΝ (λεμφαδένα μετάσταση? Ν2-Ν3 εναντίον N0-Ν1). Όλες αυτές οι παράμετροι, εκτός από το φύλο και την ηλικία σχετίζονταν σημαντικά με κατώτερη πρόγνωση (Πίνακας 2). Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε επίσης ότι το υψηλό επίπεδο CPSF4 και βαθμίδα Ρη ήταν ανεξάρτητοι προγνωστικοί παράγοντες για τη συνολική επιβίωση των ασθενών με αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα (Πίνακας 2). Όλα αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι CPSF4 μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην προώθηση πιο επιθετική συμπεριφορά των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα.

Η

CPSF4 νοκ ντάουν αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και η επιβίωση

Για να εκτιμηθεί κατά πόσον η κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα CPSF4 στηρίζονται σε αυτό για την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό, επιμολύναμε siRNA ολιγονουκλεοτίδια στόχευσης CPSF4 σε Η1299 και Α549 κύτταρα, τα οποία εκφράζουν σημαντικά επίπεδα CPSF4. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι DC-based νανοσωματίδια CPSF4 siRNA αξιοσημείωτα κατιούσα ρύθμιση της έκφρασης πρωτεΐνης CPSF4 (Εικ. 3Α), και το knockdown του CPSF4 αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική βιωσιμότητα σε σύγκριση με την επιμόλυνση με τις μη ειδικές ομάδες siRNA με δοκιμασία ΜΤΤ (Εικ. 3Β).

(Α) Ανάλυση της έκφρασης CPSF4 με κηλίδα Western 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση siRNA. Mock, τον έλεγχο του οχήματος? Ελέγχου siRNA, μη ειδικό siRNA? CPSF4 siRNA-1 και CPSF4 siRNA-2, CPSF4 συγκεκριμένες siRNA. βιωσιμότητας (Β) των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Ο μέσος όρος και SD λαμβάνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα σχεδιάζονται (*,

P

& lt? 0,05, **,

P

& lt? 0,01). (C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA CPSF4 ή ελέγχου siRNA (50 nmol /L) κάθε 3 ημέρες και αναπτύχθηκαν για 14 ημέρες? αποικίες βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες μετρήθηκαν. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων (***

P

& lt? 0.001). (D, E) Στις 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση siRNA, κυτταρικού κύκλου αναλύθηκε με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας χρώση ΡΙ. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα δείχνεται (D). Ποσοστό των κυττάρων σε κάθε φάση (Ε). (F) Η1299 και Α549 κύτταρα σπάρθηκαν σε θάλαμο του transwells επικαλυμμένα με μήτρα Matrigel. Η ικανότητα εισβολής των κυττάρων προσδιορίστηκε με καταμέτρηση κυττάρων ανάμεσα σε μήτρα Matrigel προς την βασική πλευρά του transwells. * P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με την μη ειδική ομάδα siRNA ελέγχου

Η

Για να επιβεβαιώσετε την CPSF4 siRNA μεσολάβηση αναστολή της κυτταρικής ανάπτυξης, είμαστε δίπλα εκτελούνται πειράματα σχηματισμού αποικιών και διαπίστωσε ότι CPSF4 νοκ ντάουν μειώθηκε σημαντικά το σχηματισμό αποικιών σε Η1299 και Α549 κύτταρα (Σχ. 3C). Δεδομένου ότι ένα αποτέλεσμα αναστολής αύξησης παρατηρήθηκε σε siCPSF4-επιμολυσμένα κύτταρα, αναλύσαμε τις επιμολύνσεις για τις παραμέτρους του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής. Όπως φαίνεται στο Σχ. 3D και 3Ε, η συσσώρευση των κυττάρων G1 σημαντικά αυξημένη στην ομάδα που CPSF4 siRNA αγωγή σε σύγκριση με τα μη ειδικά χειριστήρια siRNA (75% έναντι 55% σε Η1299 και 73% έναντι 46% το Α549). Επιπλέον, δείξαμε επίσης ότι knockdown του CPSF4 με siRNA σημαντικά ανέστειλε την εισβολή κυττάρων σε τόσο Η1299 και κυττάρων Α549 (Σχ. 3F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η εξουδετέρωση της CPSF4 στα καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα οδήγησε σε σημαντική αναστολές στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την κυτταρική εισβολή.

CPSF4 νοκ ντάουν αδρανοποιεί PI3K /AKT και ΜΑΡΚ σηματοδότησης

Για τον εντοπισμό των πιθανών μοριακών μηχανισμών με την οποία CPSF4 knockdown ανέστειλε επιβίωση καρκίνου του πνεύμονα και πολλαπλασιασμό κυττάρου, αναλύσαμε τις δραστηριότητες αρκετών πρωτεϊνών προ-επιβίωσης με ανάλυση κηλίδας Western. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι CPSF4 knockdown στα δύο κύτταρα Η1299 και Α549 κατέστειλε εντυπωσιακά την φωσφορυλίωση της ΡΙ3Κ, ΑΚΤ, ERK1 /2 και πρωτεΐνες JNK, αλλά σημαντικά αυξημένη φωσφορυλίωση της πρωτεΐνης ρ38 (Εικ. 4Α), οδηγώντας έτσι σε μια αδρανοποίηση της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης.

(Α) στις 72 ώρες μετά την αγωγή siRNA, η έκφραση της πρωτεΐνης CPSF4 και η συνολική και φωσφορυλιωμένο Akt, ΡΙ3Κ, ERK1 /2, πρωτεΐνες JNK και ρ38 σε Η1299 και Α549 ανιχνεύθηκε με κηλίδα Western. GAPDH χρησίμευσε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) Απόπτωση σε Η1299 και Α549 προσδιορίστηκε με κυτταρομετρία ροής 72 ώρες μετά την επιμόλυνση siRNA χρησιμοποιώντας ένα V-FITC kit /ΡΙ-χρώση Annexin. Τα αντιπροσωπευτικά δεδομένα από τρία ανεξάρτητα πειράματα που δείχνονται. (Γ) Η απόπτωση υπολογίστηκε με βάση το ΡΙΤΟ-θετικών σε κύτταρα. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων (*,

P

& lt? 0,05). (Δ) Στις 72 ώρες μετά την αγωγή siRNA, η έκφραση του Bcl-2, διασπασμένη κασπάση 3 ή 9 πρωτεϊνών σε Η1299 και Α549 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

CPSF4 knockdown διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα

Στη συνέχεια ερευνήσαμε την επίδραση της CPSF4 knockdown στην απόπτωση με Annexin V-FITC /staining- PI ανάλυση που βασίζεται FACS (Σχ. 4Β). Εξόντωση CPSF4 με siRNA είχε ως αποτέλεσμα σημαντική επαγωγή κυτταρικής απόπτωσης στα δύο κύτταρα Η1299 και Α549 (Εικ. 4C). Η ενεργοποίηση των κασπασών είναι ένα σημαντικό γεγονός στο μονοπάτι σηματοδότησης απόπτωσης. Εμείς επόμενη ανιχνεύεται η επίδραση της CPSF4 knockdown στην έκφραση και την ενεργοποίηση των δύο βασικών προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών: κασπάσης-3 και κασπάσης-9, σε Η1299 και Α549 κύτταρα με κηλίδα Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4D, CPSF4 knockdown επαγόμενη την ενεργοποίηση της κασπάσης-3 και -9, με αποτέλεσμα την αξιοσημείωτη αύξηση των επιπέδων των διασπασμένη κασπάση-3 και διασπάται πρωτεΐνες κασπάσης-9. Εξόντωση CPSF4 μειωτικά επίσης την έκφραση του Bcl-2, μια σημαντική αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη, τόσο τα κύτταρα Η1299 και Α549 (Εικ. 4D) Τα προαναφερόμενα, δηλαδή αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι CPSF4 μπορεί να ελέγχει διάφορες πτυχές της σηματοδότησης απόπτωσης.

CPSF4 υπερέκφραση προωθεί την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα και ενεργοποιεί PI3K /AKT και ΜΑΡΚ σηματοδότησης

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ο ρόλος της CPSF4 στη ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου του πνεύμονα μέσω του PI3K /AKT και ΜΑΡΚ μονοπατιών σηματοδότησης, κύτταρα Η1299 μετήχθησαν με μια κωδικοποίηση CPSF4 φορέα έκφρασης (pcDNA3.1-CPSF4) ή ένα φορέα ελέγχου που στερείται CPSF4 (pcDNA3.1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση CPSF4 προώθησε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων (Εικ. 5Α) και του σχηματισμού αποικιών (Σχ. 5Β) σε σύγκριση με την επιμόλυνση με τις ομάδες ελέγχου φορέα. Για τον προσδιορισμό των υποκείμενων μοριακών μηχανισμών με τους οποίους CPSF4 ovexexpression αυξημένη ανάπτυξη καρκίνου του πνεύμονα, αναλύσαμε την επίδραση του CPSF4 στην ενεργοποίηση των ΑΚΤ και σηματοδότηση ΜΑΡΚ με κηλίδα Western. Όπως φαίνεται στο Σχ. 5C, CPSF4 ovexexpression σημαντικά ρυθμίζεται προς τα πάνω τη φωσφορυλίωση της PI3K, AKT, ERK1 /2 και πρωτεϊνών JNK. Συνεπώς, τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκτοπη έκφραση της CPSF4 προωθείται κυτταρικής ανάπτυξης εν μέρει μέσω της ενεργοποίησης του ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και σηματοδότηση ΜΑΡΚ σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα.

(Α) Η1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν με CPSF εκφράζουν φορέα, στις 3 ή 4 ​​ημέρες η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων (*,

P

& lt? 0,05). (Β) Η1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν με φορείς έκφρασης CPSF4 ή φορέα ελέγχου κάθε 3 ημέρες και αναπτύχθηκαν για 8 ημέρες, οι αποικίες κηλιδώνονται με κρύσταλλο ιώδες και μετρώνται. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως η μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων (*,

P

& lt? 0,05). (Γ) Η1299 κύτταρα επιμολύνθηκαν με CPSF εκφράζουν φορέα, σε 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, η έκφραση του CPSF4 καθώς και το σύνολο και φωσφορυλιωμένου Akt, ΡΙ3Κ, ERK1 /2 και πρωτεΐνες JNK ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης.

Η

Συζήτηση

Σε αυτή τη μελέτη, δείξαμε ότι CPSF4 ήταν ιδιαίτερα εκφράζεται σε κυτταρικές σειρές πνεύμονα αδενοκαρκινώματα και ιστούς όγκου σε σύγκριση με φυσιολογικό κύτταρο πνεύμονα και noncancerous ιστούς των πνευμόνων, αντίστοιχα. Η έκφραση του CPSF4 σε 8 φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς ήταν ελλιπής. Επιπλέον, κλινικοπαθολογικοί δεδομένων από μικροσυστοιχίες ιστό μας έδειξε ότι τα αδενοκαρκινώματα πνεύμονα ασθενείς με υψηλή έκφραση CPSF4 έχουν μικρότερες περιόδους επιβίωσης από ό, τι τα άτομα με CPSF4 χαμηλή έκφραση. Η πολυπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι CPSF4 υψηλή έκφραση είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας για την συνολική επιβίωση των ασθενών με πνευμονική αδενοκαρκινώματα. Τα αποτελέσματα από

in vitro

πειράματά μας πρότεινε ότι CPSF4 ασκείται ογκογόνο λειτουργία του ρυθμίζοντας τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση των κυττάρων του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα.

CPSF4 ανήκει ο παράγοντας διάσπασης και πολυαδενυλίωσης ειδικότητα (CPSF) συγκρότημα, των οποίων άλλα μέλη είναι CPSF160, CPSF100, CPSF73 και Fip1 [17]. Πρόσφατα, μερικές μελέτες έχουν επικεντρωθεί στο ρόλο των παραγόντων τέλος επεξεργασίας κάποιου mRNA 3 ‘σε καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων FIP1L1, CSTF50, CSTF2 και Neo-PAP [11] – [15]. Για παράδειγμα, Aragaki και συνεργάτες βρήκαν ότι η CSTF2 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε καρκίνο του πνεύμονα, ενώ η έκφραση της ήταν σχεδόν ανιχνεύσιμη σε οποιονδήποτε από 29 φυσιολογικούς ανθρώπινους ιστούς εκτός των όρχεων. Επιπλέον, η knockdown του CSTF2 με siRNA ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα. Το πιο σημαντικό, CSTF2 υπερέκφραση συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση για τους ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα. Στην έκθεση αυτή, παρέχουμε κλινικές ενδείξεις ότι CPSF4 υπερέκφραση προβλέπει κακή πρόγνωση σε ασθενείς με αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα. Η καταστολή της έκφρασης CPSF4 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων καρκίνου του πνεύμονα

in vitro.

Η σημαντική προγνωστική αξία της CPSF4 μπορούσε να εξηγηθεί από τη λειτουργία του προ-επιβίωσης στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα. Είναι ακόμα άγνωστο γιατί CPSF4 υπερεκφράστηκε σε κύτταρα καρκίνου του πνεύμονα? Ωστόσο, με βάση τα ευρήματα της παρούσας μελέτης, πιστεύουμε ότι CPSF4 μπορεί να είναι μια πιθανή διαγνωστική ή /και θεραπευτικός στόχος σε αδενοκαρκινώματα πνεύμονα.

Σε αυτή τη μελέτη, παρατηρήσαμε ότι siRNA μεσολάβηση CPSF4 νοκ ντάουν ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων και απόπτωση που επάγεται στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα που εκφράζουν υψηλά επίπεδα CPSF4. Για τη διερεύνηση των μοριακών μηχανισμών υπογράμμιση, εξετάσαμε PI3K /AKT, ΜΑΡΚ και την απόπτωση σηματοδότηση μονοπατιών αλλοίωση. Η αδρανοποίηση του ΡΙ3Κ /ΑΚΤ, ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης με CPSF4 knockdown, όπως υποδεικνύεται από κατέστειλε φωσφορυλίωση ΡΙ3Κ, ΑΚΤ, ERK1 /2 και JNK, παρατηρήθηκε σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα. Οι οδοί ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και ΜΑΡΚ που εμπλέκονται σε μια ευρεία ποικιλία κυτταρικών διεργασιών, όπως η ανάπτυξη, πολλαπλασιασμό, διαφοροποίηση, ρύθμιση της μεταγραφής, και ανάπτυξη [18], [19]. Αυτές οι δύο οδών σηματοδότησης ενεργοποιούνται στον καρκίνο του πνεύμονα και έχουν ταυτοποιηθεί ως νέο στόχο για θεραπεία [20] – [22]. Έτσι, μπορεί να ασκεί CPSF4 ρύθμισης της ανάπτυξης δράση της, τουλάχιστον εν μέρει, με ρύθμιση της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και ΜΑΡΚ μονοπάτια σε καρκινικά κύτταρα του πνεύμονα σηματοδότησης. Παρά το γεγονός ότι περαιτέρω λεπτομερείς αναλύσεις είναι απαραίτητες για τον προσδιορισμό των άμεσων στόχων των CPSF4, τα ευρήματα αυτής της μελέτης υποδηλώνουν τη βιολογική σημασία των CPSF4 στη ρύθμιση της ανάπτυξης του καρκίνου του πνεύμονα και η επιβίωση. Έτσι, τα αποτελέσματα μας παρέχουν ένα σκεπτικό για φαρμακολογική διερεύνηση CPSF4 ως δυνητικό νέο θεραπευτικό στόχο στον καρκίνο του πνεύμονα.

Εν συντομία, CPSF4 ήταν εντόνως εκφρασμένο σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και καρκινικών ιστών και συσχετίζεται θετικά με κακή πρόγνωση του ασθενείς με αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα. Knockdown έκφρασης CPSF4 με siRNA αναστέλλει σημαντικά την κυτταρική ανάπτυξη και την απόπτωση που επάγεται σε κυτταρικές σειρές αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα με ταυτόχρονες αδρανοποίηση της ΡΙ3Κ /ΑΚΤ και ΜΑΡΚ σηματοδότηση και η ενεργοποίηση των κασπάσης-εξαρτώμενη αποπτωτικά μονοπάτια. Σε αντίθεση, η έκτοπη έκφραση της CPSF4 είχε τα αντίθετα αποτελέσματα. Συνεπώς, τα αποτελέσματα δείχνουν ότι CPSF4 παίζει σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση της ανάπτυξης και επιβίωσης των κυττάρων του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα και μπορεί να είναι ένας πιθανός θεραπευτικός στόχος για τον καρκίνο του πνεύμονα.

Υλικά και Μέθοδοι

δήλωση Ηθική

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Σουν Γιατ-Σεν Πανεπιστημίου Κέντρο Καρκίνου. Όλα τα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη ήταν ανώνυμες και συλλέγονται από ασθενείς για χρήση ρουτίνας παθολογία. Δεν επιγνώσει συναίνεση (γραπτή ή προφορική) λήφθηκε για τη χρήση των δειγμάτων αναδρομική ιστών από τους ασθενείς στη μελέτη αυτή, δεδομένου ότι οι περισσότεροι από τους ασθενείς είχαν αποβιώσει και εν επιγνώσει συναίνεση δεν κρίθηκε αναγκαίο και παραιτήθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας.

οι κυτταρικές σειρές και κυτταρική καλλιέργεια

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου NSCLC (Η1299, Α549, H1975, H1437) ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) και καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad , CA), συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Τα φυσιολογικά ανθρώπινα βρογχικά επιθηλιακά (ΗΒΕ) διατηρήθηκε σε τροποποιημένο Dulbecco μέσο Eagle συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό. Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα και 5% CO

2 στους 37 ° C.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κυτταρολύματα διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε 8-12% δωδεκυλ νάτριο θειική ρίζα μινιπηκτή κλίση πολυακρυλαμιδίου (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) και μεταφέρθηκαν ηλεκτροφορητικά σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Western κηλίδες διερευνήθηκαν με αντισώματα έναντι CPSF4 (Proteintech Group, Inc., Chicago, USA), φωσφο-ΡΙ3Κ ρ85 (Tyr458) /p55 (Tyr199), PI3K, φωσφόρου-Akt (Ser473), Akt, pTyr202 /Y204-ERK1 /2, ERK1 /2, pThr183 /Tyr185-SAPK /JNK, SAPK /JNK, διασπασμένη κασπάση 3, διασπασμένη κασπάση-9 και GAPDH (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ) .Οι ζώνες πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με ενισχυμένη χημειοφωταύγεια (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ)

Lung αδενοκαρκινώματα ιστού microarray

Tissue μικροσυστοιχιών (διάμετρος, 1.5 mM?. βάθος, 4 μm) που χρησιμοποιείται για ανοσοχρώση ανάλυση της έκφρασης πρωτεΐνης CPSF4 αγοράστηκε από τη Σαγκάη ξεπεράσει Biotech (Σαγκάη της Κίνας, https://www.superchip.com.cn/). Η μικροσυστοιχία αποτελούνταν από 150 μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη, εγκλεισμένα σε παραφίνη αδενοκαρκινώματα πνεύμονα και αντίστοιχη παρακείμενη μη κακοήθεις ιστούς των πνευμόνων. Αυτά τα δείγματα ιστού είχαν ληφθεί από ασθενείς που δεν έχουν αντικαρκινική θεραπεία πριν την εκτομή του όγκου. Τα δείγματα ιστού ιστολογικά εξετάστηκαν και ταξινομήθηκαν με τη χρήση του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας το σύστημα του 2004 ταξινόμησης [23]. Λεπτομερή κλινική και παθολογική πληροφορίες, συμπεριλαμβανομένων των κλινικών και παθολογικών όγκου-node-μετάσταση (TNM) το στάδιο και τη συνολική επιβίωση (OS) διάρκειας ήταν διαθέσιμη για όλες τις περιπτώσεις. Η παθολογική κατάσταση ΤΝΜ όλων των αδενοκαρκινώματα πνεύμονα αξιολογήθηκε σύμφωνα με τα κριτήρια της έκδοσης επτά της Αμερικανικής μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο (2010).

Η ανοσοϊστοχημεία (IHC) και ιστολογική

αξιολόγηση

Η ανοσοϊστοχημεία ήταν διεξάγεται με τη χρήση Envisionþ Kit /HRP (DakoCytomation). Εν συντομία, πλακίδια βυθίστηκαν σε Target Ανάκτηση διάλυμα (ρΗ 9? DakoCytomation) και βράζεται στους 108 ° C για 15 λεπτά μέσα σε αυτόκλειστο για ανάκτηση αντιγόνου. CPSF4 αντίσωμα (1:50 αραίωση) προστέθηκε σε κάθε αντικειμενοφόρο πλάκα μετά το κλείδωμα του ενδογενούς υπεροξειδάσης και πρωτεΐνες, και οι τομές επωάστηκαν με HRP-σημασμένο αντι-κουνελιού IgG [Histofine απλή χρώση MAX PO (G)? Nichirei] ως το δευτερογενές αντίσωμα. Υπόστρωμα-chromogenwas προστέθηκε, και τα δείγματα με αιματοξυλίνη. Ένας αρνητικός μάρτυρας ελήφθη με αντικατάσταση του πρωτογενούς αντισώματος με ένα κανονικό IgG κουνελιού.

Οι ανοσοαντιδράσεις αξιολογήθηκαν ανεξάρτητα από δύο παθολόγους τυφλωμένο στην κλινικοπαθολογική πληροφορίες. Πυρηνική ένταση χρώσης κατηγοριοποιήθηκε: απών χρώση ως 0, αδύναμο και 1, μέτρια ως 2, και ισχυρή όσο 3. Το ποσοστό των χρωσμένων κυττάρων έγινε πρόσβαση χρησιμοποιώντας ένα σύστημα πέντε κλίμακα βαθμολόγησης: 0 (χωρίς θετικά κύτταρα), 1 (& lt ? 25% θετικά κύτταρα), 2 (25% -50% θετικά κύτταρα), 3 (50% -75% θετικά κύτταρα), και 4 (& gt? 75% θετικά κύτταρα). Η βαθμολογία για κάθε ιστό υπολογίστηκε πολλαπλασιάζοντας την ένταση και την ποσοστιαία τιμή (το εύρος αυτού του υπολογισμού ήταν, επομένως, 0-12). Ο δέκτης λειτουργεί ανάλυση χαρακτηριστικών (ROC) καμπύλη χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί το σκορ αποκοπής για όγκο «υψηλή έκφραση» με τη χρήση του 0, 1-κριτήριο. Εν συντομία, η ευαισθησία και ειδικότητα για την έκβαση του ασθενούς που μελετάται σε κάθε σκορ παραστάθηκε γραφικά για να δημιουργηθεί μια καμπύλη ROC. Το σκορ επιλέχθηκε ως τιμή αποκοπής, η οποία ήταν πιο κοντά στο σημείο τόσο με μέγιστη ευαισθησία και εξειδίκευση. Οι όγκοι που χαρακτηρίζονται ως «χαμηλή έκφραση» για CPSF4 ήταν εκείνοι με βαθμολογία κάτω ή ίση με την τιμή αποκοπής, ενώ το «υψηλή έκφραση» όγκοι ήταν εκείνοι με βαθμολογίες πάνω από την τιμή. Για να διευκολυνθεί η ανάλυση της καμπύλης ROC, οι κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά διαχωρίστηκαν μεταξύ τους:. Κατάσταση επιβίωσης (θάνατος οφείλεται σε αδενοκαρκινώματα του πνεύμονα σε σχέση με λογοκρισία)

Προετοιμασία DC νανοσωματιδίων και ενθυλάκωση siRNA

ϋΟΤΑΡ-χοληστερόλης (DC) ήταν αγοράστηκε από την Avanti Polar-λιπίδια Inc. (Birmingham, AL, USA). HPLC-grade χλωροφόρμιο ελήφθησαν από την Sigma Chemical Co. (St. Louis, ΜΟ, USA) .Η νανοσωματίδια παρασκευάστηκαν με μία EmulsiFlex-B3 ομογενοποιητή υψηλής πίεσης (ΗΡΗ) (Avestin Inc., Ottawa, Canada) [24], [25]. Οι νανοσώματα διατηρήθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα πριν από την ολονύχτια φύλαξη στους 4 ° C.

CPSF4 siRNA και μη ειδική siRNA αγοράστηκαν από τη Σαγκάη GenePharma Co. (Shanghai Κίνα). Οι αλληλουχίες των ανθρώπινων CPSF4 ειδικά siRNA ήταν 5′-CAU GCA CCC UCG AUU UGA ΑΤΤ-3 ‘(siRNA-1) και 5′-GGU CAC CUG υυΑ CAA GUG UTT -3′ (siRNA-2)? μη ειδικό siRNA, 5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 ‘. Το φορείς CPSF4 υπερέκφραση pcDNA3.1-CPSF4 και οι ροϋΝΑ3.1 φορέα ελέγχου σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν από Cyagen (Cyagen Biosciences Inc., Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Για την παράδοση του CPSF4 siRNA ή CPSF4 φορέα έκφρασης σε κύτταρα καρκίνου πνεύμονα, το siRNA ή φορέα πλασμιδίου ενθυλακώθηκε σε DC νανοσώματα οποίο είχε επικυρωθεί προηγουμένως [26] – [28].

Δοκιμασία

κυτταρικό πολλαπλασιασμό και το σχηματισμό αποικιών

ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ (Promega) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε μετά από επιμόλυνση με CPSF4 siRNA ή CPSF4 φορείς έκφρασης. Στις 48 ώρες μετά την αγωγή, τα κύτταρα (Η1299 και Α549) συλλέχθηκαν, μετρήθηκαν και μονά κύτταρα σπάρθηκαν (400 κύτταρα /φρεάτιο) εις τριπλούν σε πλάκες 6 φρεατίων. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με CPSF4 φορείς έκφρασης ή CPSF4 siRNA κάθε 3 ημέρες και αναπτύχθηκαν για 8-14 ημέρες [29]? αποικίες βάφτηκαν με κρυσταλλικό ιώδες επί 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Αποικίες που περιείχαν περισσότερο από 50 κύτταρα μετρήθηκαν.

In vitro εισβολή δοκιμασία

Το

in vitro

δοκιμασία θαλάμου εισβολή έγινε με Millicell Cell Culture Εισαγωγή (24-καλά PCF 8.0 μl, Millipore). Εν συντομία, τα ένθετα που στέκεται σε πλάκα καλλιέργειας κυττάρων των 24 φρεάτων επικαλύφθηκαν με 100 μΙ 1 mg /mL Matrigel Matrix (BD Falcon, USA) σε ελεύθερο ορού RPMI-1640 και ξηραίνεται στον αέρα. 48 ώρες μετά την αγωγή CPSF4 siRNA, κύτταρα (Η1299 και Α549) συλλέχθηκαν, μετρήθηκαν, και 5 × 10

4 κύτταρα προστέθηκαν στο ένθετο 100 μΙ μέσου χωρίς ορό που περιέχει. Το κατώτερο διαμέρισμα περιείχε 0,5 ml RPMI-1640 που περιέχει 10% FBS. Αυτό ακολουθεί επώαση σε 5% CO

2 σε 37% για 24 ώρες. Τότε σταθερές τα κελιά που διαπερνούν την μεμβράνη μέσα στην κάτω πλευρά με φορμαλίνη και αυτά τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες. Η ικανότητα εισβολής των κυττάρων προσδιορίστηκε με μέτρηση των κυττάρων διείσδυσης πάνω στην κάτω πλευρά του φίλτρου μέσω των πόρων κάτω από ένα μικροσκόπιο σε μεγέθυνση x100. Εμείς προσδιορίστηκαν 3 φορές και τυχαία επιλεγμένων 3 πεδία μετρήθηκαν για κάθε δοκιμασία.

Η απόπτωση και τον κυτταρικό κύκλο ανάλυσης

Για την ανίχνευση της απόπτωσης και του κυτταρικού κύκλου, τα κύτταρα (Η1299 και Α549) επιμολυσμένα με siRNA ήταν αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Στις 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα (1 χ 10

5 κύτταρα /ml) βάφτηκαν με 5 μΙ Αηηβχίην-FITC και 5 μΐ ΡΙ (ιωδιούχο προπίδιο) χρησιμοποιώντας αννεξίνης V-FITC kit /ΡΙ-βαφή (Becton Dickinson, CA, USA), που διατίθενται στην θερμοκρασία δωματίου για 15 λεπτά στο σκοτάδι, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (EPICS XL? Beckman Coulter). Η απόπτωση υπολογίστηκε με βάση το ΡΙΤΟ-θετικών σε κύτταρα. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη χρησιμοποιώντας χρώση ΡΙ. Τα επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση, σταθεροποιήθηκαν σε 70% ψυχρής αιθανόλης για 30 λεπτά. Μετά τη θεραπεία με 100 mg /ml ΚΝάσης (Sigma-Aldrich), τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 50 mg /ml ΡΙ (Sigma Aldrich) σε PBS. Η κυτταρομετρία ροής (EPICS XL? Beckman Coulter) εκτελέστηκε αμέσως. Ακατέργαστα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Multicycle για τα Windows (Beckman Coulter).

t-τεστ στατιστική ανάλυση

Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει δύο ανεξάρτητες ομάδες των δεδομένων. Η μέση βαθμολογία ανοσοϊστοχημική χρώση χρησιμοποιήθηκε ως τιμή αποκοπής για την διαίρεση των ασθενών σε ομάδες έκφραση χαμηλής και υψηλής CPSF4. Chi-square τεστ εφαρμόστηκαν για την ανάλυση της σχέσης μεταξύ της έκφρασης CPSF4 και κλινικοπαθολογική κατάσταση. Kaplan-Meier επιβίωσης χαράχθηκαν και έγιναν δοκιμές log-rank. Μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική ανάλυση έγιναν με το μοντέλο Cox αναλογικό παλινδρόμησης κινδύνου για τον προσδιορισμό των ενώσεων μεταξύ κλινικοπαθολογική μεταβλητών και θνησιμότητα σχετιζόμενη με τον καρκίνο. Ένα

P

αξία & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική σε όλες τις περιπτώσεις