Αφηρημένο

Η παραδοσιακή κινέζικη ιατρική έχει αποκτήσει δημοτικότητα λόγω της ικανότητάς της να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα. Πρόσφατα, τα αποπτωτικά και αντι-αγγειογονικά αποτελέσματα του Trametes robiniophila Murr (Huaier) έχουν ερευνηθεί. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η επίδρασή της στην κινητικότητα των κυττάρων και την ανάπτυξη του όγκου στον καρκίνο των ωοθηκών. Η βιωσιμότητα των κυττάρων και την κινητικότητα μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας προσδιορισμούς SRB, το μηδέν και τη μετανάστευση. Κυτταρικής απόπτωσης αναλύθηκε με χρώση αννεξίνης V /ΡΙ. Χρησιμοποιώντας μια δοκιμασία δέσμη πρωτεΐνης αντίστροφης φάσης (RPPA), αναλύσαμε τα επίπεδα 153 πρωτεΐνες και /ή φωσφορυλιώσεις σε Huaier επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα κύτταρα. Huaier ανέστειλε κυτταρικής βιωσιμότητας και επάγεται τόσο νωρίς και αργά απόπτωσης σε SKOV3, SKOV3.ip1 και Hey κυττάρων σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Κυττάρων εισβολής και της μετανάστευσης ήταν επίσης κατέστειλε σημαντικά. Τα αποτελέσματα έδειξαν RPPA σημαντικές διαφορές (τουλάχιστον κατά 30%? Ρ & lt? 0,05) στα επίπεδα των 7 μορίων σε κύτταρα SKOV3 και 10 σε κύτταρα SKOV3.ip1 μεταξύ των μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων κυττάρων. Τα περισσότερα από τα μόρια που ταυτοποιούνται ρόλους παίζουν στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την απόπτωση ή κύτταρο προσκόλληση /εισβολή. Η ανάλυση στυπώματος Western αξιολογηθούν περαιτέρω ότι η θεραπεία Huaier οδήγησε σε μειωμένη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, ενισχυμένη έκφραση του συνολικού ΟδΚ3β, η αναστολή της φωσφορυλίωσης της ΟδΚ3β επί S9, μείωση τόσο της κυτταροπλασματικής έκφρασης β-κατενίνης και τη μετατόπιση της πυρηνικής β-κατενίνης, και μεταγραφική καταστολή πολλών Wnt /γονίδια β-κατενίνης (

DIXDC1, LRP6, WNT5A

, και κυκλίνη D1). Μετά από να χτυπήσει κάτω ΟδΚ3β, η έκφραση β-κατενίνης δεν θα μπορούσε να ανασταλεί από Huaier. Τέλος, Huaier ανέστειλε την ανάπτυξη των ξενομοσχευμάτων όγκου ωοθηκών in vivo. Αυτές οι μελέτες δείχνουν ότι Huaier αναστέλλει την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων στον καρκίνο των ωοθηκών μέσω της οδού σηματοδότησης AKT /ΟδΚ3β /β-κατενίνης

Παράθεση:. Γιαν X, lyu Τ, Jia Ν, Yu Υ, Hua K, Φενγκ W ( 2013) Huaier υδατικό εκχύλισμα Αναστέλλει ωοθηκών Κινητικότητα Cancer Cell μέσω της ΑΚΤ /ΟδΚ3β /β-κατενίνης Pathway. PLoS ONE 8 (5): e63731. doi: 10.1371 /journal.pone.0063731

Επιμέλεια: Salvatore V. Pizzo, του Πανεπιστημίου Duke Medical Center, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 9 Οκτ 2012? Αποδεκτές: πέμπτης Απριλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: May 8, 2013

Copyright: © 2013 Yan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίζεται από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας, χορηγεί αριθμό 30973185 (https://www.nsfc.gov.cn). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικό καρκίνο στις Ηνωμένες Πολιτείες και την πέμπτη συνηθέστερη αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις γυναίκες [1]. Η συχνότητα εμφάνισης του καρκίνου των ωοθηκών αυξάνει με την ηλικία. Εβδομήντα τοις εκατό των ασθενών παρουσιάζει με προχωρημένη νόσο, και λιγότερο από σαράντα τοις εκατό θα μπορούσε να θεραπευτεί. Η συνολική επιβίωση του προχωρημένου καρκίνου των ωοθηκών δεν έχει αποδειχθεί ελπιδοφόρα, ακόμη και μετά τη χειρουργική επέμβαση σε συνδυασμό με νέες ανοσοενισχυτικό στρατηγικές, όπως η υψηλή δόση χημειοθεραπείας με περιφερικό αίμα μεταμόσχευση βλαστικών κυττάρων, η δόση-πυκνά εβδομαδιαία πακλιταξέλη με καρβοπλατίνη, και στοχευμένη θεραπεία με καρβοπλατίνη /πακλιταξέλη. Πρόσφατα, τα αποτελέσματα από μια τυχαιοποιημένη μελέτη φάσης III (GOG 0208) έδειξαν ότι η χρήση του bevacizumab (ένα ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα υποδοχέα αντίσωμα) κατά τη διάρκεια και μέχρι και 10 μήνες μετά την καρβοπλατίνη και πακλιταξέλη χημειοθεραπεία παρατείνει τη διάμεση επιβίωση χωρίς εξέλιξη κατά περίπου 4 μήνες σε ασθενείς με προχωρημένο επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών [2]. Ωστόσο, η συνολική επιβίωση είναι παρόμοια με τη συμβατική θεραπεία παρά την υψηλή δαπάνη. Επειδή καμία από αυτές τις στρατηγικές μπορεί να προστατεύσει πλήρως ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών από την υποτροπή και μετάσταση, νέα φάρμακα χρειάζονται επειγόντως.

Μεταξύ συμπληρωματικές θεραπείες, παραδοσιακή κινεζική ιατρική (TCM) έχει αποκτήσει δημοτικότητα για την ικανότητά του να σκοτώσει τα καρκινικά κύτταρα με λιγότερο βλάβη στα φυσιολογικά κύτταρα. Επιπλέον, TCM θεραπεία με βότανα είναι σχετικά φθηνή και να έχει αναφερθεί ότι αυξάνει την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας, να μειώσει την τοξικότητα, παρατείνει το χρόνο επιβίωσης, και τη βελτίωση της ποιότητας ζωής και η ανοσοποιητική λειτουργία [3]. Trametes robiniophila Murr (Huaier) είναι ένα είδος μύκητα από την Κίνα που έχουν χρησιμοποιηθεί στο TCM για περίπου 1600 χρόνια. Ωστόσο, έχουν αποτελέσματα κατά του όγκου της και τους μηχανισμούς έχουν μελετηθεί μόνο τα τελευταία χρόνια. Τα αποτελεσματικά συστατικά εκχυλίσθηκαν και αναλύθηκαν με υγρή chromatophy υψηλής απόδοσης (HPLC) και ηλεκτροφόρηση πηκτής πολυακρυλαμιδίου δωδεκυλο θειικού (SDS-PAGE) αναλύσεις, οι οποίες προσδιορίζονται πρωτεογλυκάνες ως τα κύρια συστατικά του εκχυλίσματος Huaier, το οποίο αποτελούνταν από 41.53% πολυσακχαρίτες, 12.93 % αμινοξέα και 8,72% νερό [4], [5]. Το φάρμακο, το οποίο έχει εγκριθεί από την κινεζική Food and Drug Administration (FDA), έχει χρησιμοποιηθεί σε ασθενείς με καρκίνο στο ήπαρ. In vitro πειράματα έδειξαν ότι Huaier μπορεί να αναστείλει την ανάπτυξη των κυττάρων ηπατοκαρκινώματος (HepG2, MHCC97H), κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου πνεύμονα (Α549), και του καρκίνου του ανθρώπινου μαστού κύτταρα (MCF-7, MDA-MB-231) με την επαγωγή απόπτωσης [6] – [8]. Πρόσφατα, Wang et al. ανέφεραν ότι το εκχύλισμα Huaier θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως ένα ισχυρό αντι-αγγειογενετική και αντι-καρκινικός παράγων [9]. Ωστόσο, αν Huaier επηρεάζει τη βιολογική συμπεριφορά των κυττάρων των ωοθηκών δεν έχει διερευνηθεί. Σε αυτή τη μελέτη, εκτός από την αντι-πολλαπλασιαστική και αποπτωτικά αποτελέσματα, η νέα πιθανότητα ότι Huaier εξασκεί ένα αντι-επεμβατική επίδραση στα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μέσω της οδού σηματοδότησης AKT /ΟδΚ3β /β-κατενίνης Διερευνήθηκε.

υλικά και Μέθοδοι

Αντισώματα και αντιδραστήρια

Το RPMI-1640 αγοράστηκε από Jinuo Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Ο ορός εμβρύου μόσχου (FBS) παρασχέθηκε από Gibco-BRL (Rockville, ΙΝ, USA). Αντισώματα έναντι ΑΚΤ (1:1000), ρΑΚΤ-Thr308 (1:1000), PS6-S235 (1:1000), PS6-S240 (1:1000), κυκλίνη D1 (1:2000), κυκλίνη Α (1:2000 ), Ε-καδερίνη (1:1000), την κινάση συνθάση γλυκογόνου 3 βήτα (ΟδΚ3β, 1:1000), ΟδΚ3β φωσφο S9 (1:500, Epitomics, CA, USA.) και β-κατενίνης (1:1000) αγοράστηκαν από την Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ, USA). Το Η1 αντι-ιστόνης (1:300) και αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού IgG υπεροξειδάση κοχλιαρίας (HRP) (1:5000) αντισώματα ελήφθησαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-GAPDH (1:3000) και αντι-β-ακτίνης (1:3000) αγοράστηκαν από Biyuntian Biotech Co., Ltd (Σαγκάη, Κίνα). Όλα τα άλλα χημικά αγοράστηκαν από Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA) και Biyuntian Biotech Co., Ltd.

Προετοιμασία Huaier υδατικό εκχύλισμα

Το μαντζούνι αλοιφή της Huaier ήταν ένα δώρο από Gaitianli Medicine Co. Ltd (Jiangsu, Κίνα). Οι μέθοδοι παρασκευής για το εκχύλισμα Huaier και τα συστατικά του έχουν περιγραφεί αλλού [4], [5] Ένα σύνολο 2 g του εκλείγματος αλοιφή διαλύθηκε σε 50 ml πλήρους μέσου και αποστειρώθηκε με ένα φίλτρο 0,22 μm για να ληφθούν τα 40 mg /ml μητρικό διάλυμα, το οποίο αποθηκεύτηκε στους -20 ° C.

Κυτταροκαλλιέργεια

Οι τρεις τύποι των ωοθηκών επιθηλιακού καρκίνου κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη. κύτταρα SKOV3 και Hey ελήφθησαν από την American Type Culture Collection. κύτταρα SKOV3.ip1 ήταν δώρα από το Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου (Houston, TX) [10]. Οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν με συνήθη τρόπο σε RPMI-1640 που περιέχει 10% FBS, 100 U /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη. Τα κύτταρα επωάστηκαν στους 37 ° C σε 5% CO

2.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων δοκιμασία

Το ανασταλτικό αποτέλεσμα αύξησης της Huaier προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας ένα σουλφοροδαμίνης Β (SRB) δοκιμασίας. Εν συντομία, κύτταρα SKOV3 (2.5 × 10

3), κύτταρα SKOV3.ip1 (2 × 10

3) και Hey κύτταρα (1.5 × 10

3) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με το Huaier υδατικό εκχύλισμα σε διαφορετικές συγκεντρώσεις. Στους χρόνους που υποδεικνύονται, τα κύτταρα πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν με 30% (β /ο) τριχλωροξεικού οξέος, και χρωματίστηκαν για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου με 0,4% σουλφοροδαμίνη Β (SRB) σε 1% οξικό οξύ. Η χρωστική ξεπλυθεί με 1% (ο /ο) οξικό οξύ και στη συνέχεια διαλύθηκε σε ένα διάλυμα βάσης 10 mM Tris. Οι πλάκες αναγνώστηκαν με μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Bio-Rad) στα 570 nm. Κάθε πείραμα διεξήχθη εις τριπλούν και επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές

αννεξίνη V /PI χρώση

Το Dead κυτταρικής απόπτωσης Kit με Annexin V Alexa Fluor® 488 & amp.? Ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (Invitrogen, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για να διερευνηθεί κατά πόσο η θεραπεία με Huaier επαγόμενη τα κύτταρα SKOV3, κύτταρα SKOV3.ip1 και Hey κύτταρα να υποστούν απόπτωση. Τα κύτταρα σημασμένα με φθορισμό, ακολουθώντας τις οδηγίες από τον κατασκευαστή. Εν συντομία, καλλιεργημένα κύτταρα SKOV3 (2 × 10

5), SKOV3.ip1 (2 × 10

5) κύτταρα και Hey κύτταρα (5 × 10

3) σε ένα πιάτο 35 πιπί σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις Huaier για 48 ώρες. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και επανεναιωρήθηκαν σε 1 χ 10

6 κύτταρα /ml σε ρυθμιστικό δέσμευσης. Στη συνέχεια, το πράσινο φθορίζουσα χρωστική (AlexaFluor® 488), συζευγμένης αννεξίνη V και ΡΙ προστέθηκαν και επωάστηκαν στο σκοτάδι επί 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα δείγματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ΡΑΟδοαη ροής (Beckman) εφοδιασμένο με λογισμικό CellQuest. Το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων υπολογίστηκε από το ποσοστό των κυττάρων στο τεταρτημόριο κάτω δεξιά (LR) του οικοπέδου τελεία, η οποία αντιπροσωπεύει τον αριθμό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V + /ΡΙ-) διαιρούμενο με το συνολικό αριθμό των κυττάρων. Κάθε πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές.

In vitro μηδέν δοκιμασία

Μια δοκιμασία μηδέν in vitro διεξήχθη για να εκτιμήσει πώς η μετανάστευση κυττάρων επηρεάζεται από τη χορήγηση του υδατικού εκχυλίσματος Huaier. Ένα σύνολο 2 × 10

4 κύτταρα σπάρθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκα. σημεία αναφοράς κοντά στο «μηδέν» σημαδεύτηκαν να εξασφαλιστεί η χρήση της ίδιας περιοχής για την απόκτηση της εικόνας. Μετά από μια περίοδο επώασης 24 ωρών, συρρέουσες μονοστιβάδες του SKOV3, SKOV3.ip1 και Hey κύτταρα γδαρμένο χρησιμοποιώντας ένα ρύγχος πιπέτας 200 μl για να δημιουργήσετε μια ευθεία «μηδέν». Μετά από πλύση 2 φορές με PBS, μέσο ελεύθερο ορού που περιείχε Huaier εκχύλισμα (5 mg /ml) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο. Το πλάτος μηδέν μετρήθηκε σε τέσσερις προκαθορισμένες θέσεις στην αρχή και στο 12 και 24 ώρες μετά την αρχή στα κύτταρα SKOV3 και SKOV3.ip1. Και το πλάτος μηδέν μετρήθηκε σε Hey κύτταρα στην αρχή και στις 6 και 12 ώρες μετά το μηδέν. Οι αποστάσεις μεταξύ των 2 άκρων του μηδέν μετρήθηκαν στα σημεία αναφοράς και αναλύθηκαν στατιστικά

προσδιορισμούς εισβολής Matrigel

Το σύστημα φρεατίων (24-καλά ένθετο?. Μέγεθος πόρων, 8 μm? Corning συμπρωταγωνιστής, Lowell, MA, USA) χρησιμοποιήθηκε για να διερευνήσει την επίδραση του υδατικού εκχυλίσματος Huaier στην εισβολής του SKOV3, SKOV3.ip1 και Heycells. Τα ένθετα επικαλύφθηκαν με 30 μΙ Matrigel (B.D. Biosciences Pharmingen). Ένα σύνολο 3 κυττάρων και × 10

4 SKOV3, SKOV3.ip1 Hey κάθε αιωρήθηκε σε 0.2 ml φρέσκου μέσου χωρίς ορό εμβρύου μόσχου προστέθηκαν στο ανώτερο φρεάτιο του θαλάμου. Στην ομάδα ελέγχου, 600 μΐ πλήρους μέσου προστέθηκαν στο κατώτερο φρεάτιο, ενώ στην ομάδα δοκιμής, το μέσο περιείχε 5 mg /ml Huaier. Μετά από επώαση για 24 ώρες, τα κύτταρα επί της άνω επιφάνειας της μεμβράνης με swiped μπατονέτες. Στη συνέχεια, τα κύτταρα προσκολλώνται στην κατώτερη επιφάνεια των ενθεμάτων μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν με αιματοξυλίνη. Έξι αντιπροσωπευτικά πεδία κάθε ένθετο τυχαία μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα οπτικό μικροσκόπιο της Olympus.

array πρωτεΐνη αντίστροφης φάσης

κύτταρα SKOV3 και τα κύτταρα SKOV3.ip1 (5 × 10

5) καλλιεργήθηκαν σε δίσκους διαμέτρου 6-cm. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα χωρίστηκαν σε τέσσερις ομάδες για να λάβουν διαφορετικές θεραπείες: πλήρες μέσο μόνο για 72 ώρες, Huaier υδατικό εκχύλισμα (5 mg /ml) για 72 ώρες, πλήρες μέσο για 60 ώρες συν ολονύκτια στέρηση και 10 λεπτά διέγερση με επιδερμικό αυξητικό παράγοντα (EGF, 20 ng /ml) και υδατικό εκχύλισμα Huaier (5 mg /ml) για 60 ώρες συν ολονύκτια στέρηση και 10 λεπτά διέγερση με EGF (20 ng /ml). Η συστοιχία πρωτεΐνη αντίστροφης φάσης (RPPA) δοκιμασία διεξήχθη σε λειτουργικό Πρωτεομική Reverse Phase Πρωτεΐνη Array Πυρήνας Διευκόλυνση στο M.D. Anderson Κέντρο Καρκίνου. Εν συντομία, τα κυτταρολύματα προσαρμόστηκαν για τις συγκεντρώσεις τους σε πρωτεΐνες, μετουσιωμένη με SDS, και αραιώνονται σε σειρά (από μη αραιωμένο έως 1:16 αραίωση) για τον καθορισμό της γραμμικής περιοχής της κάθε αντίδρασης αντιγόνου-αντισώματος. Τα προϊόντα λύσης κηλιδώθηκαν σε πλακίδια νιτροκυτταρίνης επικαλυμμένες (Whatman, Inc.) χρησιμοποιώντας ένα G3 microarrayer GeneTAC (Genomic Solutions) μαζί με θετικούς και αρνητικούς μάρτυρες. Ένα σύνολο 153 επικυρωμένων αντισώματα ειδικά για πρωτεΐνες ή φωσφορυλιωμένη περιοχές τους που εμπλέκονται σε διάφορες σηματοδότηση μονοπάτια ήταν διαθέσιμα και χρησιμοποιούνται στην RPPA (Βλέπε Πίνακα S1 για πρωτεΐνες και θέσεις φωσφορυλίωσης που χρησιμοποιείται σε μελέτες RPPA). Κάθε slide ανιχνεύθηκε με ένα πρωτεύον αντίσωμα συν ένα δευτερογενές αντίσωμα συζευγμένο με χρήση της προσέγγισης ενίσχυση Dako CSA (τυραμιδίου) και απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας το DAB χρωματομετρική αντίδραση. Τα δεδομένα που συλλέχθηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας το ποσοτικό MicroVigene λογισμικού, το οποίο αναπτύχθηκε ειδικά για αυτή την προσέγγιση. Τα επίπεδα φωσφορυλίωσης πρωτεΐνης εκφράστηκαν ως αναλογία προς τις αντίστοιχες συνολικές πρωτεΐνες. Οι τιμές που λαμβάνονται από την κλίση και τις παρακολουθήσεις εκφράστηκαν σε σχέση με τις τυποποιημένες κυτταρολύματα ελέγχου στη συστοιχία. Όλες οι τιμές συγκρίθηκαν με τη μέση μέσα σε κάθε ανιχνευτή αντίσωμα και κατέστησαν ορατά με θερμικούς χάρτες που δημιουργήθηκε από την MatLab λογισμικού (Mathworks Inc.).

Κυττάρων κλασματοποίηση

πυρηνικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας την BestBio Πυρηνικής και κυτταροπλασματικά αντιδραστήρια εκχύλισης (BestBio, Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με τις προδιαγραφές του κατασκευαστή. Εν συντομία, 1 × 10

6 κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με ψυχρό PBS και λύθηκαν με 100 μΙ αντιδραστήριο παγωμένο κυτταροπλασματική εκχύλισης (CER) και 1 μΙ αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ. Μετά από συλλογή του κυτταροπλασματικό κλάσμα (υπερκείμενο), το αντιδραστήριο πυρηνικής εκχύλισης (NER) και κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης προστέθηκε στο αδιάλυτο κλάσμα, διατηρώντας την αναλογία όγκου του CER: NER: κοκτέιλ πρωτεάσης σε 100:500:1. Μετά από επώαση 60 λεπτών και 5 λεπτών φυγοκέντριση (16.000 χ

g

στους 4 ° C), το πυρηνικό κλάσμα συλλέχθηκε. Το υπερκείμενο και πυρηνικό κλάσμα υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος western για β-κατενίνης.

Western ανάλυση κηλίδος

Τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πυκνότητα 2 × 10

5 ανά 3,5 cm πιάτο διαμέτρου και συλλέγονται μετά από την ενδεικνυόμενη θεραπεία. Τα κύτταρα λύθηκαν σε ρυθμιστικό λύσης (Biyuntian Biotech Co., Ltd, Shanghai, Κίνα) ακολουθώντας τις οδηγίες από τον κατασκευαστή. Ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (20 μg ανά λωρίδα) διαχωρίστηκαν με 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore, Billerica, ΜΑ). Μετά τον αποκλεισμό, οι κηλίδες ανιχνεύθηκαν με τα πρωτεύοντα αντισώματα και επωάζονται όλη τη νύκτα στους 4 ° C, ακολουθούμενη από σήμανση με τα κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα με HRP. Ανοσο-αντιδραστικά ζώνες οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το σύστημα ανίχνευσης ECL (Pierce, Rockford, IL, USA). GAPDH, β-ακτίνη και ιστόνη Η1 χρησιμοποιήθηκαν ως οι έλεγχοι φόρτωσης.

Η ανοσοκυτταροχημεία

Τα καλλιεργημένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη. Τα πλακίδια πλύθηκαν και πάλι, υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 1% Triton για 15 λεπτά και αποκλείστηκαν με 3% Η

2O

2 για 20 λεπτά. Μετά την πλύση, τα πλακίδια αποκλείσθηκαν με φυσιολογικό ορό κατσίκας για 10 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και επωάζονται πρώτα με 1:200 αντι-ανθρώπινο Ε-καδερίνης αντίσωμα (Epitomics, CA, USA) στους 4 ° C όλη τη νύκτα και στη συνέχεια με ένα βιοτινυλιωμένο αντι-κουνελιού δευτερεύον αντίσωμα για 30 λεπτά σε RT. Στη συνέχεια, τα πλακίδια επωάστηκαν με το σύστημα αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης για 10 λεπτά σε RT και χρωματίζονται με διαμινοβενζιδίνη (DAB) για 2 λεπτά. Τέλος, βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη και παρατηρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο φωτός.

ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ή χωρίς 7,5 mg /ml Huaier για 48 ώρες. Ολικό RNA εκχυλίστηκε από τα επεξεργασμένα και τα κύτταρα ελέγχου χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Invitrogen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. cDNA συντέθηκε από 1 μα RNA χρησιμοποιώντας το κιτ RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Fermentas, St-Leon-Rot, Γερμανία). Τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την οδό σηματοδότησης Wnt [DIX περιοχή περιέχουσα-1 (

DIXDC1)

], πρωτεΐνη υποδοχέα που σχετίζονται λιποπρωτεΐνης χαμηλής πυκνότητας 6 (

LRP6)

, και χωρίς φτερά τύπου MMTV οικογενειακή ιστοσελίδα ολοκλήρωσης, μέλος 5Α (

WNT5A)

) αξιολογήθηκαν με ένα σύστημα σε πραγματικό χρόνο Illumina Eco χρησιμοποιώντας ένα κιτ Perfect Real Time (Takara). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ένας εσωτερικός έλεγχος σε κάθε αντίδραση. Οι ομάδες εναρκτήρα για αυτά τα γονίδια θα πρέπει να παρέχονται κατόπιν αιτήσεως. Οι σχετικές μεταβολές φορές υπολογίστηκαν με τη μέθοδο της ΔΔCt.

ξενομόσχευμα Ποντίκι και μέτρηση του μεγέθους του όγκου

Το ζώο πειράματα εγκρίθηκαν από την επιτροπή δεοντολογίας της Μαιευτικής και Γυναικολογίας του Νοσοκομείου του Πανεπιστημίου Fudan. Έξι εβδομάδων θηλυκά ποντίκια BALB /c αγοράστηκαν από την σινο-βρετανική SIPPR /BK Lab Animal Ltd., Co (Σαγκάη, Κίνα). κύτταρα SKOV3 (4 × 10

6) εγχύθηκαν υποδορίως στην δεξιά πλευρά κάθε ποντικού. Στη συνέχεια, οι ποντικοί χωρίστηκαν τυχαία σε τέσσερις ομάδες (η = 6 ποντίκια /ομάδα) για να λάβουν είτε φυσιολογικού ορού (NS) ως έλεγχος, Huaier (4 g /kg σωματικού βάρους), σισπλατίνη (DDP) (/kg σωματικού βάρους 5 mg ) ή Huaier συν DDP. Huaier χορηγήθηκε από του στόματος ημερησίως. DDP εγχύθηκε μία φορά την εβδομάδα για τρεις εβδομάδες. Οι ποντικοί ελέγχου υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τον ίδιο όγκο μόνο NS. Οι όγκοι των όγκων μετρήθηκαν δύο φορές την εβδομάδα χρησιμοποιώντας ένα ψηφιακό παχύμετρο και υπολογίζεται χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο τύπο: όγκος του όγκου (mm

3) = (μήκος όγκου [mm] × πλάτος Χ ύψος όγκου [mm]) π /6. Τα ποντίκια θανατώθηκαν την ημέρα 42 μετά την ένεση των καρκινικών κυττάρων. Τα σωματικά βάρη μετρήθηκαν επίσης να αξιολογήσει τις παρενέργειες. Τα μέσα των τριών ανεξάρτητων μετρήσεων τέθηκαν στον μέσο όρο

siRNA μεσολάβηση γονιδιακή σίγηση

Τα δίκλωνα siRNA ΟδΚ3β που στοχεύουν τις αλληλουχίες:. (5′-GAGCAAAUCAGAGAAAUGAdtdt-3 ‘) συνετέθη με Genechem (Shanghai , Κίνα), Για siRNA διαμόλυνση, 5 × 10

5 κύτταρα /δίσκο επιστρώθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας 60 mm. Την επόμενη ημέρα, 10 μΙ αντιδραστηρίου Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) προστέθηκε σε 0.5 ml Opti-ΜΕΜ μειωμένο ορό μέσο (Invitrogen, Carlsbad, CA) χωρίς αντιβιοτικά και ορό και επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 5 λεπτά (διάλυμα ΈΝΑ). 200 pmol siRNA προστέθηκε σε 0,5 ml μέσου Opti-ΜΕΜ χωρίς αντιβιοτικά και ορό (διάλυμα Β). Διάλυμα Α και το διάλυμα Β ήταν τότε αναμιγνύονται και επωάζονται σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά. Το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας απομακρύνθηκε, και στη συνέχεια, 1 ml του 2000-siRNA μείγμα Lipofectamine και 4 ml φρέσκου 1640 χωρίς αντιβιοτικά προστέθηκαν σε κάθε τρυβλίο καλλιέργειας και αναμίχθηκαν ηπίως. 24 ώρες αργότερα, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο καλλιέργειας ή 5 mg /ml υδατικό εκχύλισμα Huaier. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση Western blot μετά από 24 ώρες επώασης.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσοι όροι ± τυπική απόκλιση. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές. Τα αποτελέσματα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό SPSS 11.5. p & lt? 0.05 έγινε δεκτή ως σημαντική

Αποτελέσματα

Huaier ανέστειλε τη βιωσιμότητα των κυττάρων σε SKOV3, SKOV3.ip1 και Hey κύτταρα

Για να αξιολογηθεί η επίδραση της Huaier απόσπασμα σχετικά με την. SKOV3, SKOV3.ip1 και Hey κυττάρων, μετρήθηκε η βιωσιμότητα των κυττάρων με χρήση της ανάλυσης SRB. Αφού τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Huaier για 24, 48, 72 και 96 ώρες σε διάφορες συγκεντρώσεις (0, 0.625, 1.25, 2.5, 5 και 10 mg /ml), Huaier ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη του SKOV3, SKOV3.ip1 και Hey κυττάρων σε ένα χρόνο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (Σχήμα 1). Η κυτταροτοξική δράση ξεκίνησε 24 ώρες μετά την /αγωγή ml Huaier 5 mg και έγινε πιο εμφανής στις 48, 72 και 96 ώρες στον SKOV3 και Hey κύτταρα, ενώ άρχισε στις 48 ώρες στα κύτταρα SKOV3.ip1. Το Hey και τα κύτταρα SKOV3.ip1 ήταν πιο ευαίσθητα στη θεραπεία Huaier, καθώς τα ποσοστά βιωσιμότητας μειώθηκαν στους 31,94% (72 ώρες, ρ & lt? 0.001) και 20,43% (96 ώρες, ρ & lt? 0.001) στα κύτταρα SKOV3.ip1, 4,9% (72 ώρες, ρ & lt? 0.001) και 3,1% (96 ώρες, ρ & lt? 0.001) στα Hey κύτταρα σε σύγκριση με 61,1% (72 ώρες, ρ = 0,01) και 40,1% (96 ώρες, ρ & lt? 0.001) στην κύτταρα SKOV3. Μια σημαντική μείωση στη βιωσιμότητα των κυττάρων παρατηρήθηκε όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 10 mg /ml Huaier, ανεξάρτητα από τη διάρκεια της θεραπείας.

Το ανασταλτικό αποτέλεσμα αύξησης της Huaier μετρήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία SRB. SKOV3 (Α) SKOV3.ip1 (Β) και Hey κύτταρα (C) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με Huaier για 24, 48, 72 και 96 h. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως το μέσο ± SD από τρία ξεχωριστά πειράματα.

Η

κυτταρικής απόπτωσης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας ΡΙ-αννεξίνης-ν χρώση

Επειδή η Huaier εκχύλισμα ανέστειλε σημαντικά την ανάπτυξη των κυττάρων, ερευνήσαμε περαιτέρω αν το αποτέλεσμα αυτό επιτεύχθηκε με επαγωγή απόπτωσης. Η δοκιμασία χρώσης V ΡΙ-αννεξίνης έδειξαν ότι μετά από θεραπεία Huaier για 48 ώρες, η καθυστερημένη απόπτωση ή κυτταρικό θάνατο ρυθμού (UR) και ο ρυθμός πρώιμη απόπτωση (LR), τόσο αυξημένη σε ένα δοσοεξαρτώμενο τρόπο σε SKOV3, SKOV3.ip1 και Hey κύτταρα (Σχήμα 2 και Πίνακας 1).

το ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων μετρήθηκαν με κυτταρομετρία ροής χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό ΡΙ-αννεξίνης V. (Α, Β, C) Dot οικόπεδα δείχνει απόπτωση σε SKOV3 (Α), SKOV3.ip1 (Β) και Hey (C) κυττάρων με κατεργασία Huaier σε 0, 2.5, 5 και 10 mg /mL για 48 ώρες.

η

η κυτταρική κινητικότητα μειώθηκε λόγω της έκθεσής τους σε Huaier εξαγάγετε

για να διερευνήσουν κατά πόσον η Huaier εκχύλισμα πληγείσες κινητικότητα των κυττάρων, διεξήχθησαν δοκιμασίες κυτταρικής εισβολής και το μηδέν. Όταν τα κύτταρα SKOV3 έλαβαν θεραπεία με 5 mg /ml Huaier εκχύλισμα, ο αριθμός της εισβολής κυττάρων μέσω του Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνη ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με την ομάδα άνευ αγωγής (218 ± 35 έναντι 18 ± 7, ρ & lt? 0.001,), υποδεικνύοντας ότι ικανότητα εισβολής ανεστάλη. Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν στο SKOV3.ip1 και Hey κύτταρα (SKOV3.ip1: 438 ± 26 έναντι 83 ± 25? Hey: 264 ± 21 έναντι 62 ± 16 ρ & lt? 0.001, Εικόνα 3).

(Α ) Η επίδραση της Huaier για την εισβολή των SKOV3, SKOV3.ip1 και Hey κύτταρα εξετάστηκε με τη χρήση του συστήματος Transwell. Αντιπροσωπευτικά εικόνες που παρουσιάζονται. (Β) Μετά από θεραπεία 24 ωρών με 5 mg /ml Huaier, ο αριθμός των επιτυχώς εισβολής SKOV3, SKOV3.ip1 και Hey κυττάρων μετρήθηκε. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. ** Ρ & lt?. 0.01 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Μια δοκιμασία γρατσουνιά διεξήχθη για να εκτιμηθεί η κυτταρική μετανάστευση in vitro. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 4, ο δείκτης μετανάστευσης (που αντιστοιχεί σε επούλωσης πληγών ικανότητα) ανεστάλη σημαντικά σε κύτταρα SKOV3 σε επεξεργασία με Huaier για 48 ώρες σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (23,3% έναντι 69,8%, ρ & lt? 0,01), ενώ ήταν παρόμοια σε κύτταρα κατεργάζεται με Huaier για 24 ώρες και μη επεξεργασμένα κύτταρα (17,5% έναντι 24,7%, ρ & gt? 0,05). Ωστόσο, ο δείκτης μετανάστευσης μειώθηκε ήδη 24 ώρες μετά την αγωγή Huaier σε κύτταρα SKOV3.ip1 σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (19,3% έναντι 60,6%, ρ & lt? 0,05). Για Hey κύτταρα, το τραύμα μπορεί σχεδόν κλειστό για μόνο 12 ώρας επούλωσης σε ακατέργαστα κύτταρα, και ο δείκτης μετανάστευσης ανεστάλη σημαντικά σε κατεργασμένα κύτταρα με Huaier απλώς για 6 h (58,2% έναντι 29,1% p & lt?. 0.01).

(Α) μια ευθεία περιοχή του τραύματος παράχθηκε σε κάθε καλλιέργεια και στην αρχή, και τη διαχείριση των Huaier (5 mg /ml) έδειξαν μια καθυστερημένη διαδικασία κλεισίματος τραύματος σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα. Αντιπροσωπευτικές εικόνες των κυττάρων ελέγχου και /mL Huaier-επεξεργασμένα κύτταρα 5 mg αποκτήθηκαν σε 0, 12,24 h (SKOV3, SKOV3.ip1) ή 0, 6, 12 h (Hey). (Β) Οι δείκτες μετανάστευσης ήταν σημαντικά αναστέλλεται από Huaier. Οι ράβδοι αντιπροσωπεύουν το δείκτη μετανάστευση για κάθε επεξεργασία, εκφράζεται ως τιμή σε σχέση με την απόσταση μετακινηθεί από την κυτταρική μονοστοιβάδα. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσο ± SD. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τουλάχιστον τρεις φορές. ** P & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο

Η

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, την απόπτωση και την κυτταρική προσκόλληση ή εισβολή σηματοδότησης πρωτεΐνες κάτω-ρυθμίζονται από Huaier θεραπεία

Για να διερευνηθούν οι πορείες σηματοδότησης που θα μπορούσε. συμβάλλουν στην ανασταλτική επίδραση Huaier για την κινητικότητα, που χρησιμοποιείται για την ανάλυση RPPA να αξιολογήσει πρωτεΐνη αλλαγές στα κύτταρα SKOV3 και SKOV3.ip1 αντιμετωπίζονται με Huaier. RPPA είναι μια νέα τεχνολογία υψηλής απόδοσης που παρακολουθεί τις αλλαγές στην έκφραση της πρωτεΐνης την πάροδο του χρόνου, πριν και μετά από θεραπείες, μεταξύ της νόσου και των μη νοσηρές καταστάσεις και μεταξύ ανταποκρίθηκαν και μη-ανταποκρινόμενοι [11]. Χρησιμοποιώντας RPPA, αναλύσαμε το επίπεδο έκφρασης των 153 πρωτεΐνες και /ή θέσεις φωσφορυλίωσης σε Huaier-επεξεργασμένο ή των ωοθηκών καρκίνο κυτταρικές γραμμές με ή χωρίς διέγερση EGF. Για κάθε δείγμα και κάθε αντίσωμα, η διαφορά σήματος μεταξύ των μη επεξεργασμένων και Huaier-επεξεργασμένα κύτταρα υπολογίστηκε ως εξής [12]: ([μέσο των επεξεργασμένων κυττάρων – μέσου μη κατεργασμένων κυττάρων] /[μέσο των μη επεξεργασμένων κυττάρων]) × 100%.

από το 153 πρωτεϊνών και θέσεις φωσφορυλίωσης αναλύθηκαν, 7 και 10 διέφεραν κατά περισσότερο από 30% τα κατεργασμένα και μη κατεργασμένα συνθήκες στα κύτταρα SKOV3 και SKOV3.ip1, αντίστοιχα. Αντιπροσωπευτικά θερμικούς χάρτες παρουσιάζονται στο Σχήμα 5Α. Σε κύτταρα SKOV3, θεραπεία Huaier ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και μετέβαλε τα επίπεδα των σχετικών χώρων πρωτεϊνών /φωσφορυλίωσης? για παράδειγμα, μειώθηκε φωσφορυλίωση του HER2 στο Y1248 και πρωτεΐνη ER επίπεδα, αλλά επάνω ρυθμισμένη ρ53 και φωσφορυλίωση Taz σε S79. Σε κύτταρα SKOV3.ip1, περισσότερο φιλο-πολλαπλασιαστική πρωτεΐνες, όπως ER, c-kit και φωσφορυλιωμένο S6 (S6 ριβοσωμικής πρωτεΐνης κινάσης? Φωσφορυλιωμένο στο S235-236 και S240-244) έχουν κάτω-ρυθμίζονται από Huaier. Επιπλέον, Huaier ανέστειλε την έκφραση της μακρύτερης ισομορφής του Bcl (Bcl-XL) και επάνω ρυθμισμένη την έκφραση των προ-αποπτωτικών πρωτεϊνών, όπως ρ53 και διασπασμένο πολυ (ΑΟΡ-ριβόζη) πολυμεράσης (PARP_cleaved) σε SKOV3.ip1 κύτταρα (Εικόνα 5Β).

(Α) Ιεραρχική ανάλυση συστάδων των τεσσάρων δειγμάτων (έλεγχος, Huaier-θεραπεία για 72 ώρες, την πείνα + διέγερση EGF, πείνα + EGF διέγερση + Huaier για 60 ώρες) σε SKOV3 και SKOV3 .ip1 κύτταρα σύμφωνα με την έκφραση του 16 μορίων σηματοδότησης. Cluster βασικό χρώμα: κόκκινο – up-ρύθμιση? πράσινο – κάτω-ρυθμίζονται? μαύρο – αμετάβλητη. (Β και Γ): Διπλώστε αλλαγές στην έκφραση ή φωσφορυλίωση διαφόρων πρωτεϊνών μετά τη θεραπεία Huaier και προσθήκη EGF αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας τον προσδιορισμό RPPA στο SKOV3 (Β) και κύτταρα SKOV3.ip1 (C). Οι σχετικές τιμές της ομάδας ελέγχου και τα πείνα + EGF ομάδες διέγερσης ορίστηκαν ως 1.0. *:. Αλλαγή αναδίπλωσης & gt? 30%

Η

Βρήκαμε επίσης ότι Huaier μπορεί να ρυθμίζει την κυτταρική προσκόλληση και εισβολή, με βάση την ρύθμιση προς τα κάτω της ινονεκτίνης, β-κατενίνης και caveolin-1 έκφρασης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές και up-ρύθμιση του κλαουδίνης 7 στα κύτταρα SKOV3.ip1 μετά τη θεραπεία Huaier (Εικόνα 5Β).

Συμμετοχή του /mTOR /S6 οδού ρΑΚΤ σε Huaier που προκαλείται από την αναστολή της ανάπτυξης των ωοθηκών των καρκινικών κυττάρων

Χρήση η RPPA, βρήκαμε ότι ριβοσωμική S6 φωσφορυλίωση της κινάσης καταστάλθηκε με επεξεργασία Huaier. S6 κινάση είναι ένας σημαντικός στόχος του μονοπατιού mTOR, και προωθεί την ανάπτυξη των κυττάρων και τον πολλαπλασιασμό. Η οδός AKT είναι ένα ανάντη ενεργοποιητής της οδού του mTOR. Ως εκ τούτου, αναλύσαμε τα επίπεδα της πρωτεΐνης του ρΑΚΤ, ΑΚΤ, PS6 (S235-236) και PS6 (S240-244) με western αποτύπωση. Βρήκαμε ότι η φωσφορυλίωση της ΑΚΤ ήταν σημαντικά μειωμένη στα κύτταρα SKOV3.ip1 μετά από 72 ώρες θεραπείας Huaier, είτε με είτε χωρίς διέγερση EGF. Σύμφωνα με τη μείωση της ρΑΚΤ, η φωσφορυλίωση της S6 στο S235-236 και S240-244 επίσης ρυθμισμένα προς τα κάτω. Ωστόσο, σε κύτταρα SKOV3, η φωσφορυλίωση της S6 στο S235-236 και S240-244 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω στο κελί που έλαβαν θεραπεία με Huaier μόνο, αλλά όχι στις ομάδες διέγερση EGF, ενώ ρΑΚΤ ήταν ελαφρώς αυξημένη στις Huaier κατεργασμένα κύτταρα SKOV3. Huaier κάτω-ρυθμίζεται η φωσφορυλίωση της S6 στο S240-244 στις δύο Huaier έλαβαν μόνο και ομάδες διέγερση ΕΤΠ Γεια σου κύτταρα. (Σχήμα 6).

φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, τα συνολικά επίπεδα ΑΚΤ, και φωσφορυλίωση S6 στο S235 και S240 μετρήθηκαν με κηλίδωση Western των δειγμάτων από καθεμία από τις τέσσερις ομάδες θεραπείας (έλεγχος, Huaier-θεραπεία για 72 ώρες, πείνα + EGF διέγερση, την πείνα + EGF διέγερση + Huaier για 60 ώρες). Οι αριθμοί στις πρωτεϊνικές ζώνες αντιπροσωπεύουν τις φορές αλλαγές, με τα βασικά επίπεδα στον έλεγχο ή ομάδες ασιτίας + EGF ανατεθεί μια τιμή 1.0.

Η

Huaier αναστέλλει την κυτταρική εισβολή μέσω της οδού /β-κατενίνης ΟδΚ3β

Επειδή τα αποτελέσματα της χρώσης αννεξίνης V /ΡΙ έδειξε ότι Huaier προκαλεί απόπτωση και τα αποτελέσματα RPPA ανέφεραν επίσης ότι αρκετές προ- και αντι-αποπτωτικών πρωτεϊνών που διαμορφώνονται από κατεργασία Huaier, τα αποτελέσματά μας υποστηρίζουν την προ-αποπτωτικό αποτέλεσμα της Huaier που παρατηρήθηκαν σε άλλες μελέτες. Ωστόσο, η ανάλυση RPPA έδειξε επίσης ότι πρωτεΐνες που εμπλέκονται στην κυτταρική προσκόλληση και εισβολή ήταν διαμορφωμένο με κατεργασία Huaier (Σχήμα 5). Αυτό υποδηλώνει ότι Huaier μπορεί να έχει άλλο θεραπευτικά σημαντική επίδραση, ειδικά επειδή τα επιθηλιακά καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών έχουν μια μοναδική επεμβατική /μεταστατικού δυναμικού και συχνά εμφυτεύσει στην πυελική ή κοιλιακή κοιλότητα.

Μεταξύ αυτών των πρωτεϊνών, β-κατενίνης αποτελεί βασικό συστατικό του Ε-καδερίνης μεσολάβηση καταρράκτη προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου. Χρησιμοποιώντας κηλίδες Western, επαληθεύσαμε περαιτέρω τις αλλαγές στην έκφραση β-κατενίνης σε SKOV3, SKOV3ip1 και Hey κύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7, Huaier μείωσε δραματικά την κυτοσολική συσσώρευση του β-κατενίνης σε έναν χρονο-εξαρτώμενο τρόπο με τον SKOV3, SKOV3.ip1 και Hey κύτταρα. Η πυρηνική έκφραση της β-κατενίνης ήταν επίσης μειωμένη. Τα δεδομένα μας δείχνουν ότι Huaier καταστέλλει όχι μόνο την έκφραση της πρωτεΐνης, αλλά και την πυρηνική μετατόπιση της β-κατενίνης.

Τόσο η κυτταροπλασματική έκφραση και την πυρηνική μετατόπιση της β-κατενίνης ήταν σημαντικά αναστέλλεται κατά τη θεραπεία Huaier. κύτταρα (Α) SKOV3, (Β) SKOV3.ip1 και (C) Hey έλαβαν θεραπεία με 5 mg /ml και 7,5 mg /ml Huaier για 24, 48 και 72 ώρες. Οι κυτταροπλασματικές και πυρηνικές πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν ξεχωριστά. Μια αντιπροσωπευτική κηλίδα western δείχνεται. Για πυκνομετρική ανάλυση των επιπέδων β-κατενίνης, τα αποτελέσματα ομαλοποιήθηκαν στα επίπεδα του GAPDH (για κυτταροπλασματικές πρωτεΐνες) ή ιστόνης 1 (πυρηνικές πρωτεΐνες). Το βασικό επίπεδο για τα μη επεξεργασμένα ομάδων σε κάθε χρονικό σημείο ανατέθηκε μια τιμή 1.0.

Η

Για να διευκρινιστεί ο μηχανισμός που προκαλεί την προς τα κάτω ρύθμιση της β-κατενίνης, αξιολογήσαμε περαιτέρω την έκφραση του ΟδΚ3β (γλυκογόνο συνθάσης 3β κινάση), το οποίο είναι γνωστό ότι ρυθμίζει αρνητικά την κλασική Wnt /β-κατενίνης οδό σηματοδότησης μέσω φωσφορυλίωσης β-κατενίνης, η οποία οδηγεί σε υποβάθμιση της [13]. Λόγω φωσφορυλίωση της ΟδΚ3β επί S9 αναστέλλει τη δράση της και εμποδίζει την στόχευση των β-κατενίνης για την αποδόμηση, προϊόντα λύσης ολικού κυττάρου εξετάστηκαν τόσο για την ολική ΟδΚ3β και φωσφορυλιωμένη ΟδΚ3β σε επίπεδα S9 μετά από θεραπεία Huaier.