Αφηρημένο

Η αντοχή στα φάρμακα αποτελεί πρόκληση σε χημειοθεραπεία και έχει προσελκύσει το ερευνητικό ενδιαφέρον σε όλο τον κόσμο και ιδιαίτερη προσοχή έχει δοθεί φυσικών ενώσεων για να ξεπεραστεί αυτή η δυσκολία. Pulchrin Α, μία νέα ένωση που απομονώνεται από φυσικά προϊόντα απέδειξε νέα δυνατότητα για ανάπτυξη ως ένα φάρμακο. Η ταυτοποίηση των pulchrin Α διεξήχθη χρησιμοποιώντας διάφορες φασματοσκοπικές τεχνικές όπως πυρηνικό μαγνητικό συντονισμό, φασματόμετρο μάζας υγρής χρωματογραφίας, υπέρυθρο και το υπεριώδες φασματομετρία. Οι επιδράσεις κυτταροτοξικότητας επί CaOV-3 κύτταρα υποδεικνύει ότι pulchrin Α είναι πιο δραστήρια από σισπλατίνη, η οποία έχει ένα IC

50 22.3 μΜ. Σημαντικές αλλαγές στην κυτταρική μορφολογία ήταν παρόντα, όπως διόγκωση της κυτταρικής μεμβράνης και σχηματισμό αποπτωτικών σωμάτων. Η συμμετοχή των φωσφατιδυλοσερίνη (PS) στην απόπτωση επιβεβαιώθηκε με Annexin V-FITC μετά από μια θεραπεία 24 ώρες. Η απόπτωση ενεργοποιείται μέσω της εσωτερικής οδού με την ενεργοποίηση του procaspases 3 και 9 καθώς και διασπασμένου κασπάσες 3 και 9 και κατέληξε στο μονοπάτι εκτελεστής, με την εμφάνιση του DNA laddering. Η απόπτωση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω μέσω των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης και της πρωτεΐνης, στην οποία πρωτεΐνη Bcl-2 ρυθμισμένα προς τα κάτω και ρυθμιζόταν up-Βαχ πρωτεΐνη. Επιπλέον, ο κυτταρικός κύκλος CaOV-3 διαταράχθηκε κατά τη φάση G0 /G1, που οδηγούν σε απόπτωση. Μοριακή μοντελοποίηση των πρωτεϊνών Bcl-2 έδειξαν μια υψηλή συγγένεια, η οποία ανέστειλε τη λειτουργία των πρωτεϊνών Bcl-2 και οδήγησε σε κυτταρικό θάνατο. Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης μπορεί να ρίξει φως σχετικά με την ανάπτυξη νέων θεραπευτικών παραγόντων, ιδιαίτερα, τα ανθρώπινα θεραπείες για τον καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Nordin Ν, Fadaeinasab M, Mohan S, Mohd Χασίμ Ν, Οθμάν R, Karimian Η, et al. (2016) Pulchrin Α, ένα νέο φυσικό παράγωγο κουμαρίνης του

Enicosanthellum pulchrum

, διεγείρει απόπτωση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών μέσω ενδογενούς οδού. PLoS ONE 11 (5): e0154023. doi: 10.1371 /journal.pone.0154023

Επιμέλεια: Yi-Hsien Hsieh, Ινστιτούτο Βιοχημείας και Βιοτεχνολογίας, ΤΑΪΒΑΝ

Ελήφθη: 26 του Δεκεμβρίου 2015? Δεκτές: 7, Απρίλη του 2016? Δημοσιεύθηκε: 2 Μάη 2016

Copyright: © 2016 Nordin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Πανεπιστήμιο της Malaya πλαίσιο επιχορήγησης ΣΔΙΤ (PG151-2012B) και το Υπουργείο Ανώτατης Εκπαίδευσης της Μαλαισίας υπό την επίδραση Κονδυλίων Έρευνας Υψηλή (UM -MOHE UM.C /625/1 /HIR /Mohe /SC /09)

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος είναι μια σημαντική νόσος που προσβάλλει τον ανθρώπινο πληθυσμό σε όλο τον κόσμο [1]. Περίπου, το ήμισυ όλων των ανδρών και περισσότερο από το ένα τρίτο όλων των γυναικών έχουν διαγνωστεί με καρκίνο κατά τη διάρκεια της ζωής τους. Εν τω μεταξύ, το ένα τέταρτο των ενηλίκων πεθαίνουν εξαιτίας του καρκίνου [2]. Στοιχεία που συγκεντρώνονται από τον Διεθνή Οργανισμό για την Έρευνα στον Καρκίνο (IARC) για την καταχώρηση του καρκίνου και τη θνησιμότητα δείχνουν ότι περίπου 12,6 εκατομμύρια νέα κρούσματα καρκίνου έχουν αναφερθεί μόνο το 2008 σε όλο τον κόσμο [2]. Σύμφωνα με το Εθνικό Αρχείο Καρκίνου της Μαλαισίας [3], συνολικά 8.123 (44,6%) άνδρες και 10.096 (55,4%) γυναίκες κάτοικοι είχαν διαγνωστεί με καρκίνο στη χερσόνησο της Μαλαισίας το 2007.

Εν τω μεταξύ, ένα σύνολο 239.000 νέες περιπτώσεις παγκοσμίως καταγράφηκαν για τον καρκίνο των ωοθηκών [4]. Ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογικό καρκίνο, κυρίως λόγω της έλλειψης συμπτωμάτων ειδικότητας και βιοδεικτών που διατίθενται για την ανίχνευση κατά τα πρώτα στάδια της νόσου. Στην πλειονότητα των περιπτώσεων καρκίνου των ωοθηκών, τελευταίο στάδιο διάγνωση συχνά ανιχνεύεται σε ασθενείς οι οποίοι δεν ήταν σε θέση να ανταποκριθεί αποτελεσματικά στη θεραπεία. Σε γενικές γραμμές, οι ασθενείς αυτοί έχουν ποσοστό επιβίωσης 5 ετών, αλλά το ποσοστό αυτό έχει μειωθεί στο 20-30% [5-7]. Η θεραπεία των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών βασίζεται στο πρότυπο πρωτόκολλο όπου η χειρουργική επέμβαση είναι η αρχική θεραπεία που ακολουθείται από χημειοθεραπεία. Τρία διαφορετικά φάρμακα που χρησιμοποιούνται συνήθως για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών είναι η δοξορουβικίνη, καρβοπλατίνη και ταξανίου. Ωστόσο, αυτά τα φάρμακα είναι συχνά λιγότερο αποτελεσματικές οποία οι ασθενείς μπορεί να παρουσιάζουν αντοχή σε χορηγούμενου φαρμάκου [8]. Αυτά τα μειονεκτήματα οδήγησαν τους ερευνητές να διερευνήσουν δυνητικά αποτελεσματική εναλλακτική ενώσεων ως θεραπεία για τον καρκίνο των ωοθηκών.

κουμαρίνη και τα παράγωγα της ανήκουν στην οικογένεια λακτόνη που περιλαμβάνει το σκελετικό πλαίσιο βενζοπυρόνη, η οποία μπορεί να βρεθεί ευρέως στη φύση [9]. Τα παράγωγα κουμαρίνης έχουν βρεθεί να εμφανίζουν σημαντικές θεραπευτικές και διάφορες βιολογικές δραστηριότητες [10, 11] που είναι χρήσιμα στην φωτοχημειοθεραπεία, αντικαρκινική θεραπεία και η θεραπεία κατά του HIV [12, 13]. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως κεντρικού νευρικού συστήματος (ΚΝΣ) διεγερτικά [14], αντιβακτηριακά [15, 16], αντιμυκητιακά [17, 18], αντι-φλεγμονώδη [19], αντι-θρομβωτικά [20], αντιφυματικά φάρμακα [21] και βαφές [22]. Μερικά από τα παράγωγα κουμαρίνης έχουν επίσης αναφερθεί ως στερεωτικό και αρωματικούς παράγοντες. Ωστόσο, οι Ηνωμένες Πολιτείες Τροφίμων και Φαρμάκων (FDA) έχει ρυθμιστεί η χρήση της κουμαρίνης ως πρόσθετα τροφίμων [23-25]. Ισχυροί αντιβιοτικά που λαμβάνονται από κουμαρίνης, όπως νοβοβιοκίνη, coumaromycin και chartesium είναι εμπορικά διαθέσιμα [26]. Στην παρούσα μελέτη, ένα νέο παράγωγο κουμαρίνης απομονώθηκε για πρώτη φορά από το φυσικό προϊόν,

Enicosanthellum pulchrum

. Μια μεγάλη ομάδα αλκυλίου συνδέθηκε με ετεροκυκλικών δακτυλίων κουμαρίνης για τη διερεύνηση των δυνατοτήτων του ως πολλά υποσχόμενη αντικαρκινικός παράγοντας ενάντια στην ανθρώπινη καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών γραμμή CaOV-3 σε χαμηλές συγκεντρώσεις μέσα σε 24 ώρες.

Υλικά και Μέθοδοι

Πειραματικό

σιλικαζέλ H αγοράστηκε από την Sigma-Aldrich, ενώ σίλικα τζελ 60 (230˗400 mesh), dimetylsulfoxide (DMSO), μεθανόλη (MeOH), αιθανόλη (EtOH),

n

εξάνιο και οξικό αιθυλεστέρα (EtOAc) αγοράστηκαν από την Merck Co. (Γερμανία). 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, 5-διφαινυλ τετραζόλιο (αντιδραστήριο ΜΤΤ) παρασχέθηκε από την Invitrogen (Carlsbad, USA). RPMI-1640 (ρΗ 7,4), πενικιλλίνη /στρεπτομυκίνη και εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS) αγοράσθηκαν από Nacalai Tesque (Ιαπωνία) και θρυψίνη-ΕϋΤΑ 10Χ παρασχέθηκε από Biowest (USA). Η υπεριώδης (UV) φάσματα και το (IR) φάσματα υπερύθρων καταγράφηκαν σε ένα υν φασματοφωτόμετρο (UV-1601 Shimadzu, Ιαπωνία) και FT-IR φασματόμετρο Φάσμα RXI (Perkin Elmer, USA), αντίστοιχα. Τα φάσματα πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) καταγράφηκαν σε 600 MHz Bruker (Ελβετία) φασματόμετρο. Οπτική περιστροφή διεξήχθη σε Jusco (Tokyo, Japan). Τα φάσματα μάζας καταγράφηκαν για ιονισμό ψεκασμού ηλεκτρονίου (ESI) φασματομετρία μάζας επί IT-TOF από Shimadzu, Japan. υγρή χρωματογραφία (HPLC) υψηλής απόδοσης διεξήχθη επίσης.

Προετοιμασία του εργοστασίου εξόρυξης

Ρίζες του

E

.

pulchrum

συλλέχθηκαν τον Σεπτέμβριο του 2011 στο δάσος του βουνού της Cameron Highlands (Pahang, Μαλαισία). Ο Διευθυντής του Τμήματος Δασών του Pahang, τη Μαλαισία δόθηκε η άδεια να εισέλθουν και να συλλέγουν τα δείγματα [27]. Το φυτό εντοπίστηκε από τον αείμνηστο καθηγητή Δρ Kamarudin Mat Salleh από Universiti Kebangsaan Μαλαισία (UKM). Το δείγμα (SM769) τοποθετήθηκε στο Βοτανικής Τμήμα Ερμπάριο, Σχολή Θετικών Επιστημών και Τεχνολογίας, UKM (Μπανγκί, Μαλαισία). Οι ρίζες ξηράνθηκαν στον αέρα και αλέθεται σε 40-60 mesh μέγεθος σωματιδίων. Τα εκχυλίσματα που λαμβάνονται με διαβροχή στο

ν

εξάνιο διαλύτη. Ένα περιστροφικό εξατμιστήρα (Buchi, Switzerland) χρησιμοποιήθηκε για την απομάκρυνση των διαλυτών από τα δείγματα.

Εκχύλιση και απομόνωση του pulchrin Μια

Για τον καθαρισμό του pulchrin Α, το εκχύλισμα εξανίου διαχωρίστηκε με χρωματογραφία στήλης (CC) με τη χρήση διοξειδίου του πυριτίου τύπου gel 60 (230-400 mesh). Το σύστημα διαλύτη που χρησιμοποιείται για το διαχωρισμό των ενώσεων στην στήλη κλίσεως από λιγότερο πολικές σε πιο πολικό (εξάνιο-EtOAc-MeOH). Ένα σύνολο 157 κλάσματα συλλέχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φιαλίδιο των 20 mL. Ένα σύνολο 12 κλασμάτων ελήφθησαν με βάση τον παράγοντα κατακράτησης της κάθε ένωσης με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας ανάλυση (TLC). Το κλάσμα 3 (Α9-Α12) καθαρίστηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας παρασκευαστική TLC. Μία νέα ένωση διαχωρίστηκε με επιτυχία χρησιμοποιώντας το

N

εξάνιο-EtOAc (8: 2) σύστημα διαλυτών. Η ένωση που αναφέρεται ως pulchrin Α διαλευκάνθηκε με NMR, ενώ η καθαρότητα της pulchrin Α προσδιορίστηκε με HPLC χρησιμοποιώντας 10% έως 100% ακετονιτρίλιο (ν /ν) διαβαθμιζόμενη έκλουση επί 15 λεπτά με ρυθμό ροής 0,5 mL /min.

διαλεύκανση της δομής αναλύσεις

Φασματοσκοπία Πυρηνικού μαγνητικού Συντονισμού (NMR).

Εν συντομία, pulchrin Α αναλύθηκε με NMR για την εξέταση της παρουσίας του πρωτονίου και άνθρακα μέσω 1D (

1 και

13C) και 2D (COSY-45, HSQC και HMBC) πειράματα. Η ένωση παρασκευάστηκε με διάλυση με δευτεριούχο χλωροφόρμιο (ΟϋΟ

3) στο σωλήνα NMR. Πριν από την ανάλυση, ο σωλήνας NMR τοποθετήθηκε στο φασματογράφο NMR για περαιτέρω επεξεργασία.

φασματοσκοπία μάζας (MS).

φασματοσκοπία μάζας είναι κυρίως να καθοριστεί το μοριακό βάρος του pulchrin Α Η ανάλυση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το όργανο LCMS-IT-TOF. Pulchrin Α διαλύθηκε σε MeOH πριν από την έγχυση μέσα στο όργανο. Το φάσμα μάζας καταγράφηκε στο θετικό και αρνητικό τρόπο.

Fourier Transform-φασματοσκοπία υπερύθρου (FT-IR).

Η φασματοσκοπία μετασχηματισμού Fourier υπερύθρων (FT-IR) διεξήχθη για την ανίχνευση η παρουσία λειτουργικής ομάδας σε pulchrin A. η ένωση διαλύθηκε σε ΟΗΟ

3 και έπεσε πάνω στο χλωριούχο νάτριο (NaCl) σφαιρίδιο. Πριν από την ανάλυση, το σφαιρίδιο τοποθετήθηκε στο όργανο FT-IR. Το αποτέλεσμα καταγράφηκε η απορρόφηση των 500-4000 cm

-1.

φασματοσκοπία υπεριώδους (UV) και Οπτική περιστροφή.

Pulchrin Α διαλύθηκε σε MeOH πριν να μεταφερθεί σε μια κυψελίδα. Τα μήκη κύματος που χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση της παρουσίας των ατόμων, κυμαίνονταν από 190 nm έως 800 nm. Η απορρόφηση στη συνέχεια καταγράφηκε χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο UV. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν με τη μορφή ενός φάσματος απορρόφησης. Εν τω μεταξύ, ένα σύνολο 0,05 Μ pulchrin Α διαλύθηκε σε ΟΗΟ

3 και μεταφέρθηκαν σε ένα Jasco P-1020 πολωσίμετρο. Η θερμοκρασία της μέτρησης της οπτικής περιστροφής ήταν 24 ° C.

κυτταροτοξικότητας

δοκιμασία

Δύο ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών (CaOV-3 και SKOV-3) αρχικά αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC , Manassas, USA). Αθανατοποιημένα ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών (T1074) ελήφθησαν από την Applied Βιολογικών Υλικών (ΑΒΜ

® Crestwood Place Richmond, Καναδάς). Αυτές οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν στο εργαστήριο ίδρυμα μας. Όλα τα κύτταρα υποκαλλιεργήθηκαν και αναπτύχθηκαν σε 25 mL φιάλη που περιέχει μέσο RPMI-1640 (CaOV-3 και SKOV-3) και Prigrow 1 μέτριο (T1074) [28], η οποία συμπληρώνεται με 10% FBS και 1% πενικιλίνη /στρεπτομυκίνη. Συρρέοντα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν με PBS πριν τη συγκομιδή με διάλυμα Τρυψίνης-ΕϋΤΑ 10X. Τα συλλεχθέντα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 1800 rpm για 5 λεπτά και αραιώθηκαν σε 1 χ 10

6 κύτταρα /mL κύτταρα. Δοκιμασία διεξήχθη σε πλάκα 96 φρεατίων που περιείχε 1 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο. Πριν από τη θεραπεία, ένα σύνολο 1 × 10

4 μg /mL του pulchrin Α παρασκευάστηκε με προσθήκη 1,0 mg της ένωσης σε 100 μL DMSO. Τα κύτταρα CaOV-3 υποβλήθηκαν σε αγωγή με pulchrin Α σε συγκέντρωση 50 μg /mL έως 0,78 μg /ml με 2-φορές σειριακή αραίωση. Τα κύτταρα στη συνέχεια επωάστηκαν στους 24, 48 και 72 ώρες. Πριν από την μέτρηση, διάλυμα ΜΤΤ (20

μ

L) προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και επωάστηκαν για 3 h. Η πλάκα καταγράφηκε σε απορρόφηση 570 nm με τη χρήση ενός αναγνώστη μικροπλακός. Το αποτέλεσμα ορίστηκε ως η IC

50 αξία, σύμφωνα με την οποία η σισπλατίνη (IC

50: 30.6 μΜ). Χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας στη μελέτη

ακριδίνης πορτοκαλί /ιωδιούχου προπιδίου (ΑΟ /ΡΙ) διπλή χρώση δοκιμασία

δοκιμασία διπλή χρώση AO /ΡΙ διεξήχθη σύμφωνα με την τυπική διαδικασία που χρησιμοποιείται για μικροσκοπία φθορισμού (Lieca με το λογισμικό Q-Φλόρο). Η δοκιμασία διεξήχθη σε μια φιάλη των 25 καλλιέργειας (Nunc), σύμφωνα με την οποία τα κύτταρα CaOV-3 και T1074 εκτέθηκαν με pulchrin Α (22 μΜ) σε 24, 48 και 72 ώρες. Πριν από την κηλίδωση, τα μαζεμένα κύτταρα πλύθηκαν με PBS. Ένα σύνολο 10

μ

L του ΑΟ και PI (10

μ

g /mL) προστέθηκαν στο κυτταρικό ίζημα. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν μέσα σε 30 λεπτά υπό υπεριώδες μικροσκόπιο φθορισμού (Olympus BX51) να αξιολογήσει τις μορφολογικές αλλαγές πριν φθορισμού ξεθώριασμα.

Annexin-V-FITC

δοκιμασία

Η επίδραση της pulchrin Α κατά τη διάρκεια το αρχικό στάδιο της απόπτωσης αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το φθορίζον ισοθειοκυανικό Kit (FITC) Ανίχνευση αννεξίνης V η απόπτωση I (BD Pharmingen

™). Τα κύτταρα CaOV-3 αναπτύχθηκαν σε μια πλάκα 6 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με pulchrin Α (22 μΜ) για 24, 48 και 72 ώρες. Τα κύτταρα (5 × 10

4 κύτταρα /mL) μετά συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 1600 rpm για 5 λεπτά. Ένα σύνολο 100 μL από το κάθε δείγμα μεταφέρθηκε σε σωλήνα που περιέχει 5 μι FITC Annexin V και 10 μι PI. Το εναιώρημα αναμίχθηκε ήπια και προστέθηκε με 100 μι ρυθμιστικού διαλύματος προσδιορισμού 1 ×. Η ανίχνευση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας ένα flowcytometer (BD FACSCanto

™ II, San Jose, CA, USA)

Χρωματομετρική κασπασών ανάλυση

Κυστεϊνύλ ασπαρτικό οξύ-πρωτεάσης (κασπάσες) -3,. – 8 και -9 δοκιμασίες διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας ένα εμπορικό κιτ (κασπάσες 3, 8 και 9 χρωματομετρική δοκιμασία: R &? D Systems, Inc. USA). Τα κύτταρα εμβολιάστηκαν σε μια φιάλη 75 και κατεργάζεται με το IC

50 συγκέντρωση pulchrin Α για 24, 48 και 72 ώρες. Τα επεξεργασμένα κύτταρα συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στις 1800 rpm για 5 λεπτά. Το ρυθμιστικό διάλυμα λύσης προστέθηκε τότε στο κυτταρικό ίζημα και επωάστηκαν σε πάγο για 10 λεπτά. Το προϊόν λύσης φυγοκεντρήθηκε περαιτέρω στα 9450 rpm για 1 λεπτό για να συλλεχθεί το υπερκείμενο. Η δοκιμασία διεξήχθη σε ένα επίπεδο πυθμένα μικροπλάκα 96 φρεατίων. Περίπου 5 μί της κασπάσης 3, 8 ή 9 χρωματομετρικό υπόστρωμα (LEHD-ρΝΑ) προστίθεται σε κάθε αντίδραση που περιέχει ένα κυτταρικό λύμα και 2 Χ ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης της κασπάσης 3, 8 ή 9. Η αντίδραση επωάστηκε για 1 ώρα στους 37 ° C και στη συνέχεια, διαβάστε για μια συσκευή ανάγνωσης μικροπλάκας (Άπειρο M200PRO, Tecan, Männedorf, Ελβετία) σε μήκος κύματος 405 nm.

Πολλαπλές δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας

Πολλαπλές δοκιμασίες κυτταροτοξικότητας διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το Cellomics

® Multiparameter κυτταροτοξικότητα 3 Kit (Thermo Scientific, PA, USA). Ένα σύνολο 5 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο του 96 φρεατίων μικροπλάκα. Τα κύτταρα μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με pulchrin Α σε τρεις συγκεντρώσεις (11, 22 και 33 μΜ) για 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν όλη τη νύκτα στους 37 ° C. Μετά την επώαση, διάφορες λύσεις συνεχώς προστίθενται σε κάθε φρεάτιο που περιέχει 50 μι ζωντανών διαλύματος χρώσεως των κυττάρων, 100 μί ρυθμιστικού διαλύματος στερέωσης, 100 μΙ ρυθμιστικού διαλύματος διαπερατότητας 1 Χ και 100 μL 1 Χ ρυθμιστικό αποκλεισμού, τα οποία επωάστηκαν για 20 λεπτά, 10 min, 30 min και 15 min, αντίστοιχα. Δύο λύσεις αντίσωμα (κυτόχρωμα

γ

πρωτογενές αντίσωμα και DyLight

™ 649 Συζευγμένο Goat Anti-Mouse IgG δευτερογενή αντισώματα) προστέθηκαν στο τελικό στάδιο της προετοιμασίας της δοκιμασίας. Η πλάκα στη συνέχεια, διαβάστε και αξιολογούνται από την ArrayScan, διαλογή υψηλής περιεκτικότητας (HCS) Reader από την Thermo Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, USA).

DNA κατακερματισμό δοκιμασία

Αυτό το πείραμα διεξήχθη με τη χρήση μια αυτοκτονία-Track

™ DNA απομόνωση Ladder Kit (Calbiochem, KgaA, Darmstadt, Γερμανία). Τα κύτταρα COAV-3 σπάρθηκαν σε 75 φιάλες καλλιέργειας mL και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με pulchrin Α (22 μΜ) για 24, 48 και 72 ώρες. Τα κυτταρικά ιζήματα που λαμβάνονται με φυγοκέντρηση στις 1800 rpm για 5 λεπτά. Οι σβώλοι κυττάρων επαναιωρήθηκαν απαλά σε τρία διαλύματα διαδοχικά: 55 μL του διαλύματος # 1, 20 μι διαλύματος # 2 και 25 μL του διαλύματος # 3 (συστατικά του κιτ). Πριν από την επώαση στους 50 ° C, 500 μL του ρυθμιστικού διαλύματος επαναιώρησης προστέθηκε στο μίγμα. Η ηλεκτροφόρηση διεξήχθη με την παρασκευή του πηκτώματος αγαρόζης (1,5%) σε 1 χ ΤΑΕ ρυθμιστικό διάλυμα με ένα αντιδραστήριο χρώσης που παρέχεται στο κιτ. Η γέλη έτρεξε σε 50 βολτ μέχρις ότου η βαφή φθάσει 1-2 cm από το άκρο του πήγματος. Η γέλη γίνεται ορατή κάτω από υπεριώδες φως transilluminator και έπειτα φωτογραφήθηκαν.

Real-time PCR

Ολικό RNA εξήχθη από CaOV-3 κύτταρα χρησιμοποιώντας RNeasy Mini Kit (Qiagen, Germany). Η τελική συγκέντρωση του ολικού RNA και η καθαρότητά του μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα φασματοφωτόμετρο Nanodrop 2000 (Thermo Scientific). Η μετατροπή από RNA σε cDNA διεξήχθη χρησιμοποιώντας το Two-Step qRT-PCR Kit (Applied Biosystems, USA). Ένα σύνολο 1 μg /mL του cDNA (1 μL) χρησιμοποιήθηκε στη δοκιμασία γονίδια έκφρασης με επτά TaqMan ειδικούς εκκινητές και ανιχνευτή (β-ακτίνη, Bax, Bcl-2, survivin, όπως επίσης και κασπάσες 3, 8 και 9) γονίδια προστέθηκαν στην δοκιμασία (Applied Biosystem, USA). Τα επίπεδα έκφρασης του γονιδίου στη συνέχεια αξιολογήθηκαν χρησιμοποιώντας την StepOne Plus σύστημα πραγματικού χρόνου PCR (Applied Biosystems, USA)? Κάθε κύκλος αποτελούνταν από 2 λεπτά της αντίστροφης μεταγραφάσης στους 50 ° C, 20 sec ενεργοποίησης πολυμεράσης στους 95 ° C, 1 sec μετουσιώσεως στους 95 ° C και 20 sec ανοπτήσεως στους 60 ° C. Η διαδικασία ολοκληρώθηκε μετά από 40 κύκλους της ανάγνωσης. Τα δεδομένα στη συνέχεια υπολογίζεται με βάση τη συγκριτική Ct (2-ΔΔCt) τυποποιημένη μέθοδο που περιγράφεται στη μελέτη του Wong και Medrano (2005) [29].

κηλίδας Western δοκιμασία

Η CaOV-3 κύτταρα σπάρθηκαν σε φιάλη καλλιέργειας 75 mL και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με pulchrin Α (22 μΜ) σε 24, 48 και 72 ώρες. Τα συλλεχθέντα κύτταρα φυγοκεντρήθηκαν στις 13.000 rpm για 10 s και 400 μL του PRO-PREP

™ διάλυμα προστέθηκε για να επαναιωρηθούν τα κύτταρα. Τα κύτταρα επάγονται για λύση από επώαση στους -20 ° C για 20 λεπτά. Πριν από το διαχωρισμό με 10% SDS-PAGE, 100 μg πρωτεΐνης δειγματίστηκε και αναμιγνύεται με χρωστική φόρτωσης. Η γέλη αφέθηκε να τρέξει για 90 λεπτά πριν να μεταφερθεί σε μία μεμβράνη polyvinylidenedifluoride (PVDF) (Bio-Rad). Η μεμβράνη PVDF αποκλείστηκε για 3 ώρες με 5% BSA. Το πρωτογενές αντίσωμα για

β-ακτίνης

(1: 1000), Βαχ (1: 1000), Bcl-2 (1: 1000), survivin (1: 1000), κασπάσες 3 και 9 (1: 1000 ) και διασπάται κασπασών 3 και 9 (1: 1000) συζεύχθηκαν με δευτερεύον αντίσωμα (αίγας pAb να Rb IgG). Η διαδικασία συνεχίστηκε για 1 ώρα επώαση σε θερμοκρασία δωματίου. Το δεσμευμένο αντίσωμα ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας ένα χρωματομετρικό κιτ ανίχνευσης και εκτέθηκαν για αρκετά λεπτά για να επιτρέψει την εμφάνιση των ζωνών. Η μεμβράνη PVDF αντιμετωπίσθηκε και φωτογραφήθηκε χρησιμοποιώντας ένα υπεριώδες φως transilluminator.

συστοιχία προφίλ Protein

κύτταρα επεξεργασμένα με Pulchrin Α (22 μΜ) αξιολογήθηκαν για αποπτωτικό πρωτεϊνικών δεικτών, χρησιμοποιώντας το Proteome

3 CaOV- Profiler Array (RayBio

® Ανθρωπίνων απόπτωση αντίσωμα Kit Array, Raybiotech, USA), σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Εκχυλίσματα πρωτεΐνης (200 μg /mL) από CaOV-3 κύτταρα προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο που περιέχει μεμβράνη και αφέθηκε όλη τη νύχτα στους 4 ° C για την επώαση. Η διαδικασία πλύσης, χρησιμοποιώντας τα ρυθμιστικά διαλύματα πλύσης Ι και ΙΙ εκτελέστηκε για κάθε επώαση. Πριν από την ανίχνευση, η μεμβράνη προστέθηκε με ένα βιοτινυλιωμένο αντίσωμα κοκτέιλ και ακολούθως με ΗΚΡ-στρεπταβιδίνης για επώαση όλη τη νύκτα. Ένα σύνολο 500 μι του ρυθμιστικού ανίχνευσης με πιπέτα επί της μεμβράνης. Τα σάντουιτς μεμβράνες μεταφέρθηκαν και εκτίθενται στο σύστημα απεικόνισης χημειοφωταύγειας και στη συνέχεια φωτογραφήθηκαν (Biospectrum AC Chemi HR 410, UVP, Cambridge, UK).

κυτταρικού κύκλου δοκιμασία

Τα επεξεργασμένα κύτταρα με pulchrin Α συλλέχθηκαν και μετά πλύθηκαν δύο φορές με PBS σε 1800 rpm φυγοκέντρηση για 5 λεπτά. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με διάλυμα στερέωσης, με την προσθήκη 700 μL 90% κρύο EtOH και διατηρήθηκε όλη τη νύχτα στους 4 ° C για την αποκατάσταση της ακεραιότητας των κυττάρων. EtOH στη συνέχεια απορρίφθηκε και ξεπλένεται με 600 μΙ PBS με φυγοκέντρηση στις 1800 rpm για 5 λεπτά. Ένα σύνολο 25 μλ RNaseA (10 mg /mL) και 50 μΐ ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ) (1 mg /mL) αναμίχθηκαν με τα σταθεροποιημένα κύτταρα και επωάστηκαν για 1 ώρα στους 37 ° C. Η ανάλυση του περιεχομένου του DNA για αναστολή του κυτταρικού κύκλου εκτελέσθηκε με κυτταρομετρία ροής (BFACSCanto

™ II).

αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-δεσμευτική

Αυτή η μελέτη διεξήχθη χρησιμοποιώντας την αντι-αποπτωτική πρωτεΐνη Bcl- 2 σε συνδυασμό με το πρότυπο αναστολέα Bcl-2 ΑΒΤ 737 [30]. Η δομή τρισδιάστατη κρυσταλλική Bcl-2 ελήφθη από το RCSB Protein Data Bank [31, 32] με 4IEH ΠΣΠ id του [30]. Το πρόγραμμα αυτοματοποιημένο λογισμικό σύνδεσης (ΑυΤΌϋΟΟΚ 4.2) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της σύνδεσης των μικρών μορίων, με βάση την Λαμαρκιανή γενετικό αλγόριθμο [33]. Τα μόρια του νερού απομακρύνθηκαν για την παρασκευή των πρωτεϊνικών μορίων. Polar άτομα υδρογόνου προστέθηκαν στη δομή, ενώ μη πολικά άτομα υδρογόνου συγχωνεύθηκαν. Επιπλέον, Gasteiger τέλη και οι παράμετροι ενυδάτωσης είχαν ανατεθεί από προεπιλογή. Με τη χρήση του λογισμικού 4.2 AutoGrid, το αρχείο παράμετρος πλέγμα ορίστηκε χρησιμοποιώντας τιμές για x, y, z και άξονες? η απόσταση του πλέγματος ήταν 0.375 Α, την προεπιλεγμένη τιμή. Η ενέργεια αλληλεπίδρασης σύνδεσης υπολογίστηκε επίσης χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ΑυΤΌϋΟΟΚ 4.2.

Η στατιστική ανάλυση

Το IC

50 τιμές προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας GraphPad Prism ver. 4.0 (Graphpad Software Inc, USA). Κάθε δοκιμή έγινε σε τρεις επαναλήψεις και οι τιμές αναφέρθηκαν ως μέσος όρος ± τυπική απόκλιση (SD). Με τη χρήση του SPSS ver. 17.0 (IBM Corporation, USA), μονόδρομη ANOVA με τεστ Dunnett χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των δεδομένων για τη στατιστική σημαντικότητα. Εν τω μεταξύ, ποσοτικές αναλύσεις των πρωτεϊνών perfomed χρησιμοποιώντας το λογισμικό ImageJ.

Αποτελέσματα

Δομή Στοιχεία της Pulchrin Μια

Ένα νέο παράγωγο φυσικού κουμαρίνης, pulchrin Α (Σχήμα 1) διαλευκάνθηκε χρησιμοποιώντας το πλήρες φάσμα NMR (Πίνακας 1), καθώς επίσης και φασματομετρία μάζας UV, IR και ESI (S1-S7 Σχήματα).

Ο συσχετισμός HMBC επισημαίνεται με κόκκινο και μπλε βέλη υποδεικνύονται ως

J

2 και

J

3, αντίστοιχα, ενώ COSY συσχετίσεις σε μαύρο χρώμα βέλος

Η

Λευκό πετρελαίου.? Απόδοση: 0,005%, [α] -16 (

γ

0,05, ΟΗΟΙ

3). TLC: (

n

εξάνιο: EtOAc, 80:20 ν /ν): R

f = 0,56. Υν (MeOH) λ

max (log €): 356 (3,80), 315 (4,03), 280 (4.32) nm. IR ν

max (ΟΗΟ

3)? 2921, 2853 (ΟΗ), 1759 (OC = O), 1463 εκατοστά

-1. HRESIMS m /z [M + Na] 465.3240 (10), 338,3380 (90), 339,3430 (60) (υπολογισμένο για C

30Η

50ο

2, 442,7066).

1Η NMR (ΟϋΟ

3, 600MHz) δ ppm: 0,89 (3Η,

m

, Η-21), 1.25 (2Η,

m

, Η-18) , 1,28 (14Η,

m

, Η-11, Η-12, Η-13, Η-14, Η-15, Η-16, Η-17), 1.29 (2Η,

m

, Η-6′), 1,30 (2Η,

m

, Η-19), 1.32 (2Η,

m

, Η-20), 1.34 (2Η,

m

, Η-7′), 1.43 (2Η,

m

, Η-8′), 1.51 (2Η,

m

, Η-2), 1,55 (2Η ,

m

, Η-10), 1.59 (2Η,

m

, Η-5 ‘), 2.02 (2Η,

m

, Η-9), 2,21 (2Η,

m

, Η-3), 2,25 (2Η,

m

, Η-1), 2,91 (2Η,

m

, Η-6), 2.93 (1Η,

m

, H-4a), 4.90 (1Η,

m

, Η-8a), 5,33 (1Η,

m

, Η-7) , 5,35 (1Η,

m

, Η-8), 5.40 (2Η,

m

, Η-4, Η-5), 6,98 (1Η,

m

, Η-4′).

13C NMR (ΟϋΟ

3, 150 MHz) δ ppm: 14,1 (C-21), 22,4 (C-20), 22,7 (C-18), 24,3 (C-3), 25,2 (C- 1), 26,6 (C-2), 27,2 (C-7′), 27,4 (C-9), 27,9 (C-5′), 28,0 (C-10), 29,2 (C-6′), 29.5 ( C-11, C-12, C-13, C-14), 29,6 (C-15, C-16, C-17), 29,7 (C-8′), 32,0 (C-19), 56,8 (C -4a), 57,3 (C-6), 76,9 (C-8a), 128,3 (C-8), 129,8 (C-7), 131.0 (C-4, C5), 134,4 (C-3′), 148,8 (C-4′), 173.9 (C-2′).

κυτταροτοξική δράση του Pulchrin Α

τρεις κυτταρικές γραμμές δοκιμάστηκαν, συμπεριλαμβανομένων δύο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα (CaOV-3 και SKOV- 3) και μία αθανατοποιημένη ανθρώπινη φυσιολογική ωοθηκική επιθηλιακή κυτταρική σειρά (T1074) για τον προσδιορισμό των κυτταροτοξικών επιδράσεων pulchrin Α (Πίνακας 2). Επιπλέον, η σισπλατίνη ελέγχθηκε επίσης ως θετικός μάρτυρας σε αυτή τη μελέτη (Σχήμα 2). Το IC

50 αποτελέσματα έδειξαν ότι pulchrin Α ανέστειλε το 50% της CaOV-3 ανάπτυξη κυττάρων σε 22,31 μΜ, σε σύγκριση με 33,63 μΜ έναντι SKOV-3 κύτταρα μετά από 24 ώρες θεραπείας. Τα κύτταρα του CaOV-3 και SKOV-3 ερευνήθηκαν περαιτέρω για κυτταροτοξικά αποτελέσματα στις 48 και 72 ώρες, που εμφανίζουν μειώσεις στον IC

50 τιμές, όπως φαίνεται στο Σχ 2. Εν τω μεταξύ, οι κυτταροτοξικές επιδράσεις της pulchrin Α επέδειξε συγκρίσιμα αποτελέσματα σε σύγκριση με σισπλατίνη στις 24 ώρες έναντι CaOV-3 και τα κύτταρα SKOV-3, η οποία κατέδειξε ότι pulchrin Α ασκείται υψηλότερη κυτταροτοξικότητα έναντι αμφοτέρων των κυτταρικών γραμμών καρκίνου ωοθηκών. Αντίθετα, ένας λιγότερο κυτταροτοξική δράση κατά των κυττάρων T1074 βρέθηκε ακόμα και σε συγκεντρώσεις άνω των 100 μΜ.

Το πείραμα έγινε εις τριπλούν. Τα δεδομένα αναφέρονται ως μέση τιμή ± SD.

Η

Cytomorphology Αξιολόγηση της απόπτωσης από ΑΟ /ΡΙ διπλή χρώση

Η αποπτωτική δράση του pulchrin Α στην CaOV-3 και T1074 κύτταρα παρατηρηθεί μέσω μορφολογικές αλλαγές κάτω από ένα μικροσκόπιο φθορισμού. Η αξιολόγηση cytomorphology διεξήχθη σε CaOV-3 κύτταρα λόγω pulchrin Α έδειξε χαμηλή IC

50 συγκέντρωση κατά CaOV 3-κυττάρων σε σύγκριση με SKOV-3 κύτταρα στην δοκιμασία κυτταροτοξικότητας. Μετά την επεξεργασία σε συγκέντρωση 22 μΜ για 24, 48 και 72 ώρες, τα κύτταρα CaOV-3 επέδειξε αποπτωτικά χαρακτηριστικά σε σύγκριση με τα κύτταρα T1074. Κάτω από μη επεξεργασμένο συνθήκες, τα κύτταρα εμφάνισαν μια υγιή στρογγυλεμένο σχήμα με ένα άθικτο πυρηνική δομή. Η μορφολογία των κυττάρων άλλαξαν μετά από 24 ώρες θεραπείας σε CaOV-3 κύτταρα με την παρουσία διόγκωση της κυτταρικής μεμβράνης και κατάτμηση του DNA. Εκτεταμένες κυτταρική βλάβη μπορεί να παρατηρηθεί καθαρά μετά από 48 ώρες και μετά με την παρουσία αποπτωτικών σωμάτων και ένα κοκκινωπό-πορτοκαλί χρώμα, υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα υπέστησαν αργά απόπτωση (Σχήμα 3α). Σε αντίθεση, τα κύτταρα T1074 παρουσίασαν καμία σημαντική διαφορά στη μορφολογία των κυττάρων συγκριτικά με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα T1074 προς διαδικασίας απόπτωσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι pulchrin Α ήταν ακίνδυνο για τα κανονικά κύτταρα των ωοθηκών (Εικόνα 3b).

[Α] μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων -CAOV-3 κύτταρα με pulchrin Α σε 24, 48 και 72 ώρες της θεραπείας. Τα κύτταρα CaOV-3 παρουσίασαν διόγκωση της κυτταρικής μεμβράνης ήδη 24 ώρες της θεραπείας. Οι ακόλουθες 48 ώρες της θεραπείας έδειξαν περισσότερο κυτταρικής μεμβράνης διόγκωση και την παρουσία αποπτωτικών σωμάτων και cromatin συμπύκνωση. Η παρουσία κύτταρα πορτοκαλιών χρώσης σε 72 ώρες της αγωγής, που αντιπροσωπεύει το σήμα κατατεθέν της καθυστερημένης απόπτωσης. [B] μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων-T1074 κυττάρων με pulchrin Α σε 24, 48 και 72 ώρες της θεραπείας. Τα κύτταρα T1074 δεν έδειξαν σημαντικές διαφορές στην μορφολογία των κυττάρων μετά από επεξεργασία με pulchrin Α έως 72 ώρες της θεραπείας. VI, βιώσιμα κύτταρα? BL, διόγκωση της κυτταρικής μεμβράνης? CC, συμπύκνωση της χρωματίνης? LA, αργά απόπτωση? ΑΒ, αποπτωτικά σώματα. (Μεγέθυνση 40 × και 100 ×).

Η

Ανάλυση της μεμβράνης Τροποποίηση

Οι αλλαγές στην κυτταρική μεμβράνη παρατηρήθηκε με προσδιορισμό αννεξίνης V-FITC διεξάγεται με τη χρήση ενός mL φιάλη 25 cointaining CaOV-3 κύτταρα κατεργασμένα με pulchrin Α σε 24, 48 και 72 ώρες. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι CaOV-3 κύτταρα που κατεργάζονται με pulchrin Α σε 24, 48 και 72 ώρες υπέστησαν απόπτωση πρώιμης φάσης όπως υποδεικνύεται από 5,3, 9,4 και 14,3% αυξάνεται σε ποσότητα σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο, αντίστοιχα. Τα κύτταρα τα οποία υπέστησαν απόπτωση όψιμης φάσης και νέκρωση αύξησε επίσης εντός των πρώτων 24 έως 72 ώρες μετά τη θεραπεία, σε αντίθεση με τα βιώσιμα κύτταρα, η οποία έδειξε μια μείωση 92,5% σε 40,5% σε πληθυσμό κυττάρων μετά τη θεραπεία.

[Α] ελέγχου (χωρίς θεραπεία), [Β] 24 ώρες, [C] 48 ώρες, [D] 72 ώρες. Σκούρο κόκκινο, μπλε, πράσινο και ανοικτό κόκκινο χρώμα αναγράφεται βιώσιμο, πρώιμη απόπτωση, αργά απόπτωση και δευτεροβάθμιας νέκρωση, αντίστοιχα. Μετακίνηση του κυτταρικού πληθυσμού άρχισε το Q3 (βιώσιμα κύτταρα) σε Q4 (πρώιμη απόπτωση) σε Q2 (τέλη απόπτωση), και, τέλος, να Q1 (δευτεροβάθμια νέκρωση). [Ε] Ιστόγραμμα των κυτταρικών πληθυσμών των βιώσιμων, νωρίς-απόπτωση, αργά-απόπτωση και δευτεροβάθμιας νέκρωση κυττάρων CaOV-3. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD από τρεις επαναλήψεις. *

σ

& lt?. 0.05 δείχνει σημαντική διαφορά από τον έλεγχο

Η

Ανάλυση των κασπασών

Οι κασπάσες 3, 8 και 9 ελέγχθηκαν για τον προσδιορισμό των μονοπατιών της απόπτωσης. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 5 δείχνουν ότι κασπασών 9 και 3 ενεργοποιήθηκαν με pulchrin ένα άνοιγμα μέσα από τα ενδογενή και την εκτέλεση μονοπάτια, αντίστοιχα. Σε αντίθεση, η κασπάση 8 έδειξαν ακανόνιστες τιμές, όπως απεικονίζεται στο γράφημα ράβδων, γεγονός που υποδηλώνει ότι η μη ενεργοποίηση της κασπάσης 8 ανιχνεύθηκε μέσω της διέγερσης του pulchrin Α ενεργοποίηση κασπασών 3, 8 και 9 επιβεβαιώθηκαν επίσης στα επίπεδα του mRNA στο οποίο μόνο κασπάσες 3 και 9 παρουσίασαν υπερέκφραση σε σχέση με κασπάση 8 σε ένα χρόνο-εξαρτώμενο τρόπο. Ομοίως, τα επίπεδα έκφρασης της κασπάσης 3 και κασπάσης 9 πρωτεΐνες ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (

ρ

& lt? 0,05) σε σχέση με εκείνη των μη επεξεργασμένων κυττάρων CaOV-3. Επιπλέον, η έκφραση της πρωτεΐνης του διασπασμένης κασπάσης 3 και διασπασμένη κασπάση 9 αυξήθηκε σύμφωνα με τις τρεις διαφορετικές περιόδους θεραπείας, υποδεικνύοντας ότι η επαγωγή της απόπτωσης συνέβη μέσω των εγγενών και εκτέλεση οδούς.

[Α και Β] Χρωματομετρική και πραγματικό ανάλυση χρόνου PCR των κασπασών 3, 8 και 9, αντίστοιχα. [C] ανάλυση Western blot χαρακτηρίζονται από εικόνες και ιστόγραμμα για προ-κασπασών και διασπασμένο κασπασών. Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως μέση τιμή ± SD τριών ανεξαρτήτων πειραμάτων. Η σημαντική διαφορά εκφράζεται ως *

σ

& lt?. 0.05

Η

Ανάλυση του μιτοχονδριακού Αλλαγές

Αυτή η μελέτη διεξήχθη για να εξεταστεί η συμμετοχή των μιτοχονδρίων στην απόπτωση κατά την pulchrin Μια θεραπεία. Οι τρεις παράμετροι του συνολικού πυρηνικών ένταση, κυτταρική διαπερατότητα και κυτόχρωμα

γ

απελευθέρωσης έδειξε ότι η ένταση φθορισμού αυξήθηκε, όπως φαίνεται στο Σχ 6. Οι εντάσεις φθορισμού των τριών αυτών παραμέτρων αυξήθηκε σε συγκεντρώσεις τόσο χαμηλές όσο 22 μΜ και σημαντικές διαφορές (

σ

& lt? 0,05) προσδιορίστηκαν σε συγκέντρωση 33 μΜ. Αντίθετα, η ένταση φθορισμού του δυναμικού της μιτοχονδριακής μεμβράνης (ΜΜΡ) για τα CaOV-3 κύτταρα pulchrin A-αγωγή μειώθηκε κατά εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο. Σημαντική διαφορά παρατηρήθηκε μεταξύ των επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων CaOV-3 κύτταρα σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από 33 μΜ όταν

ρ

& lt?. 0.05

Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με Hoechst, διαπερατότητα κυττάρου, το δυναμικό της μιτοχονδριακής μεμβράνης (MMP) και κυτόχρωμα

γ

βαφές. Οι εικόνες σε κάθε σειρά είχαν συλληφθεί από τον ίδιο τομέα. Τα κύτταρα CaOV-3 παρουσίασαν μία μείωση του αριθμού των κυττάρων και ΜΜΡ, ενώ τα κύτταρα που υπέστησαν κατεργασία με pulvhrin Α στις 24 ώρες (20 × μεγέθυνση) έδειξαν αυξήσεις στην κυτταρική διαπερατότητα και γ

απελευθέρωση κυτοχρώματος

. Ιστόγραμμα αντιπροσωπεύει μέση ένταση που παρατηρείται ταυτόχρονα σε CaOV-3 κύτταρα σε ένα εξαρτώμενο από τη συγκέντρωση τρόπο για το σύνολο των πυρηνικών ένταση, διαπερατότητα κυττάρου, ΜΜΡ και κυτόχρωμα

γ

απελευθέρωσης. Όλα τα δεδομένα προσδιορίστηκαν ως μέσες ± SD στην οποία η σημαντική διαφορά εκφράσθηκε σαν *

ρ

& lt? 0.05.

Η

Δοκιμασία DNA κατακερματισμός

Αυτή η δοκιμασία διεξήχθη για να επιβεβαιώσει την εμφάνιση των καθυστερήσεων απόπτωση σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με pulchrin Α Η παρουσία μιας σκάλας DNA στα κύτταρα CaOV-3 παρατηρήθηκε μετά από 24 ώρες αγωγής (Σχήμα 7)? το ίδιο παρατηρήθηκε για τις επόμενες 48 και 72 ώρες. Ο σχηματισμός σκάλας ϋΝΑ απέδειξε την εμφάνιση του κατακερματισμού του DNA στα κύτταρα CaOV-3, η οποία επάγεται απόπτωση

Λωρίδες Α-Γ:. Κύτταρα που κατεργάζονται με pulchrin Α για 72, 48 και 24 ώρες, αντίστοιχα. Λωρίδα D: μη επεξεργασμένα κύτταρα.