Αφηρημένο

μυελοβλαστωμάτων και γλοιοβλαστώματα, οι πιο συχνές πρωτοπαθείς όγκους του εγκεφάλου στα παιδιά και τους ενήλικες, αντιστοίχως, είναι εξαιρετικά δύσκολο να αντιμετωπιστεί. Οι προσπάθειες για τον εντοπισμό νέων πρωτεϊνών απαραίτητη για την ανάπτυξη αυτών των όγκων μπορεί να βοηθήσει στην περαιτέρω κατανόηση της βιολογίας των όγκων αυτών, καθώς και, τον εντοπισμό στόχων για μελλοντικές θεραπείες. Η πρόσφατη αναγνώριση των πολλαπλών μεταγραφής τοπίων αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης παράγοντα-κεντρική σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα έχει εντοπίσει πολυάριθμες μελετημένο πρωτεΐνες που είναι απαραίτητες για την αυτο-ανανέωση αυτών των βλαστικών κυττάρων. Για τον εντοπισμό νέων πρωτεϊνών απαραίτητη για την τύχη των κυττάρων του όγκου του εγκεφάλου, εξετάσαμε το δίκτυο αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης του παράγοντα μεταγραφής, SOX2, σε κύτταρα μυελοβλάστωμα. Για το σκοπό αυτό, Πολυδιάστατη Protein Ταυτοποίηση Τεχνολογίας (MudPIT) προσδιόρισε Μπορεί η πρωτεομική οθόνη του SOX2 πρωτεϊνών που σχετίζονται βοηθήσει στον εντοπισμό πρόσθετων πρωτεϊνών που απαιτούνται από τα κύτταρα του όγκου του εγκεφάλου; Αναφέρουμε ότι SOX2 συνεργάτες με & gt? 280 πρωτεΐνες στα κύτταρα ϋΑΟΥ. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι δύο SOX2 που σχετίζονται πρωτεΐνες, MSI2 και ειδική για ουμπικιτίνη πεπτιδάση 9x (USP9X), τα οποία έχουν πρόσφατα εμπλακεί στην ανάπτυξη άλλων καρκίνων [16] – [21], απαιτούνται για να υποστηρίξουν την ανάπτυξη και την επιβίωση του κύτταρα ϋΑΟΥ και δύο κυτταρικές γραμμές όγκου GB, U87 και U118.

Πειραματικές Διαδικασίες

Cell Culture

ϋΑΟΥ (ΗΤΒ-186, ΑΤΟΟ, Manassas, VA), i- SOX2-ϋΑΟΥ, U87 (ΗΤΒ-14, ATCC), U118 κύτταρα (ΗΤΒ-15, ATCC) και ΗΕΚ293Τ (CRL-11268, ATCC) καλλιεργήθηκαν, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22]. Λεντοϊών σωματίδια παρήχθησαν, και τα κύτταρα μολύνθηκαν, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15]. Η ανάπτυξη των κυττάρων εξετάστηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15] χρησιμοποιώντας κύτταρα απλώνονται εκ νέου σε 3-4 ημέρες μετά τη μόλυνση βραδέος.

παραγωγή πλασμίδιο

FUW-ίείΟ-SOX2 (20.724) ελήφθη από Addgene (Cambridge, ΜΑ). pLVX-Tet-On® Σύνθετη φορέας λήφθηκε από Clontech (632.162, Mountain View, CA). Φορείς για την παραγωγή shRNA φακοϊών για MSI2 (RMM4534-NM_011443) και USP9X (RHS4533-NM_001039590) knockdowns ελήφθησαν από Open Biosystems (Huntsville, AL). Μια προηγουμένως επικυρωθεί μη ειδικό shRNA (κωδικοποιημένο) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας σε πειράματα εξουδετέρωσης [23]. Οι shRNA αλληλουχίες που παρέχονται στον συμπληρωματικό πίνακα S4.

Για να κατασκευαστούν pLVX-tetO- (fs) SOX2, Strep και Flag ετικέτες προστέθηκαν διαδοχικά στο Ν-τελικό άκρο της SOX2 με δύο γύρους PCR. Η πρώτη PCR χρησιμοποιείται γύρο FUW-ίείΟ-SOX2 ως πρότυπο, ανοδικά του εκκινητή: CAAGAAGCTTGCC

AACTGGAGCCACCCACAATTCGAGAAG

GGCGGAATGTATAACATGATGGAGACGGAGCTGAAG (υπογραμμισμένη: HindIII, με πλάγια γράμματα: Strep-επιτόπου, τολμηρό: SOX2 CDS, τολμηρή υπογράμμισε: σιωπηλή μετάλλαξη για να καταστρέψει ενδογενής ιστοσελίδα ΒδτΟΙ) και ο μεταγενέστερος αστάρι: AGGACTCGAGCGCGGGACCACACCATGAAGG (υπογραμμισμένη: XhoI). Αυτό το θραύσμα υπέστη πέψη με Hindlll και Xhol και συνδέθηκε εντός αντίστοιχες θέσεις του Bluescript KS + (Sratagene, Santa Clara, CA). Ο δεύτερος γύρος της PCR, χρησιμοποιώντας το ενδιάμεσο πλασμίδιο ως εκμαγείο, διεξήχθη με την ακόλουθη ανάντη αστάρι: AAGGTCTAGATGTAC

ATGGACTACAAGGACGACGATGACAAG

GGGTCGGCCGCC

AACTGGAGCCACCCACAATTCGAGAAG

(υπογραμμισμένη: XbaI, γκρι: ΒδτΟΙ, τολμηρό και πλάγια: flag-επίτοπο, πλάγιο: Strep-επιτόπιο) και ο μεταγενέστερος εκκινητή που περιέχει τη θέση XhoI που περιγράφεται παραπάνω. Αυτό το προϊόν PCR στη συνέχεια υπέστη πέψη με Xbal και Xhol και συνδέθηκε εντός αντίστοιχες θέσεις του Bluescript. Το Flag-tagged Strep 5 ‘άκρο του SOX2 απομονώθηκε από αυτό το ενδιάμεσο φορέα και μεταφέρεται στον φορέα FUW-ίείΟ-SOX2 χρησιμοποιώντας ΒδτΟΙ και μια εσωτερική θέση RsrII, να δημιουργήσει FUW-tetO- (fs) SOX2. (Fs) SOX2 απομονώθηκε από FUW-tetO- (fs) SOX2 χρησιμοποιώντας EcoRI και προσδέθηκε στο pLVX-Tight-Puro (632.162, Clontech), για να δημιουργήσετε pLVX-tetO- (fs) SOX2. Προσανατολισμός επιβεβαιώθηκε με ανάλυση αλληλουχίας.

i-SOX2-ϋΑΟΥ κυτταρικής μηχανικής

κύτταρα ϋΑΟΥ σπάρθηκαν σε κλωνική πυκνότητα και μολύνθηκαν με pLVX-Tet-On® Σύνθετη lentivirus να παράγουν rtTA-ϋΑΟΥ. Τα κύτταρα επανατροφοδοτήθηκαν φρέσκο ​​μέσο 2-3 φορές την εβδομάδα. Οκτώ ημέρες μετά τη σπορά σε κλωνική πυκνότητα, οι μεμονωμένες αποικίες απομονώθηκαν, και δύο ημέρες αργότερα, απομονωμένες αποικίες εκτέθηκαν σε G418 (300 μg /mL). rtTA-ϋΑΟΥ κλώνοι επεκτάθηκαν για ~ 2 εβδομάδες υπό επιλογή G418. κύτταρα rtTA-ϋΑΟΥ σπάρθηκαν σε κλωνική πυκνότητα και μολύνθηκαν με pLVX-tetO- (fs) SOX2. Τα κύτταρα επανατροφοδοτήθηκαν φρέσκο ​​μέσο 2-3 φορές την εβδομάδα. Οκτώ ημέρες μετά την σπορά, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε πουρομυκίνη (5 μg /mL) για 72 ώρες, μετά τις οποίες απομονώθηκαν 6 κλώνοι. Κάθε κλώνος καλλιεργήθηκε σε μέσο συμπληρωμένο με δοξυκυκλίνη (0.1 μg /mL) για 24 ώρες, και πυρηνικές πρωτεΐνες απομονώθηκαν. Επαγώγιμη έκφραση (fs) SOX2 επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ένας απλός κλώνος, που αναφέρεται ως i-SOX2-ϋΑΟΥ, χρησιμοποιήθηκε για πρωτεομική ανάλυση.

Protein Απομόνωση και Ανοσοκαταβύθιση

Dounce ομογενοποίηση χρησιμοποιήθηκε για την απομόνωση πυρηνικές πρωτεΐνες για ανάλυση MudPIT όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],24]. Για ανοσοκαταβύθιση, πυρηνικά εκχυλίσματα φορτώθηκαν M2-σφαιρίδια (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) και πλύθηκαν, και τα σύμπλοκα πρωτεΐνης εκλούστηκαν χρησιμοποιώντας 3Χ πεπτίδιο Flag (Sigma-Aldrich), όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Διαφορική pulldown μεταξύ των επάγεται (+ Dox) και δεν είχαν επαχθεί (-Dox) δείγματα επιβεβαιώθηκε με χρώση αργύρου [9].

MudPIT Ταυτοποίηση SOX2 πρωτεϊνών που σχετίζονται

Πολυδιάστατη Πρωτεΐνη Αναγνώριση Τεχνολογία (MudPIT ) ανάλυση διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [9]. Τα σύνολα δεδομένων MS /MS εξετάστηκαν χρησιμοποιώντας SEQUEST και το

Homo sapiens

βάση δεδομένων πρωτεϊνών (NCBI, 2010-11-22 απελευθέρωση). Κατανεμημένη ομαλοποιημένη φασματική Παράγοντες αφθονία (dNSAF) υπολογίστηκαν για κάθε ανιχνευθεί πρωτεΐνη, όπως περιγράφεται αλλού [25]. Τρία ανεξάρτητα πειράματα και στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Η φασματική ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη προσδιορίστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9], [26].

Ανάλυση Western Blot

ανάλυση κηλίδος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. εκχυλίσματα Πυρηνική και κυτταροπλασματική πρωτεΐνη παρασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας κιτ ΝΕ-PER (Thermo-Scientific, Rockford, IL) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή για την απομόνωση πρωτεϊνών για την ανάλυση στυπώματος Western, όπως περιγράφεται προηγουμένως [9]. Σχετικά επίπεδα ανιχνεύονται πρωτεΐνες προσδιορίστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11]. Πρωτογενή αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: α-MSI2 (ab83236, Abcam, Cambridge, ΜΑ), α-USP9X (ab56461, Abcam), α-USP7 (A300-033A, Bethyl Laboratories, Montgomery, ΤΧ), α-Flag (F3165, Sigma -Aldrich), α-GAPDH (G8795, Sigma-Aldrich), α-μουδιάσει (ab4147, Abcam), α-SOX2 (abl5830, Abcam), α-MCL1 (SC-819, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) , α-β-κατενίνης (9562, Cell Signaling Technology, Danvers, ΜΑ).

RNA Ανάλυση

απομόνωση RNA και cDNA σύνθεση πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [9]. Γονιδιακή έκφραση MSI2 και USP9X σε ϋΑΟΥ, U87, U118 ή κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με στόχευση ή περιπλεγμένο shRNA αναλύθηκαν με SYBR Green (SuperArrayBioscience Corporation, Federick, MD) ποσοτική πραγματικού χρόνου αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (RT-qPCR) [9]. Εναρκτήρες που χρησιμοποιούνται για το στάδιο της PCR στην ανάλυση του RNA MSI2 ήταν h-MSI2-F (AAGTATTAGGTCAGCCCCAC) και h-MSI2-R (TTCTCAAAAGTGACAAAGCC). Εναρκτήρες που χρησιμοποιούνται για το στάδιο της PCR στην ανάλυση του RNA USP9X ήταν h-USP9X-F (CAGATGACCAAGATGCTCC) και h-USP9X-R (GGGGATACTTCTTCACTGCC). Οι εκκινητές για την έκφραση έλεγχο GAPDH έχουν περιγραφεί προηγουμένως [15].

Αποτελέσματα

Μηχανικών του i-SOX2-ϋΑΟΥ κύτταρα και MudPIT Ανάλυση SOX2 πρωτεϊνών που σχετίζονται

Για να σας βοηθήσουμε προσδιορίσει νέες πρωτεΐνες απαραίτητες για την ανάπτυξη των κυττάρων MB, εξετάσαμε την SOX2-interactome σε ϋΑΟΥ MB κύτταρα. Είναι σημαντικό, οι παράγοντες μεταγραφής, όπως SOX2, δεν λειτουργούν μεμονωμένα, αλλά λειτουργούν ως μέρος μεγάλων πρωτεϊνικών συμπλόκων. Από αυτή την άποψη, οι προηγούμενες μελέτες που διεξήχθησαν με ESC υφίστανται διαφοροποίηση έχουν δείξει ότι Sox2 είναι παρούσα σε πολλαπλά μεγάλα συγκροτήματα μοριακού βάρους πρωτείνη, ορισμένες ανώτερο του 880 kDa [27]. Για να εξεταστεί η SOX2-interactome, κύτταρα ΩΑΟΥ κατασκευάστηκαν για την επαγώγιμη έκφραση με επισύναψη επιτόπου SOX2 (i-SOX2-ϋΑΟΥ), επειδή αντισώματα που στρέφονται κατά SOX2 δεν είναι κατάλληλα για πολύ ειδικές και ευαίσθητες απομόνωση των συμπλοκών SOX2-πρωτεΐνης. Αυτό μας επέτρεψε να απομονώσουμε με συνέπεια SOX2 και σχετίζεται με τις πρωτεΐνες του χρησιμοποιώντας Μ2-σφαιρίδια. Να κατασκευάσει i-SOX2-ϋΑΟΥ, τα κύτταρα ϋΑΟΥ διαδοχικά μολυνθεί με ένα φακοϊό να εισαγάγει εκφράζουν συντακτικά τρανσενεργοποιητή αντίστροφη-tet και ένα δεύτερο φορέα λεντοϊού που εκφράζει μια σημαία-Strep διπλή επισύναψη επιτόπου μορφή SOX2 [(fs) SOX2] κάτω από το έλεγχο ενός Dox-διεγέρσιμο προαγωγό (Εικ. 1Α).

(Α) Σχηματικό διάγραμμα του συστήματος λεντοϊού χρησιμοποιηθεί για να εισαχθεί ένα Dox-επαγώγιμο, επισύναψη επιτόπου SOX2 σε ϋΑΟΥ MB κύτταρα. Δύο φορείς λεντοϊών χρησιμοποιήθηκαν για την εισαγωγή εκφράζουν συντακτικά τρανσενεργοποιητή αντίστροφης-tet (rtTA) και επαγώγιμη (fs) SOX2 [επισημασμένο: Flag-SOX2]. (Β) Το πρωτόκολλο που χρησιμοποιείται για να απομονώσει σύμπλοκα SOX2-πρωτεΐνης από ϋΑΟΥ MB κύτταρα για τους μεταγενέστερους ανάλυση MudPIT. (Γ) ανάλυση κηλίδας Western σχολαστικά για SOX2 με ένα αντίσωμα Sox2. Το επίπεδο των (fs) SOX2 συγκρίθηκε με το επίπεδο της ενδογενούς SOX2, η οποία ορίζεται σε 1. (D) χρώση αργύρου αποδεικνύοντας εμπλουτισμό των πρωτεϊνών μετά την επαγωγή (fs) SOX2 με Dox και ανοσοκαθίζηση με M2-σφαιρίδια. Ο διακεκριμένος μπάντα παρατηρήθηκε σε -45 kDa είναι ένα κοινό μολυσματικό όταν Μ2-σφαιρίδια που χρησιμοποιούνται για ανοσοκαθίζηση. * Η εκτιμώμενη θέση του (fs) SOX2 υποδεικνύεται με ένα βέλος. (Ε) ανάλυση Western blot σχολαστικά για Flag-SOX2 να επαληθεύσει ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας Μ2-χάντρες.

Η

Για να απομονώσετε (fs) SOX2 και συνδέονται συμπλέγματα πρωτεϊνών της από τα κύτταρα i-SOX2-ΩΑΟΥ, (fs) έκφραση SOX2 επάχθηκε για 24 ώρες (0,1 μg /mL Dox), και (fs) πρωτεϊνικά σύμπλοκα SOX2 απομονώθηκαν από εκχυλίσματα πυρηνικής πρωτεΐνης με ανοσοκαταβύθιση χρησιμοποιώντας Μ2-σφαιριδίων (Εικ. 1Β). Ως έλεγχος, πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα i-SOX2-ϋΑΟΥ χωρίς έκθεση σε Dox (χωρίς επαγωγή δείγματα). Μετά την επαγωγή με Dox, το επίπεδο της (fs) SOX2, η οποία μεταναστεύει ελαφρώς βραδύτερα από SOX2, βρέθηκε να είναι περίπου 2,5 φορές υψηλότερη από εκείνη του ενδογενούς SOX2 (Εικ. 1 C). Ωστόσο, αν η έκφραση του εξωγενούς SOX2 μειώνει την έκφραση του ενδογενούς SOX2 όπως συμβαίνει σε ESC [11], τα συνολικά επίπεδα SOX2 στις Dox-κατεργασμένων κυττάρων ήταν μικρότερη από 2,5 φορές υψηλότερη από ότι στα μη επεξεργασμένα κύτταρα ϋΑΟΥ. Σημαντικά, ανάλυση χρώσεως με άργυρο της ανοσοκαταβυθίζονται εκλουσμάτων έδειξαν σημαντική εμπλουτισμό των πρωτεϊνών που απομονώνονται όταν (FS) SOX2 προκλήθηκε (Σχ. 1D). Όπως ήταν αναμενόμενο, (fs) SOX2 μπορούσε να ανιχνευθεί εύκολα με ανάλυση κηλίδος Western στην επαγόμενη, αλλά όχι στα μη επαγόμενα εκλούσματα (Σχ. 1Ε). Ο διακεκριμένος μπάντα παρατηρήθηκε σε -45 kDa (Σχ. 1D) είναι ένα κοινό μολυσματικό όταν Μ2-σφαιρίδια που χρησιμοποιούνται για ανοσοκαθίζηση [9], [11].

Για την αναγνώριση πρωτεϊνών που συνδέουν με SOX2 σε i-SOX2 -DAOY κύτταρα, σύμπλοκα SOX2-πρωτεΐνης από μη διεγερμένων και διεγερμένων κυττάρων i-SOX2-ϋΑΟΥ υποβλήθηκαν σε ανάλυση MudPIT. Για να βοηθήσει στην ελαχιστοποίηση πειραματική διακύμανση και για στατιστική ανάλυση, ανάλυση MudPIT διεξήχθη επί τρία ανεξάρτητα ζεύγη δειγμάτων. Η φασματική ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη της πρωτεομικής οθόνες μας ήταν 0,27% ± 0,16 και 0,37 ± 0,08% για μη διεγερμένων και διεγερμένων δειγμάτων, αντίστοιχα, όπως προσδιορίζεται με τη μέθοδο του Elias και συνεργάτες [26]. Πρωτεΐνες που προσδιορίζονται ως SOX2 πρωτεΐνες που συνδέονται με ομαδοποιήθηκαν σε τρεις μεγάλες κατηγορίες, σε μια προσπάθεια να ελαχιστοποιηθεί ο αποκλεισμός των καλόπιστων SOX2 πρωτεΐνες που συνδέονται με: 1) πρωτεϊνών εξακρίβωσαν μονάχα σε επαγόμενη δείγματα μας σε τρεις MudPIT αναλύσεις με τις αυστηρότερες BY-ρυθμίζεται σημασία p & lt? 0,05 (Εικ. 2Α, συμπληρωματικό πίνακα S1)? 2) πρωτεΐνες που προσδιορίζονται μόνο σε επαγόμενη δείγματα σε τρεις MudPIT αναλύσεις χωρίς ΑΠΟ προσαρμοσμένο σημαντικότητα (ρ & gt? 0,05), αλλά με σημασία t-test (ρ & lt? 0,05) (Σχ 2Β, συμπληρωματικός πίνακας S2).? και 3) πρωτεΐνες που εμπλουτίστηκαν στην επαγόμενη δείγμα περισσότερο από 6 φορές (Εικ. 2C, συμπληρωματικός πίνακας S3). Κατηγορίας 1 και 2 ανήλθαν σε 156 και 39 πρωτεΐνες, αντίστοιχα. Όλες οι πρωτεΐνες στην κατηγορία 1 συνάντησε τη στατιστική απαίτηση που χρησιμοποιείται για την κατηγορία 2. Μαζί με την κατηγορία 3, η οποία περιελάμβανε 88 πρωτεΐνες, συνολικά 283 SOX2 που σχετίζονται πρωτεΐνες ταυτοποιήθηκαν όταν συνδυάστηκαν οι τρεις κατηγορίες.

(Α ) οι πρωτεΐνες που εντοπίστηκαν σε όλες τις τρεις που προκαλείται εκλούσματα M2-χάντρα, αλλά δεν προσδιορίζονται στην μη επαγόμενα δείγματα, όπως SOX2 πρωτεϊνών που σχετίζονται με ανάλυση MudPIT, η οποία ήταν στατιστικά σημαντικές, σύμφωνα με την από-προσαρμοσμένη μέθοδο (ρ & lt? 0,05). Οι τιμές NSAF από τις τρεις επαναλήψεις κατά μέσο όρο και οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. Το οικόπεδο είναι χωρισμένο σε δύο? οι «μέσες τιμές NSAF» του αριστερό μισό ανάβαση αριστερά προς τα δεξιά, και οι «μέσες τιμές NSAF» του δικαιώματος μισό δεξιά ανάβαση προς τα αριστερά. (Β) Οι πρωτεΐνες που προσδιορίζονται σε 3 από 3, Dox επαγόμενη, αλλά όχι σε μη επαγόμενη, επαναλήψεις ΩΑΟΥ MudPIT που ήταν στατιστικώς σημαντική σύμφωνα με t-test του φοιτητή (ρ & lt? 0,05), αλλά δεν ήταν σημαντικές, ανάλογα με το BY-προσαρμογής ( p & gt? 0,05). (Γ) Οι πρωτεΐνες που εντοπίστηκαν στις τρεις επαγόμενη αλλά τουλάχιστον ένα δείγμα που δεν επάχθηκε MudPIT, σχεδιάζονται σύμφωνα με πάσο εμπλουτισμού (τιμές NSAF) σε Dox επαγόμενη δείγματα σε σύγκριση με μη επαγόμενα. Μόνο πρωτεΐνες με τιμές εμπλουτισμού & gt? 6 φορές είχαν συμπεριληφθεί. Πρωτεΐνες που απεικονίζεται με ένα μαύρο μπαρ είχε εμπλουτισμό αξίες που ήταν στατιστικά σημαντικές, σύμφωνα με την από-προσαρμογή (p & lt? 0,05). Πρωτεΐνες που απεικονίζεται με γκρι μπάρες ήταν στατιστικά σημαντικές, σύμφωνα με t-test του φοιτητή (ρ & lt? 0.05), αλλά όχι σημαντικά, ανάλογα με το από-προσαρμογή (p & gt? 0,05).

Η

Για την καλύτερη κατανόηση της βιολογικής λειτουργίες του SOX2 που σχετίζονται πρωτεΐνες, εκτελέσαμε γονίδιο ταξινόμηση οντολογία με τη βάση δεδομένων για σχολιασμού Οπτικοποίηση και Ολοκληρωμένη Discovery (David). Δεδομένης της πυρηνικής θέσης και λειτουργίας SOX2, δεν είναι έκπληξη το γεγονός ότι η μεταγραφή είναι ένα από τα μεγαλύτερα λειτουργικές κατηγορίες (Εικ. 3). Ωστόσο, SOX2 που σχετίζονται πρωτεΐνες έχουν συνδεθεί με πολλές άλλες κυτταρικές διεργασίες. Αυτό είναι παρόμοιο με το εύρημα ότι οι Sox2 πρωτεΐνες που συνδέονται σε ESC ποντικού και σε ποντίκι ESC υφίστανται διαφοροποίηση εμπλέκονται σε μία ποικιλία λειτουργιών [9], [11]. Σε αυτά τα κυτταρικά πλαίσια, ένα παρόμοιο ποσοστό SOX2 πρωτεϊνών που σχετίζονται συμμετείχαν στις κατηγορίες επεξεργασίας RNA (6% έως 9%) και την ανάπτυξη (10% έως 11%). Ωστόσο, υπήρξαν αρκετές αξιοσημείωτες διαφορές. Το ποσοστό των SOX2 που σχετίζονται με πρωτεΐνες που εμπίπτουν στην κατηγορία επιδιόρθωση του DNA αντιπροσώπευαν το 11% στην ΟΚΕ υφίστανται διαφοροποίηση [9], αλλά μόνο το 1% στα κύτταρα ϋΑΟΥ. Η ταξινόμηση για κάθε SOX2-πρωτεΐνης που συνδέεται παρέχεται στον συμπληρωματικό πίνακα S5.

ανάλυση Γονιδιακή οντολογία του SOX2 που σχετίζονται με πρωτεΐνες που προσδιορίζονται στο ϋΑΟΥ MB κύτταρα διεξήχθη με τη χρήση της βάσης δεδομένων για το σχολιασμό, την απεικόνιση και την Ολοκληρωμένη Discovery (David). Ειδικές περιγραφές οντολογία για SOX2 πρωτεΐνες που συνδέονται με ομαδοποιήθηκαν σε 14 μεγάλες κατηγορίες.

Η

MudPIT είναι ένα εξαιρετικά ευαίσθητο μέθοδο που είναι σε θέση να ανιχνεύσει τις πρωτεΐνες σε δείγματα που δεν ανιχνεύονται εύκολα με ανάλυση στυπώματος western. Για το λόγο αυτό, χρησιμοποιήσαμε μια πιο παραδοσιακή βιοχημική προσέγγιση και επιλεγμένες πρωτεΐνες με μέτρια τιμές NSAF για την επικύρωση αναγνώριση μας SOX2 που σχετίζονται πρωτεΐνες. Συγκεκριμένα, MSI2, μια πρωτεΐνη που βρίσκεται μόνο σε επαγόμενη δείγματα μας (Εικ. 2Α), και USP7, εμπλουτισμένο ~ 20-φορές (Σχ. 2C), επιβεβαιώθηκαν να συνδέσει με SOX2 μέσω συν-ανοσοκαθίζηση χρησιμοποιώντας πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάστηκαν από κύτταρα ϋΑΟΥ ( συμπληρωματική Εικ. S1 Α). Έχουμε καθορίζεται επίσης ότι SOX2 είναι σε θέση να συνδέσει με MSI2 και USP7 σε άλλα κυτταρικά περιβάλλοντα. Από αυτή την άποψη, MSI2 και USP7 ταυτοποιήθηκαν ως SOX2 πρωτεΐνες που συνδέονται σε ένα ενιαίο πρωτεομική οθόνη του SOX2 που σχετίζονται πρωτεΐνες στα κύτταρα U87 GB (Wilder και Rizzino, αδημοσίευτα αποτελέσματα). Επιπλέον, έχουμε διαπιστώσει ότι εκτοπικά εκφραζόμενη Flag-SOX2 συνεργάτες με ενδογενή USP7 βρίσκεται σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ (συμπληρωματική Σχ. S1B). Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι εκτοπικά εξέφρασε Σημαία-MSI2 συν-ανοσοκαταβυθίσματα εκφράζεται εκτοπικά SOX2 σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ (συμπληρωματική Εικόνα. S1c).

Ενσωμάτωση SOX2-πρωτεΐνης Interactomes αποκαλύπτει μια σειρά κοινών Συνειρμών Πρωτεΐνες

Εκτός από την πρωτεομική οθόνη SOX2 διεξήχθη σε κύτταρα ϋΑΟΥ, έχουμε διεξήχθη πρόσφατα ανάλυση MudPIT να προσδιορίσει SOX2 πρωτεΐνες που συνδέονται σε πολλά άλλα κυτταρικά περιβάλλοντα, συμπεριλαμβανομένων των αδιαφοροποίητων ESC [11] και ESC υφίστανται διαφοροποίηση [9]. Είναι σημαντικό ότι, οι τρεις SOX2-interactomes εντοπίστηκαν προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τις ίδιες μεθόδους απομόνωσης πρωτεϊνών και πρωτεομική ανάλυση, και ένα παρόμοιο φασματικό ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (& lt? 0,4%) προσδιορίστηκε σε κάθε ανεξάρτητη πλαίσιο [9], [11]. Σε κάθε περίπτωση, Flag-tagged επιτόπιο SOX2 και συναφείς πρωτεΐνες του απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας Μ2-σφαιριδίων από πυρηνικά εκχυλίσματα παρασκευάζονται με Dounce ομογενοποίηση, ακολουθούμενη από ανάλυση MudPIT χρησιμοποιώντας την ίδια πρωτεομική πλατφόρμα. Ως εκ τούτου, σε σύγκριση με SOX2-interactomes προσδιορίζονται σε κάθε μία από αυτές τις κυτταρικές πλαισίων (συμπληρωματική Σχ. 2, συμπληρωματικός πίνακας S6), επειδή οι πρωτεΐνες που συνδέουν με SOX2 σε πολλαπλές κυτταρικές πλαίσια είναι επίσης πιθανό να παίζουν ουσιαστικό ρόλο στη συμπεριφορά των κυττάρων του όγκου του εγκεφάλου. Από αυτή την άποψη, τα ανθρώπινα κύτταρα ΜΒ και ποντικού ESC είχε αρκετές SOX2 πρωτεΐνες που συνδέονται από κοινού, παρά δραματικές διαφορές στην κυτταρική πλαίσιο. Από 283 πρωτεΐνες που εντοπίζονται στην SOX2-interactome σε ϋΑΟΥ ΜΒ κύτταρα, 19 συνεργάτης με SOX2 σε τουλάχιστον ένα άλλο κυψελοειδές πλαίσιο, συμπεριλαμβανομένων των MSI2 και USP9X, και δύο συνεργάτης με SOX2 στις τρεις κυτταρικά πλαίσια (συμπληρωματική Σχ. S4, συμπληρωματικός πίνακας S6 ). Πρόσφατα, έχουμε δείξει ότι Msi2 απαιτείται για την αυτο-ανανέωση και πλειοδυναμία του ποντικιού ESC [14] και, πιο πρόσφατα, έχουμε διαπιστώσει ότι νοκ ντάουν της Usp9x στο ποντίκι ΟΚΕ αυξάνει σημαντικά τη διαφοροποίηση της ΟΚΕ (αδημοσίευτα αποτελέσματα). Επιπλέον, MSI2 και USP9X έχουν ενοχοποιηθεί σε άλλους καρκίνους [16] – [21], αλλά οι ρόλοι τους στους όγκους του εγκεφάλου δεν έχουν εξεταστεί. Ως εκ τούτου, επεκτείναμε την ανάλυσή μας για SOX2 πρωτεϊνών που σχετίζονται με τον προσδιορισμό εάν μειώνοντας την έκφραση MSI2 και USP9X επηρεάζει τη συμπεριφορά των κυττάρων όγκου του εγκεφάλου.

Musashi-2 είναι απαραίτητη για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του εγκεφάλου

Προηγούμενες εκθέσεις έδειξαν ότι MSI2 είναι απαραίτητη για την εξέλιξη της CML [16] – [18], και η knockdown του άλλου μέλους της οικογένειας, Μουσάσι-1 (MSI1), διαταράσσει τη βιωσιμότητα των ϋΑΟΥ ΜΒ κύτταρα και τα κύτταρα GB [28], [29]. Για να προσδιορίσετε αν MSI2 είναι απαραίτητο για τον πολλαπλασιασμό των ϋΑΟΥ MB κυττάρων, shRNA κατασκευάσματα χρησιμοποιήθηκαν για να χτυπήσει κάτω ενδογενή MSI2. Συγκεκριμένα, φακοϊούς που χρησιμοποιήθηκαν ιδιοσυστατικά εκφράζουν shRNA έναντι MSI2 να μολύνει ϋΑΟΥ MB κύτταρα. Δύο ανεξάρτητες κατασκευές shRNA χρησιμοποιήθηκαν για να knockdown MSI2, και ένας προηγουμένως χαρακτηριζόμενη μη ειδικό shRNA (κωδικοποιημένο) χρησιμοποιήθηκε ως ένας έλεγχος [15], [23]. Μετά την επιλογή των μολυσμένων κυττάρων με πουρομυκίνη, ανάλυση στυπώματος western έδειξε ότι MSI2 ισομορφών 1 και 2 ουσιαστικά χτυπηθεί κάτω (Σχ. 4Α). Αυτή η μείωση της MSI2 επαληθεύτηκε στα επίπεδα του RNA με RT-qPCR (Συμπληρωματικό Εικ. S3A). Επιπλέον, σε σύγκριση με την ανάπτυξη των κυττάρων ϋΑΟΥ μολύνθηκαν με τα κωδικοποιημένα shRNA λεντοϊκούς φορείς, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση της ανάπτυξης όταν τα κύτταρα μολύνθηκαν με MSI2 shRNA λεντοϊκούς φορείς (Εικ. 4Β). Επιπλέον, μικροφωτογραφίες ελήφθησαν 7 ημέρες μετά τη μόλυνση έδειξε ότι τα κύτταρα στα οποία MSI2 είχαν χτυπηθεί κάτω ήταν επίπεδη και μεγαλύτερα, που θυμίζει μετα-μιτωτικών κυττάρων, σε σύγκριση με τα κωδικοποιημένα ελέγχου (Εικ. 4C).

(Α ) ανάλυση Western blot των επιπέδων MSI2 σε ϋΑΟΥ ολικού κυττάρου εκχυλισμάτων 96 ώρες μετά τη μόλυνση με κωδικοποιημένο ή φακοϊούς MSI2 shRNA. Δύο ισομορφές ανιχνεύθηκαν: ισομορφής 1 (MSI2-1) και ισομορφή 2 (MSI2-2). GAPDH ανιχνεύθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Τα επίπεδα MSI2 ποσοτικά, με τα επίπεδα που βρέθηκαν στο κωδικοποιημένο ελέγχου 1.00. (Β) Η ανάπτυξη των κυττάρων εξετάστηκε εις τριπλούν με τη δοκιμασία ΜΤΤ 6 ημέρες μετά να τοποθετηθούν σε 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός 12 φρεατίων. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέσοι όροι σε σχέση με τον έλεγχο αγωνίζομαι. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. Οι τιμές Ρ προσδιορίστηκαν με student t-test και βρέθηκε να είναι & lt? 0,01 τόσο για MSI2 shRNA 1 και 2. (C) φωτομικρογραφίες των ϋΑΟΥ MB κυττάρων μετά από μόλυνση με είτε μη-ειδική (κωδικοποιημένο) ή MSI2 στόχευση (Νο 1 , Νο 2) shRNA φακοϊούς. Τα κύτταρα μολύνθηκαν την ημέρα 0, επιλέγονται με τη χρήση μέσου συμπληρωμένου με πουρομυκίνη την Ημέρα 1 και επανατροφοδοτήθηκαν φρέσκο ​​μέσο για την Ημέρα 2. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν την ημέρα 7 μετά την μόλυνση. (Δ) ανάλυση Western blot των μουδιασμένος στο ΩΑΟΥ MB εκχυλίσματα που χρησιμοποιούνται στην Εικόνα 4Α.

Η

Επί του παρόντος, σχετικά λίγα είναι γνωστά για τους ρόλους των MSI2, αλλά στο μοντέλο ποντικού της λευχαιμίας πιστεύεται να υποβαθμίσουν τα ρυθμίζουν την πρωτεΐνη Numb [16], η οποία έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει τόσο τα Notch και σηματοδότηση Wnt [30], [31]. Ως εκ τούτου, εξετάστηκε αν νοκ ντάουν της MSI2 στα κύτταρα ϋΑΟΥ επηρεάζει την έκφραση της μουδιασμένο. Διαπιστώσαμε ότι νοκ ντάουν της MSI2 με shRNA φορείς λεντοϊών # 1 και # 2 προκάλεσε αύξηση στα επίπεδα της πρωτεΐνης του μουδιασμένο (Εικ. 4D). Έτσι, νοκ ντάουν της MSI2 προκαλεί τόσο μεγάλη μείωση στην ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων ϋΑΟΥ MB και αυξάνει την έκφραση της μουδιασμένο.

Θα εξεταστούν επίσης οι συνέπειες της να χτυπήσει κάτω MSI2 στα καρκινικά κύτταρα GB, επειδή MSI2 επίσης εντοπιστεί ως SOX2-πρωτεΐνη που συνδέεται σε κύτταρα U87 GB (Wilder και Rizzino, αδημοσίευτα αποτελέσματα). Για το σκοπό αυτό, αρχικά μολυσμένα κύτταρα U87 GB όγκου με τις ίδιες MSI2 shRNA φορείς λεντοϊών που περιγράφηκε προηγουμένως. Και πάλι, μια ομελέτα shRNA χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τρεις ημέρες μετά την μόλυνση με φορείς λεντοϊού, ανάλυση στυπώματος western προσδιορίστηκε ότι MSI2 ισομορφή 1 και ισομορφής 2 ήταν τόσο σημαντικά μειωμένη (Εικ. 5Α) και η μείωση της MSI2 επιβεβαιώθηκε στα επίπεδα του RNA με RT-qPCR (συμπληρωματική Εικ. S3b) . Όπως και στην περίπτωση των κυττάρων ϋΑΟΥ, U87 κύτταρα μολυσμένα με GB MSI2 shRNA κατασκευάσματα επέδειξαν αξιοσημείωτη μείωση του πολλαπλασιασμού των κυττάρων (Εικ. 5Β) και μια σημαντική αύξηση του μεγέθους των κυττάρων (Εικ. 5C). Να επεκτείνει αυτά τα ευρήματα, τα κύτταρα U118 GB μολύνθηκαν με MSI2 shRNA φακοϊούς. Παρόμοια με ϋΑΟΥ και U87 κύτταρα, knockdown του MSI2 σε κύτταρα U118 οδήγησε σε μείωση σε πρωτεΐνη MSI2 και RNA, μια μεγάλη μείωση της κυτταρικής ανάπτυξης, και σημαντική αύξηση του μεγέθους των κυττάρων (συμπληρωματική Εικ. S4 και το Σχ. S3C). Λαμβανόμενα μαζί, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι MSI2 απαιτείται για να διατηρηθεί η επιβίωση των ϋΑΟΥ ΜΒ κυττάρων, και την πολλαπλασιαστική ικανότητα των U87 και κυττάρων U118 GB.

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των επιπέδων MSI2 σε U87 πυρηνικά εκχυλίσματα 96 ώρες μετά τη μόλυνση με Ομελέτα ή MSI2 shRNA φακοϊούς. Τα επίπεδα MSI2 ποσοτικά, με τα επίπεδα που βρέθηκαν στο κωδικοποιημένο ελέγχου 1.00. (Β) Η ανάπτυξη των κυττάρων εξετάστηκε εις τριπλούν με τη δοκιμασία ΜΤΤ 5 μέρες μετά να τοποθετηθούν σε 1,5 × 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός 12 φρεατίων. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέσοι όροι σε σχέση με τον έλεγχο αγωνίζομαι. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. Οι τιμές Ρ προσδιορίστηκαν με student t-test και βρέθηκε να είναι & lt? 0,01 τόσο για MSI2 shRNA 1 και 2. (C) φωτομικρογραφίες των U87 κυττάρων GB μετά από μόλυνση με είτε μη-ειδική (κωδικοποιημένο) ή MSI2 στόχευση (Νο 1 , Νο 2) shRNA φακοϊούς. Τα κύτταρα μολύνθηκαν την ημέρα 0, επιλέγονται με τη χρήση μέσου συμπληρωμένου με πουρομυκίνη την Ημέρα 1 και επανατροφοδοτήθηκαν φρέσκο ​​μέσο την ημέρα 3. Τα κύτταρα φωτογραφήθηκαν την ημέρα 6 μετά τη μόλυνση.

Η

εξόντωση USP9X μειώνει τη βιωσιμότητα του εγκεφάλου Τα καρκινικά κύτταρα

Θα εξεταστεί επίσης αν USP9X απαιτείται για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων του εγκεφάλου. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε shRNA μεσολάβηση knockdown του USP9X. Πιο συγκεκριμένα, τρεις ανεξάρτητες φακοϊούς χρησιμοποιήθηκαν για να παραδώσει ουσιαστικά δραστική shRNA κατασκευάσματα κατά USP9X μεταγραφές σε ϋΑΟΥ MB κύτταρα. Όπως και με MSI2-νοκ ντάουν μελέτες μας, Κωδικοποιημένα shRNA χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας. Εξόντωση USP9X επιβεβαιώθηκε με ανάλυση western blot των δύο πυρηνικών και κυτταροπλασματικών εκχυλισμάτων (Εικ. 6Α) και επαληθεύτηκαν στα επίπεδα του RNA με RT-qPCR (συμπληρωματική Σχ. S5A). Αν και υπήρχαν ελάχιστες επιδράσεις του να χτυπήσει κάτω USP9X κατά τις τρεις πρώτες ημέρες της καλλιέργειας, παρατηρήσαμε μια σημαντική μείωση στον αριθμό των κυττάρων τα οποία θα μπορούσαν να ξαναβάλουν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Επιπλέον, τα λίγα κύτταρα από τον πληθυσμό knockdown USP9X που επανατοποθετηθεί μετά υποκαλλιέργεια εμφάνισαν ελάχιστη ή και καμία πολλαπλασιασμό (Εικ. 6, Β και C). Επιπλέον, εξετάσαμε αν η knockdown του USP9X επηρεάζει την έκφραση αρκετών γνωστών στόχων της στα κύτταρα ϋΑΟΥ. USP9X έχει αναφερθεί ότι αποουβικιτινιώνει ένα μεγάλο αριθμό πρωτεϊνών, συμπεριλαμβανομένης MCL1 και β-κατενίνης [19], [32] – [35]. Ωστόσο, knockdown του USP9X δεν φάνηκε να μεταβάλλει την έκφραση του MCL1 ή β-κατενίνης στα πυρηνικά ή κυτταροπλασματικές διαμερισμάτων (Εικ. 6D).

(Α) ανάλυση κηλίδας Western για την επαλήθευση της knockdown του USP9X σε ϋΑΟΥ MB κυττάρων μετά από μόλυνση με φακοϊούς να εισαγάγει ουσιαστικά δραστική shRNA έναντι USP9X μεταγραφές. κλάσματα Πυρηνική και κυτταροπλασματική πρωτεΐνη παρασκευάστηκαν 4 ημέρες μετά την μόλυνση κυττάρων με φακοϊούς. Τα επίπεδα USP9X ποσοτικά, και τα επίπεδα στο κωδικοποιημένο ελέγχου 1.00. (Β) Η ανάπτυξη των κυττάρων εξετάστηκε εις τριπλούν με τη δοκιμασία ΜΤΤ 6 ημέρες μετά να τοποθετηθούν σε 10

4 κύτταρα ανά φρεάτιο ενός 12 φρεατίων. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται είναι μέσοι όροι σε σχέση με τον έλεγχο αγωνίζομαι. Οι ράβδοι σφάλματος αντιπροσωπεύουν την τυπική απόκλιση. Οι τιμές Ρ προσδιορίστηκαν με student t-test και βρέθηκε να είναι & lt? 0,01 τόσο για USP9X shRNA 1, 2 και 3. (C) φωτομικρογραφίες των ϋΑΟΥ MB κυττάρων μετά knockdown του USP9X χρησιμοποιώντας λεντοϊού που παραδίδεται shRNA κατασκευάσματα κατά USP9X μεταγραφές. Την ημέρα 0, τα κύτταρα μολύνθηκαν με USP9X shRNA φακοϊούς. Αρχίζοντας την ημέρα 1, που επιλέγεται μολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας πουρομυκίνη για 48 ώρες.