Αφηρημένο

Ιστορικό

Int-6

(ιστοσελίδα ένταξη 6) αναγνωρίστηκε ως ογκογονίδιο σε μια οθόνη του ιού του όγκου του μαστού ογκογόνο ποντίκι (MMTV) προσθήκες.

ΙΝΤ6

έκφραση μεταβάλλεται σε καρκίνους του ανθρώπου, αλλά ο ακριβής ρόλος του διαταράσσεται

ΙΝΤ6

στην ογκογένεση παραμένει ασαφής, και ένα ζωικό μοντέλο για τη μελέτη

Int-6

φυσιολογική λειτουργία έχει λείπει.

Κύρια Ευρήματα

Εδώ, έχουμε δημιουργήσει ένα

in vivo

μοντέλο λειτουργίας ΙΝΤ6 στο zebrafish, και μέσω της γενετικής και χημικά-γενετικές προσεγγίσεις εμπλέκουν ΙΝΤ6 ως ιστός -ειδικές διαμορφωτής της ΜΕΚ-ERK σηματοδότησης. Βρίσκουμε ότι ΙΝΤ6 απαιτείται για την κανονική έκφραση των ΜΕΚ1 πρωτεΐνης σε ανθρώπινα κύτταρα, και για Erk σηματοδότηση σε έμβρυα ψαριού zebra. Απώλεια είτε ΙΝΤ6 ή ΜΕΚ προκαλεί ελαττώματα στην κρανιοπροσωπική ανάπτυξη και ΙΝΤ6 και Erk-σηματοδότηση έχουν επικαλυπτόμενες περιοχές της έκφρασης ιστού.

Σημασία

Τα αποτελέσματά μας παρέχουν νέα εικόνα του φυσιολογικού ρόλου των σπονδυλωτών ΙΝΤ6, και να έχουν επιπτώσεις για τη θεραπεία ανθρώπινων όγκων προβάλλοντας μεταβληθεί

ΙΝΤ6

έκφραση

Παράθεση:. Grzmil Μ, Whiting D, Maule J, Αναστασάκη C, Amatruda JF, Kelsh RN, κ.ά. . (2007) Η

ΙΝΤ6

Cancer Gene και ΜΕΚ μονοπάτια σηματοδότησης Converge κατά τη διάρκεια Ζεβρόψαρο Ανάπτυξης. PLoS ONE 2 (9): Ε959. doi: 10.1371 /journal.pone.0000959

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Θωμάς Zwaka, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3 Αυγ του 2007? Αποδεκτές: 2 του Σεπτεμβρίου του 2007? Δημοσιεύθηκε: 26 Σεπτεμβρίου, 2007

Copyright: © 2007 Grzmil et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από μια επιχορήγηση MRC να EEP, και με επιχορηγήσεις από CRUK και το AICR να CJN. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό ή διεξαγωγή της μελέτης, στη συλλογή, ανάλυση ή ερμηνεία των δεδομένων, ή για την προετοιμασία, την αναθεώρηση ή την έγκριση του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δήλωσε ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

εμβρυϊκή ανάπτυξη και την ανάπτυξη των όγκων συχνά μοιράζονται υποκείμενων μοριακών μηχανισμών, μια έννοια που απεικονίζεται από την ταυτοποίηση των γονιδίων που διαταράσσεται από τον ιό μαστικού όγκου ποντικού (MMTV) σε μαστικού καρκίνους [1]. Ένα σημαντικό παράδειγμα, το

Int-1

γονίδιο, το οποίο είναι ένα κοινό τόπο ένταξης για ΜΜΤν σε μαστικούς όγκους, κωδικοποιεί το ομόλογο του

Drosophila χωρίς φτερά

γονίδιο [2], [3] και ήταν στη συνέχεια το όνομά του

Wnt1

(χωρίς φτερά /Int) σε αναγνώριση αυτού του διατηρημένου λειτουργία. Σηματοδότηση Wnt είναι τώρα γνωστό ότι διαταράσσεται σε πολλούς ανθρώπινους τύπους όγκων, ειδικά καρκίνου του παχέος εντέρου [4]. Άλλες

Int

γονίδια, όπως

Int-2

και

4

(Fgf3, 4), και

Int-3

(Notch4), κωδικοποιούν μιτογόνα και ρυθμιστές της ανάπτυξης που είναι επίσης misactivated σε πολλούς καρκίνους [1], [5].

στην πλειονότητα των περιπτώσεων, MMTV ενεργοποιεί

Int

γονιδιακής έκφρασης ως αποτέλεσμα της ενσωμάτωσης προϊού ανάντη της περιοχής του υποκινητή. Αξίζει να σημειωθεί ότι, και οι τρεις προσθήκες ΜΜΤν βρεθεί σε

Int-6

, το οποίο κωδικοποιεί ένα συστατικό του ευκαρυωτικού παράγοντα εκκινήσεως μεταφράσεως 3 (eIF3), βρέθηκαν να βρίσκονται εντός ιντρονίων, και στον αντίθετο μεταγραφικό προσανατολισμό προς το

Int-6

γονίδιο, δημιουργώντας μια κολοβωμένη

Int-6

mRNA [1], [6]. Έκτοπη έκφραση ισοδύναμα κόλουρου

Int-6

μπορεί να μετατρέψει καλλιέργειες κυττάρων [7], [8], και την προώθηση της επίμονης μαστικών κυψελιδικά υπερπλασία και την καρκινογένεση σε διαγονιδιακά ποντίκια [9].

Παρά τις σημαντικές αποδείξεις υπέρ ενός ρόλου για ΙΝΤ6 στην ανθρώπινη ογκογένεση [10] – [12], η μοριακή βάση για ΙΝΤ6 στην ανάπτυξη καρκίνου παραμένει άλυτο. Εξαιρετικά διατηρημένη σε ευκαρυωτικά, ΙΝΤ6 περιέχει έναν τομέα PCI, που βρίσκονται σε πρωτεΐνες του 19S ρυθμιστικών καπάκι του πρωτεασώματος, η COP9 σηματοσώματος (CSN), και το σύμπλοκο έναρξης μετάφρασης eIF3? Όλα τα τρία συγκροτήματα μοιράζονται συνολική δομική ομοιότητα, και ΙΝΤ6 έχει βρεθεί που σχετίζεται με κάθε [13]. Όταν υπερεκφράζεται σε ζυμομύκητες, ΙΝΤ6 επάγει αντίσταση σε πολλαπλά φάρμακα με την ενεργοποίηση ενός παράγοντα μεταγραφής ΑΡ-1 [14], [15], και σε ανθρώπινα κύτταρα, το εύρος της λειτουργίας ΙΝΤ6 περιλαμβάνει ομαλής εξέλιξης μέσω της μίτωσης [16], η ρύθμιση του πρωτεασώματος εξαρτώμενη από τη σταθερότητα των MCM7 [17] και HIF2α [18], και με τη μεσολάβηση ανοησίες mRNA αποσύνθεσης [19].

Με κανένα ζωικό μοντέλο για ΙΝΤ6 απώλεια-του-λειτουργία διαθέσιμη, εμείς αιτιολογημένη ότι η κατανόηση του

ΙΝΤ6

κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης θα παρέχει νέα εικόνα για τη λειτουργία ΙΝΤ6 σε φυσιολογικά κύτταρα σπονδυλωτών, παρέχοντας έτσι μια νέα προοπτική για τη λειτουργία ΙΝΤ6 στο σχηματισμό του καρκίνου. Εδώ, με τη χρήση zebrafish και θηλαστικών, περιγράφουμε την πρώτη ΙΝΤ6 απώλειας λειτουργίας φαινοτύπου σε ένα ζώο, και συνδέουν ΙΝΤ6 με ένα μονοπάτι σηματοδότησης, ότι όπως και εκείνοι που πραγματοποιούνται από άλλα

Int

γονίδια, είναι κρίσιμη τόσο για την ανάπτυξη και τον καρκίνο.

Αποτελέσματα

ΙΝΤ6 είναι απαραίτητη για zebrafish εμβρυογένεση

Εμείς επιλέξαμε να μελετήσουμε το φυσιολογικό ρόλο του zebrafish ΙΝΤ6 κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, χρησιμοποιώντας μορφολινο ολιγονουκλεοτίδια (MOS) για τη μείωση των ΙΝΤ6 πρωτεΐνης, καθώς και

ΙΝΤ6

hi2470

παρεμβατικής μεταλλαγμένη γραμμή (ευγενική προσφορά από τον Ν Hopkins, Α Άμστερνταμ και S. Farrington. MIT). Zebrafish ΙΝΤ6 είναι πάνω από 90% ταυτόσημη προς την αλληλουχία αμινοξέων της στα ανθρώπινα ΙΝΤ6 (

Ensembl

ENSDARG00000002549) και χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα που εγείρεται έναντι ΙΝΤ6 το Ν-άκρο του ανθρώπινου ΙΝΤ6 [20] διαπιστώσαμε ότι το

ΙΝΤ6

MO είχε ως αποτέλεσμα την απώλεια της ΙΝΤ6 (Εικόνα 1Α). Όπως ΙΝΤ6 έχει εμπλακεί στον έλεγχο του κυτταρικού κύκλου G2 /M φάση, εκτελέσαμε πρώτα ολόκληρο-mount ανοσοϊστοχημεία με την καθυστερημένη G2 /δείκτη φάση Μ, φωσφο-ιστόνης Η3, και βρήκε μόνο ελαφρώς μειωμένη αριθμοί κυττάρων στα τέλη φάση G2 /M στο

ΙΝΤ6

morphant σύγκριση με τον μάρτυρα (Σχήμα S1). Είναι σημαντικό, βρήκαμε ότι τα έμβρυα ένεση με

ΙΝΤ6

MO είχε συγκεκριμένες αναπτυξιακές ανωμαλίες (Εικόνα 1Β-Ν), κυρίως μειωμένη melanisation 2 ημέρες μετά τη γονιμοποίηση (DPF:

int-6

MO n = 51/53? con ΜΟ n = 0/35?

int-6 5MM

n = 3/31)? άστοχη χρωστικών κυττάρων στην ουρά 3 dpf (

int-6

ΜΟ n = 46/49? con ΜΟ n = 3/30)? και ανώμαλη μορφογένεση γνάθου, με στοιχεία χόνδρο μειώνεται ή ακατάλληλο σε 4 και 5 dpf (

int-6

ΜΟ n = 81/85 4 dpf, n = 76/83 5 dpf? con ΜΟ 1/67 4 dpf , n = 1/61 5 DPF). Οι κρανιοπροσωπικές και χρωστική ελαττώματα των κυττάρων που παρατηρούνται στο

int-6

morphant και

hi2470

μεταλλαγμένων δείχνουν ότι

int-6

μπορεί να συμβάλει στην ανάπτυξη της νευρικής ακρολοφίας-κυττάρων (NCC ) παράγωγα. Χρησιμοποιήσαμε πολλούς δείκτες της ΕΚΣ και των παραγώγων τους για την αξιολόγηση όταν προκύπτουν αυτές οι φαινότυποι, και βρήκε ΙΝΤ6 δεν φαίνεται να απαιτείται για τον καθορισμό ή την οργάνωση της premigratory και μεταναστεύουν πρόδρομων ουσιών του χόνδρου (Εικόνα S2). Σε αντίθεση, Αλσατίας χρώση μπλε χόνδρου αποκάλυψε μια συγκεκριμένη απώλεια των πέντε ceratobranchial στοιχεία του χόνδρου στο

ΙΝΤ6

morphants, ενώ, palatoquadrate και hyoid χόνδρου Meckel ήταν όλοι παρόντες, αν και παραμορφωμένο (5,5 dpf

ΙΝΤ6

ΜΟ n = 45/53? con ΜΟ n = 1/34? Εικόνα 1Ι-L, Σχήμα S3). Έκφραση του

ΙΝΤ6

mRNA αποκατασταθούν οι κανονικές συνθήκες κρανιοπροσωπικές στοιχεία για το

ΙΝΤ6

morphant (

δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα

)? και η

ανάλυση ΙΝΤ6

hi2470

μεταλλαγμένο είχε ένα σχεδόν πανομοιότυπο κρανιοπροσωπικές φαινότυπο (Σχήμα 1 Μ, Ν) υποδεικνύει μια πραγματική απαίτηση για ΙΝΤ6 στην κρανιοπροσωπική ανάπτυξη.

(Α) Western blot της ΙΝΤ6 (*) στο zebrafish έμβρυα ένεση με έλεγχο (con) MO ή

ΙΝΤ6

ΜΟ. (Β)

ΙΝΤ6

morphant μελανοκύτταρα είναι λιγότερο απειλητικά χρωματισμένο. (C-F) ΙΝΤ6 απαιτείται για τοποθέτηση χρωστικών κυττάρων στην ουρά, όπως

ΙΝΤ6

morphants και

ΙΝΤ6

hi2470

μεταλλάξεις έχουν χαθεί τα κύτταρα χρωστικής ουσίας σε πτερυγίου της ουράς (D, βέλος ). φωτισμού περιβάλλοντος φωτίζει «αστέρι-φως» μοτίβο των iridophore δει στο

ΙΝΤ6

hi2470

έμβρυα (F, βέλος). (G-Η) Με 5 dpf, τα έμβρυα ένεση με ένα con ΜΟ έχουν σαφώς ορατή certobranical καμάρες, ενώ

ΙΝΤ6

morphants δεν έχουν ορατά certobranical καμάρες, πέραν των άλλων ανωμαλιών, συμπεριλαμβανομένων unconsumed κρόκος sac, την καρδιά και ανάπτυξη των ματιών. (ΣΕ). Alcian μπλε χρώση των 5 εμβρύων DPF δείχνει απώλεια ceratobrancial καμάρες 1 έως 5. Μ, του Meckel? PQ, palatoquadrate? CH, ceratohyal? CB, ceratobrancial.

Η

Απώλεια ΙΝΤ6 μεταβάλλει ΜΕΚ πρωτεΐνη και ERK σηματοδότησης

Βιοχημικά αποδεικτικά στοιχεία σε σχάση ζύμη υποδηλώνει ότι ΙΝΤ6 είναι μέρος ενός εξειδικευμένου συμπλόκου έναρξης της μετάφρασης eIF3 που μπορούν να στοχεύουν ειδικά mRNA για μετάφραση [21]. Με δεδομένη την εμπλοκή της ΙΝΤ6 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων [16], κηλίδες Western χρησιμοποιώντας ένα πάνελ αντισωμάτων κατά των πρωτεϊνών που εμπλέκονται στον κυτταρικό κύκλο και συνδέονται μονοπατιών σηματοδότησης πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης από τον έλεγχο και την ΙΝΤ6 siRNA επιμολυσμένα MDA-MB-231 κύτταρα. Από 16 πρωτεΐνες διερευνήθηκε με τον τρόπο αυτό, μόνο τα επίπεδα ΜΕΚ1 μεταβλήθηκαν από ΙΝΤ6 siRNA διαμόλυνση (Σχήμα 2). Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [20], βρήκαμε

ΙΝΤ6

-siRNA κυτταρολύματα είχαν μειωμένα επίπεδα ΙΝΤ6 πρωτεΐνης σε σύγκριση με μη-μεταμολυσμένα και αντίστροφη

ΙΝΤ6

-siRNA αλληλουχία. Βρήκαμε επίσης μια δραματική μείωση των επιπέδων της πρωτεΐνης ΜΕΚ1 που συσχετίζεται με την απώλεια της ΙΝΤ6, ενώ ΒΑΧ, τα επίπεδα πρωτεΐνης τουμπουλίνης και ακτίνης εμφανίστηκε ανεπηρέαστη στο

ΙΝΤ6

-siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2Α). Η απώλεια της ΜΕΚ1 ήταν ειδικά στο επίπεδο πρωτεΐνης, ως ημι-ποσοτική PCR-έδειξαν κανονικά επίπεδα

ΜΕΚ1

mRNA σε

ΙΝΤ6

-siRNA επεξεργασμένα κύτταρα, όπως επίσης και τα αναμενόμενα μειωμένα επίπεδα το μήνυμα ΙΝΤ6 στους

ΙΝΤ6

-siRNA επιμολυσμένα κύτταρα (Σχήμα 2Β). Η πιθανότητα ότι

ΙΝΤ6

μπορεί να επηρεάσουν ΜΑΡΚ σηματοδότησης μέσω του ελέγχου των επιπέδων της πρωτεΐνης ΜΕΚ μας ώθησε να εξετάσει την κατάσταση φωσφορυλίωση των ERK1 /2, προς τα κάτω τους στόχους των κινασών ΜΕΚ, στο

ΙΝΤ6

morphant zebrafish έμβρυα . Σε σύγκριση με τα έμβρυα ΜΟ ελέγχου,

ΙΝΤ6

morphant λύματα έμβρυο είχε μειωμένα επίπεδα φωσφο-ΕΚΚ (Εικόνα 2C). Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν μία νέα λειτουργία για ΙΝΤ6 στον έλεγχο της ΜΑΡΚ σηματοδότησης στο αναπτυσσόμενο έμβρυο, ενδεχομένως με άμεσο έλεγχο των επιπέδων της πρωτεΐνης ΜΕΚ1.

A. Κύτταρα οστεοσαρκώματος U2-OS μη επιμολυσμένα (U), ή επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύουν ενάντια στο

ΙΝΤ6

mRNA (SI) ή την αντίστροφη σειρά (R), δείχνουν μειωμένα επίπεδα ΙΝΤ6 και ΜΕΚ1 πρωτεΐνη ειδικά μετά την επιμόλυνση με

INT6-

siRNA, αλλά καμία μείωση στα επίπεδα ΒΑΧ, τουμπουλίνης ή πρωτεΐνη ακτίνη. (Β) δείχνει Ημι-ποσοτική PCR-

MEK1

mRNA δεν επηρεάζεται με την αντίστροφη σειρά και

ΙΝΤ6

-siRNA επεξεργασμένα κύτταρα, σε συνδυασμό με τα αναμενόμενα μειωμένα επίπεδα του

ΙΝΤ6

μήνυμα στους

ΙΝΤ6

-siRNA επιμολυσμένα κύτταρα. c, έλεγχος PCR χωρίς DNA. Τα επίπεδα (C) φωσφο-ΕΚΚ μειωθεί σε

ΙΝΤ6

morphants, ενώ Ponceau λεκέ ανιχνεύει ίση φόρτωση πρωτεϊνών στη γέλη.

Η

ΙΝΤ6 και Mek πορείες συγκλίνουν κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης

Αν ΙΝΤ6 ελέγχει Mek δραστηριότητα στο αναπτυσσόμενο έμβρυο, έχουμε υποθέσει ότι συγκεκριμένες ανάπτυξη των ιστών μπορεί να έχουν επικαλυπτόμενες περιοχές έκφραση της πρωτεΐνης ΙΝΤ6 και τη δραστηριότητα φωσφο-ΕΚΚ. Πράγματι, ανοσοϊστοχημεία με αντισώματα που κατευθύνονται εναντίον ΙΝΤ6 και φωσφο-ΕΚΚ απεκάλυψε αλληλοεπικάλυψη πεδίων της έκφρασης στον αναπτυσσόμενο κρανιοπροσωπικό περιοχής 3 και 4 dpf εμβρύων (Σχήμα 3Α-F). Ισχυρή ΙΝΤ6 ιστο-ειδική έκφραση ανιχνεύθηκε επίσης στον αναπτυσσόμενο έντερο και το φακό, περιοχές οι οποίες είχαν μικρή ή καθόλου φωσφο-ΕΚΚ έκφρασης (Σχήμα S4). Δεδομένης η παρατηρούμενη φωσφο-ΕΚΚ και ΙΝΤ6 έκφραση στο κρανιοπροσωπικών περιοχή, υποθέσαμε ότι ορισμένοι από τους φαινοτύπους ΙΝΤ6, όπως το ελάττωμα σχηματισμός σαγόνι, μπορεί να phenocopied με καταστολή του Erk σηματοδότησης. Ως ερμηνεία των φαινοτύπων ΜΟ έχει πρόσφατα περιπλέκεται από την ταυτοποίηση των ΜΟ-διεγειρόμενη ρ53-εξαρτώμενη κρανιοπροσωπικών ελαττωμάτων [22], χρησιμοποιήσαμε μια εναλλακτική προσέγγιση – το άκρως επιλεκτικός, κλινικά δραστικό αναστολέα ΜΕΚ CI-1040 [23] – να μειώσει Mek σηματοδότηση στο zebrafish. Προσθέσαμε το φάρμακο σε 4 HPF σε συγκέντρωση 0,25, 0,5, και 1,0 μΜ, και επιβεβαιώθηκε η απώλεια της έκφρασης φωσφο-ΕΚΚ με ανάλυση κηλίδας Western (

δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα

). Αξίζει να σημειωθεί ότι η προσθήκη του CI-1040 προκάλεσε μια εξαρτώμενη από τη δόση απώλεια των οπίσθιων δομών του εμβρύου, έτσι ώστε 1,0 μΜ CI-1040 προκάλεσε σοβαρή πρόσθια-οπίσθια (ΑΡ) άξονας ελάττωμα (Σχήμα 4Α-C), σε συνέπεια με ένα ρόλος για FGF σηματοδότηση στην ανάπτυξη του άξονα AP [24]. CI-1040 προκάλεσε επίσης απώλεια ceratobranchial στοιχείων του χόνδρου, ενώ τα πρόσθια στοιχεία – του Meckel, palatoquadrate και hyoid χόνδρων – ήταν παρόντες, αλλά παραμορφωμένο (Σχήμα 3G-J), παρόμοια με τις επιδράσεις που παρατηρήθηκαν σε

ΙΝΤ6

morphants και μεταλλάξεις .

(Α-F). Ανοσο-ιστοχημεία των ΙΝΤ6 και φωσφο-ΕΚΚ στις αναπτυσσόμενες κρανιοπροσωπικές ιστούς, σε αντίθεση χρώση με αιματοξυλίνη και φωσφο-ιστόνης Η3 να δείξει κύτταρα ποδηλασία. (G, H) Ventral ολόκληρη mount απόψεις του μπλε της Αλσατίας χρωματισμένο χόνδρους του φάρυγγα δείχνουν απώλεια ceratobrancial τόξα 1-5 και μείωση του Meckel του (Μ), palatoquadrate (PQ) και ceratohyal (CH) χόνδρους σε 4 DPF έμβρυα που έλαβαν θεραπεία με 0,5 μΜ CI-1040. (I, J) τμήματα των 4 DPF εμβρύων αιματοξυλίνη και ηωσίνη βάφονται μετά από 0,5 μΜ CI-1040 αγωγή αποκαλύπτει απώλεια τόξα CB 1-5 (παρένθεση). Ε, Ethmoid πλάκα? PC, παραχορδών χόνδρου.

Η

Για να διευκρινιστεί περαιτέρω η βιολογική σημασία της ΙΝΤ6 και ΜΕΚ, επωφεληθήκαμε από την ευκολία με την οποία μονοπάτια σηματοδότησης μπορεί να μεταβληθεί φαρμακολογικά σε συγκεκριμένες γενετικές πλαίσια του zebrafish σύστημα. Εμείς αιτιολογημένη ότι αν ΙΝΤ6 συμβάλλει στην ενεργοποίηση των ΜΕΚ, τότε έμβρυα με μειωμένη ΙΝΤ6 θα πρέπει να είναι υπερευαίσθητοι σε χαμηλές δόσεις του αναστολέα της ΜΕΚ CI-1040. Σε έμβρυα που υπέστησαν αγωγή με 0.25 μΜ CI-1040, καμία αλλαγή στα πρόσθια-οπίσθια άξονα ανιχνεύθηκαν (Σχήμα 4Β). Επιπλέον,

ΙΝΤ6

morphants παράγεται από χαμηλές δόσεις ΜΟ (0,25 ng) δεν έχουν μια αλλαγμένη άξονα ΑΡ (Σχήμα 4D). Αντιθέτως, σε συνδυασμό με χαμηλές δόσεις CI-1040, η χαμηλή δόση

ΙΝΤ6

morphant παρουσίασαν σοβαρά ενισχυμένη φαινότυπο άξονα ΑΡ (Σχήμα 4Ε). Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά παρέχουν περαιτέρω ενδείξεις ότι

ΙΝΤ6

μπορεί να παίζουν ρόλο στην διαμόρφωση ΜΕΚ

in vivo

.

(Α-Γ). Μόνο τα έμβρυα που έλαβαν θεραπεία με το 1.0 μΜ CI-1040, και όχι 0,25 μΜ, δείχνουν μια απώλεια της οπίσθιας δομές, σε αντίθεση με (D)

ΙΝΤ6

morphants (

ΙΝΤ6

ΜΟ 0,25 ng). (E, F) σε συνδυασμό με 0,25 μΜ CI-1040, 0.25 μg του

ΙΝΤ6

MO προκαλεί μια δραματική μεταβολή του πρόσθιου-οπίσθιου άξονα.

Η

Συζήτηση

ο ενεργός στις περισσότερες μορφές καρκίνου, η οδός σηματοδότησης ΜΑΡΚ είναι από τα πιο ελκυστικούς στόχους για νέες θεραπείες κατά του καρκίνου [23]. Όπως μονοπάτια σηματοδότησης ΜΑΡΚ, οι περισσότεροι από το

Int

μονοπάτια – Wnt, FGF, και Notch – διατηρούνται ρυθμιστές της ανάπτυξης που ενεργοποιούνται συχνά για την προώθηση της ογκογένεσης. Παρέχουμε αποδείξεις ότι, όπως και άλλοι

Int

γονιδιακά προϊόντα,

ΙΝΤ6

απαιτείται για την ανάπτυξη των σπονδυλωτών (Σχήμα 1), εν μέρει με την παροχή ενός νέου στρώματος ΜΑΡΚ ρύθμισης μεταγωγής σήματος (Σχήμα 2) . Με το ευρύ φάσμα των κυτταρικών δραστηριοτήτων που δόθηκε στη ΙΝΤ6, η μηχανιστική λεπτομέρεια του ελέγχου αυτού μένει να γίνει κατανοητό? νωρίς έρευνες μας δείχνουν μείωση των ΜΕΚ1 στο

ΙΝΤ6

-siRNA επεξεργασμένα κύτταρα των θηλαστικών δεν εξαρτάται από την πρωτεασώματος (MG & amp? CJN,

αδημοσίευτα

δεδομένων), καθιστώντας άμεση ρύθμιση MEK1 από ΙΝΤ6-εξαρτώμενη μετάφραση δυνατότητα.

Πρόσφατα, η σημασία της RAS, RAF και ΜΕΚ στην ανθρώπινη ασθένεια έχει επεκταθεί πέρα ​​από τον καρκίνο από την ανακάλυψη ότι η ανθρώπινη μεταλλάξεις βλαστικής σειράς σε αυτά τα γονίδια προκαλούν την οικογένεια LEOPARD-Noonan των συνδρόμων [25] . Λεπτομερής ανοσοϊστοχημικές μελέτες σε ποντίκια έχουν εντοπιστεί σε αυστηρές ρυθμίσεις, συγκεκριμένους τομείς των διακριτών και δυναμική ΕΚΚ φωσφορυλίωση σε όλη την ανάπτυξη, συμπεριλαμβανομένων των τόξων του φάρυγγα και τα μπουμπούκια των άκρων [26]. Στις πρώτες μελέτες έκφρασης πρωτεΐνης ΙΝΤ6 σε ένα ολόκληρο ζώο ανάπτυξη, δείχνουμε ότι ΙΝΤ6 έχει περιφερειακό επικαλυπτόμενες περιοχές της πρωτεϊνικής έκφρασης με φωσφο-ΕΚΚ, κυρίως στο κρανιοπροσωπικών περιοχή (Σχήμα 3, Σχήμα S4). Δάνεια βιολογική σημασία στις παρατηρήσεις αυτές, δείχνουμε ότι τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά από κοινού μεταξύ της απώλειας του ΙΝΤ6 και αναστολή της δραστηριότητας ΜΕΚ (Σχήμα 3). Επιπλέον, μερική απώλεια ΙΝΤ6 προκαλεί εμβρύων να είναι ιδιαίτερα ευαίσθητα σε ένα ήπια διακυβεύεται δόση αναστολή ΜΕΚ, αποκαλύπτοντας μια

in vivo

αλληλεπίδραση μεταξύ έκφρασης πρωτεΐνης ΙΝΤ6 και αναπτυξιακές σηματοδότηση Mek-Erk (Σχήμα 4). Ήδη από υπερ-έκφραση του Ras-Raf-ΜΕΚ προκαλεί μορφολογικές ανωμαλίες, είμαστε σήμερα τη δημιουργία διαγονιδιακών γραμμών που επιτρέπουν χρονική έλεγχο των ΜΕΚ, η οποία θα είναι ένα πολύτιμο εργαλείο για βαθύτερη γενετική εκτομή της σχέσης ΙΝΤ6-ΜΕΚ-ΕΚΚ

in vivo

. Θα είναι κρίσιμη σε μελλοντικές μελέτες για να διαπιστωθεί εάν ΙΝΤ6 είναι σε θέση να ελέγχουν τόσο Mek1 και ΜΕΚ2? αρχικές μελέτες MO μας δείχνουν ότι ΜΕΚ2 μπορεί να έχει ένα συγκεκριμένο ρόλο στη μετανάστευση των μελανοκυττάρων (CA & amp? ΕΕΡ,

αδημοσίευτα

δεδομένων), αυξάνοντας την πιθανότητα ότι τα ελαττώματα της μετανάστευσης χρωστική ουσία των κυττάρων που παρατηρείται στην

ΙΝΤ6

morphants αντανακλούν επίσης αλλαγμένη σηματοδότησης ΜΕΚ.

σηματοδότηση FGF είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη του σκελετού, παραδειγματικά με τις μεταλλάξεις που διασπούν σηματοδότηση FGF σε ανθρώπινα γενετικά σύνδρομα σκελετική ανωμαλία [27]. Στον αναπτυσσόμενο έμβρυο ποντικού, τα περισσότερα πεδία φωσφο-ΕΚΚ επικαλύπτονται με domains FGF σηματοδότηση [26]. FGF σηματοδότησης μόρια είναι υποψήφιοι για ανάντη ενεργοποίηση του ΙΝΤ6-μετριάστηκε σηματοδότησης ΜΕΚ-Erk που διαμορφώνει το κρανιοπροσωπικό σκελετό σε σπονδυλωτά [28], [29], και τις υποψήφιες προς τα κάτω τους στόχους της ΙΝΤ6-ΜΕΚ-ΕΚΚ σηματοδότησης περιλαμβάνουν τη διαφοροποίηση των χονδροκυττάρων μεταγραφικού παράγοντα SOX9 , η οποία απαιτεί Mek δραστηριότητα για μεταγραφική δραστηριότητα [30]. Σημειώνουμε επίσης ότι

ERK2

, αλλά όχι

ERK1

, εκφράζεται ειδικά στις καμάρες του φάρυγγα σε δύο ημερών zebrafish έμβρυα [31], ενδεχομένως υποδηλώνει ότι η διαφοροποίηση ΙΝΤ6-ΜΕΚ στην ανάπτυξη κρανιοπροσωπικές περιοχή μπορεί να σηματοδοτήσει συγκεκριμένα μέσω στόχους της Erk2.

Σχετικά τη διαμόρφωση ΙΝΤ6 της ΜΕΚ-Erk σηματοδότησης για την ανάπτυξη του καρκίνου είναι μια νέα οπτική γωνία για τη μελλοντική έρευνα. Μια πιθανότητα είναι ότι σε ΜΜΤν επαγόμενη μαστικούς όγκους, το ακρωτηριασμένο Int-6 πρωτεΐνη μπορεί να δρα ως ένα ογκογονίδιο μεταβάλλοντας σηματοδότηση ΜΕΚ-ΕΚΚ. Προτείνουμε ότι οι διάφορες κυτταρικές θέσεις της ΙΝΤ6, σε συνδυασμό με τη χρονική έκφραση και ο εντοπισμός των Mek1 /2 και Erk1 /2, μπορεί να οδηγήσει σε εξομάλυνσης των οδών σηματοδότησης ΜΕΚ-Erk σε συγκεκριμένους ιστούς κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης, και μπορεί να έχει σημαντικές συνέπειες για ο ρόλος των ΙΝΤ6 στην ογκογένεση.

Μέθοδοι

τα ψάρια-ζέβρες εκτροφής και μορφολινο μελέτες

Zerbafish (

Danio rerio

) γραμμές ΑΒ, ΑΒ *, και AB * -TPL τέθηκαν και ανέβηκε όπως περιγράφεται [32], [33]. MOS (Πίνακας 1) σχεδιάστηκαν από και αγοράζονται από τα Εργαλεία Gene, LLC (ΗΠΑ), και 1 ng ένεση σε έμβρυα σταδίου ενός κυττάρου.

Η

Φαινότυπος ανάλυση

ανάλυση φαινότυπο πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφεται: μελέτες του κυτταρικού κύκλου [34]? βαφή Alcian Blue [35]? σύνθεση ανιχνευτή και ολόκληρη-mount υβριδισμοί in-situ [36]. ανιχνευτές cDNA για νευρωνικό δείκτες λοφίο ήταν η ευγενική δωρεά του David Raible (University of Washington, USA). Πολυαδενυλιωμένο

ΙΝΤ6

mRNA δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας Ambion mMessage mMachine (# 1340).

Κυτταρική καλλιέργεια και ανάλυση RT-PCR

MDA-MB-231 κύτταρα αναπτύχθηκαν και επιμολύνθηκαν όπως περιγράφεται [19] χρησιμοποιώντας Lipofectamine (Invitrogen) με SI-ολιγονουκλεοτίδια (Πίνακας 1? Eurogentec) σε τελική συγκέντρωση 100 ηΜ σε Optimem (Gibco). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την επιμόλυνση το ολικό RNA απομονώθηκε (RNeasy Mini Kit? Qiagen). Και ένα βήμα RT-PCR αντιδράσεις (Qiagen) επιτυγχάνεται χρησιμοποιώντας ειδικούς εκκινητές (Πίνακας 1)

ανοσοαποτύπωσης

λύματα ολόκληρων κυττάρων και zebrafish εκχυλίσματα δημιουργήθηκαν [31], [19] και ανοσοϊστοχημεία εκτελέστηκε όπως περιγράφεται [36]. Τα αντισώματα χρησιμοποιούνται ως στον Πίνακα 2.

Η

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

ανάλυση κυτταρικού κύκλου των ΙΝΤ6 morphants. Ολόκληρο-mount ανοσοϊστοχημεία με τα τέλη της G2 /M φάση δείκτη, φωσφο-ιστόνης Η3 εμφανίζει μόνο ελαφρώς μειωμένη αριθμοί κυττάρων στα τέλη G2 /M φάση του morphant ΙΝΤ6 σύγκριση με τον έλεγχο. Ομοίως, το περιεχόμενο του DNA όπως μετράται με ροή αποκαλύπτει κυτταρομετρία μόνο μία ελαφρά μείωση των κυττάρων σε G2 /M φάση του morphant ΙΝΤ6. Έτσι, διαπιστώνουμε ότι η απώλεια ΙΝΤ6 σε φυσιολογικά κύτταρα σπονδυλωτών (καθώς και σε πρόσθετες κυτταρικές σειρές ανθρώπινου καρκίνου, MG & amp? CJN αδημοσίευτα δεδομένα) δεν εμφανίζεται αποτέλεσμα σε μία συσσώρευση των κυττάρων στο G2 /M εξέλιξη

DOI.: 10.1371 /journal.pone.0000959.s001

(4,75 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Πλευρική θέα in situ υβριδισμού των νευρικών δεικτών κορυφής στον έλεγχο και ΙΝΤ6 morphants, αποκαλύπτοντας καμία αλλαγή στον αριθμό κυττάρων ή η μετανάστευση, όπως υποδεικνύεται από το φαινομενικά φυσιολογική έκφραση της dlx2 (στάδια 6-36 HPF, εξετάζονται σε διαστήματα δύο ωρών), ούτε πρώιμους δείκτες της NCC και μελανοκυττάρων, όπως sox10, crestin, σαλιγκάρι και mitfa (24 HPF) σε ΙΝΤ6 morphants. Αυτές οι παρατηρήσεις επεκτάθηκαν με εξέταση ενός διαγονιδιακού γραμμής sox10-GFP (1) αποκαλύπτοντας αναλλοίωτη GFP που εκφράζουν NC-προερχόμενα κύτταρα σε ΙΝΤ6 morphants εντός του πρώτου 48 HPF, αλλά η απώλεια της GFP έκφρασης διαφοροποιημένων αψίδες φαρυγγικό 3-7 από 3 dpf ( τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0000959.s002

(40.41 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S3.

Ανάπτυξη των τόξων του φάρυγγα στον αναπτυσσόμενο ελέγχου (Α-Γ) και (Δ-ΣΤ) ΙΝΤ6 morphant ζώα. Σημειώστε την απώλεια των τόξων του φάρυγγα (Α, βραχίονα) στις ΙΝΤ6 morphants (βραχίονα). Οι τομές χρωματίστηκαν με κυανό του μεθυλενίου. Πρόσθια προς τα αριστερά

doi:. 10.1371 /journal.pone.0000959.s003

(14.09 MB ΔΕΘ)

Εικόνα S4.

Ανοσοϊστοχημεία των ΙΝΤ6 και φωσφο-ΕΚΚ χρώση σε 4 έμβρυα dpf. (Α, Β) Ενώ ΙΝΤ6 και φωσφο-ΕΚΚ αλληλεπικάλυψη στην κρανιοπροσωπικών περιοχή σηματοδότησης, έχουν επίσης διαφορετικά πρότυπα, για παράδειγμα στα μάτια και (C, D) του εντέρου. Σημειώνουμε ότι ενώ ΙΝΤ6 και φωσφο-ΕΚΚ έχουν επικαλυπτόμενες περιοχές της έκφρασης στην κρανιοπροσωπικού περιοχή, ΙΝΤ6 χρώση στο κρανιοπροσωπικό περιοχή ήταν ισχυρότερη από ό, τι φωσφο-ΕΚΚ, και χρώση φωσφο-ΕΚΚ περιορίστηκε σε συγκεκριμένους ιστούς στο εσωτερικό του κρανιοπροσωπικού περιοχή. Μ, του Meckel? Ε: Ethmoid πλάκα? CH, ceratohyal? CB, ceratobrancial. Οβελιαία τομή, πρόσθια προς τα αριστερά

doi:. 10.1371 /journal.pone.0000959.s004

(17.60 MB ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Είμαστε ευγνώμονες στον Ν Hopkins , Α Άμστερνταμ και S. Farrington για το

ΙΝΤ6

hi2470

γραμμή? R. Marais και C. Marshall για CI-1040? Δ Raible για κατασκευάσματα DNA? Κ Gull για αντισώματα αντι-τουμπουλίνης? Ε Prichard για πρόσθετες παρατηρήσεις CI-1040? Δ Faratian για βοήθεια σχετικά με ανοσοϊστοχημεία? Β Morgan για βοήθεια σχετικά με χειρόγραφο προετοιμασία? Λ Poulton για κριτική ανάγνωση του χειρογράφου? και Ν Hastie και D. Harrison για τις χρήσιμες συζητήσεις.