Αφηρημένο

Εμείς πρόσφατα ανέφερε ότι δύο διμερή αρτεμισινίνη προέρχεται (διμερές πρωτοταγή αλκοόλη 606 και διμερές σουλφόνη 4 -καρβαμικό 832-4) είναι σημαντικά πιο ισχυρή στην αναστολή του ανθρώπινου κυτταρομεγαλοϊού (CMV) αντιγραφή από μονομερή αρτεμισινίνης προέλευσης. Στη συνεχιζόμενη αξιολόγηση μας από τις δραστηριότητες της artemisinins αναστολή CMV, χρησιμοποιήθηκαν δώδεκα αρτεμισινίνη προέρχεται διμερή και πέντε μονομερή αρτεμισίνη προέρχεται. Διμερή ως ομάδα βρέθηκαν να είναι ισχυροί αναστολείς της αντιγραφής του CMV. Σύγκριση της αναστολής CMV και την παράμετρο κλίση διμερών και μονομερών δείχνουν ότι διμερή είναι διακριτές σε αντι-CMV δραστηριότητές τους. Ένα διμερές δεοξυ (574), που δεν έχει την γέφυρα ενδοϋπεροξειδίου, δεν είχε καμία επίδραση επί της αντιγραφής CMV, προτείνοντας ένα ρόλο για τη γέφυρα ενδοϋπεροξειδίου αναστολή CMV. Οι διαφορές στην αντι-CMV δραστικότητα παρατηρήθηκαν μεταξύ των τριών δομικών αναλόγων του διμερούς σουλφόνη 4-καρβαμικό 832-4 που δείχνει ότι η ακριβής τοποθέτηση και η οξείδωση κατάσταση του ατόμου θείου μπορεί να συμβάλει στην δραστικότητα του αντι-CMV. Όλων των ελεγχθέντων διμερή, αρτεμισινίνη προέρχονται φωσφορικός διφαινυλεστέρας διμερές 838 αποδείχθηκε ότι είναι ο πλέον ισχυρός αναστολέας της αντιγραφής του CMV, με δείκτη εκλεκτικότητα περίπου 1.500, σε σύγκριση με προηγουμένως αναφερθείσες διμερές σουλφόνη μας 4-καρβαμικού 832-4 με δείκτη εκλεκτικότητα περίπου 900. διφαινυλο διμερές φωσφορικό 838 ήταν ιδιαίτερα δραστική έναντι ενός στελέχους CMV Ganciclovir ανθεκτικά και ήταν επίσης ο πιο ενεργός διμερές σε αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων. Έτσι, φωσφορικό διφαινυλαιθέρες διμερές 838 μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα προβάδισμα για την ανάπτυξη ενός εξαιρετικά ισχυρή και ασφαλή ένωση αντι-CMV

Παράθεση:. Αυτός R, Mott BT, Rosenthal AS, Γέννα DT, Posner GH, Αράβ-Boger R (2011) Μια αρτεμισινίνη-Προέρχεται διμερές έχει πολύ ισχυρό αντι-κυτταρομεγαλοϊός (CMV) και Anti-Cancer Δραστηριότητες. PLoS ONE 6 (8): e24334. doi: 10.1371 /journal.pone.0024334

Επιμέλεια: Kim D. Janda, Το Ερευνητικό Ινστιτούτο Scripps, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 1 Ιουνίου 2011? Αποδεκτές: 6 του Αυγούστου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 31 Αυγούστου, 2011

Copyright: © 2011 Ο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Υποστηρίζεται από ΝΙΗ AI 34885 (GHP), ΝΙΗ KO8 AI074907, ΝΙΗ 1R01AI093701 και τον Μάρτιο του Dimes 6 FY11 268 (RAB). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η μόλυνση με CMV, ένα μέλος της οικογένειας του ιού του έρπητα, είναι κοινή στους ανθρώπους. τα ποσοστά οροθετικότητας αυξάνουν με την ηλικία, φθάνοντας το 90% σε άτομα μεγαλύτερα των 80 ετών [1]. Ο ιός θεσπίζει τη διά βίου επίμονη λοίμωξη, η οποία παραμένει συνήθως ασυμπτωματική. Σε ανοσοκατεσταλμένους ξενιστές όπως λήπτες μοσχευμάτων και σε ασθενείς με AIDS, λοίμωξη CMV συνδέεται με σημαντική νοσηρότητα και θνησιμότητα [2], [3]. CMV είναι επίσης η πιο κοινή εκ γενετής-λοίμωξη που προκαλεί νοητική υστέρηση και κώφωση σε εκ γενετής μολυσμένα παιδιά [4]. Πρόσφατα, η ανίχνευση CMV σε ανοσοεπαρκή άτομα έχει συνδεθεί με τα αποτελέσματα αρκετών συνδρόμων συμπεριλαμβανομένης της σήψης, πνευμονικών επιπλοκών σε ασθενείς στη μονάδα εντατικής θεραπείας μονάδες, και σε έναν όγκο στον εγκέφαλο, πολύμορφο γλοιοβλάστωμα [5] – [7]. Αν και ο άμεσος ρόλος του CMV σε αυτά τα σύνδρομα είναι ασαφής, αντιγραφή του ιού μπορεί να συμβάλλει στην φυσική τους ιστορία, και ο ρόλος της θεραπείας με αντι-CMV σε αυτές τις συνθήκες επί του παρόντος υπό διερεύνηση.

Το διαθέσιμο συστημική αντι-CMV φάρμακα πράξη με στόχο το ιικό DNA πολυμεράση. Οι ενώσεις αυτές καταστέλλουν αποτελεσματικά την αντιγραφή του CMV, αλλά η χρήση τους συνδέεται με σημαντική τοξικότητα στο μυελό των οστών (Ganciclovir-GCV) και των νεφρών (Foscarnet και Cidofovir) [8], [9], καθώς και η εμφάνιση των μεταλλάξεων ανθεκτικών στα φάρμακα κατά τη διάρκεια της παρατεταμένης μαθήματα θεραπεία [9], [10]. Έτσι, νέες ενώσεις με χαμηλή τοξικότητα και ιδανικά με μια ξεχωριστή μηχανισμό CMV αναστολής χρειάζονται για τη θεραπεία CMV.

Η αρτεμισινίνη προέρχεται μονομερούς artesunate αρχικά αναφέρθηκε ότι αναστέλλει την αντιγραφή του CMV

in vitro

και

in vivo

[11], [12]. Πρόσφατα, αναφέρθηκε σε δύο διμερή αρτεμισινίνη προκύπτει με σημαντικά πιο ισχυρή δραστικότητα έναντι αντιγραφής CMV

in vitro

σε σύγκριση με μονομερή αρτεμισινίνη προέρχεται [13]. μονομερή αρτεμισίνη είναι επί του παρόντος τα φάρμακα επιλογής για τη θεραπεία της ελονοσίας [14]. Επιπλέον, και οι δύο μονομερή αρτεμισινίνη και διμερή έδειξαν να έχουν δραστηριότητες αντικαρκινική [15] – [17]. Η ισχυρή αντι-ΟΜν δύο αρτεμισινίνη προέρχονται διμερή [13] μας ώθησε να αξιολογήσει μια σειρά από πρόσφατα συντεθεί αρτεμισινίνη προέρχονται διμερή. Έχουμε υποβάλει έκθεση σχετικά με τις δραστηριότητες αντι-CMV και αντι-καρκίνου από τις πιο ισχυρές ενώσεις στην παρούσα έρευνα.

Αποτελέσματα

Μια σύγκριση των αντι-CMV, της 17ης παράγωγα αρτεμισινίνης

Έχουμε αναφερθεί στο παρελθόν για την αντι-CMV δραστηριότητα των τεσσάρων μονομερών αρτεμισινίνη (αρτεμισινίνη, artesunate, artemether και artefanlide) και δύο διμερή αρτεμισινίνη προέρχεται (διμερές πρωτοταγή αλκοόλη 606 και διμερές σουλφόνη 4-καρβαμιδικό 832 – 4) [13]. Τώρα δοκιμάζεται ένα νέο αρτεμισινίνη προέρχεται μονομερές και 10 επιπλέον νέα διμερή αρτεμισινίνη προέρχεται και σύγκριση αντι-CMV δραστηριοτήτων τους με εκείνες των προηγουμένως εξετασθέντων ενώσεων. Οι συντομογραφίες των 17 ενώσεων και τα μοριακά βάρη τους παρατίθενται στον Πίνακα 1. Στην παρούσα έκθεση, κάθε ένωση αναφέρεται από το μοριακό βάρος του. Για παράδειγμα, ένωση 606, αναφέρεται στο διμερές πρωτοταγή αλκοόλη, και 832-4 αναφέρεται σε διμερές σουλφόνη 4-καρβαμικό (Πίνακας 1). Σουλφόνη καρβαμιδικό 551 είναι η μονομερής εκδοχή της διμερούς σουλφόνης καρβαμιδικού 832 – 4. Η χημική δομή του διμερούς σουλφόνη 4-καρβαμικού 832-4 αποτρέπει από το να καταβολίζεται σε μονομερές σουλφόνη 4-καρβαμικού 551. Η ένωση 574, η οποία είναι η εκδοχή δεοξυ του 606, επιλέχθηκε για τη δοκιμή επειδή τα κατά της ελονοσίας και αντικαρκινικές δραστηριότητες του artemisinins είναι τουλάχιστον εν μέρει ενδοϋπεροξειδίου γέφυρα εξαρτώμενη [18], [19].

Η

Οι δύο προηγουμένως δοκιμαστεί διμερή αρτεμισινίνη προέρχονται είχε ισχυρή αντι-ΟΜν δραστικότητα σε συγκεντρώσεις 1 μΜ ή χαμηλότερη, ενώ οι αρτεμισινίνη προέρχονται μονομερή επιτευχθεί ένα παρόμοιο βαθμό αναστολής CMV μόνο σε συγκεντρώσεις υψηλότερες από 10 μΜ [13]. Με βάση αυτά τα δεδομένα, όλα τα νέα ενώσεις αρχικά σε διαλογή για δραστηριότητες αντι-CMV. Οι πιο δραστικές ενώσεις στη συνέχεια εξετάστηκαν λεπτομερώς για τις δραστηριότητές τους αντι-CMV. Όλα τα διμερή αρχικά αξιολογήθηκαν σε συγκεντρώσεις 1 μΜ, 0,3 μΜ και 0,1 μΜ. Η δεοξυ διμερές 574 και το μονομερές σουλφόνη καρβαμιδικό 551 ελέγχθηκαν σε 1 μΜ και 10 μΜ. Στο 1 μΜ, τα διμερή εμφανίζονται ισχυρή αναστολή της έκφρασης των όψιμων γονιδίων pp28 (το οποίο συσχετίζεται με υψηλά μείωση πλακών) [20] μετράται με δραστικότητα λουσιφεράσης, αλλά η δεοξυ διμερές 574 και το μονομερές σουλφόνης καρβαμικό 551 δεν το έκανε (Εικ. 1Α). Αρκετές διμερή ήταν επίσης αποτελεσματικά σε 0,3 μΜ, αλλά μόνο δύο διμερή, σουλφόνη 4-καρβαμικού 832-4 και φωσφορικό διφαινυλεστέρα 838, ήταν εξαιρετικά ανασταλτικά κατά 0,1 μΜ. Τρία δομικά ανάλογα σουλφόνης 832-4 συντέθηκαν (832-3, 800-3 και 800-4) μεταβάλλοντας την κατάσταση οξείδωσης και τη θέση του ατόμου θείου επί του αρωματικού δακτυλίου (σχ. 1Β). Αν και η μετα-σουλφίδιο (800-3), μετα-σουλφόνη (832-3), και παρα-σουλφίδιο (800-4) ήσαν δραστικές έναντι αντιγραφής CMV σε 0,3 μΜ, σε αντίθεση με παρα-σουλφόνη 832-4 δεν ήταν δραστικές στα 0.1 μΜ (Εικ. 1Α). Ως εκ τούτου, η ακριβής τοποθέτηση και η οξείδωση κατάσταση του ατόμου θείου συμβάλλει στην αντι-CMV δραστικότητα του

Α:. Σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης των διμερών artemsinin προερχόμενων (αριστερά), δεοξυ διμερές 574, και μονομερή αρτεμισινίνη (δεξιά) . Μολυσμένα και κατεργάστηκε ΟΔΠΣ συλλέχθηκαν 72 hpi και πλύθηκαν μία φορά με PBS. Τα προϊόντα λύσης εξετάστηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης χρησιμοποιώντας δοκιμασία λουσιφεράσης Kit (Promega, Madison, WI). B. Χημική δομή των αναλόγων του διμερούς σουλφόνη 4-καρβαμικού 832-4. Απεικονίζονται δύο ανάλογα σουλφίδιο καρβαμικού (800-3 και 800-4) και μία σουλφόνη 3-καρβαμικό ανάλογο (832 – 3) σουλφόνης 4-καρβαμικού 832-4. C: Η κυτταροτοξικότητα των δέκα αρτεμισινίνη διμερή και πέντε αρτεμισινίνη μονομερή στην ΕΠΟ. HFFS αντιμετωπίζονται με διμερή /μονομερή στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις συλλέχθηκαν στις 72 και πλύθηκαν μία φορά με PBS. Τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν για την βιωσιμότητα των κυττάρων χρησιμοποιώντας CellTiter-Glo φθορισμού κυττάρων Βιωσιμότητας κιτ δοκιμασίας επί + Detection System GloMax®-Πολλαπλών (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Η

επόμενο διαλογή για την κυτταρική τοξικότητα των διμερών και μονομερή χρησιμοποιώντας προσδιορισμό κυττάρων Βιωσιμότητα CellTiter-Glo φθορισμού σε συγκεντρώσεις 10 μΜ, 50 μΜ και 100 μΜ. Για τα περισσότερα διμερή (εκτός 644 και 760), 50% κυτταρική κυτταροτοξικότητα (CC

50) κυμαίνονταν από 50 έως 100 μΜ (Εικ. 1 C). Μονομερή εμφανίζονται συνολικά παρόμοιο μοτίβο κυτταροτοξικότητα, αλλά ήταν σημαντικά περισσότερο τοξικό από διμερή στα 100 μΜ (Ρ = 0,03 με δύο ουρών t-test). Διμερή 832-4 και 838 είχε την καλύτερη δείκτης επιλεκτικότητας (SI), που είναι ο λόγος του CC

50 έως ΕΚ

50, και επομένως επιλέχθηκαν για περαιτέρω λεπτομερή ανάλυση των αντι-CMV δραστικότητα.

σχέση δομής δραστικότητας και της τοξικότητας των κυττάρων των διμερών 832-4 και 838 και η μητρική διμερή τους 760 και 606

Μια λεπτομερής σύγκριση των αντι-CMV δραστικότητα και τοξικότητα στα κύτταρα μη πρωτοπαθή καρκίνο του HFF ήταν επόμενο πραγματοποιήθηκε με οι πιο ισχυροί διμερή, 832-4 και 838 (Σχ. 2Α). Μία δοσοεξαρτώμενη αύξηση των αντι-CMV δραστικότητα παρατηρήθηκε από 0,01 μΜ έως 1 μΜ και για τους δύο διμερή 832 έως 4 και 838 (σχ. 2Β, πίνακας 2). Cellular τοξικότητες, που μετράται σε 1 μΜ έως 100 μΜ (Πίνακας 2), δεν παρατηρήθηκαν σε συγκεντρώσεις της πλήρους αναστολής CMV. Το ΕΚ

50, CC

50 και SI φαίνονται στο Σχ. 2Β και στον Πίνακα 2. διμερή 832-4 και 838 είχαν ένα υψηλό SI, αλλά 838 ήταν το καλύτερο ένωση. Οι μητρικές αλκοόλες από τις οποίες συνετέθησαν 832-4 και 838, 760 και 606, αντίστοιχα, ήταν λιγότερο αποτελεσματικά από ό, τι τα παράγωγα τους σε αναστολή CMV. Για το ζεύγος 606-838 η διαφορά στο SI ήταν 5-φορές, καθώς και για την 760-832-4 ζεύγος, 30 φορές (2Α Σχ., 2Β). Αν και η σουλφόνη διμερές 4-καρβαμικού 832-4 και το μονομερές σουλφόνη 4-καρβαμικό 551 έχουν πανομοιότυπα σουλφόνη 4-καρβαμικές λειτουργικές ομάδες (Εικ. 2Α), του διμερούς 832-4 ήταν τουλάχιστον 150 φορές πιο αποτελεσματικό στην αναστολή CMV από μονομερές 551.

Α: Χημικές δομές των δύο πιο ισχυρά αρτεμισινίνη προέρχεται διμερή 838 και 832-4 και το αντίστοιχο πατρικό τους αλκοόλες 606 και 760. μονομερές 551 απεικονίζεται στα αριστερά του διμερούς 832-4. Η σουλφόνη βενζυλικό μονάδα διμεθυλο καρβαμικού είναι η ίδια σε μονομερές 551 όπως στο διμερές 832 – 4. Ως εκ τούτου, η ενισχυμένη αντι-CMV δραστικότητα του διμερούς 832-4 πάνω από 551 μονομερές δεν οφείλεται σε οποιαδήποτε διαφορά στο τμήμα σουλφόνη καρβαμικού του μορίου. Β: Λεπτομερής αντι-CMV δραστικότητα των διμερών 832-4 και 838, και οι αντίστοιχες μητρικές τους ενώσεις 760 και 606. CMV μολυσμένα HFF υπέστησαν αγωγή με διμερή 832-4 και 838 στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. 72 δραστικότητα λουσιφεράσης hpi προσδιορίστηκε στα προϊόντα λύσης των μολυσμένων κυττάρων. Λουσιφεράσης τιμές αντιπροσωπεύουν την μέση και SD των δεδομένων που προκύπτουν από τουλάχιστον τέσσερα ανεξάρτητα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν. Η τοποθέτηση εργαλειοθήκη καμπύλη, το λογισμικό Matlab (v7.5), Mathworks (Natick, ΜΑ) χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό ΕΚ

50 τιμές χρησιμοποιώντας τεσσάρων παραμέτρων λογιστικής παλινδρόμησης.

Η

Αναστολή της GCV-ανθεκτικό στέλεχος CMV από διμερή 832-4 και 838

Είμαστε αξιολόγησε την αναστολή της GCV-ανθεκτικό στέλεχος (ΕΚ

50 GCV = 7,6 μΜ) από διμερή 832-4 και 838 χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία μείωσης πλάκας. Διμερή 832-4 και 838 εφαρμόστηκαν σε μολυσμένα κύτταρα σε συγκέντρωση 0.1 μΜ? GCV εφαρμόστηκε στα 5 μΜ και 30 μΜ. Είκοσι μία ημέρες μετά τη μόλυνση, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και οι πλάκες μετρήθηκαν σε κάθε συνθήκη (Εικ. 3). Διμερή 832-4 και 838 πλήρως ανέστειλε το σχηματισμό πλάκας στα 0,1 μΜ, ενώ το στέλεχος αυτό έδειξε μια προφανή αντίσταση στη GCV στα 5 μΜ.

Μια δοκιμασία μείωσης πλάκας χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της αναστολής του GCV ανθεκτικών CMV. CMV μολυσμένα HFF υπέστησαν αγωγή με 832-4, 838 και GCV στις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις. Οι πλάκες μετρήθηκαν 21 ημέρες μετά την μόλυνση.

Η

κλίσεις των καμπυλών απόκρισης δόσης αντι-ΟΜν των δοκιμαζόμενων ενώσεων αντι-CMV

Μια κλασική περιγραφή των σχέσεων δόσης-απόκρισης είναι η διάμεσος μοντέλο επίπτωση βάσει μαζική δράση δείχνει ότι [21]: σε αυτή τη λειτουργία, είναι το ποσοστό του ανέστειλε κλάσμα ιούς, ή το ποσοστό αναστολής,

D

είναι η συγκέντρωση του φαρμάκου,

ΕΚ

50

είναι η συγκέντρωση φαρμάκου που επιτυγχάνει 50% της μέγιστης ανασταλτικής επίδρασης και

m

είναι μια παράμετρος κλίση της καμπύλης μαθηματικά. Η επίδραση της παραμέτρου κλίσης για αντι-HIV αξιολογήθηκε πρόσφατα, και απέδειξε ότι είναι ένα χαρακτηριστικό της κατηγορίας των ναρκωτικών και μια κρίσιμη διάσταση παράμετρο στην ανάλυση της αντι-ιική δράση [21].

Έχουμε εφαρμόσει αυτό το μοντέλο για να παράγωγα μας και υπολογίζεται η παράμετρος κλίση από τα πιο ισχυρά διμερή (832-4 και 838), GCV, και αρτεμισινίνη προερχόμενο μονομερές artesunate (Πίνακας 2). Σε σύγκριση με GCV και artesunate, η οποία είχε ένα αντι-CMV

m

αξίας περίπου 1, το

m

τιμές 832-4, 838, 760 και 606 ήταν περίπου 4, μια ένδειξη ότι οι ενώσεις αυτές είναι ένας πολύ ισχυρός κατηγορία αντι-CMV ενώσεων.

Αναστολή της ανάπτυξης καρκινικών κυττάρων από διμερή 832-4 και 838

μονομερή αρτεμισίνη προερχόμενο και αρκετά διμερή έχουν αναφερθεί ότι αναστέλλουν την ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών καρκίνου του [16], [17]. Τέσσερα διμερή (832-4, 838, 760 και 606), δύο μονομερή (artesunate και artefanilide) και GCV εφαρμόσθηκαν σε τρία καρκινικές κυτταρικές σειρές: HeLa (τραχηλικό αδενοκαρκίνωμα), HCT116 (καρκίνωμα του παχέος) και 1205Lu (μελάνωμα) σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0,01 μΜ έως 1 μΜ. δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη 72 ώρες μετά τη θεραπεία και CC

50 της κάθε ένωσης σε κάθε κυτταρική σειρά καρκίνου υπολογίστηκε (Πίνακας 3). Η CC

50 κάθε ένωσης σε καρκινικά κύτταρα συγκρίθηκε με το CC

50 σε μη καρκινικά κύτταρα HFF πρωτογενή. Όλα τα διμερή ήταν σημαντικά πιο δραστική από μονομερή στην αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυτταρικών γραμμών. Για παράδειγμα, το διμερές 838 ήταν τουλάχιστον 200 φορές πιο ισχυρό στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων HCT116 και 1205Lu και 37 φορές πιο ισχυρό στην αναστολή της ανάπτυξης των κυττάρων HeLa, σε σύγκριση με artesunate, το πιο ισχυρό μονομερούς σε αυτή τη δοκιμασία. Μια ποιοτική συσχέτιση παρατηρήθηκε μεταξύ του αντι-CMV δραστικότητα και την αντικαρκινική δράση μεταξύ των τεσσάρων διμερή (838, 832-4, 606 και 760)? διμερές 838, το πιο ισχυρό από όλα τα δοκιμασμένα διμερών κατά την αντιγραφή του CMV, είχε επίσης την ισχυρότερη επίδραση στην αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων.

Η

Συζήτηση

Αναφέρουμε εδώ σχετικά με την αντι-CMV δραστηριότητα δέκα νέων αρτεμισινίνη προέρχονται διμερή, ένα διμερές δεοξυ και ένα νέο μονομερές αρτεμισινίνη, και τον προσδιορισμό της πλέον ισχυρός αντι-CMV διμερές. Η ενισχυμένη αντι-CMV δραστικότητα των διμερών, σε σύγκριση με τα μονομερή δεν ήταν αποτέλεσμα της αυξημένης cytotoxcity αλλά μάλλον ένα συγκεκριμένο αντι-ΟΜν δράση. Οι δύο πιο πολύ ισχυρός διμερή ήταν αποτελεσματικές στην αναστολή του στελέχους Towne εργαστήριο προσαρμοσμένο καθώς και ένα GCV-ανθεκτικό στέλεχος. Είχαν επίσης αποδειχθεί ότι έχει την ισχυρότερη ανασταλτική δράση επί της ανάπτυξης καρκινικών κυτταρικών γραμμών.

Όλα τα διμερή επέδειξαν ισχυρή αναστολή CMV σε 1 μΜ. Ωστόσο, μόνο δύο ενώσεις (832-4 και 838) θα μπορούσαν να επιλεγούν ως πολύ ισχυρός αντι-CMV παράγοντες που βασίζονται στην υψηλή αναστολή CMV τους στα 0.1 μΜ και χαμηλή κυτταροτοξικότητά τους. Σε αυτή τη συγκέντρωση, οι άλλες διμερή είτε είχαν καμία αναστολή ή το πολύ 40% αναστολή της έκφρασης λουσιφεράσης, ενώ GCV δεν είχε καμία αναστολή καθόλου.

παράγωγα αρτεμισινίνης αναπτύχθηκαν αρχικά ως φάρμακα κατά της ελονοσίας, αλλά αργότερα ήταν επίσης βρέθηκαν να έχουν πρόσθετες φαρμακολογικές δράσεις όπως αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων και η αναστολή της αντιγραφής του CMV [12], [13], [22] – [25]. Το αν ή όχι αυτές οι νέες δραστηριότητες που σχετίζονται με την άλλη και δείχνουν έναν κοινόχρηστο μηχανισμό, η γέφυρα ενδοϋπεροξειδίου φαίνεται να είναι κρίσιμη σε όλες τις φαρμακολογικές δράσεις των παραγώγων αρτεμισινίνης.

Ως γενικευμένη παρατήρηση, τα διμερή ήταν σημαντικά πιο ισχυρές από τα μονομερή αναστολή CMV. Χρησιμοποιώντας το ΕΚ

50 τιμές

, διμερές 838 ήταν 165 φορές πιο ισχυρή από ό, τι artesunate σε αντι-CMV και SI της ήταν 134 φορές υψηλότερη σε σύγκριση με artesunate. Προς υποστήριξη αυτού του ευρήματος, το μοντέλο της παραμέτρου κλίσης απόκρισης δόσης που χρησιμοποιήθηκε πρόσφατα για να χαρακτηριστούν οι δραστηριότητες των ενώσεων κατά του HIV [21] έδειξε ότι τα διμερή είχε πολύ μεγαλύτερη κλίση από μονομερή. Γενικά, μία υψηλότερη κλίση συσχετίζεται με μία πιο έντονη αντι-ιική δράση. Αυτό θα μπορούσε να προέλθει είτε από πολύ υψηλή συνάφεια σύνδεσης προς ένα ενιαίο συνδετήρα ή από συνεταιρισμό επίδραση των πολλαπλών συνδετών με παρόμοια συγγένεια του φαρμάκου.

Αρκετές αντικαρκινικών παραγόντων (όπως οι αναστολείς της κινάσης) έχει αποδειχθεί ότι αναστέλλουν την αντιγραφή του CMV , αλλά σε γενικές γραμμές, οι συγκεντρώσεις που απαιτούνται για να επιτευχθεί η αναστολή CMV ήταν τοξικές για τα κύτταρα και απαγορεύεται η χρησιμοποίησή τους ως υποψηφίων αντι-ιικά [26]. Είναι ενδιαφέρον, Sorafenib, ένας αναστολέας πολλαπλών κινασών φαίνεται να αναστέλλει την αντιγραφή του CMV χωρίς συνδέονται κυτταρική τοξικότητα [27]. Τα διμερή που αναφέρονται εδώ παρεμπόδισε την ανάπτυξη των κυτταρικών σειρών καρκίνου και ήταν ισχυροί αναστολείς της αντιγραφής CMV χωρίς εμφανή κυτταρική τοξικότητα. Ως εκ τούτου, μπορεί να παρέχει μία νέα κατηγορία παραγόντων κατά του CMV, με μια ξεχωριστή μηχανισμό δράσης. Παρόμοια με την αντι-CMV δραστικότητα, τα διμερή ήταν επίσης πιο αποτελεσματικές από μονομερή αναστολή των καρκινικών κυττάρων. Οι μελλοντικές μελέτες μπορεί να αποκαλύψει αν η διπλή δραστηριότητες αντι-CMV και αντικαρκινικές διμερών προκύπτουν από ένα κοινό μηχανισμό δράσης. Εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι η αναστολή της αντιγραφής του CMV με παράγωγα αρτεμισινίνης εμφανίζεται νωρίς κατά τη διάρκεια του κύκλου αντιγραφής και περιλαμβάνει ένα μηχανισμό ο οποίος είναι διαφορετικός από τους αναστολείς πολυμεράσης DNA [28], [29]. Οι δραστηριότητες κατά του καρκίνου του artemisinins προταθεί να εμπλέξει διακοπή του κυτταρικού κύκλου, απόπτωση, ή /και της αγγειογένεσης [30], διεργασίες που επηρεάζονται επίσης από συγκεκριμένα γονίδια CMV, ως επί το πλείστον άμεσα πρώιμα γονίδια. . Μελλοντικές μελέτες θα αντιμετωπίσει τον μηχανισμό αναστολής CMV από διμερή αρτεμισινίνη προέρχεται και πιθανή επικάλυψη τους με ογκογόνο γεγονότα σηματοδότησης

Εν κατακλείδι, έχουμε δείξει ότι: 1). Διμερή είναι εντόνως δραστικές έναντι αντιγραφής CMV, και φωσφορικό διμερές διφαινυλεστέρα 838 είναι η πιο ισχυρή αναστολή CMV. 2). Η παράμετρος κλίση δόσης-απόκρισης διμερών είναι σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των μονομερών αρτεμισινίνης και GCV, μια πιθανή ένδειξη ότι διμερή είναι μια ξεχωριστή κατηγορία αντι-CMV ενώσεων. 3) διμερή είναι περισσότερο ισχυροί αναστολείς από μονομερή σε αμφότερες τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές και σε CMV.

Υλικά και Μέθοδοι

Ενώσεις

Ganciclovir (GCV) ελήφθη από τη Roche, USA . Όλα τα παράγωγα αρτεμισινίνης χρησιμοποιήθηκαν στη μελέτη αυτή συντέθηκαν στο Πανεπιστήμιο Johns Hopkins [17], [31] – [33]. Πρόσφατα συντέθηκε σουλφίδιο διμερές 3-καρβαμικό (800-3) και διμερές σουλφίδιο 4-καρβαμικό (800-4), καθώς και διμερές σουλφόνη 3-καρβαμικό (832 – 3) συντέθηκαν όπως περιγράφεται στο Υλικά S1. Αρτεμισινίνη προερχόμενο μονομερή και διμερή διαλύθηκαν σε διμεθυλοσουλφοξείδιο (DMSO) και τα αποθέματα 10 mM αποθηκεύτηκαν σε -80 ° C. Οι συνθετικές ενώσεις ήταν τουλάχιστον 98% καθαρή με βάση την φασματοσκοπία πρωτονίου NMR. Το ίδιο το DMSO ελέγχθηκε σε κύτταρα CMV μολυσμένα, και δεν είχε καμία αντι-ιική δράση [13].

Ιοί

Το στέλεχος Towne pp28-λουσιφεράσης κατασκευάστηκε όπως περιγράφεται προηγουμένως [ ,,,0],20]. Εν συντομία, ο ανασυνδυασμένος ιός που εκφράζει λουσιφεράση υπό τον έλεγχο του UL99 (pp28) όψιμο υποκινητή δημιουργήθηκε με εισαγωγή του γονιδίου αναφοράς μεταξύ του US9 και πλαισίων US10 ανοικτής ανάγνωσης (ORFs) στο γονιδίωμα Towne. Η έκφραση του pp28 -luciferase έντονα ενεργοποιείται 48-72 ώρες μετά τη μόλυνση (ΒΑΑ) και είναι σχεδόν εντελώς αναστέλλεται παρουσία αναστολέων της πολυμεράσης DNA όπως GCV και φοσκαρνέτη [20]. Έχουμε πρόσφατα ανέφεραν ότι το σύστημα αναφοράς pp28-λουσιφεράσης είναι ευαίσθητο, επαναλήψιμη και άκρως συσχετίζεται με μείωση πλακών [20]. Η ανθεκτικών στέλεχος ganciclovir (GCV) ελήφθη από έναν ασθενή με νόσο CMV. Έχει μια μετάλλαξη UL97 (H520Q) και μία ΕΚ

50 7,6 μΜ για GCV. Αυτή η κλινική απομόνωση που παρέχονται από τον κλινικό εργαστήριο ιολογίας χωρίς αναγνωριστικά που μπορούν να συνδεθούν με ένα συγκεκριμένο θέμα. Το Johns Hopkins Γραφείο Ανθρωπίνων Θέμα Research Board κριτική Θεσμικών προσδιορίζεται ότι η έρευνα αυτή πληροί τις προϋποθέσεις για τη χορήγηση απαλλαγής.

Cell Culture, μόλυνση από τον ιό και αντι-ιικές δοκιμασίες

ινοβλάστες ανθρώπινης ακροποσθίας (HFF) πέρασμα 12 -16 (ATCC, CRL-2088 ™) αναπτύχθηκαν σε κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό (Gibco, Carlsbad, CA) σε ένα 5% CO

2 επωαστήρα στους 37 ° C και χρησιμοποιήθηκε για λοιμώξεις με pp28-λουσιφεράσης Towne CMV ή το GCV-ανθεκτικό στέλεχος. Μία ημέρα πριν από τη μόλυνση με τον pp28-λουσιφεράσης, 4 × 10

4 κύτταρα HFF σπάρθηκαν σε κάθε ένα φρεάτιο πλακών καλλιέργειας ιστών 24 φρεατίων. Η μόλυνση πραγματοποιήθηκε σε πολλαπλότητα μόλυνσης 1 ΡΡΙΙ /κύτταρο (ΜΟΙ = 1). Μετά 90 λεπτά με τα πόδια προσρόφηση, μέσα που περιέχουν τον ιό απομακρύνθηκε και αντικαταστάθηκε με ϋΜΕΜ με 4% ορό εμβρύου μόσχου (Gibco, Carlsbad, CA) που περιέχουν ενώσεις αντι-ιικά. Η συγκέντρωση κάθε ένωσης υπολογίστηκε και ρυθμίστηκε σε όγκο, έτσι ώστε δεν ήταν σταθερή κατά τη διάρκεια του πειράματος.

Τα μολυσμένα και επεξεργασμένα κύτταρα HFF συλλέχθηκαν 72 hpi και πλύθηκαν μία φορά με PBS. Τα προϊόντα λύσης αναλύθηκαν για λουσιφεράση και η βιωσιμότητα των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα Λουσιφεράσης Assay Kit (Promega, Madison, WI) και CellTiter-Glo φθορισμού κυττάρων Βιωσιμότητα κιτ δοκιμασίας, αντίστοιχα, σε + Detection System GloMax®-Πολλαπλών (Promega) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ινοβλάστες ανθρώπινου πνεύμονα (HEL) πέρασμα 8-12 (ATCC, CCL-137 ™) αναπτύχθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. Μία ημέρα πριν από τη μόλυνση, 3 × 10

5 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο των πλακών καλλιέργειας ιστού των 12 φρεατίων. GCV ανθεκτικά CMV αραιώθηκε σε ϋΜΕΜ σε μια επιθυμητή συγκέντρωση η οποία έδωσε περίπου 100 πλάκες ανά φρεάτιο και προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο εις διπλούν. Οι πλάκες επωάστηκαν για 90 λεπτά με ανακίνηση κάθε 10 λεπτά? στη συνέχεια προστέθηκαν φάρμακα και μια μεθυλοκυτταρίνης επικάλυψη που εφαρμόζεται σε κάθε φρεάτιο. Μετά από επώαση για 21 ημέρες, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες και οι πλάκες μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο με μεγέθυνση 40 φορές.

Anti-Cancer Cells Δοκιμασία

HeLa (ανθρώπινο εγκεφαλικό αδενοκαρκίνωμα), HCT116 (Human ορθοκολικό καρκίνωμα) και κύτταρα 1205Lu (Human μελάνωμα) (όλα από την ATCC) διατηρήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου. 12-16 ώρες πριν από τη θεραπεία φαρμάκων, 3 × 10

3 έως 5 × 10

3 κύτταρα σπάρθηκαν σε κάθε φρεάτιο των πλακών καλλιέργειας ιστού 96 φρεατίων. Τα φάρμακα αραιώνονται σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% βόειο εμβρυϊκό ορό και στα κύτταρα. 72 ώρες μετά την αγωγή του φαρμάκου, 20 μΐ διαλύματος ΜΤΤ (5 mg /ml σε PBS) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, ακολουθούμενο από ανακίνηση των πλακών στις 150 rpm για 5 λεπτά και επώαση 4 ωρών (37 ° C, 5% CO

2). Τα μέσα απομακρύνθηκαν, ξηραίνεται πλακών και κάθε φρεάτιο επαναιωρήθηκε σε 100 μΙ ΜΤΤ φορμαζάνης /DMSO. Η απορρόφηση της κάθε φρεάτιο καταγράφηκε στα 560 nm σε + Detection System GloMax®-πολυ (Promega).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Υλικά S1.

1) Σύνθεση Διμερούς Sulfide 3-Καρβαμικούς 800-3. 2) Σύνθεση Διμερούς σουλφόνη 3-Καρβαμικό 832-3. 3) Σύνθεση Διμερούς σουλφίδιο 4-Καρβαμικό 800-4. 4) Σύνθεση δεοξυ-αρτεμισινίνη αλκοόλ 574. 5) Σύνθεση Μονομερούς Sulfone ΒενΕυλική διμεθύλιο Καρβαμικούς 551.

doi: 10.1371 /journal.pone.0024334.s001

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Michael Forman από το Τμήμα Παθολογίας, Johns Hopkins Ιατρικών Ιδρυμάτων, Βαλτιμόρη, Μέριλαντ, για την παροχή της GCV ανθεκτικό CMV.