Αφηρημένο

Micro RNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των μικρών, μη-κωδικοποίησης είδη RNA που παίζουν κρίσιμο ρόλο σε όλη την κυτταρική ανάπτυξη και ρύθμιση. πρότυπα έκφρασης miRNA ληφθεί από διάφορους τύπους ιστών συχνά επισημαίνουν την κυτταρική καταγωγή ενός ατόμου τύπου ιστού, και έτσι είναι μια πιο αναλλοίωτη σφραγίδα τύπου ιστού. Πρόσφατη εργασία έχει δείξει ότι αυτά τα σχέδια miRNA έκφρασης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ταξινόμηση των κυττάρων του όγκου, και ότι αυτή η ταξινόμηση μπορεί να είναι πιο ακριβή από την κατάταξη επιτυγχάνεται με τη χρήση προτύπων έκφρασης γονιδίου αγγελιοφόρου RNA. Μια πτυχή της miRNA βιογένεσης που καθιστά ιδιαίτερα ελκυστική ως βιοδείκτη είναι το γεγονός ότι διατηρούνται σε μια προστατευόμενη κατάσταση στον ορό και το πλάσμα, επιτρέποντας έτσι την ανίχνευση των προτύπων έκφρασης miRNA κατευθείαν από τον ορό. Αυτή η μελέτη επικεντρώνεται στην αξιολόγηση των προτύπων έκφρασης miRNA σε ανθρώπινο ορό για πέντε τύπους ανθρώπινου καρκίνου, του προστάτη, του παχέος εντέρου, των ωοθηκών, του μαστού και του πνεύμονα, χρησιμοποιώντας ένα παν-ανθρώπινο microRNA, υψηλής πυκνότητας μικροσυστοιχιών. Αυτή η πλατφόρμα μικροσυστοιχιών επιτρέπει την ταυτόχρονη ανάλυση όλων των ανθρωπίνων microRNAs είτε από φθορισμού ή ηλεκτροχημικά σήματα, και μπορεί να επανασχεδιαστεί εύκολα να συμπεριλάβει πρόσφατα εντοπίστηκαν miRNAs. Δείχνουμε ότι υπάρχουν επαρκή miRNAs είναι παρόντες σε ένα χιλιοστόλιτρο ορού για την ανίχνευση σχεδίων έκφρασης miRNA, χωρίς την ανάγκη για τεχνικές ενίσχυσης. Επιπλέον, είμαστε σε θέση να χρησιμοποιήσει αυτά τα πρότυπα έκφρασης να διακρίνει σωστά μεταξύ φυσιολογικού και του καρκίνου δείγματα ασθενών

Παράθεση:. Lodes MJ, Caraballo Μ, Suciu D, Munro S, Kumar Α, Β Anderson (2009) Ανίχνευση του Καρκίνου με ορό miRNAs σε ένα ολιγονουκλεοτίδιο Microarray. PLoS ONE 4 (7): e6229. doi: 10.1371 /journal.pone.0006229

Επιμέλεια: Alfredo Herrera-Estrella, Cinvestav, Μεξικό

Ελήφθη: 3 Φεβ 2009? Αποδεκτές: 4 Ιούνη του 2009? Δημοσιεύθηκε: 14 Ιουλίου του 2009

Copyright: © 2009 Lodes et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. CombiMatrix είναι μια εμπορική κερδοσκοπική εταιρεία, η οποία προβλέπεται χρηματοδότηση για τη μελέτη. Βασικά ερευνητές είναι υπάλληλοι της εταιρείας. Άδεια από νομικά και οικονομικά τμήματα της εταιρείας λήφθηκε για να υποβάλει τη δημοσίευση, και την άδεια από τους επόπτες λήφθηκε για να ξεκινήσει τη μελέτη. Επιστημονικό προσωπικό σχεδιασμένα τη μελέτη, συλλέγονται και αναλύονται τα δεδομένα και έγραψε το χειρόγραφο

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. CombiMatrix είναι μια εμπορική εταιρία για-κέρδους και των βασικών ερευνητών είναι υπάλληλοι της εταιρείας. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν άλλα ανταγωνιστικά συμφέροντα.

Εισαγωγή

Τα microRNAs (miRNA) είναι μονόκλωνα μόρια RNA περίπου 21-23 νουκλεοτίδια, τα οποία λειτουργούν στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφραση. Τα miRNAs εκφράζονται ως τμήμα της πρωτογενούς μεταγραφές με τη μορφή φουρκέτες με σήματα για dsRNA-ειδική διάσπαση νουκλεάσης από την ριβονουκλεάση Drosha σε συνδυασμό με ένα RNA-πρωτεΐνη δέσμευσης. Μετά το πρόδρομο miRNA απελευθερώνεται ως περίπου 70 nt RNA, μεταφέρεται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα από Exportin-5, και στη συνέχεια διασπάται από Dicer RNase III για να σχηματίσουν ένα δίκλωνο RNA. Dicer εκκινεί τον σχηματισμό του RNA επαγόμενη φίμωση σύμπλοκο (RISC), η οποία είναι υπεύθυνη για την γονιδιακή σίγηση παρατηρείται οφείλεται σε έκφραση miRNA και παρεμβολή RNA [1], [2], [3].

Τα microRNAs έχουν έχουν βρεθεί σε ιστούς και επίσης στον ορό και το πλάσμα, και άλλα σωματικά υγρά, σε σταθερή μορφή που προστατεύεται από ενδογενή δραστικότητα ριβονουκλεάσης (σε συνεργασία με RISC, είτε ελεύθερα στο αίμα ή σε εξωσώματα (ενδόσωμα προερχόμενο οργανίδια)). Μελέτες από Lu et al [4] απέδειξαν την σκοπιμότητα και χρησιμότητα της παρακολούθησης της έκφρασης των miRNAs σε ανθρώπινο καρκινικό ιστό. Βρήκαν ένα υψηλό επίπεδο διαφορετικότητας στην έκφραση των miRNAs σε όλη καρκίνους, και διαπίστωσε ότι περίπου 200 miRNAs θα μπορούσε να είναι αρκετή για να χαρακτηρίσει ανθρώπινων καρκίνων. Tam [5] προσθέτει ότι επειδή miRNAs λειτουργία ως διαχειριστές στο δίκτυο ρύθμισης γονιδίων, είναι διακριτή από άλλες βιοδείκτες επειδή έχουν ένα παθογόνο ρόλο στη διαδικασία της νόσου και δεν είναι υποπροϊόντα της κατάστασης της ασθένειας. Επειδή miRNAs λειτουργία με ειδική σύνδεση προς τους στόχους τους, πολυμορφισμοί (SNP) εντός της αλληλουχίας του miRNAs ή mRNAs στόχο τους μπορεί να οδηγήσει σε ασθένεια, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Αυτά τα miRNA-ειδική SNPs μπορούν να επηρεάσουν τον κίνδυνο της νόσου και μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τη διάγνωση αυτών των ασθενειών [6]. έχουν προβεί σε απορύθμιση miRNAs έχουν περιγραφεί από πολυάριθμους ανθρώπινους καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του μαστού, του πνεύμονα, του παχέος εντέρου, των ωοθηκών και του καρκίνου του προστάτη. Mitchell et al [7] διαπιστώθηκε ότι miRNAs προέρχονται από ιστό καρκίνου του προστάτη εισέλθουν κυκλοφορία και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάκριση των ασθενών με καρκίνο του προστάτη από υγιείς ελέγχους και καθιέρωσε μια προσέγγιση PCR με βάση το αίμα για την ανίχνευση του ανθρώπινου καρκίνου του προστάτη. Μια παρόμοια προσέγγιση χρησιμοποιήθηκε για την ανίχνευση miRNA ορού από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών [8]. Taylor και Gercel-Taylor [9] ερεύνησε τη χρήση του κυκλοφορούντος εξωσωμάτων στη διάγνωση του καρκίνου. Βρήκαν ότι η περιεκτικότητα miRNA των κυττάρων των ωοθηκών όγκου και κυκλοφορούν εξωσωμάτων ήταν παρόμοια και θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη διάκριση ασθενών με καρκίνο από ασθενείς με καλοήθη ασθένεια ωοθηκών και από φυσιολογικούς μάρτυρες.

miRNA υπογραφές από φυσιολογικών και καρκινικών ιστών έχουν χρησιμοποιηθεί για την ταξινόμηση διαφόρων τύπων καρκίνου και μπορεί επίσης να επιτρέψει κλινικούς ιατρούς για να καθορίσουν μια πορεία θεραπείας με βάση το αρχικό τύπο ιστού. Μπορεί επίσης να είναι δυνατή η χρήση προτύπων έκφρασης miRNA ως βιοδείκτη για την παρακολούθηση της επίδρασης της θεραπείας επί εξέλιξης του καρκίνου [2]. Επειδή προφίλ έκφρασης miRNA παράλληλα τις αναπτυξιακές προέλευση των ιστών, και επειδή σχετικά λίγοι miRNAs μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον τύπο αποτελεσματικά τους ιστούς, είναι δυνητικά ανώτερη από δείκτες αγγελιοφόρων RNA για τη διάγνωση του καρκίνου [4]. Το δυναμικό για τη χρήση των miRNAs ορού ως βιοδείκτες της νόσου και ως στόχοι των θεραπευτικών υπόσχεται [10], αφού αυτό θα σήμαινε μια μη επεμβατική, ακριβές τεστ για τον καρκίνο. Σε αυτή τη μελέτη, έχουμε αποδείξει ότι miRNAs ορού μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη διάκριση μεταξύ ορούς ασθενή με καρκίνο και φυσιολογικό ορό δότη, χρησιμοποιώντας μια απλή δοκιμασία μικροσυστοιχιών που δεν απαιτεί βήμα ενίσχυσης.

Αποτελέσματα

εξόρυξη Ορός microRNA

Έχουμε προσδιορίσει ότι μία επαρκής ποσότητα miRNAs είναι παρούσα σε λιγότερο από 1 ml ανθρώπινου ορού για την παραγωγή ενός ανιχνεύσιμου σήματος σε μία μικροσυστοιχία χρησιμοποιώντας φθορισμό ή ηλεκτροχημικής ανίχνευσης (ECD). Χρησιμοποιώντας ένα απλό πρωτόκολλο εκχύλιση με φαινόλη /χλωροφόρμιο, ανακτήσαμε περίπου 1.3 μg του RNA ορός από κάθε 800 μΙ ορού (μέσος όρος 18 δειγμάτων? Τυπική απόκλιση 0,3). Το προκύπτον πρότυπο έκφρασης miRNA θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για τη διάκριση μεταξύ ασθενών με καρκίνο και κανονικούς δότες.

Ο κατά προσέγγιση μέγεθος των μικρών RNAs που ανακτάται από πλάσμα προσδιορίστηκε με την απομόνωση μεγάλων θραυσμάτων RNA (χαμηλή συγκέντρωση αιθανόλης) και μικρά θραύσματα RNA (υψηλή συγκέντρωση αιθανόλης) χρησιμοποιώντας το κιτ απομόνωσης Invitrogen PureLink miRNA, μετά εκχύλιση με φαινόλη /χλωροφόρμιο και οξύ καθίζηση. Οι δύο κλασματώσεις μέγεθος RNA σημάνθηκαν με βιοτίνη (Mirus) και υβριδοποιήθηκε σε μικροσυστοιχία. Αποτελέσματα (δεν δείχνονται) έδειξαν ότι η συντριπτική πλειοψηφία των σήμα ήταν από το μικρό κλάσμα RNA, το οποίο ήταν παρόμοιο με το σήμα από το δείγμα un-κλασματώθηκαν.

μόλυνση DNA του εκχυλίζεται νουκλεϊνικού οξέος του ορού εξετάστηκε με σύγκριση του ένα εξαχθέν δείγμα που διασπάστηκε, και το ήμισυ σε κατεργασία με ϋΝάση Ι μετά από σήμανση των δύο επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων δειγμάτων με βιοτίνη και υβριδοποίηση σε διάφορους τομείς της ίδιας συστοιχίας 4 × 2K, πολύ μικρή διαφορά θα μπορούσε να θεωρηθεί μεταξύ επεξεργασμένων και μη επεξεργασμένων δειγμάτων (r

2 = 0.9 και 0.96, αντίστοιχα, για δύο αντίγραφα) υποδεικνύοντας ότι λίγο DNA μολύνει τα δείγματα (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ευαισθησία της ανάλυσης και της σταθερότητας

Η ευαισθησία της δοκιμασίας miRNA μας προσδιορίστηκε με την προσθήκη αραιώσεις ενός συνθετικού RNA ολιγονουκλεοτίδιο από την δοκιμασία μας κατά την εκχύλιση του ορού. Είχαμε τη δυνατότητα να ανιχνεύσει περίπου 4000 αντίγραφα του microRNAs ορού ανά μικρολίτρο ορού (Εικόνα 1). Αυτό το επίπεδο ανίχνευσης είναι παρόμοιο με αυτό που αναφέρθηκε στο Mitchell et al [7] για τον καρκίνο του προστάτη ειδικό microRNA miR-141 χρησιμοποιώντας δοκιμασίες TaqMan. μικροσυστοιχίες miRNA είναι σχετικά πιο ευαίσθητα από το κανονικό μικροσυστοιχίες έκφραση επειδή μικρά ολιγονουκλεοτίδια τείνουν να έχουν καλύτερη κινητική υβριδισμού από μεγαλύτερα μόρια RNA ή DNA. Για miRNAs, τόσο την προστασία τους από την πέψη από διάφορους κυτταρικούς παράγοντες, και το μικρό μέγεθος τους να συμβάλουν στην ανίχνευση τους στον ορό με μικροσυστοιχίες σε επίπεδα που είναι τόσο χαμηλά όσο αυτές που παρατηρήθηκαν με τις μεθόδους που θα μπορούσαν αλλιώς να θεωρούνται πιο ευαίσθητες.

RNA miRNA αναλόγου ολιγονουκλεοτίδια, σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται από 0 έως 40 εκατομμυρίων αντιγράφων ανά μικρολίτρο, εμπλουτίστηκαν σε 400 ul ορού μετά την προσθήκη του ρυθμιστικού διαλύματος RLT. RNA στη συνέχεια εξάγεται από τον ορό χρησιμοποιώντας εκχυλίσεις φαινόλης /χλωροφορμίου και μία καταβύθιση με αιθανόλη. Τα δείγματα στη συνέχεια επισημαίνονται και υβριδοποιήθηκε σε μια μικροσυστοιχία. Κάθετες μπάρες δείχνουν εντάσεις σήματος array για ειδικούς ανιχνευτές miRNA που αντιπροσωπεύει την ακολουθία άγριου τύπου (άγρια) και ανιχνευτές με δύο εσωτερικές μεταλλάξεις (mut) για (Α) κουπί