Αφηρημένο

Ιστορικό

Η ομεπραζόλη έχει πρόσφατα περιγραφεί ως διαμορφωτής της χημειοαντίσταση όγκου, αν και υποκείμενη μοριακοί μηχανισμοί παραμένουν αμφιλεγόμενα. Από όγκους του παγκρέατος είναι ιδιαίτερα χημειοθεραπεία, ένα λογικό βήμα θα ήταν να διερευνήσει τις φαρμακοδυναμικές, μορφολογικές και βιοχημικές επιδράσεις της ομεπραζόλης στην παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές σειρές.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Οι καμπύλες δόσης-αποτελέσματος της ομεπραζόλη, παντοπραζόλη, γεμσιταβίνη, 5-φθοριοουρακίλη και οι συνδυασμοί της ομεπραζόλης και 5-φθοριοουρακίλη ή γεμκιταβίνη δημιουργήθηκαν για τις παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές MiaPaCa-2, ASPC-1, Colo357, PancTu-1, PANC1 και Panc89. Αποκάλυψαν ότι η ομεπραζόλη ανέστειλε πολλαπλασιασμό κατά πάσα πιθανότητα μη τοξικές συγκεντρώσεις και ανέστρεψε τα φαινόμενα hormesis της 5-φθοροουρακίλης. Η ηλεκτρονική μικροσκοπία έδειξε ότι η ομεπραζόλη οδήγησε σε συσσώρευση phagophores και στις αρχές αυτοφαγοσώματα σε κύτταρα MiaPaCa-2 ASPC-1 και. Του σήματος μεταβάλλεται υποδεικνύοντας ανέστειλε πολλαπλασιασμό και προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο βρέθηκε με φασματοσκοπία NMR πρωτονίου και των δύο κυτταρικών γραμμών όταν υποβάλλονται σε επεξεργασία με ομεπραζόλη η οποία ταυτοποιήθηκε ενδοκυτταρικά. Ομεπραζόλη ρυθμίζει την οδό μεταφοράς λυσοσωμική όπως φαίνεται με ανάλυση στυπώματος Western της έκφρασης του LAMP-1, Καθεψίνη-D και β-COP σε lysosome- και Golgi σύμπλοκο που περιέχει τα κλάσματα κυττάρου. Ακριδίνης χρώση πορτοκάλι αποκάλυψε ότι η λειτουργία της αντλίας του vATPase δεν ανεστάλη ειδικά με ομεπραζόλη. Γονιδιακή έκφραση του γονιδίου LC3 autophagy σχετίζονται καθώς και Bad, MDR-1, Atg12 και ο vATPase αναλύθηκε μετά την επεξεργασία των κυττάρων με 5-φθοριοουρακίλη και η ομεπραζόλη και επιβεβαίωσε τα ανωτέρω αποτελέσματα.

Συμπεράσματα

υποθέτουν ότι η ομεπραζόλη αλληλεπιδρά με τις ρυθμιστικές λειτουργίες του vATPase χωρίς αναστολή της λειτουργίας της αντλίας του. Μία διαμόρφωση της οδού του λυσοσωματικής μεταφορά και αυτοφαγία προκαλείται σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα οδηγεί σε προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο. Αυτό μπορεί να παρακάμψει τους κοινούς μηχανισμούς αντίστασης του καρκίνου του παγκρέατος. Από ομεπραζόλη χρήση έχει ήδη καθιερωθεί στην κλινική πράξη τα αποτελέσματα αυτά θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε νέες κλινικές εφαρμογές

Παράθεση:. Udelnow Α, Kreyes Α, Ellinger S, Landfester Κ, Walther P, Klapperstueck T, et al. (2011) Η ομεπραζόλη αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό και διαμορφώνει Autophagy σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 6 (5): e20143. doi: 10.1371 /journal.pone.0020143

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 24 Νοεμβρίου, 2010? Αποδεκτές: 26 Απρίλη του 2011? Δημοσιεύθηκε: May 24, 2011

Copyright: © 2011 Udelnow et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτοί οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Παρά την σχετική πρόοδο στη διάγνωση, εκτομή και τη χημειοθεραπεία, καρκίνο του παγκρέατος συνδέεται με μια μικρή επιβίωση [1]. Συστατική πολλαπλασιασμό και τη βαθιά αντίσταση στην απόπτωση είναι χαρακτηριστικά των κυττάρων του παγκρέατος όγκου τα καθιστά ιδιαίτερα ανθεκτικά σε κοινά χημειοθεραπευτικά στρατηγικές. Αρκετοί μηχανισμοί που είναι υπεύθυνοι για την αντίσταση απόπτωσης έχουν αναφερθεί, συμπεριλαμβανομένων μειορύθμιση προαποπτωτικών πρωτεϊνών, προς τα πάνω ρύθμιση του αντιαποπτωτικών πρωτεϊνών [2], [3], ενεργοποίηση διαφόρων κινασών όπως πρωτεϊνική κινάση C (PKC) /πρωτεϊνικής κινάσης D1 (ΡΚϋ1) και κινάση καζεΐνης 1 (CK1) [4] – [6], αυξημένη έκφραση διαφόρων microRNAs [7], μεταλλάξεις ρ53 και πολυμορφισμών mdm2 [8]. Ως εκ τούτου, τον προσδιορισμό των ουσιών οι οποίες είναι σε θέση να παρακάμψουν αυτούς τους μηχανισμούς θα ήταν πολύτιμη.

Πρόσφατα, ομεπραζόλη (OMP), καθιερώθηκε ως ένα παγκόσμιο πρότυπο φάρμακο για γαστρίτιδα και έλκος του δωδεκαδακτύλου από το 1980, έχει περιγραφεί ως δυναμικό ανασταλτικός παράγοντας και ένας διαμορφωτής αντίσταση τόσο in vitro όσο και σε ξενομοσχεύματος όγκους ποντικών [9], [10]. Περαιτέρω έρευνα έχει προτείνει ότι η αναστολή της αντλίας πρωτονίων κενοτοπική (vATPase), η οποία ρυθμίζει την λυσοσωματική ρΗ, ή συσσώρευση στα λυσοσώματα μπορεί να είναι τα κορυφαία μηχανισμών για ευαισθητοποίηση κυττάρων προς κυτταροστατική θεραπεία [9] – [12]. Επιπλέον, ο σχηματισμός αντιδραστικών ειδών οξυγόνου [9] και της συμμετοχής των p38 ΜΑΡΚ [13] έχει αναφερθεί ότι συνδέονται με κυτταρικές επιδράσεις ΟΜΡ που προκαλείται. Επιπλέον P-γλυκοπρωτεΐνη (Pgp) [14] και το κυτόχρωμα P450 2C19 ισομορφή [15] αιτία φαρμακοκινητικές αλληλεπιδράσεις του OMP με άλλα φάρμακα (π.χ. αντιβιοτικά, τα βαρβιτουρικά, κυτταροστατικά), τα οποία έχουν κλινική σημασία. Αυτά τα μέχρι τώρα δεδομένα δείχνουν πολύπλοκους μηχανισμούς που αφορούν, μεταξύ άλλων, το σύστημα λυσοσωμικού μεταφορών. Η συζήτηση για το αν και πώς OMP μπορεί να αναστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και να ενισχύσει κυτταροστατικά αποτελέσματα των κυτταροστατικών βρίσκονται σε εξέλιξη.

Μέχρι σήμερα, ούτε η ίδια ούτε από τους στόχους της το φάρμακο έχουν παρατηρηθεί άμεσα εντός των καρκινικών κυττάρων. Υπάρχει επίσης σχεδόν δεν υπάρχουν στοιχεία που περιγράφουν τη σχέση δόσης-επίδρασης των ΟΜΡ σε κύτταρα όγκου. Θα ήταν σημαντικό ενδιαφέρον αν αυτό το φάρμακο είναι αποτελεσματικό σε κλινικά εφαρμόσιμη συγκεντρώσεις. Επιπλέον, με τις γνώσεις μας, OMP δεν έχει ακόμη χρησιμοποιηθεί σε παγκρεατικά θεραπεία του καρκίνου, ακόμη και αν τα δεδομένα που λαμβάνονται σε ασθενείς με σύνδρομο Zollinger-Ellison δείχνουν ότι ΟΜΡ έχει ένα ευρύ θεραπευτικό εύρος και προκαλεί μόνο σπάνια και ήπιες παρενέργειες, ακόμη και σε υψηλότερες δόσεις [ ,,,0],16]. Αντίθετα, άλλοι ρυθμιστές αντίστασης όπως η βεραπαμίλη [17] ή βαφιλομυκίνης [18] είναι πολύ τοξικά για κλινική χρήση.

Λαμβάνοντας υπόψη το υψηλό χημειοαντίσταση των παγκρεατικών κυττάρων του όγκου, ένας από τους κύριους στόχους της μελέτης μας ήταν να προσδιορίσει είτε OMP θα ήταν αποτελεσματική σε παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές. Συνεπώς ερευνήσαμε τις μονοδιάστατης και δισδιάστατης σχέσεις δόσης-επίδρασης των ΟΜΡ μόνη της ή σε συνδυασμό με 5-fluorouracile (5-FU) ή γεμσιταβίνη (GEM) στις καλά χαρακτηρισμένο ανθρώπινο παγκρεατικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές MiaPaCa-2, ASPC-1 , Colo357, PANC1, Panc89 και PancTu1 in vitro [19] – [21]. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι οι μέσες ανασταλτικές συγκεντρώσεις (IC

50) της ΟΜΡ ήταν στο εύρος των κλινικών εφαρμοσιμότητα σε αυτές τις κυτταρικές γραμμές.

Για τους περαιτέρω έρευνες χρησιμοποιήθηκαν οι δύο κυτταρικές σειρές MiaPaCa-2 και ASPC -1, και, εκτός του OMP, κυτταροστατικής 5-FU, προκειμένου να αξιολογηθεί η ειδικότητα των επιδράσεων ΟΜΡ προκαλεί μέσα σε αυτές τις κυτταρικές σειρές.

Ερευνήσαμε τις υποκυτταρική και μοριακές μεταβολές σε MiaPaCa-2 και ASPC- 1 κύτταρα κατεργασμένα με ΟΜΡ. μετάδοσης ηλεκτρονίου μικροσκοπία (ΤΕΜ) και πρωτονίου φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού των βιώσιμων κυττάρων (φάσματα Ή-ΝΜΚ) διεξήχθησαν. Βρήκαμε ότι η διαμόρφωση της αυτοφαγία είναι ένα πρώιμο αποτέλεσμα των OMP. Επιπλέον, η ανάλυση των υποκυτταρικών κλασμάτων που περιέχουν λυσοσώματα και τα συμπλέγματα Golgi με ανάλυση Western blot και φασματοσκοπία NMR σε ακατέργαστα και επεξεργασμένα κύτταρα MiaPaCa-2 επιβεβαίωσε ότι λυσοσώματα είναι το κύριο ενδοκυτταρικό στόχο της OMP που οδηγούν σε αποτελέσματα σχετικά με τις οδούς ανακύκλωση των πρωτεϊνών και των μεταφορών, συμπεριλαμβανομένης της συγκρότημα Golgi .

Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ΟΜΡ ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο και πιθανώς σε μη τοξικές συγκεντρώσεις in vitro. OMP ενισχύει επίσης τα αποτελέσματα της 5-FU και GEM. Η οδός λυσοσωμικής μεταφοράς μεταβάλλεται κατά την αγωγή OMP και αυτοφαγία είναι, άμεσα ή έμμεσα, διαμορφωμένο. Έτσι, ΟΜΡ μπορεί να παρέχει μία νέα θεραπευτική προσέγγιση στη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος.

Αποτελέσματα

OMP αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος σε έναν δοσοεξαρτώμενο τρόπο και ενισχύει τις κυτταροστατικά αποτελέσματα της GEM και 5- FU

Οι καμπύλες δόσης-επίδρασης των OMP, παντοπραζόλη (PZL), GEM και 5-FU παρήχθησαν με τη χρήση της ΑΤΡ-βιοφωταύγεια δοκιμασία. Ένας από τους στόχους των ερευνών μας ήταν να αξιολογηθεί η κλινική εφαρμοσιμότητα των ΟΜΡ. Ως εκ τούτου, προσδιορίσαμε το IC

δεκαετίας του ’50 με την προσαρμογή των καμπυλών σε ένα log-logistic μοντέλο των τριών παραμέτρων. Το IC

50, απαριθμούνται στον πίνακα 1, κυμαίνονταν από 9-42 μg /ml για OMP, 22 – 99 μg /ml για PZL, 0,004 έως 0,24 μg /ml για GEM και 0,20 έως 0,57 μg /ml για 5- FU, ανάλογα με την κυτταρική γραμμή.

η

Αυτά δόσης-επίδρασης-καμπύλες (Σχήμα 1) έδειξε σταδιακή διαφορές sigmoidicity και άλλες φαρμακοδυναμικές παραμέτρους. Είναι προφανές ότι σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις των φαρμάκων ο αριθμός των κυττάρων μπορεί να είναι ακόμη υψηλότερη από την αντίστοιχη ομάδα ελέγχου (τιμές πάνω από 1 στην Εικόνα 1) υποδεικνύοντας μία διεγερτική δράση ανάπτυξης. Το φαινόμενο αυτό, που ονομάζεται hormesis, η οποία ορίζεται ως μια overcompensatory απόκριση των ζωντανών οργανισμών σε διάφορους παράγοντες στρες [22], μπορεί να ευθύνεται για την ανάπτυξη αντίστασης κατά τη διάρκεια της χημειοθεραπείας [23].

ASPC-1, MiaPaCa-2, Colo -357, Panc-1, Panc-89 και PancTu-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε απουσία ή παρουσία των αναφερομένων συγκεντρώσεων της ομεπραζόλης, 5-fluorouracile, η παντοπραζόλη ή γεμσιταβίνη, αντίστοιχα, για 4 ημέρες για να προσδιοριστεί η IC

50 αξίες. Το IC

50 ες και οι sigmoidicities σταδιακά διαφέρει μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις παρατηρήθηκε ελαφρά αύξηση-διεγερτική δράση (hormesis).

Η

Γι ‘αυτό ερεύνησε τις επιπτώσεις της OMP όταν συνδυάζεται με κυτταροστατικά σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις, προκειμένου να αξιολογηθεί ο ρόλος του στην χημειοαντίσταση και hormesis ξεπεραστούν . Πρόσθετη, συνεργιστικών ή ανταγωνιστικών αμοιβαία αλληλεπίδραση των δύο φαρμάκων μπορεί να ποσοτικοποιηθεί εντός της οιονεί γραμμική περιοχή των δόσης-επίδρασης-καμπύλες χρησιμοποιώντας την αρχή του μέσου αποτελέσματος των Chou [24] ή της ενιαίας απόκριση επιφάνεια Greco et al. [25]. Ωστόσο, οι αλληλεπιδράσεις του συνδυασμού φαρμάκων είναι δύσκολο να ποσοτικοποιηθεί για hormetic δόσης-απόκρισης σχέσεων [26]. Υπάρχουν διάφορα μοντέλα για την εκτίμηση hormesis για ένα ενιαίο θεραπείας από τα ναρκωτικά [27], [28].

Ο Πίνακας 2 δείχνει την ανεπηρέαστη κλάσμα (στ

u), το οποίο είναι το κύτταρο μετράνε που σχετίζονται με τον έλεγχο, κατά την χαμηλές συγκεντρώσεις της 5-FU και GEM, όταν χρησιμοποιείται σαν απλούς παράγοντες. Σε ASPC-1, παρατηρήθηκαν Panc-1 και PancTu-1 κύτταρα σημαντικές αυξήσεις της f

υ άνω 1 κατόπιν 5-FU, υποδεικνύοντας hormesis. Αντίθετα δεν υπήρχε σημαντική hormesis κατά GEM. Όταν ΟΜΡ προστίθεται στο 5-FU σε αυτές τις συγκεντρώσεις, η hormesis μετριάζεται στην ASPC-1, Panc-1 και PancTu-1 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2). Σε κύτταρα MiaPaCa-2 ο ΟΜΡ και 5-FU συνδυασμός έδειξε αθροιστικών επιδράσεων, στην κυτταρική σειρά Panc-89 ΟΜΡ οδήγησε σε ανταγωνιστική αλληλεπίδραση. Σε Colo357 κύτταρα δεν δόσης-επίδρασης-καμπύλη θα μπορούσε να δημιουργηθεί λόγω των μεγάλων τυπικά σφάλματα. GEM και OMP έδειξε προσθετική ή ανταγωνιστικές αλληλεπιδράσεις (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Οι κυτταρικές σειρές ASPC-1, MiaPaCa-2, Colo357, Panc-1, Panc89 και PancTu1 ήταν χωρίς θεραπεία ή θεραπεία με 5-FU μόνη της ή σε συνδυασμό με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις ΟΜΡ για 4 ημέρες. Σε χαμηλότερες δόσεις 5-FU μόνο (μαύρες γραμμές, 0 μg /ml ΟΜΡ) ένας αυξητικός-διεγερτικό αποτέλεσμα (hormesis) παρατηρήθηκε στις κυτταρικές γραμμές ASPC-1, Panc-1 και PancTu-1. Τα σημεία δεδομένων δείχνουν το μέσο 8 μετρήσεων. Οι καμπύλες τοποθετούνται σε αυτές τις κυτταρικές σειρές χρησιμοποιώντας το μοντέλο Brain-Cousens (βλέπε υποενότητα 4.11). Σε MiaPaCa-2 και Panc-89 κύτταρα δεν hormesis συμβεί, αυτές οι καμπύλες προσαρμόστηκαν χρησιμοποιώντας μία τρία παράμετρο λογιστικό μοντέλο. Σε κύτταρα Colo357 οι καμπύλες δεν θα μπορούσε να τοποθετηθεί από οποιαδήποτε φαρμακοδυναμική μοντέλο λόγω της μεγάλης τυπικά σφάλματα σε αυτές τις χαμηλότερες συγκεντρώσεις (φαίνεται σημεία δεδομένων). Τα κόκκινα, πράσινα και μπλε γραμμές δείχνουν τις καμπύλες δόσης-αποτελέσματος της 5-FU όταν διάφορες συγκεντρώσεις ΟΜΡ προστέθηκαν (10, 20 και 40 μg /ml, αντίστοιχα). Σε ASPC-1 και Panc-1 κύτταρα η hormesis του 5-FU αντιστράφηκε και PancTu-1 κύτταρο ήταν μετριάζεται από ΟΜΡ, ανάλογα με τη συγκέντρωση του 5-FU. Σε κύτταρα MiaPaCa-2 βρήκαμε ένα προσθετικό αλληλεπίδραση του 5-FU με ΟΜΡ. Σε Panc-89 κύτταρα η αλληλεπίδραση ήταν ανταγωνιστική.

Η

Έτσι, OMP έχει μια δοσοεξαρτώμενη αντι-πολλαπλασιαστική επίδραση και η in vitro IC

50 OMP σε αυτά υποστηρίζουν την υπόθεση της κλινικής εφαρμογής (που συζητείται περαιτέρω στο τμήμα συζήτηση). Ωστόσο, η σχέση δόσης-επίδρασης των φαρμάκων διέφερε μεταξύ των κυτταρικών σειρών. Η συνδυασμένη θεραπεία του ΟΜΡ με είτε 5-FU ή GEM αποκάλυψε αλληλεπιδράσεις πρόσθετο δοσοεξαρτώμενη και μετριασμός της hormetic διέγερση της ανάπτυξης χαμηλής δόσης 5-FU σε ASPC-1, PANC1 και τα κύτταρα Panc89. .

γραμμή κυττάρων συγκεκριμένες αλλαγές στο ρΗ intralysosomal μετά τη θεραπεία του καρκίνου του παγκρέατος κυττάρων με ΟΜΡ και 5-FU είτε μόνα τους είτε σε συνδυασμό

πορτοκαλί της ακριδίνης (AO) μικροσκοπία φθορισμού διεξήχθη για να προσδιοριστεί κατά πόσον OMP αυξάνει το ρΗ intralysosomal όπως περιγράφεται σε πρόσφατες εκθέσεις, είτε με αναστολή της vATPase [10] ή με τη συσσώρευση στα λυσοσώματα [11]. Τα όξινα διαμερίσματα των κυττάρων βάφονται κόκκινα και τα ουδέτερα τμήματα βάφονται πράσινα με ΑΟ. Ειδική αναστολή του vATPase με βαφιλομυκίνης Α1 έχει δειχθεί ότι οδηγεί σε ταχεία αναστολή της ερυθρού φθορισμού [29], [30].

Οι ερυθρό προς πράσινο αναλογίες φθορισμού ποσοτικοποιείται με ποσοτική ανάλυση εικόνας για MiaPaCa -2 και ASPC-1 κύτταρα φαίνεται στο Σχήμα 3. Οι πρώιμες αλλαγές (μετά από 30 λεπτά της θεραπείας) αποτελείτο από ένα ελαφρώς υψηλότερο οξύτητα κατά την κατεργασία 5-FU σε κύτταρα MiaPaCa-2 και σε ASPC-1 κύτταρα επεξεργασμένα με ΟΜΡ ή ΟΜΡ + 5-FU. Μετά από 24 ώρες, η λυσοσωμική οξύτητα των κυττάρων MiaPaCa-2 ήταν βαθμιαία, αλλά σημαντικά καταστέλλεται από ΟΜΡ, 5-FU και ΟΜΡ + 5-FU. Ωστόσο, αυτά παρατήρηση δεν κατηγορηματικά αντιστοιχούν στις προαναφερθείσες αναφορές, δεδομένου ότι το αποτέλεσμα δεν ήταν ειδικό για ΟΜΡ. Σε ASPC-1 κύτταρα, και οι τρεις αγωγές θεραπείας είχε ως αποτέλεσμα μια ελαφρά υψηλότερη οξύτητα μετά από 24 ώρες.

πορτοκαλί της ακριδίνης προστέθηκε σε ζώντες μη επεξεργασμένα κύτταρα ASPC-1 και MiaPaCa-2 και κύτταρα επεξεργασμένα με 5-FU, OMP ή ο συνδυασμός και των δύο για 30 λεπτά ή 24 ώρες. Μικροσκοπική εικόνες ζωής ελήφθησαν στα 525 nm (πράσινο) και 650 nm (κόκκινο) για την ανίχνευση μεταβολών στην αξία λυσοσωμικό ρΗ (τρεις εικόνες ανά πλάκα, τρεις πλάκες ανά ομάδα). Το κόκκινο σε πράσινο αναλογία φθορισμού των λυσοσώματα των κατεργασμένων κυττάρων σε σύγκριση με τις ομάδες ελέγχου με το Mann-Whitney-U-test. Οι σημαντικές διαφορές σε σχέση με τον έλεγχο που επισημαίνονται με *. Σε κύτταρα ASPC-1, μετά από 30 λεπτά θεραπείας, intralysosomal οξύτητα αυξήθηκε κατά την κατεργασία με ΟΜΡ (p: 0,0051) και 5-FU + ΟΜΡ (ρ & lt? 0,0001). Μετά από 24 ώρες, η οξύτητα αυξάνεται από όλα τα θεραπευτικά σχήματα (5-FU – p: 0,0002? ΟΜΡ – ρ & lt? 0,00001? ΟΜΡ + 5-FU – p: 0,037). Σε κύτταρα MiaPaCa-2 η οξύτητα είναι αυξημένα μετά από 30 λεπτά μετά την 5-FU (ρ: 0.005) και μειώθηκε μετά από αγωγή με ΟΜΡ (p: 0,037), 5-FU (ρ: 0.00026) και 5-FU + ΟΜΡ (p: 0.011) μετά από 24 ώρες.

η

Έτσι καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι OMP δεν προκάλεσαν μια συνεπή αλλαγή στην τιμή του pH intralysosomal των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Παρ ‘όλα αυτά μια μικρή αναστολή συνέβη σε κύτταρα MiaPaCa-2 προς όλα τα σχήματα θεραπείας μετά από 24 ώρες. Σε αντίθεση, ASPC-1 κύτταρα έδειξαν μία υψηλότερη οξύτητα λυσοσωμική όταν θεραπεύονται με ΟΜΡ, 5-FU ή ένας συνδυασμός και των δύο.

Phagophores και αυτοφαγοσώματα συσσωρεύονται σε ASPC-1 και MiaPaCa-2 κυττάρων μετά κατεργασία ΟΜΡ

Μέχρι στιγμής, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι vATPase αναστολή και την ανύψωση λυσοσωμικών pH δεν ήταν τα κύρια αποτελέσματα που προκαλούνται από OMP σε κυτταρικές σειρές ASPC-1 MiaPaCa-2 και. Η μικροσκοπία φθορισμού ΑΟ ωστόσο, αποκάλυψε ότι λυσοσώματα συμμετείχαν σε αμφότερα OMP- και 5-FU μεσολάβηση αναστολή του πολλαπλασιασμού. Συνεπώς εξετάσαμε τα υποκυτταρικά μορφολογικές αλλαγές μετά τη θεραπεία με ΟΜΡ, 5-FU και ο συνδυασμός και των δύο με ΤΕΜ.

Σχήμα 4 συγκρίνει έναν μη επεξεργασμένο ASPC-1 κυττάρων (Σχήμα 4 Α) με κύτταρα επεξεργασμένα με 160 μg /ml (Σχήμα 4Β) και με 80 μg /ml ΟΜΡ (Σχήμα 4C) για 24 ώρες. Η αγωγή με 80 μg /ml ΟΜΡ είχε ως αποτέλεσμα autophagy όπως υποδεικνύεται από την εμφάνιση της πρώιμης κυπελλοειδή phagophores περιέχει κυτταροπλασματική υλικό και αυτοφαγοσώματα γεμίζουν με επικαλυμμένα κυστίδια (Εικόνα 4C). Μετά τη θεραπεία με 160 μg /ml ΟΜΡ, τα κύτταρα ASPC-1 υποβλήθηκαν σε απόπτωση μετά από 24-48 ώρες (Εικόνα 4Β). Παρόμοιες μεταβολές παρατηρήθηκαν σε κύτταρα MiaPaCa-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με 80 μg /ml ΟΜΡ συμπεριλαμβανομένης κενοτοπιώδη ως ταυτόχρονη ένδειξη της απόπτωσης (Εικόνα 4D).

(Α) ASPC-1 κυττάρων χωρίς αγωγή (800 φορές). (Β) ASPC-1 κυττάρων που υφίστανται απόπτωση κατά 160 μg /ml ΟΜΡ μετά από 24 ώρες (800 φορές). Κενοτοπιώδη του κυτταροπλάσματος και συμπύκνωση του πυρήνα είναι ορατά. (Γ) Phagophores και αυτοφαγοσώματα σε ένα τμήμα ενός κυττάρου ASPC-1 θεραπεία με ομεπραζόλη 80 μg /ml για 24 ώρες (διεύρυνση 2800fold). Οι phagophores χαρακτηρίζονται από ένα κυπελλοειδές σχήμα (λευκά βέλη). Αυτοφαγοσώματα είναι κλειστά σωματίδια, ο αριθμός των οποίων αυξάνεται σε κατεργασμένα κύτταρα (μαύρα βέλη). (δ) Πρώιμη phagophores και αυτοφαγοσώματα βρίσκονται επίσης σε κύτταρα MiaPaCa-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ΟΜΡ των 80 μg /ml μετά από 24 ώρες σε μια περιπυρηνική περιοχή που περιέχει λυσοσώματα και το σύμπλοκο Golgi. Σε αντίθεση με τα κύτταρα ASPC-1, τα πρώτα σημάδια της απόπτωσης όπως σχηματισμό κενοτοπίων, είναι επίσης παρούσες. (Ε) Barchart των αριθμών των αυτοφαγοσώματα και λυσοσώματα ανά κύτταρο σε MiaPaCa-2 και ASPC-1 κύτταρα μη επεξεργασμένα ή επεξεργασμένα με 5-FU, OMP ή το συνδυασμό των δύο για 24 ώρες με τυπικά σφάλματα. Οι σημαντικές διαφορές σε σχέση με τον έλεγχο που επισημαίνονται με *. Σε ASPC-1 κύτταρα υπήρχαν σημαντικές διαφορές σε σύγκριση με τον έλεγχο στην ομάδα ΟΜΡ (p: 0,03) και η ομάδα + ΟΜΡ 5-FU (ρ: 0,03). Στα κύτταρα MiaPaCa-2 η ομάδα 5-FU + OMP διέφερε σημαντικά από τον έλεγχο (ρ & lt? 0.001).

Η

Αν και phagophores ήταν εύκολα αναγνωρίσιμα από μοναδικά μορφολογικά χαρακτηριστικά, αυτοφαγοσώματα, λυσοσώματα, ενδοσώματα και autolysosomes δεν θα μπορούσε να διακριθεί με ΤΕΜ. Σημαντικά μεγαλύτερες ποσότητες όλων αυτών των λυσοσώματος-όπως organells παρατηρήθηκαν σε ASPC-1 κύτταρα επεξεργασμένα με ΟΜΡ ή ΟΜΡ + 5-FU και σε κύτταρα MiaPaCa-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ΟΜΡ + 5-FU (Σχήμα 4Ε).

συνοπτικά, OMP οδήγησε στη συσσώρευση των δεικτών των πρώιμων σταδίων της αυτοφαγία (autophagophores) σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Αν και δείκτες μεταγενέστερα στάδια, όπως autolysosomes, δεν θα μπορούσαν να διακριθούν μορφολογικά από άλλες οδούς λυσοσωμικών μεταφοράς, ο συνολικός αριθμός των λυσοσώματος-όπως οργανίδια αυξήθηκε σε ASPC-1 κύτταρα μετά από κατεργασία με ΟΜΡ ή 5-FU + ΟΜΡ και σε MiaPaCa-2 κύτταρα κατεργασμένα με 5-FU + ΟΜΡ. Τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι είτε η ενεργοποίηση του κύκλου εργασιών της πρωτεΐνης ή την απομείωση της οδού λυσοσωμικής μεταφοράς συνέβη.

Αναγνώριση των μεταβολικών αλλαγών εντός βιώσιμων κυττάρων μετά από θεραπεία με OMP, 5-FU ή ένα συνδυασμό και των δύο

φασματοσκοπία NMR πρωτονίων των βιώσιμων κυττάρων πραγματοποιήθηκε σε κυτταρικές σειρές ASPC-1 MiaPaCa-2 και για να αναλυθούν οι βιοχημικές διεργασίες που συνδέονται με τις μορφολογικές αλλαγές που περιγράφονται παραπάνω. Διάφορα χαρακτηριστικό χαμηλού μοριακού ενδοκυτταρική μεταβολίτες όπως λιπαρά οξέα, αμινοξέα, που συνδέεται μεμβράνη mebolites φωσφολιπίδιο και ενδιάμεσα κιτρικό κύκλο και γλυκόλυση μεταβολίτες ταυτοποιήθηκαν (Σχήμα 5).

Τα κύτταρα συλλέχθηκαν από καλλιέργεια μονοστιβάδας, διατηρείται και μετράται στους 20 ° C. Μέτρηση έγιναν με ένα φασματόμετρο Bruker 600 ΜΗζ. Για καλύτερη ορατότητα το τμήμα του φάσματος που δείχνει τα πρωτόνια αλειφατικών ομάδων χωρίζονται σε 2 μέρη – Α και Β (Α). αλειφατικό τμήμα I. Το μεθύλιο και β- και γ- ομάδες μεθυλενίου των διαφόρων λιπαρών οξέων και αμινοξέων είναι ορατά. Επιπλέον, ισοπροπανόλη και tetrachlorethan (το εξωτερικό πρότυπο συγκέντρωση) εμφανίστηκε ως μολύνσεις. (Β) Αλειφατικές μέρος ΙΙ. Φωσφολιπιδίων μεταβολίτες και οι α-μεθυλενο ομάδες αμινοξέων και γαλακτικό είναι ορατά. (C) Τύπος της ΟΜΡ με αρίθμηση των αντίστοιχων πρωτονίων. Οι ομάδες μεθυλίου (1-3, 9) και η ομάδα μεθυλίου (4) καλύπτονται από άλλα μεταβολιτών στα αλειφατικά τμήματα του φάσματος. Σε αντίθεση, τα αρωματικά πρωτόνια είναι ορατές (Η5, H8, H10). (D) Επικάλυψη των αρωματικών τμημάτων του διαφορετικά φάσματα για την ενδοκυτταρική αναγνώριση των ΟΜΡ. Η μονού του πρωτονίου Η5 και τις διπλοί των πρωτονίων H8 και Η10 μπορεί να προσδιοριστεί όταν η σύγκριση των φασμάτων των κυττάρων μέσο και σε σύγκριση με εκείνους χωρίς θεραπεία OMP. Συντομογραφίες: His – ιστιδίνη, Tyr – τυροσίνη, Phe – φαινυλαλανίνη, Leu, Ile, Val – λευκίνη, ισολευκίνη, βαλίνη. Ala – Αλανίνη. Glu – Γλουταμινικό, Gin – Γλουταμίνη, PC – φωσφατιδυλοχολίνη, Cho – χολίνη, GPC – γλυκεροφωσφοχολίνης, Tau – ταυρίνη, Scyllo -. Scylloinositole

Η

ίδια OMP εντοπίστηκε ενδοκυτταρικά και στις δύο κυτταρικές σειρές μετά από θεραπεία με 80 μg /ml για 24 ώρες. Τα σήματα των αρωματικών Η8 και Η10 πρωτόνια του ΟΜΡ (Σχήμα 5C) έχουν προσδιοριστεί εύκολα (Εικόνα 5D) σε κύτταρα MiaPaCa-2. ΟΜΡ ταυτοποιήθηκε επίσης εντός ASPC-1 κύτταρα από το πρωτόνιο Η5 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Απ ‘όσο γνωρίζουμε, αυτή είναι η πρώτη φορά που OMP έχει παρατηρηθεί στο εσωτερικό των κυττάρων.

Αν και ο προσδιορισμός της απόλυτης ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις με φασματοσκοπία NMR είναι γενικά επιρρεπή σε συστηματικά σφάλματα, ο υπολογισμός των ολοκλήρωμα αναλογίες των διαφόρων σημάτων μπορεί να περιέχει χρήσιμες ποσοτικές πληροφορίες σχετικά με τις μεταβολικές οδούς. Αυτές οι μεταβολικές οδοί εμφανίζεται ως έντονα απλοποιημένο δίκτυο για κύτταρα ASPC-1 στο Σχήμα 6 και τα κύτταρα MiaPaCa-2 στο σχήμα 7. Μια γραμμή μεταξύ δύο σημάτων συμβολίζει μια μεταβολική οδό. Η γραμμή είναι πορτοκαλί όταν η αναλογία έντασης σήματος του συνδεδεμένου ουσιών διαφέρει από τον έλεγχο με ρ & lt?. 0.05 και κόκκινο όταν το ρ είναι κάτω από 0,01

Η κυτταρική γραμμή ASPC-1 φαίνεται χωρίς και μετά από διάφορες αγωγές θεραπείας ( ΟΜΡ, 5-FU ή 5-FU + ΟΜΡ συνδυασμό). Οι κόμβοι του δικτύου αυτού συμβολίζουν μεταβολίτη σήματα, τα χρώματά τους να αντιστοιχούν με τη σχετική ένταση του σήματος (σε σύγκριση με ένα εξωτερικό πρότυπο), όπως αναφέρεται στην κλίμακα Heatmap παρακάτω. Η ένταση του σήματος σχετίζεται γραμμικά με την ενδοκυτταρική συγκέντρωση. Το υπόβαθρο των κόμβων έχουν μείνει κενή όταν η ένταση του σήματος είναι έξω από την περιοχή που υποδεικνύεται από την κλίμακα Heatmap. Οι γραμμές μεταξύ των κουτιών συμβολίζουν απλοποιημένη έντονα μεταβολικές οδούς. Τα χρώματα αυτών των γραμμών υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές των αναλογιών ένταση του σήματος των συνδεδεμένων μεταβολιτών σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, όταν πορτοκάλι (ρ & lt? 0,05), κόκκινες γραμμές υποδεικνύουν ρ & lt? 0,01. Οι πιο προφανείς αλλαγές είναι ότι η αναλογία PC /Cho είναι σημαντικά μικρότερη στην ομάδα ΟΜΡ σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Μετά 5-FU, ο Cho /οξικό μείωση αναλογία είναι η μόνη σημαντική αλλαγή. Στην 5-FU ομάδα + OMP, υπάρχουν αρκετές σημαντικές αλλαγές, δηλαδή όσο αναλογία /CH = CH FACH2 είναι σημαντικά υψηλότερο. Επιπλέον, η οξική αναλογία Cho /αλλάξει με 5-FU + ΟΜΡ όπως στην ομάδα 5-FU, αλλά και η αναλογία κιτρικού /GSH. Τα κυτταρικά βιοχημικά αποτελέσματα αφορούν κυρίως το λιπαρό οξύ και ο μεταβολισμός φωσφολιπιδίου μεμβράνης δείχνουν προς αναβολισμός. Συντομογραφίες: Gln – γλουταμίνη, Ala – αλανίνη, PC – φωσφατιδυλοχολίνη, Cho – χολίνη, Lac1 + FACH2 – σήμα μεθυλική ομάδα του γαλακτικού οξέος και του μεθυλενίου ομάδες των λιπαρών οξέων, Lac2 – μεθυλενίου ομάδα του γαλακτικού οξέος, CH = CH – πρωτόνια των methin ομάδων ακόρεστα λιπαρά οξέα.

Η

Η κυτταρική γραμμή δείχνεται χωρίς και από διάφορες θεραπευτικές αγωγές (ΟΜΡ, 5-FU ή 5-FU + ΟΜΡ συνδυασμό). Οι κόμβοι του δικτύου αυτού συμβολίζουν μεταβολίτη σήματα, τα χρώματά τους να αντιστοιχούν με τη σχετική ένταση του σήματος (σε σύγκριση με ένα εξωτερικό πρότυπο), όπως αναφέρεται στην κλίμακα Heatmap παρακάτω. Η ένταση του σήματος σχετίζεται γραμμικά με την ενδοκυτταρική συγκέντρωση. Το υπόβαθρο των κόμβων έχουν μείνει κενή όταν η ένταση του σήματος είναι έξω από την περιοχή που υποδεικνύεται από την κλίμακα Heatmap. Οι γραμμές μεταξύ των κουτιών συμβολίζουν απλοποιημένη έντονα μεταβολικές οδούς. Τα χρώματα αυτών των γραμμών υποδεικνύουν σημαντικές διαφορές των αναλογιών ένταση του σήματος των συνδεδεμένων μεταβολιτών σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, όταν πορτοκάλι (ρ & lt? 0,05), κόκκινες γραμμές υποδεικνύουν ρ & lt? 0,01. Κατά OMP, το PC αναλογίες Cho /είναι σημαντικά χαμηλότερες σε σύγκριση με τον έλεγχο. Επιπλέον, η αναλογία οξικού /FACH2 μειώνεται σημαντικά στην ομάδα ΟΜΡ. Η τελευταία έδειξε επίσης ένα υψηλότερο επίπεδο = CH CH, η αναλογία να FACH2 είναι, ωστόσο, μειώθηκε. Μετά 5-FU και 5-FU + ΟΜΡ, θα μπορούσε να παρατηρηθεί παρόμοιες αλλαγές. Επιπλέον, σε αντίθεση με ASPC-1 κύτταρα, η οδός Ala /Gln /ΑΜΡ εμπλέκεται επίσης. Συντομογραφίες: Gln – γλουταμίνη, Ala – αλανίνη, PC – φωσφατιδυλοχολίνη, Cho – χολίνη. Lac1 + FACH2 – σήμα μεθυλ ομάδα του γαλακτικού και μεθυλενο ομάδες των λιπαρών οξέων, Lac2 – μεθυλένο ομάδα γαλακτικού, CH = CH -. Πρωτόνια των ομάδων methin των ακόρεστων λιπαρών οξέων

Η

μεμβρανικές λιπαρών οξέα είναι συνήθως NMR-ορατή μόνο όταν χρησιμοποιώντας την τεχνική Magic-Angle-Spinning (MAS) [31]. Σε αντίθεση, τα κινητά πολυακόρεστο λιπαρό οξύ ομάδες (PUFA) (δηλ. Ο CH = CH σε 5,3 ppm ή CH = CHCH2CH = CH στα 2,8 ppm), οι οποίες έχουν συσχετισθεί με το σχηματισμό λιπιδίων σταγόνων στο αυτοφαγοσώματα διάρκεια αυτοφαγία και προγραμματισμένο κυτταρικό θάνατο (ΣΑΠ) [32], κατέστη επείγουσα στα φάσματα NMR πρωτονίων των κυττάρων MiaPaCa-2 υποβάλλεται σε επεξεργασία με ΟΜΡ ή 5-FU + ΟΜΡ. Επιπλέον η αύξηση των ομάδων μεθυλενίου λιπαρού οξέος (FACH2) σε σύγκριση με οξικό παρατηρήθηκε μετά ΟΜΡ και 5-FU κατεργασία + ΟΜΡ σε MiaPaCa-2-, αλλά όχι σε κύτταρα ASPC-1. Αυτό συσχετίζεται με τα δεδομένα ηλεκτρονικής μικροσκοπίας που δείχνουν ότι οι μορφολογικές αλλαγές που σχετίζονται με autophagy συνοδεύεται από κενοτοπιώδη η οποία επισημαίνει την έναρξη της απόπτωσης σε MiaPaCa-2, αλλά όχι τα κύτταρα ASPC-1, σε 80 μg /ml ΟΜΡ.

Cho και φωσφοχολίνης (PC) σήματα είναι δείκτες της ανάπτυξης σε ανθρώπινα κύτταρα, σύμφωνα με την οποία αυξημένα PC συνδέεται με γρήγορο πολλαπλασιασμό και κακοήθη συμπεριφορά [33] – [35]. Η καταστολή του PC μπορεί να προκληθεί από την κινάση χολίνης και φωσφολιπάση C μειορύθμιση και επαγωγή της φωσφολιπάσης Α2 που οδηγεί σε αναστολή του πολλαπλασιασμού [36]. Στη μελέτη μας, το PC κατεστάλη σημαντικά σε σύγκριση με Cho στα κύτταρα MiaPaCa-2 που έλαβαν θεραπεία με OMP, 5-FU και 5-FU + OMP και ASPC-1 κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με OMP μόνο. ​​

Στο σύνολό τους, αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το λιπαρό οξύ και φωσφολιπίδιο σήματα μεταβολίτης αλλάξει κατά την κατεργασία ΟΜΡ. Παρά το γεγονός ότι παρατηρήθηκαν παρόμοιες αλλαγές και στα δύο κύτταρα ASPC-1 και MiaPaCa-2, οι αλλαγές αυτές ήταν πιο ενισχυμένη σε κύτταρα MiaPaCa-2, ειδικά σε σχέση με αυτές τις αλλαγές σήμα που δείχνει ανέστειλε τον πολλαπλασιασμό (PC) και ΣΑΠ (PUFA). Αυτό αντιστοιχεί με τις ανωτέρω περιγραφείσες φαρμακοδυναμικές και μορφολογικές αλλαγές. Ωστόσο, σε κύτταρα MiaPaCa-2 τα βιοχημικά αποτελέσματα δεν περιορίστηκαν σε θεραπεία OMP, αλλά επίσης εμφανίστηκε επάνω 5-FU και 5-FU + ΟΜΡ και ως εκ τούτου δεν μπορεί να θεωρηθεί ότι είναι ειδικά για OMP.

Συμμετοχή των λυσοσωμάτων και το σύμπλοκο Golgi στη κυτταρική απόκριση σε ΟΜΡ

Πιθανοί στόχοι υποκυτταρική ΟΜΡ ταυτοποιήθηκαν με απομόνωση από κύτταρα οργανίδια MiaPaCa-2 με φυγοκέντρηση πυκνότητας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 8, το πρώτο και δεύτερο κλάσματα πυκνότητας περιείχαν πρώιμη και όψιμη ενδοσώματα και τα λυσοσώματα, που εντοπίστηκαν από LAMP-1 και αντισώματα Καθεψίνη-D (Σχήμα 8Β) στην ομάδα ελέγχου. Στην ομάδα που έλαβε OMP, αυτές οι πρωτεΐνες βρέθηκαν μόνο στο πρώτο κλάσμα. Το τρίτο κλάσμα της ομάδας ελέγχου περιείχαν το σύμπλεγμα Golgi, όπως υποδεικνύεται από το αντίσωμα β-COP. Ωστόσο, η έκφραση αυτής της πρωτεΐνης μειώνεται κατά την κατεργασία ΟΜΡ. Τα φάσματα NMR πρωτονίου αυτών των κλασμάτων δείχνονται στα σχήματα 8Α και 8C. Το Σχήμα 8Α δείχνει τις εκχωρήσεις σήμα συγκρίσεως των φασμάτων των κλασμάτων αυτών (που ονομάζεται F1-F3) με εκείνες των iodixanol (Optiprep), καθώς και μια λυσοσωμική κύτταρο κλάσμα των μη επεξεργασμένων κυττάρων (F1 *), το οποίο πλύθηκε με PBS μία φορά μετά υπερφυγοκέντρηση (σε αντίθεση για κλάσματα F1-F3, το οποίο πλύθηκαν δύο φορές). Iodixanol συνέβη σε όλα τα κλάσματα, αλλά μειώθηκε μετά το πλύσιμο των ultracentrifugates δύο φορές. Αυτό δείχνει σε μερική ενσωμάτωση των iodixanol στις μεμβράνες ή του αυλού των οργανιδίων. Τα περισσότερα από τα υδατοδιαλυτά χαμηλότερη μοριακού ουσίες μειώθηκε επίσης σε F1-F3, όπως γαλακτικό και κιτρικό, σε σύγκριση με F1 *, η οποία έδειξε ένα έκπλυση. Η ακεραιότητα των οργανιδίων είχαν επαληθεύθηκαν με επιτυχία με τη χρήση ενός εξωτερικού προτύπου (tetrachlorethan) για τη βαθμονόμηση χημική μετατόπιση. Υπήρξε μια εξαρτώμενη από το ρΗ μετατόπιση των σημάτων κιτρικού προς οξίνισης στα κλάσματα λυσοσωμικών σε σύγκριση με το σύνολο εναιωρήματα κυττάρου.

(Α) Επικάλυψη των θραυσμάτων φάσματος NMR πρωτονίου των ακόλουθων αιωρημάτων (από πάνω προς τα κάτω) : χωρίς θεραπεία πρώτης (λυσοσωμική) κλάσμα των κυττάρων μετά από ultracentrifgation και ένα πλύσιμο (F1 *), iodixanole (Optiprep) αναστολή, κάτω (F3), μεσαία (F2) και το ανώτερο κλάσμα (F1) των ultracentrifugates μετά από δύο πλύσεις. Οι χημικές μετατοπίσεις του φάσματα βαθμονομηθεί με το σήμα χολίνη /φωσφατιδυλοχολίνη (Cho /PC). Εκτός από iodixanol, θα μπορούσαμε να προσδιορίσει τις ομάδες PUFA (ομάδες μεθυλενίου που βρίσκεται ανάμεσα σε δύο ομάδες CH = CH), Cho /PC και γλυκεροφωσφοχολίνης (GPC) σε F1 * και F1-3. Επιπλέον παρατηρήσαμε το γαλακτικό και τις ομάδες μεθυλενίου των λιπαρών οξέων (κατά 1,3 ppm), κιτρικό (κατά 2,55 και 2,7 ppm) και φωσφοαιθανολαμίνης (3,1 ppm) στα F1 * αλλά όχι στις ομάδες F1-F3 .. (Β) Δυτική ανάλυση κηλίδας του LAMP-1, ένα αργά δείκτη ενδοσώματος, η οποία ήταν σχεδόν ταυτόσημα κατανεμημένες κατά τα δύο πρώτα κλάσματα σε σύγκριση με την καθεψίνη-ϋ, στην controle ομάδα, αλλά μεσολαβήσει μόνο στο πρώτο κλάσμα στην ομάδα που έλαβε ΟΜΡ. β-COP ως δείκτης της Golgi σύμπλοκο, βρίσκεται έντονα στο κατώτερο κλάσμα στην ομάδα ελέγχου, αλλά πολύ ασθενώς στην ομάδα που έλαβε ΟΜΡ. Η καθεψίνη – D, ένας πρώιμος δείκτης ενδόσωμα, το οποίο μπορεί να βρεθεί στο άνω και μεσαίο κλάσμα της ομάδας ελέγχου, αλλά όσον αφορά την ομάδα ΟΜΡ, διαπιστώθηκε μόνο στην πρώτη. (Ε) Επικάλυψη των φασμάτων NMR όλων των κλασμάτων του ελέγχου και της OMP. Η πιο σημαντική διαφορά είναι η απογαλακτισμό του σήματος GPC μετά την επεξεργασία ΟΜΡ στο 1ο κλάσμα μετά από μόνο 6 ώρες.

Η

Σε αντίθεση με το σύνολο φάσματα κυττάρου (βλέπε σχήμα 5Β), γλυκεροφωσφοχολίνης (GPC) ήταν βρέθηκε στο πρώτο (λυσοσωματική) κλάσμα. Όταν συγκρίνουμε τον έλεγχο στην ομάδα OMP-αγωγή (Σχήμα 8C), το σήμα GPC σαφώς μειωμένη κατά την αγωγή OMP. Επιπλέον, η αύξηση της PUFAs στην ομάδα ΟΜΡ επεξεργασμένο επιβεβαιώθηκε (Εικόνα 8C) αναλόγως προς το σύνολο φάσματα κυττάρου. OMP δεν μπορούσαν να ταυτοποιηθούν σε οποιοδήποτε από αυτά τα κλάσματα, και επομένως έχει κατά πάσα πιθανότητα δεν συσσωρεύονται στα λυσοσώματα ή στο σύμπλοκο Golgi. Αυτό υπογραμμίζει τη διαπίστωση ότι οι ενδόσωμα και λυσόσωμα κλάσματα υποβλήθηκαν σε αναβολική μεταβολές κατά τη διάρκεια της θεραπείας ΟΜΡ (που αντιστοιχούν στα δεδομένα ΤΕΜ). Ωστόσο, το συγκρότημα Golgi ως ένα σημαντικό μέρος του συστήματος λυσοσωμικού μεταφορών, συμμετέχει επίσης.

Προσδιορισμός των αυτοφαγικά δραστηριότητας

Πραγματοποιήσαμε ανάλυση κηλίδος LC3-Western για την ανίχνευση μεταβολών στην έκφραση της LC3 . Η έκφραση LC3-γονίδιο συσχετίζεται καλά με τον αριθμό των αυτοφαγοσώματα [37], [38]. Επιπλέον δύο κλάσματα μπορεί συνήθως να διαφοροποιηθούν – LC3-Ι και LC3-II. Οι πρώτες occures σε autophagophores και θεωρείται ένας δείκτης επαγωγή αυτοφαγία, η τελευταία περιέχεται εντός των αυτοφαγοσώματα και αποικοδομείται, μετά τη σύντηξη τους με λυσοσώματα, σε autolysosomes. [10].