Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) παίζουν κρίσιμο ρόλο στη γαστρική εξέλιξη του καρκίνου και της μετάστασης. Αυτή η μελέτη ερεύνησε το ρόλο των miRNA-135α στις αρχές του γαστρικού καρκίνου (EGC) συμπεριλαμβανομένων λεμφαδένα (LN) μετάσταση. Εξετάσαμε τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των miRNAs-135α και τα κλινικά αποτελέσματα σε 59 ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση για την EGC. Χρησιμοποιώντας κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, εκτελέσαμε λειτουργικό και αναλύσεις γονιδίου στόχου. έκφραση miRNA-135α ήταν κάτω-ρυθμίζονται σε 33,9% των ασθενών. Αυτοί οι ασθενείς έδειξαν σημαντικά πιο προχωρημένο στάδιο (ΤΝΜ stage≥IB, 35,0% έναντι 12,8%, ρ = 0,045) και υψηλότερο ποσοστό LN μετάστασης (30,0% έναντι 5,1%, p = 0,014) από εκείνες με αυξητική ρύθμιση του έκφραση miRNA-135α. Σε μια πολυπαραγοντική ανάλυση, προς τα κάτω ρύθμιση των miRNA-135α ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για LN μετάσταση (προσαρμοσμένη αναλογία πιθανοτήτων, 8,04? 95% διάστημα εμπιστοσύνης, 1,08 έως 59,81? P = 0,042). Λειτουργικές αναλύσεις χρησιμοποιώντας γαστρικού κυτταρικές σειρές καρκίνου έδειξαν ότι miRNA-135α κατέστειλε την κυτταρική βιωσιμότητα, επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβασης, κύτταρο εισβολή, και τη μετανάστευση. ROCK1 ήταν ένας στόχος των miRNA-135a και η έκφρασή της ήταν αντιστρόφως ανάλογη με εκείνη των miRNA-135α. έκφραση ROCK1 ήταν σημαντικά αυξημένη σε ασθενείς EGC με LN μετάσταση σε σχέση με εκείνους που δεν έχουν LN μετάσταση. Τα αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν την ογκο-κατασταλτική ρόλος του miRNA-135α, και καταδεικνύουν το ρόλο της στην LN μετάστασης σε EGC. miRNA-135α και το γονίδιο στόχο του

ROCK1

μπορεί να είναι νέα θεραπευτική και προγνωστική στόχους για EGC

Παράθεση:. Shin JY, Kim YI, Cho SJ, Lee MK, Kook MC, Lee JH, et al. (2014) microRNA 135α Καταστέλλει μετάσταση λεμφαδένα μέσω κάτω ρύθμιση των ROCK1 τον πρώιμο καρκίνο του στομάχου. PLoS ONE 9 (1): e85205. doi: 10.1371 /journal.pone.0085205

Επιμέλεια: Masaru Katoh, Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, Ιαπωνία

Ελήφθη: 28 Οκτ 2013? Αποδεκτές: 23 Νοεμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 21 Ιανουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Shin et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από επιχορήγηση 1.110.532 έως 3 από το Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, την Κορέα. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. ΗΑ είναι μέλος του διοικητικού συμβουλίου ΕΝΑ συντακτικής PLoS και αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

γαστρικός καρκίνος παραμένει ακόμα το δεύτερο πιο συχνό αίτιο θνησιμότητας από καρκίνο σε όλο τον κόσμο, παρά τη μείωση των ποσοστών επίπτωσης και θνησιμότητας στις ανεπτυγμένες χώρες [1 ].

Σε περιοχές, συμπεριλαμβανομένης της Κορέας και της Ιαπωνίας, όπου προσυμπτωματικού ελέγχου για καρκίνο του στομάχου γίνεται ευρέως, η έγκαιρη διάγνωση είναι συχνά δυνατό. Επειδή η αύξηση του ποσοστού της έγκαιρης ανίχνευσης του καρκίνου του στομάχου μπορεί να οδηγήσει σε μια βελτιωμένη πρόγνωση, συμφέροντα στη βελτίωση της ποιότητας ζωής των ασθενών και χρησιμοποιώντας ελάχιστα επεμβατικές θεραπείες έχουν αυξηθεί. Σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου, λεμφαδένα (LN) μετάσταση είναι ένα από τα πιο σημαντικά προγνωστικούς παράγοντες, και η συνολική επίπτωση της μετάστασης LN στις αρχές του γαστρικού καρκίνου (EGC) κυμαίνεται από 5 έως 20% [2] – [4].

γαστρεκτομή με LN ανατομή θεωρείται ως η τυπική θεραπεία για καρκίνο του στομάχου? Ωστόσο, 80 έως 95% των ασθενών με EGC δεν απαιτούν ανατομή LN εάν το γαστρικό καρκίνο είναι εντελώς αποκόπτεται από λιγότερο επεμβατικές θεραπείες όπως ενδοσκοπική εκτομή [5] – [7] ή ελάχιστα επεμβατική χειρουργική επέμβαση (

π.χ.

, απλά σφηνοειδής εκτομή ή χειρουργική επέμβαση πλοήγησης φρουρού LN) [8] – [10]. Αν και οι μελέτες της βιολογικής προγνωστικών και προγνωστική δείκτες για LN μετάσταση σε EGC έχουν διεξαχθεί, δεν υπάρχουν προγνωστικά εργαλεία για κομβικό μετάσταση του EGC πραγματικά.

Αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει ότι το βάθος της εισβολής, το μέγεθος του όγκου, και του λεμφικού εισβολή είναι σχετίζεται με LN μετάσταση σε EGC [4], [11]. Ωστόσο, οι περισσότεροι από αυτούς τους παράγοντες έχουν προσδιοριστεί μετά την τελική παθολογική εξέταση των ιστών εκτομή, η οποία δεν είναι χρήσιμο στον προσδιορισμό στρατηγική θεραπείας.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μικρά κωδικοποίησης RNAs μη-πρωτεΐνης. Μελέτες έχουν αποδείξει ότι μεταβολές στην έκφραση των miRNAs συμβάλλει στην παθογένεση καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων της γαστρεντερικής προέλευσης [12] – [15].

miRNAs έχουν επίσης δειχθεί να είναι χρήσιμη στη διαφοροποίηση του καρκίνου και φυσιολογικούς ιστούς [ ,,,0],16], [17]. Επιπλέον, οι miRNAs εκφράζονται διαφορικά σε κάθε στάδιο του γαστρικού καρκίνου του καρκινογένεσης [18]. miRNA-27 [19] και ο ZEB1-ρυθμιζόμενη οικογένεια miRNA-200 [20] έδειξαν ότι σχετίζεται με το στάδιο της μεταβάσεως επιθηλίου-μεσεγχύματος (ΕΜΤ) σε γαστρικό καρκίνο. Ως εκ τούτου, miRNAs μπορεί να σχετίζεται με τη διαδικασία της μετάστασης σε LN EGC. Μεταξύ miRNAs, miRNA-135α έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα κατασταλτικό του όγκου miRNA, και η έκφρασή του ρυθμίζεται προς τα κάτω σε αρκετούς καρκίνους συμπεριλαμβανομένου του καρκινώματος νεφρικών κυττάρων [21] και του λεμφώματος [22]. Με τη σειρά του, υπερ-έκφραση ή την αποκατάσταση του miRNA-135α προάγει την απόπτωση και καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων μέσω των γονιδίων στόχων του c-Myc [21] και JAK2 [22], αντίστοιχα. Σε μια

in vitro

μελέτη, miRNA-135α κατέστειλε μεταναστευτικών και επεμβατικές δραστηριότητες των γαστρικών καρκινικών κυττάρων [23]. Ωστόσο, η κατασταλτική του όγκου ρόλος των miRNA-135α σε καρκίνο του στομάχου είναι ασαφής.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνηθεί η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης των miRNAs-135α και κλινικές εκβάσεις σε ασθενείς EGC συμπεριλαμβανομένων LN μετάσταση.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ανθρώπινων ιστών και κλινικά δεδομένα

Πενήντα εννέα ενήλικες ασθενείς διαγνώστηκαν με EGC στο Εθνικό Κέντρο Καρκίνου, την Κορέα, από Ιανουάριος 2011-Απρίλιος 2013 ήταν προοπτικά περιλαμβάνονται στο αυτή η μελέτη. Αυτοί οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ανοιχτή ή λαπαροσκοπική υποβοηθούμενη γαστρεκτομή με D1 + ή περισσότερα LN ανατομή. Η έκταση της LN ανατομή ακολούθησε τις συστάσεις της ιαπωνικής γαστρικός καρκίνος Ένωση [24]. Το στάδιο μετά την επέμβαση αξιολογήθηκε σύμφωνα με την 7

η έκδοση της American μεικτής επιτροπής σχετικά με το σύστημα σταδιοποίησης του καρκίνου TNM [25]. Ανθρώπινοι ιστοί συμπεριλαμβανομένων τόσο γαστρικού καρκίνου και συμφωνημένα φυσιολογικούς ιστούς από κάθε ασθενή καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Από την ανασκόπηση της ιατρικής διαγράμματα, κλινικοπαθολογική χαρακτηριστικά όπως η ηλικία, το φύλο,

Helicobacter pylori

ιδιότητα, τα χαρακτηριστικά του όγκου, το στάδιο, και το καθεστώς των LN μετάσταση ελήφθησαν και αναλύθηκαν. Ενημέρωσε γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς και η μελέτη εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review του Εθνικού Κέντρου Καρκίνου, την Κορέα (NCCNCS-11-445).

Κυτταρική καλλιέργεια και επιμόλυνση

Η ανθρώπινη φυσιολογική γαστρικού επιθηλίου κυτταρική σειρά HFE145 [26], [27] ήταν ένα δώρο από τον Δρ Χασάν Ashktorab και Duane T. Smoot (Πανεπιστήμιο Χάουαρντ, Washington, USA) και εμπορικά διαθέσιμα κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου AGS, YCC2, ΜΚΝ28, KATOIII, SNU 1 , SNU5, SNU 16, SNU216, SNU601, SNU638, SNU668 και SNU719 ελήφθησαν από την Κορέα Κυτταρική Γραμμή Τράπεζα (KCLB, Σεούλ, Κορέα). Όλες οι κυτταρικές γραμμές διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 μέσο που περιέχει 10% ορό εμβρύου μόσχου (FBS) και 1% αντιβιοτικά (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Μεταξύ των κυτταρικών γραμμών γαστρικού καρκίνου, επιλέχθηκαν κυτταρικές γραμμές ΜΚΝ28 και SNU668 επειδή σπανίως εκφράζουν miRNA-135α, και επιλέχθηκαν κυτταρικές γραμμές YCC και KATOIII επειδή έχουν μια ουσιαστική βασική έκφραση του miRNA-135α (Σχήμα 1Α). Διαμολύνσεις με μιμείται miRNA-135α (mirVana ™ miRNA μιμείται, Ambion, Austin, TX, USA), έναν αναστολέα miRNA-135α (αναστολέας mirVana ™ miRNA, Ambion, Austin, TX, USA), και ROCK1 siRNA (5′-UGAUGCAAAGAUUGUACUC- 3 ‘? UGBioneer, Σεούλ, Κορέα) σε SNU668, YCC2, ΜΚΝ28, και κυτταρικές γραμμές KATOIII διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Lipofectamine RNAiMAX και αντιδραστήρια Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. ΜΚΝ28, SNU668, YCC2, και KATOIII κυτταρικές γραμμές συλλέχθηκαν δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, και διάφορες αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν.

(Α) έκφραση miRNA-135α, εξετάστηκαν με ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR, ρυθμίζεται προς τα κάτω σε γαστρικά καρκινικά κύτταρα συγκριτικά με φυσιολογικά κύτταρα γαστρικού βλεννογόνου (HFE 145 κύτταρα). (Β) σχετική έκφραση miRNA-135α του ιστού όγκου σε σχέση με τα αντίστοιχα κανονικά με πραγματικού χρόνου PCR ανάλυση σύμφωνα με το στάδιο του ασθενούς.

* Ασθενείς με πιο προχωρημένο στάδιο του καρκίνου (στάδιο ΙΒ ή μεγαλύτερο) παρουσιάζουν σημαντικά κάτω-ρυθμίζονται miRNA- επίπεδα έκφρασης 135α σε ιστούς όγκων σε σύγκριση με τα επίπεδα σε ασθενείς με λιγότερο προχωρημένο στάδιο (στάδιο ΙΑ) καρκίνο (μέση τιμή 9,97 έναντι 2,30, p = 0,009). (C) Σχετική έκφραση miRNA-135α του ιστού όγκου σε σχέση με την κανονική τους ομολόγους τους σε πραγματικό χρόνο ανάλυση PCR ανάλογα με την κατάσταση της μετάστασης LN. Οι ασθενείς με μετάσταση LN δείχνουν σημαντικά κάτω ρυθμισμένα επίπεδα έκφρασης miRNA-135α σε ιστούς όγκου (σε σύγκριση με τα αντίστοιχα φυσιολογικούς ιστούς) από ότι οι ασθενείς χωρίς LN μετάσταση (μέση 9,63 vs. 0.61, ρ = 0.002). * 7

ου αμερικανική μεικτής επιτροπής για τον Καρκίνο TNM στάσης.

Η

εκχύλιση RNA και miRNAs ποσοτικοποίηση

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από 13 κυτταρικές σειρές και 59 ιστούς γαστρικό ασθενείς με καρκίνο », αντίστοιχα, με τη χρήση ΤΚΙζοΙ (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Χρησιμοποιήθηκε η TaqMan καθολική PCR αντιδραστήρια κύριο μείγμα κιτ (Applied Biosystems, Tokyo, Japan). Ενίσχυση και ανίχνευση πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα 7900HT Σύστημα Ανίχνευσης Αλληλουχίας (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) με 40 κύκλους μετουσίωσης στους 95 ° C (15 δευτερόλεπτα) και ανασύνδεσης /επέκτασης στους 60 ° C (60 δευτερόλεπτα). Αυτό προηγήθηκε με ανάστροφη μεταγραφή στους 50 ° C για 30 λεπτά και μετουσίωση στους 95 ° C για 10 λεπτά. Για την ποσοτικοποίηση ώριμη miRNAs, TaqMan microRNA Αναλύσεις κιτ (Applied Biosystems, Tokyo, Japan) χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των miRNA-135α και ελέγχου miRNA (RNU6B).

ανάλυση Western blot

Η πρωτεΐνη ήταν εξάγεται από 13 κυτταρικές γραμμές και 59 δείγματα ιστών ασθενών EGC »χρησιμοποιώντας ρυθμιστικό RIPA (Biosesang, Σεούλ, Κορέα) που περιλαμβάνει ένα κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) σύμφωνα με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε με τη χρήση αντι-ROCK1 και αντι-β-ακτίνης (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) αντισώματα. Σήματα ανιχνεύθηκαν με μια προνομιακή κιτ ECL (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

προσδιορισμούς πολλαπλασιασμού κυττάρων

πολλαπλασιασμός των κυττάρων μετρήθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία ΜΤΤ. Τα κύτταρα επιστρώθηκαν σε πλάκες καλλιέργειας 96 φρεατίων (3 χ 10

3 κύτταρα ανά φρεάτιο) και επιμολύνονται με μιμείται miRNA-135α μετά από δύο ημέρες επώασης. Ακολούθως, 200 μΙ ΜΤΤ (0,5 mg /ml, Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Μετά από τέσσερις ώρες επιπλέον επώασης, διαλύματα ΜΤΤ απορρίφθηκαν, 200 μΙ DMSO (Amresco, Solon, ΟΗ, USA) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, και η πλάκα ανακινήθηκε απαλά. Η απορρόφηση μετρήθηκε σε αναγνώστη ELISA (Moecular Devices, Sunnyvale CA, USA) σε δοκιμαστικό μήκος κύματος 570 nm.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Τα κύτταρα τοποθετούνται σε πλάκες καλλιέργειας 60π και επιμολύνθηκαν με miRNA -135a μιμείται ή miRNA μιμείται αρνητικό μάρτυρα (μιμείται-NC). Αυτά τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη για τουλάχιστον δύο ώρες στους -20 ° C. Τα κυτταρικά ιζήματα πλένονται με ψυχρό αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό και επωάστηκε για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου σε PI /RNase ρυθμιστικό υλικό κηλιδώσεως (BD Biosciences, San Diego, CA, USA). Μετά τη χρώση, τα δείγματα αναλύθηκαν με FACScan κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) και 10.000 συμβάντα συλλέχθηκαν ανά δείγμα. Τα δεδομένα από κυτταρομετρία ροής αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό Cell Quest (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Δοκιμασίες

μετανάστευση Trans-φίλτρο και εισβολή

Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με μιμείται miRNA-135α , αναστολείς miRNA-135α, ROCK1 siRNA, και ROCK1 siRNA αρνητικού ελέγχου (scRNA) για μία ημέρα και στη συνέχεια μεταφέρθηκε στον άνω θάλαμο της πλάκας transwell επικαλύπτονται με 0,5 mg τύπο /ml κολλαγόνο Ι (BD Bioscience, Bedford, ΜΑ, USA) και μία αραίωση 1:15 Matrigel (BD Bioscience, Bedford, ΜΑ, USA). RPMI 1640 με 10% FBS και 1% αντιβιοτικά (Gibco BRL, Grand Island, ΝΥ, USA) προστέθηκε στον κάτω θάλαμο και η πλάκα από επώαση για 20 ώρες. Μετεγκατάσταση και εισβάλλοντα κύτταρα προσδιορίστηκαν ποσοτικά χρησιμοποιώντας βαφή αιματοξυλίνης και ηωσίνης.

Το πλασμίδιο αναφοράς λουσιφεράσης κατασκευές

Ο άγριου τύπου 3 ‘UTR του ROCK1 περιέχουν θέσεις σύνδεσης για miRNA-135α ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας gDNA από SNU668 κύτταρα ως μήτρα. Οι συσχετισμένων μεταλλαγμένο κατασκευάσματα δημιουργήθηκαν με μετάλλαξη των περιοχών οι σπόροι των θέσεων σύνδεσης miRNA-135. Τόσο άγριου τύπου και μεταλλαγμένων 3 ‘UTR κλωνοποιήθηκαν σε κατάντη του γονιδίου της λουσιφεράσης σε ένα φορέα ελέγχου pGL3. Τα κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση.

δοκιμασία Λουσιφεράσης

λουσιφεράσης δοκιμασίες διεξήχθησαν σε κύτταρα SNU668 και YCC2. SNU668 και YCC2 κύτταρα επιμολύνθηκαν με κάθε ένα από τα πλασμίδια (κενός φορέας [MOCK], ROCK1 3 ‘UTR άγριου τύπου [WT], και ROCK1 3’ UTR μετάλλαγμα [MUT], ως θέση σύνδεσης miRNA-135α) μαζί με miRNA- 135α μιμείται, αναστολείς miRNA-135α, και του αρνητικού μάρτυρα RNA σε πλάκες 24 φρεατίων. Δύο ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και λύθηκαν. Λουσιφεράσης δοκιμασίες διεξήχθησαν επί των προϊόντων λύσεως με τη χρήση ενός κιτ δοκιμασίας λουσιφεράσης (Promega, Madison, WI, USA). δραστηριότητα λουσιφεράσης ομαλοποιήθηκε με την β-γαλακτοσιδάση.

χρώση

Η ανοσοϊστοχημική χρώση

Η ανοσοϊστοχημική (IHC) πραγματοποιήθηκε για τις αντιπροσωπευτικές 20 περιπτώσεις από τις ομάδες χαμηλής και υψηλής έκφρασης ROCK1. Το αντιγόνο ανάκτηση έγινε με θερμική επεξεργασία για 30 λεπτά σε ρΗ 8,0 ρυθμιστικό διάλυμα Tris-EDTA (CC1, Ventana Medical System, Tucson, ΑΖ, USA) στους 95 ° C. πλάκες ιστών επωάστηκαν στους 42 ° C για 30 λεπτά με αντι-ROCK1 mAb (ab134181, κλώνος EPR638Y, μονοκλωνικά κουνέλι, 1:5,000? Abcam, Cambridge, ΜΑ, USA). Οι αρνητικοί έλεγχοι χρησιμοποιήθηκαν ταυτόσημα με μη ανοσοποιημένα IgG κουνελιού. Τα αποτελέσματα ερμηνεύονται από έναν έμπειρο παθολογοανατόμο (MC Kook).

Η στατιστική ανάλυση

Κλίμακα Τα στοιχεία που δίνονται ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Chi-square ή ακριβής δοκιμές του Fisher και το Mann-Whitney U χρησιμοποιήθηκαν για τη σύγκριση κατηγορηματικές μεταβλητές και συνεχείς μεταβλητές, αντίστοιχα. Ο συντελεστής συσχέτισης Pearson χρησιμοποιήθηκε για τη σύγκριση του προτύπου έκφρασης γονιδίου μεταξύ miRNA-135α και ROCK1. Ένα πολυμεταβλητό μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης χρησιμοποιήθηκε για τον καθορισμό ανεξάρτητους παράγοντες που σχετίζονται με LN μετάσταση. Συμπαράγοντες που ήταν σημαντικές, χρησιμοποιώντας chi-τετράγωνο ή ακριβές εξετάσεις του Fisher (

P

& lt? 0,05) εισήχθησαν στο μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης. Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν με τη χρήση του λογισμικού STATA 12.1 (Stata Corp, College Station, TX, USA). Ένα

P

τιμή μικρότερη του 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική.

Αποτελέσματα

Τα επίπεδα έκφρασης των miRNAs-135α που σχετίζονται με την εξέλιξη και LN μετάσταση σε EGC

Μια προηγούμενη μελέτη έδειξε ότι η έκφραση miRNA-135α ρυθμίζεται προς τα κάτω σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου [23]. Με τη χρήση qRT-PCR, βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση miRNA-135α ρυθμίζεται προς τα κάτω σε διάφορες κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου σε σύγκριση με εκείνη σε ένα κανονικό γαστρικού επιθηλίου κυτταρική σειρά (Σχήμα 1Α).

Ωστόσο, ο συσχετισμός μεταξύ της έκφραση miRNA-135α και κλινικά αποτελέσματα σε γαστρικό καρκίνο δεν έχει διερευνηθεί. Συνεπώς, μετρήσαμε τα επίπεδα έκφρασης miRNA-135α σε πρωτογενείς γαστρικό καρκίνο και τα αντίστοιχα επίπεδα τους σε φυσιολογικούς ιστούς από 59 ασθενείς με EGC. Κατάντη και αυξητική ρύθμιση των γονιδίων σε ιστούς όγκων σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς ορίστηκαν ως ο λόγος του όγκου σε φυσιολογικά επίπεδα γονιδιακής έκφρασης ιστού του & lt? 1,0 και & gt?. 1.0, αντίστοιχα

Αντίθετα με το αποτέλεσμα του

in vitro

πείραμα, μόνο 20 (33,9%) των 59 ασθενών με EGC παρουσίασαν τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης των miRNAs-135α. Ωστόσο, αυτοί οι ασθενείς παρουσίασαν σημαντικά πιο προχωρημένο στάδιο (ΤΝΜ stage≥IB, 35,0% έναντι 12,8%, p = 0,045? Αναλογία αργού περίεργο [OR], 2,11? 95% διάστημα εμπιστοσύνης [CI], 01/08 έως 04/10) και υψηλότερο ποσοστό LN μετάστασης (30,0% έναντι 5,1%, p = 0,014? αργού Ή, 2,73? 95% CI, 1,50 – 4,98) από εκείνες με up-ρύθμιση της έκφρασης των miRNAs-135α (Πίνακας S1). Η ευαισθησία και η ειδικότητα της κατάστασης έκφρασης miRNA-135α για την πρόβλεψη του LN μετάστασης ήταν 75,0% και 72,5%, αντίστοιχα. Επιπλέον, οι ασθενείς με πιο προχωρημένο στάδιο (Εικόνα 1Β) ή LN μετάστασης (Εικόνα 1C) έδειξε μια σημαντικά χαμηλότερη αναλογία όγκου προς φυσιολογικά επίπεδα έκφρασης miRNA-135α από εκείνους με σταδίου ΙΑ ή χωρίς LN μετάσταση. Μια πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης έδειξε επίσης ότι miRNA-135α κάτω ρύθμιση συσχετίστηκε ανεξάρτητα με LN μετάσταση (προσαρμογή OR, 8,04? 95% CI, 1,08 έως 59,81? P = 0,042? Πίνακας 1). Συλλογικά, τα ευρήματα αυτά υποδηλώνουν ότι η προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης των miRNAs-135α μπορεί να σχετίζεται με το γαστρικό εξέλιξης του καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων LN μετάσταση.

Η

miRNA-135α καταστέλλει τη βιωσιμότητα του γαστρικού καρκίνου των κυττάρων, EMT, η μετανάστευση και την εισβολή

για να διερευνηθεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ miRNA-135α και τα κλινικά αποτελέσματα, πραγματοποιήσαμε λειτουργικές δοκιμασίες για τη βιωσιμότητα των κυττάρων, του κυτταρικού κύκλου, EMT, μετανάστευση, και εισβολή σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου. Η υπερέκφραση του miRNA-135α με μιμείται miRNA-135α κατέστειλε σημαντικά την βιωσιμότητα των κυττάρων (Σχήμα 2Α) και αύξησε την subdiploid κλάσμα SNU668 κύτταρα, μία κυτταρική γραμμή που σπάνια εκφράζει miRNA-135α (Σχήμα 2Β), γεγονός που υποδηλώνει την αυξημένη απόπτωση των γαστρικών καρκινικών κυττάρων. Ωστόσο, η καταστολή της miRNA-135α από τους αναστολείς miRNA-135α που προκαλείται ούτε μία αύξηση στην βιωσιμότητα των κυττάρων ούτε subdiploid μείωση κλάσματος σε YCC2 κύτταρα, μία κυτταρική γραμμή που εκφράζει σημαντικές miRNA-135α (Σχήμα 2Α και 2Β). Διερευνήσαμε επίσης τη συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης miRNA-135α και EMT στο γαστρικό καρκινικά κύτταρα, επειδή miRNA-135α κάτω ρύθμιση ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για LN μετάστασης σε ασθενείς EGC (Πίνακας 1). Αυξημένη έκφραση του miRNA-135α συνδέθηκε με την καταστολή της ΕΜΤ και έδειξε μια αύξηση στην έκφραση της Ε-καδερίνης και την καταστολή τόσο της Ν-καδερίνης και Slug σε SNU688 κύτταρα. Σε αντίθεση, η αναστολή της έκφρασης miRNA-135α σαν αποτέλεσμα την ενεργοποίηση του ΕΜΤ συμπεριλαμβανομένης της καταστολής της έκφρασης Ε-καδερίνης και του πάνω ρύθμιση τόσο Ν-καντερίνης και έκφραση Slug σε YCC2 κύτταρα (Σχήμα 2C). Κατά την εκτίμηση για λειτουργικές συνέπειες, η υπερέκφραση του miRNA-135α από μιμείται miRNA-135α κατέστειλε σημαντικά τις μετανάστευση και την εισβολή των ικανοτήτων των SNU668 γαστρικών καρκινικών κυττάρων (Σχήμα 2D). Αντιστρόφως, ο αποκλεισμός των miRNA-135α από τους αναστολείς miRNA-135α αύξησε σημαντικά τη μετανάστευση και την εισβολή του YCC2 γαστρικού καρκίνου κύτταρα (Σχήμα 2Ε). Συνολικά, τα αποτελέσματα μας πρότεινε ότι miRNA-135α είναι ένας ρυθμιστής κατασταλτικό όγκου για γαστρικό καρκίνο πολλαπλασιασμό και τη μετάσταση.

(Α) Up-ρύθμιση του miRNA-135α που επάγεται από μιμείται miRNA-135α καταστέλλει βιωσιμότητα γαστρικού καρκίνου κυττάρου σε SNU668 κυτταρική σειρά, μία κυτταρική γραμμή που σπάνια εκφράζει miRNA-135α (p = 0,012), ενώ οι αναστολείς miRNA-135α επηρεάζει σπάνια βιωσιμότητα των κυττάρων στην κυτταρική σειρά YCC2, μια κυτταρική γραμμή που εκφράζει ουσιαστικά miRNA-135α. (Β) Up-ρύθμιση του miRNA-135α με μιμείται miRNA-135α αυξάνει την subdiploid κλάσμα του DNA, όπως προσδιορίζεται με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής, γεγονός που υποδηλώνει αυξημένη απόπτωση σε SNU668 κύτταρα. (Γ) Με την παρουσία του μιμείται miRNA-135α, ανάλυση RT-PCR δείχνει ότι τα κύτταρα SNU668 έχουν αυξημένη έκφραση του mRNA του Ε-καδερίνης και καταστέλλει την έκφραση του mRNA τόσο της Ν-καντερίνης και Slug. Αντίθετα, στην παρουσία αναστολέων miRNA-135α, κύτταρα YCC2 παρουσιάζουν μειωμένη έκφραση του mRNA του Ε-καδερίνης και αυξημένη έκφραση του mRNA τόσο της Ν-καδερίνης και Slug σε ανάλυση RT-PCR. (Δ) Η υπερέκφραση του miRNA-135α χρησιμοποιώντας μιμείται miRNA-135α καταστέλλει σημαντικά τη μετανάστευση και την εισβολή των SNU668 κυττάρων. (Ε) Αναστολή των miRNA-135α χρήση αναστολέων miRNA-135α αυξάνει σημαντικά μεταναστευτικά και επεμβατική κύτταρα των κυττάρων YCC2. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD τριών τουλάχιστον πειραμάτων. NC, αρνητικός έλεγχος.

Η

ROCK1 είναι ένα γονίδιο στόχος των miRNA-135α σε γαστρικό καρκίνο

Για την διαλεύκανση των μηχανισμών που διέπουν τις επιδράσεις των miRNA-135α στην κλινική έκβαση, ψάξαμε υποθετικό στόχοι με τη χρήση της βάσης δεδομένων TargetScan 6.2. 718 συντηρημένη στόχους, έχουμε επιλέξει στόχους με την υψηλότερη βαθμολογία των οποίων τα κάτω ρύθμιση μπορεί να οδηγήσει σε αυξημένο πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή. Βρήκαμε ότι ROCK1 μπορεί να είναι ένα γονίδιο στόχος του miRNA-135α επειδή αναστολή ή καταστολή της ROCK1 έχει αναφερθεί ότι προάγουν απόπτωση και να καταστέλλουν τη μετανάστευση, εισβολή και εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων εκείνων του γαστρικού καρκίνου [28] – [30]. ανάλυση TargetScan αποκάλυψε ότι η αλληλουχία 3’UTR του ROCK1 έχει μία δυνατή θέση δέσμευσης για miRNA-135α (Σχήμα 3Α). Για να επιβεβαιώσει εάν ROCK1 είναι ο στόχος του miRNA-135α, ένας προσδιορισμός λουσιφεράσης εκτελέστηκε. Οι λουσιφεράσης 3’UTR κατασκευάσματα που περιγράφονται στο τμήμα των μεθόδων συν-επιμολύνεται σε κύτταρα με SNU688 μιμείται miRNA-135α και σε YCC2 κυττάρων με αναστολείς miRNA-135α. Κατασκευάσαμε επίσης ROCK1 3’UTR MUT από σημειακή μετάλλαξη C → G στην πιθανή θέση δέσμευσης (Σχήμα 3Α). Η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης της ROCK1 3’UTR WT ήταν σημαντικά αυξημένη με την παρουσία αναστολέων miRNA-135α (Σχήμα 3Β). Αντιστρόφως, η δραστηριότητα αυτή μειώθηκε σημαντικά με την παρουσία του μιμείται miRNA-135α (σχήμα 3C). Σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου, miRNA-135α και ROCK1 παρουσίασαν μια αντίθετη πρότυπο έκφρασης. Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε ότι η έκφραση ROCK1 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω υπό την παρουσία μιμείται miRNA-135α, και ρυθμίζεται προς τα πάνω υπό την παρουσία αναστολέων miRNA-135α (σχήμα 3D και 3Ε). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι miRNA-135α καταστέλλει την έκφραση ROCK1 με απευθείας στόχευση 3’ΙΙΤΡ του.

(α) την 3 ‘αλληλουχία UTR της ROCK1 έχει μια πιθανή θέση δέσμευσης για miRNA-135α, όπως καθορίζεται από ανάλυση TargetScan. Το 3 ‘UTR κατασκευάσματα για ROCK1 WT και MUT δείχνονται. (Β) Με την παρουσία των αναστολέων miRNA-135α, σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης της ROCK1 3 ‘UTR WT είναι σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με ROCK1 3’ UTR MUT σε SNU668 κύτταρα (p = 0,035). (Γ) Αντιθέτως, υπό την παρουσία μιμείται miRNA-135α, η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης των ROCK1 3 ‘UTR WT μειώνεται σημαντικά (p = 0,043), ενώ η σχετική δραστικότητα λουσιφεράσης του ROCK1 3’ UTR MUT δεν μειώνεται σε η κυτταρική σειρά YCC2. (Δ) ανάλυση Western blot δείχνει ότι η υπερέκφραση του miRNA-135α χρησιμοποιώντας μιμείται miRNA-135α καταστέλλει την έκφραση της πρωτεΐνης ROCK1 στην ΜΚΝ28 και SNU688 γαστρικά καρκινικά κύτταρα, τα οποία είναι κυτταρικές σειρές που σπάνια εκφράζουν miRNA-135α. (Ε) Αναστολή της miRNA-135α που σχετίζεται με αυξημένη έκφραση πρωτεΐνης σε ROCK1 YCC2 και ΚΑΤΟ III γαστρικά καρκινικά κύτταρα, τα οποία είναι κυτταρικές σειρές που εκφράζουν ουσιαστικά miRNA-135α. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD τριών τουλάχιστον πειραμάτων. WT, άγριου τύπου? MUT, μεταλλαγμένα? NC, αρνητικός έλεγχος.

Η

Η έκφραση της ROCK1 συσχετίζεται αντίστροφα με εκείνη των miRNA-135α σε ασθενείς με EGC

Ανάλυση των 59 ασθενών με EGC έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης της ROCK1 είχε σημαντικά αρνητική συσχέτιση με εκείνες των miRNA-135α (r = -0.697, p & lt? 0,001? Σχήμα 4Α). Επιπλέον, οι ασθενείς με προς τα πάνω ρύθμιση της έκφρασης miRNA-135α είχαν σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης πρωτεΐνης ROCK1 από εκείνους με ρύθμιση προς τα κάτω του miRNA-135α (μέση όγκου προς κανονικό αναλογία, 0.81 vs. 1.55, ρ & lt? 0,001? Σχήμα 4Β) .

(Α) έκφραση miRNA-135α μετρήθηκε με ανάλυση σε πραγματικό χρόνο PCR. Το επίπεδο της πρωτεΐνης ROCK1 αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση Western blot και ποσοτικά χρησιμοποιώντας πυκνομετρική μέθοδο. Σε 59 ασθενείς με πρώιμο καρκίνο του στομάχου, η έκφραση της ROCK1 δείχνει μια σημαντικά αρνητική συσχέτιση με εκείνη των miRNA-135α (r = -0,697, p & lt? 0.001). (Β) ανάλυση στυπώματος Western δείχνει ότι οι ασθενείς με έκφραση miRNA-135α ρυθμισμένα προς τα κάτω έχουν σημαντικά υψηλότερη έκφραση πρωτεΐνης ROCK1 σε ιστούς όγκου σε σύγκριση με την έκφραση σε φυσιολογικούς ιστούς αντίστοιχο (ρ & lt? 0.001).

Η

ROCK1 είναι που συνδέονται με την LN μετάσταση στο EGC και συμμετέχει στο γαστρικό μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων και την εισβολή καταστέλλεται από miRNA-135α

Για να αξιολογηθεί περαιτέρω η συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης ROCK1 και τα κλινικά αποτελέσματα σε EGC, αναλύσαμε τα μοτίβα έκφρασης ROCK1 στην αναφορά με την ιδιότητα μετάσταση LN των περιελάμβανε ασθενείς. Οι ασθενείς με μετάσταση LN είχαν σημαντικά υψηλότερη έκφραση πρωτεΐνης ROCK1 από εκείνους χωρίς LN μετάσταση (μέση όγκου προς κανονικό αναλογία, 1.86 vs. 0.93, ρ = 0.007? Σχήμα 5Α). Επιπλέον, τα επίπεδα της χρώσης ROCK1 IHC ήταν παρόμοια με αυτά της έκφρασης ROCK1 σε ανάλυση κηλίδας Western (

δηλαδή

, οι ασθενείς χωρίς LN μετάσταση είχε ασθενή μορφών κηλίδωσης [Σχήμα 5Β], αλλά εκείνοι με LN μετάσταση είχε ισχυρή χρώση θετική IHC [Σχήμα 5C)].

(Α) ανάλυση κηλίδας Western των 59 ασθενών πρώιμο γαστρικό καρκίνο δείχνει ότι οι ασθενείς με μετάσταση LN έχουν σημαντικά υψηλότερη έκφραση πρωτεΐνης ROCK1 από ασθενείς χωρίς LN μετάσταση (p = 0,007). Αντιπροσωπευτικά μικροσκοπικές εικόνες των τμημάτων του όγκου με ανοσοϊστοχημική χρώση (αρχική μεγέθυνση χ 100) δείχνουν ότι η (Β) οι ασθενείς νωρίς γαστρικού καρκίνου χωρίς LN μετάσταση δεν έχουν καμία έκφραση ROCK1 σε ιστούς όγκων, αλλά (Γ) εκείνες με LN μετάσταση έχουν ισχυρή έκφραση ROCK1 εντός του πυρηνικού μεμβράνη και κυτόπλασμα των ιστών όγκου. (D) ROCK1 siRNA καταστέλλει σημαντικά τη μετανάστευση (ρ & lt? 0.001) και εισβολή (p = 0,002) σε SNU668 γαστρικά καρκινικά κύτταρα. (Ε) ROCK1 έκφραση πρωτεΐνης αυξάνεται με αγωγή με αναστολείς miRNA-135α και μειώθηκε με κατεργασία με ROCK1 siRNA, και σχετίζεται με αυξημένο επίπεδο miRNA-135α σε YCC2 γαστρικά καρκινικά κύτταρα, υποδηλώνοντας ότι τα πρότυπα έκφρασης πρωτεΐνης ROCK1 συσχετίζονται αντίστροφα με εκείνα της έκφρασης miRNA-135α. (F) Όταν τα κύτταρα YCC2 θεραπεία με αναστολείς miRNA-135α, την εισβολή των κυττάρων και η μετανάστευση είναι παρόμοια ή ακόμη και αυξημένη σε σύγκριση με τους μάρτυρες. ROCK1 siRNA ή σε συνδυασμό ROCK1 siRNA και αναστολείς miRNA-135α μειώνουν τη μετανάστευση των κυττάρων (p = 0,003) και της εισβολής (p = 0,017). Αυτά δείχνουν ότι ROCK1 αντισταθμίζει τις κατασταλτικές επιδράσεις τόσο τη μετανάστευση και την εισβολή που προκαλείται από miRNA-135α. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι οι μέσες ± SD τριών τουλάχιστον πειραμάτων. LN, λεμφαδένων? NC, αρνητικός έλεγχος.

Η

Τέλος, για να διερευνηθεί κατά πόσο οι κατέστειλε τη μετανάστευση και την εισβολή των ικανοτήτων που απορρέουν από το miRNA-135α up-ρύθμιση που παρατηρείται σε κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου ήταν το αποτέλεσμα της ROCK1 πάνω ρύθμιση, εμείς πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς μετανάστευσης και εισβολή χρησιμοποιώντας κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου επιμολυσμένα με ειδικά ROCK1 siRNA. ROCK1 siRNA κατέστειλε μεταναστευτικών και επεμβατικές δραστηριότητες στην SNU668 κύτταρα (Σχήμα 5D). Σε κύτταρα YCC2 συν-επιμολύνθηκαν με αναστολείς miRNA-135α και ROCK1 siRNA (Σχήμα 5Ε), δοκιμασίες μετανάστευσης και εισβολή έδειξαν ότι η αναστολή της ROCK1 με siRNA μετρίασε σημαντικά τις ενισχύοντας μεταναστευτικών και επεμβατική επιδράσεις των miRNA-135α τα κάτω ρύθμιση από τους αναστολείς miRNA-135α (Σχήμα 5F).

Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι ROCK1 σχετίζεται με LN μετάσταση σε ασθενείς EGC, και ότι αυτό προκύπτει από την αυξημένη έκφραση ROCK1 στο πλαίσιο των miRNA-135α τα κάτω ρύθμιση. Ως εκ τούτου, ROCK1 μπορεί να εμπλέκονται σε miRNA-135a-κατέστειλε γαστρικό μετάσταση του καρκίνου.

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι miRNA-135α είχε όγκου κατασταλτική ρόλους σε καρκίνο του στομάχου. Σε ασθενείς με EGC, ρύθμιση προς τα κάτω του miRNA-135α ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας κινδύνου για LN μετάστασης. Σε γαστρικό καρκινικά κύτταρα, τα επάνω ρυθμισμένη miRNA-135α καταστέλλεται γαστρική καρκινογένεση καταστέλλοντας τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, ΕΜΤ και της μετάστασης. Επιπλέον, προσδιορίσαμε επίσης ένα νέο γονίδιο στόχο του miRNA-135α, ROCK1, η οποία σχετίζεται με LN μετάσταση σε καρκίνο του στομάχου.

Σε ασθενείς με EGC, αξιολόγηση των LN μετάστασης πριν τη θεραπεία είναι ένα σημαντικό βήμα στον καθορισμό στρατηγικών θεραπείας. Λιγότερο επεμβατικές θεραπείες όπως ενδοσκοπική εκτομή [5] – [7] ή χειρουργική πλοήγηση φρουρός LN [9], [10] μπορεί να είναι δυνατό σε ασθενείς EGC χωρίς LN μετάσταση. Αυτές οι θεραπευτικές προσεγγίσεις έχουν βελτιώσει την ποιότητα ζωής των ασθενών σε σχέση με τα τέλη επιπλοκές που σχετίζονται με το πρότυπο χειρουργικές θεραπείες συμπεριλαμβανομένου του συνδρόμου ντάμπινγκ, απώλεια βάρους, και τα συμπτώματα παλινδρόμησης σχετίζονται [31]. Ως εκ τούτου, είναι πιο συγκεκριμένη και ευαίσθητη βιοδεικτών που απαιτούνται για την πρόβλεψη της κατάστασης της LN μεταστάσεων σε ασθενείς με EGC. Στην παρούσα μελέτη, miRNA-135α κάτω ρύθμιση ήταν ένας ανεξάρτητος παράγοντας για την LN μετάσταση, και την αξία πρόβλεψης της κατάστασης έκφρασης των miRNAs-135α ήταν σχετικά υψηλή, με ευαισθησία 75% και ειδικότητα 73%. Αν και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες επικύρωσης χρειάζεται, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η μέτρηση των επιπέδων miRNA-135α πριν από τον προσδιορισμό του σχεδίου θεραπείας για ασθενείς EGC θα μπορούσε να είναι ένα χρήσιμο τεστ για την πρόβλεψη της κατάστασης LN.

Είναι ενδιαφέρον, miRNA-135α έχει αναφερθεί να είναι κατασταλτικό του όγκου και ογκογόνο. Η υπερέκφραση του miRNA-135α έχει συσχετιστεί με την καταστολή του πολλαπλασιασμού των όγκων και της ανάπτυξης σε καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [21], καθώς και με την αυξημένη απόπτωση και την καλύτερη ελεύθερη νόσου επιβίωση σε λέμφωμα [22]. Σε αντίθεση, miRNA-135α ενεπλάκη σε καρκίνο του παχέος εντέρου εξέλιξης [32] και σε αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων του μαστού και εισβολή [33]. Στην παρούσα μελέτη, miRNA-135α φάνηκε να είναι ένα κατασταλτικό του όγκου miRNA, η οποία είναι σε συμφωνία με το αποτέλεσμα μιας προηγούμενης μελέτης [23]. Ειδικά, η υψηλότερη έκφραση του miRNA-135α κατέστειλε αρκετά στάδια της γαστρικής καρκινογένεσης συμπεριλαμβανομένων πολλαπλασιασμός, μετανάστευση, και διείσδυση. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι miRNA-135α ενδέχεται να καταστέλλουν EMT, η οποία έχει αναφερθεί ότι συσχετίζεται με την έναρξη της διαδικασίας πολλαπλών βημάτων της καρκινογένεσης και της προώθησης της μετάστασης [34], [35]. Πριν από την παρούσα μελέτη, η συσχέτιση μεταξύ των miRNA-135α και EMT δεν έχει διερευνηθεί, αν και προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι miRNAs όπως miRNA-27 [19], η οικογένεια miRNA-200 [20], miRNA-7 [36] και miRNA-1228 [37] Καταστολή EMT μέσω των δικών τους γονιδίων-στόχων σε καρκίνο του στομάχου. Στο σύνολό τους, miRNA-135α είναι ένα κατασταλτικό όγκου miRNA στον καρκίνο του στομάχου.

Μια προηγούμενη μελέτη αναλύει 353 ανθρώπινο γαστρικό καρκινικούς ιστούς έδειξε ότι τα πρότυπα έκφρασης των miRNAs είναι ποικίλες και ότι ορισμένοι miRNAs συνδέθηκαν με την εξέλιξη και την πρόγνωση του γαστρικού καρκίνος [14]. Στη μελέτη, miRNA-135α είχε χαρακτηριστεί ως ένα ογκογόνο miRNA στον καρκίνο του στομάχου με βάση τα αποτελέσματα των αναλύσεων του DNA μικροσυστοιχιών. Ωστόσο, σε μια πρόσφατη [23] και μελέτη μας, miRNA-135α ενήργησε ως καταστολέας όγκου, παρά το υψηλό ποσοστό των ασθενών με miRNA-135α ανοδική ρύθμιση.