Αφηρημένο

Ιστορικό

Η διατήρηση των microRNAs σε μονιμοποιηθεί με φορμαλίνη και έχει εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστός καθιστά ιδιαίτερα χρήσιμα για μελέτες βιοδείκτη. Η χρησιμότητα των μικρών αλληλουχίας RNA για τη σκιαγράφηση έκφραση microRNA δείγματα FFPE έχει ακόμη καθοριστεί.

Μέθοδοι

Το συνολικό RNA εξήχθη από-παραφινοποιήθηκαν και πρωτεϊνάση Κ επεξεργασμένο δείγματα FFPE (15- 20 ετών), της 8ης ανθρώπινων όγκων αδενοκαρκίνωμα του πνεύμονα με χρωματογραφία συγγένειας σε στήλες διοξειδίου του πυριτίου. Τα microRNAs στα παρασκευάσματα RNA ποσοτικοποιήθηκαν με την πλατφόρμα αλληλούχιση Illumina HiSeq 2000 με βιβλιοθήκες αλληλούχιση παρασκευάζεται με το TruSeq Small RNA δείγματος Kit Παρασκευή (έκδοση 2.0) για να ληφθεί μη ζευγαρωμένα διαβάζει 50 b για μικρά θραύσματα RNA. Τα microRNAs επίσης ποσοτικά χρησιμοποιώντας Agilent Ανθρωπίνων miRNA (απελευθερώσει 16.0) μικροσυστοιχίες που μπορεί να ανιχνεύσει 1.205 ώριμη microRNAs και από ποσοτική αντίστροφη μεταγραφή (RT) -PCR δοκιμασίες.

Αποτελέσματα

Μεταξύ 9,1 έως 16.900.000 διαβάζει ελήφθησαν με μικρό RNA αλληλούχιση του εκχυλίζεται δειγμάτων RNA. Από αυτά, μόνο το 0,6 – 2,3% (μέσος όρος = 1,5%) αντιπροσωπεύεται microRNAs. Η μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας ανιχνεύονται 454-625 microRNAs /δείγματος (μέση τιμή = 550) σε σύγκριση με 200-349 (μέσος όρος = 286) microRNAs ανιχνεύεται από μικροσυστοιχιών. Σε αναλύσεις Spearman συσχέτιση, ο μέσος συντελεστής συσχέτισης για τις 126 microRNAs ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα από τις δύο μεθόδους ήταν 0.37, και & gt? 0,5 ​​για 63 microRNAs. Σε συσχέτιση αναλύσεις της sequencing- και μετρήσεις RT-PCR-based, οι συντελεστές ήταν 0,19 – 0,95 (μέσος όρος = 0,73) και & gt? 0,7, αντίστοιχα, για τα 7 από 9 εξετάστηκαν microRNAs. Η μέση μεταξύ επαναληπτικές Spearman συντελεστής συσχέτισης για την μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας ήταν 0.81.

Συμπεράσματα

Μικρές αλληλούχιση RNA μπορεί να χρησιμοποιηθούν για να ληφθούν προφίλ microRNA δειγμάτων ιστού FFPE με χαρακτηριστικά απόδοσης παρόμοια με εκείνα των μικροσυστοιχιών , παρά τον κατακερματισμό του ριβοσώματος και αγγελιοφόρο RNA που μειώνει την ενημερωτική ικανότητα της μεθόδου. Η ακρίβεια της μεθόδου μπορεί θεωρητικά να βελτιωθεί με την αύξηση του βάθους αλληλουχίας ή /και καταστρέφουν FFPE RNAs ιστού ριβοσωμικού RNA θραύσματα

Παράθεση:. Buitrago DH, Patnaik SK, Kadota K, KANNISTO Ε, Jones DR, Adusumilli PS (2015) Μικρές RNA αλληλουχίας για το προφίλ Τα microRNAs στο Long-Term Διατηρητέα φορμόλη-Σταθερή και ενσωματωμένες σε παραφίνη μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα όγκου δείγματα. PLoS ONE 10 (3): e0121521. doi: 10.1371 /journal.pone.0121521

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Soheil Σ Dadras, Πανεπιστήμιο του Κονέκτικατ Κέντρο Υγείας, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 27 του Αύγ 2014? Αποδεκτές: τρίτης Φεβρουαρίου 2015? Δημοσιεύθηκε: 26 Μαρτίου του 2015

Copyright: © 2015 Buitrago et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. εργαστηριακό έργο των συγγραφέων υποστηρίζεται από επιχορηγήσεις από τα Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (R21 CA164568-01A1, R21 CA164585-01A1, R01 CA136705-06, U54 CA137788, Ρ30 CA008748, και Ρ50 CA086438-13), το Υπουργείο άμυνας των ΗΠΑ (PR101053 και LC110202), και ο κ William H. Goodwin και η κα Αλίκη Goodwin, το Ίδρυμα της Κοινοπολιτείας για την Έρευνα του Καρκίνου, και το Experimental Therapeutics Κέντρο Memorial Sloan Kettering,. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Δύο από τους συν-συγγραφείς αυτού του χειρογράφου (ΠΠ και SKP) είναι PLoS ONE Editorial μελών του Διοικητικού συμβουλίου. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων να PLoS ONE πολιτικές και τα κριτήρια σύνταξης.

Εισαγωγή

Τα microRNAs είναι μονόκλωνο, μη-κωδικοποίησης RNA των 18-25 νουκλεοτιδίων σε μήκος που λειτουργούν ως επιγενετική ρυθμιστές με αναστολή της μετάφρασης πρωτεΐνης από ή επάγει αποικοδόμηση του αγγελιοφόρου RNA (mRNA) ότι στοχεύουν [1, 2]. Οι Τα microRNAs εμπλέκονται στην κρίσιμη βιολογικές διεργασίες, όπως ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, τη διαφοροποίηση και την απόπτωση [3], και η απορύθμιση των microRNAs έχει καταδειχθεί σε έναρξη και την εξέλιξη μιας ποικιλίας ανθρώπινων κακοηθειών [4-8]. Χαρακτηρισμός της έκφρασης microRNA υπήρξε χρήσιμη στην ταξινόμηση, τη διάγνωση και την πρόγνωση των διαφόρων κακοηθειών [9-12].

δείγματα ιστών που έχουν διασωθεί μέσω καθήλωσης σε φορμόλη είναι μια πολύτιμη πηγή για αναδρομικές μελέτες. Λόγω της απλότητάς του και το χαμηλό κόστος, τεράστιες ποσότητες των κλινικών δειγμάτων ρουτίνας αρχειοθετούνται μετά την μονιμοποίηση φορμαλίνης. Σε αντίθεση με mRNAs, microRNAs διατηρούν καλά σε σταθεροποιημένο με φορμαλίνη ιστού λόγω της πολύ μικρής μήκος τους [13, 14]? Αυτό επιτρέπει τη χρήση τέτοιων ιστών για τις μετρήσεις microRNA για κλινική και ερευνητικούς σκοπούς. προφίλ microRNA φορμαλίνη σταθερών και εμπεδωθεί με παραφίνη (FFPE) ιστούς είναι συγκρίσιμες με εκείνες που λαμβάνονται από συμφωνημένα, φρέσκα-κατεψυγμένα δείγματα ιστού (π.χ., [15, 16-19]), υπογραμμίζοντας την καταλληλότητα των FFPE δείγματα ως κατάλληλους πόρους για microRNA αναλύσεις έκφρασης. Ένας μεγάλος αριθμός μελετών σχετικά με το βιολογικό ρόλο, καθώς και χρησιμότητα βιοδείκτη των microRNAs έχουν ως εκ τούτου έχουν πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας δείγματα FFPE (π.χ., [20, 21]).

Οι μικροσυστοιχίες υβριδισμός χρησιμοποιούνται συνήθως για την παγκόσμια προφίλ έκφραση microRNA της δείγματα FFPE. Μικρές αλληλουχίας RNA έχει αναδειχθεί ως μια νέα τεχνολογία για τη σκιαγράφηση έκφραση microRNA. Προσφέρει τα πλεονεκτήματα της υψηλής ευαισθησίας και ειδικότητας, η ανίχνευση και των δύο νέων και γνωστών microRNAs, ταυτοποίηση των πολυμορφισμών αλληλουχίας microRNA και την επεξεργασία, και απλούστερη στρατηγικές κανονικοποίηση των δεδομένων για τη σύγκριση δειγμάτων [22]. Με το κόστος του επαρκώς ενημερωτικό προσδιορισμούς αλληλούχισης RNA που προσεγγίζει εκείνη των μικροσυστοιχιών και με τις βελτιώσεις να ευχρηστία και την ευρωστία των μεθόδων για την ανάλυση δεδομένων αλληλούχισης RNA, μικρά αλληλούχιση RNA είναι πιθανό να χρησιμοποιηθεί πιο συχνά από ό, τι μικροσυστοιχίες στο εγγύς μέλλον. RNA σε δείγματα FFPE τροποποιείται χημικά μέσω σταυροειδών δεσμών λόγω της φορμαλδεΰδης και είναι σημαντικά κατακερματισμένη [23] με οξείδωση από την έκθεση στον αέρα, τη δραστηριότητα των ενδογενών ριβονουκλεάσες κατά τη διάρκεια της στερέωσης, και η χρήση υψηλών θερμοκρασιών κατά την διάρκεια της διαδικασίας ενσωματώσεως παραφίνης. Αποδόμηση του RNA εμφανίζεται επίσης κατά τη διάρκεια της απομόνωσης της από δείγματα FFPE, η οποία περιλαμβάνει παρατεταμένη έκθεση σε υψηλές θερμοκρασίες (55 ° C-70 ° C). Μικρά θραύσματα του ριβοσωμικού RNAs (rRNAs) και mRNAs που προκύπτουν από την αποικοδόμηση τους ανταγωνίζονται μικρών RNA (π.χ., microRNAs) κατά τη διάρκεια προσδιορισμού σειράς RNA. Για παράδειγμα, Sanger προσδιορισμό αλληλουχίας DNA των cDNA κλωνοποιηθεί από FFPE RNA ιστού δείχνει ότι πάνω από το 80% των 18-25 νουκλεοτιδίων μεγέθους μικρών RNAs σε FFPE ιστούς είναι θραύσματα του rRNAs και RNA μεταφοράς [24]. Παρά αυτές τις δυσμενείς επιπτώσεις της καθήλωσης με φορμαλίνη, είναι θεωρητικά δυνατό να προφίλ microRNAs σε ιστούς FFPE εάν αλληλούχιση RNA πραγματοποιείται με κατάλληλο βάθος. Ως εκ τούτου, επιδιώξαμε να εξετάσει τη σκοπιμότητα της μικρής αλληλουχίας RNA για την ποσοτικοποίηση των microRNAs σε δείγματα FFPE. Όταν ξεκινήσαμε αυτό το έργο, υπήρχε μόνο μία δημοσιευμένη μελέτη που είχε προσπαθήσει να αντιμετωπίσει αυτό το ζήτημα [25].

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική δήλωση

Αυτή η μελέτη διεξήχθη με σιωπηρή γραπτή και εν επιγνώσει συναίνεση των συμμετεχόντων και έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό συμβούλιο Institutional Review του Memorial Sloan Kettering, (MSK) στη Νέα Υόρκη, Νέα Υόρκη (IRB αριθμός WA0269-08).

δείγματα

όγκου

χρησιμοποιήθηκαν δείγματα FFPE 8 θεραπείας-αφελή μοναχικό όγκοι του αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα παθολογικές σταδίου Ι εκτομή σε MSK μεταξύ Ιανουαρίου 1995 και Δεκεμβρίου 1999. Οι 8 όγκοι ήταν από ένα σύνολο περιπτώσεων αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα σταδίου Ι που έχουν περιγραφεί προηγουμένως [26, 27]. Έλασης τμήματα 4 μm και πάχος 20 μm ελήφθησαν από τα δείγματα για την εκχύλιση RNA. Οι τομές 4 μm βάφηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη για ιστολογική αξιολόγηση κάτω από το μικροσκόπιο BX51 (Olympus, Tokyo, Japan) για να διασφαλιστεί ότι το RNA εκχυλίστηκε από ιστό με & gt? Περιεκτικότητα όγκου 70%

εξαγωγή RNA και ποσοτικοποίηση.

Ολικό RNA απομονώθηκε από 4 τμήματα, ή περίπου 3 mm

3 κάθε όγκου, χρησιμοποιώντας την περιστροφή συγγένεια στήλη με βάση υψηλής καθαρότητας FFPE Απομόνωση RNA Kit (Roche, Indianapolis, USA). Το RNA ποσοτικοποιήθηκε μέσω φασματοφωτομετρία απορρόφησης σε ένα όργανο Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, USA) και μέσω RiboGreen χρωστικής φθορισμού σε ένα φθορισμόμετρο qubit (Life Technologies, Carlsbad, USA). Ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε ευκαρυωτικό οργανισμό ολικό RNA Pico τσιπ για Bioanalyzer 2100 (Agilent, Santa Clara, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής). Κλάσματα RNA φυλάχθηκαν στους -80 ° C.

δοκιμασίας Microarray του microRNAs

Οκτώ δείγματα RNA αναλύθηκαν εις διπλούν και σε ξεχωριστά πειράματα μικροσυστοιχιών για τα δύο σύνολα των επαναλήψεων. Η 8x60k Agilent SurePrint G3 Ανθρωπίνων miRNA (απελευθερώσει 16.0) πλατφόρμα μικροσυστοιχιών [28] χρησιμοποιήθηκε. Η πλατφόρμα αυτή μπορεί να ανιχνεύσει 1.205 ανθρώπων και των 287 ανθρώπινα ιογενή ώριμη microRNAs. Για καθένα από αυτά τα microRNAs και ελέγχου RNAs, η μικροσειρά έχει 1-4 διαφορετικών ανιχνευτών DNA του 40-60 β? κάθε ένα από αυτά συντέθηκε στη μικροσυστοιχία κατά 10-40 κηλίδες διαμέτρου 30 μm. RNA (120 ng) σημάνθηκε με 3 ‘, 5′-κυτιδίνη διφωσφορικής με χρωστική κυανίνης που συνδέεται στο 3’ φωσφορικό και υβριδοποιήθηκαν σε 45 μΐ σε μια μικροσυστοιχία για 20 ώρες στους 45 ° C υπό περιστροφή κατά 1/3 Hz, χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια και μεθόδους που παρέχονται με το Complete Σήμανση Agilent miRNA και υβριδισμός Kit. Μετά το πλύσιμο μετα-υβριδισμού, slides μικροσυστοιχιών σαρώθηκαν σε ένα Agilent G2505C μικροσυστοιχιών σαρωτή και τα δεδομένα από τις εικόνες που εξήχθη χρησιμοποιώντας Agilent λογισμικού Feature Extraction (έκδοση 9.5.3). Ανεπεξέργαστα δεδομένα μικροσυστοιχιών κατατέθηκε στο NCBI Gene Expression Omnibus αποθετήριο [29] (αριθμός ένταξης GSE57835).

Μικρές RNA αλληλουχίας

Ένα μg RNA χρησιμοποιήθηκε για να δημιουργήσει μια μικρή βιβλιοθήκη αλληλουχίας RNA χρησιμοποιώντας αντιδραστήρια και οι μέθοδοι που παρέχονται με TruSeq Μικρές RNA δείγματος Prep Kit version 2 (Illumina, San Diego, USA). Εν συντομία, Τ4 RNA χρησιμοποιήθηκε για απολίνωση RA5 και RA3 ολιγονουκλεοτίδια RNA σε 5 ‘και 3’ άκρα του RNA, αντίστοιχα. Προσαρμογέας-προσδέθηκε RNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας έναν εκκινητή RTP και το προκύπτον cDNA ενισχύθηκε σε μια 11-κύκλος PCR που χρησιμοποιήθηκαν RP1 και ευρετήριο εκκινητές RP1. Τα προϊόντα PCR από 140-160 bp απομονώθηκαν μετά από ηλεκτροφόρηση σε 6% Novex γέλη Τρισ-βορικό πολυακρυλαμιδίου (Life Technologies). Ποιότητα της παραγόμενης μικρή βιβλιοθήκη αλληλουχίας RNA επιβεβαιώθηκε χρησιμοποιώντας Agilent Υψηλή DNA Kit ανάλυση ευαισθησίας σχετικά με Bioanalyzer 2100 μέσο. Quadruplexed αλληλουχίας των βιβλιοθηκών για τη δημιουργία ενιαίου τέλους διαβάζει 50 β διεξήχθη σε όργανο Illumina HiSeq 2000 χρησιμοποιώντας HiSeq ομαδοποίησης και αντιδραστήρια αλληλουχίας (έκδοση 2.0). Illumina HCS (έκδοση 1.4.8), RTA (έκδοση 1.12.4.2), και CASAVA (έκδοση 1.8.2) του λογισμικού χρησιμοποιήθηκαν για τη βάση-κλήση και την παραγωγή των πρώτων, τα δεδομένα αλληλουχίας de-πολυπλεξίας σε μορφή FASTQ. Δεδομένα πρωτογενών αλληλουχίας κατατέθηκε στο NCBI Ακολουθία Διαβάστε Αρχείο [30] (ένταξη αριθμός SRP047429).

Η αντίστροφη μεταγραφή (RT) -PCR αναλύσεις των μικρών RNAs

Εν συντομία, 50 ng RNA ήταν αντίστροφη μεταγραφή σε 15 μΐ χρησιμοποιώντας ένα microRNA-ειδικό ολιγονουκλεοτίδιο? αντιδραστήρια και μέθοδοι που παρέχονται στο κιτ TaqMan microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή (Life Technologies). Το cDNA (1,33 μΐ) χρησιμοποιήθηκε ως μήτρα σε πραγματικό χρόνο PCR των 40 κύκλων και 15 μΙ που πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν σε ένα μηχάνημα 7900HT (Life Technologies) με μετουσίωση για 15 s στους 95 ° C και σε συνδυασμό ανόπτηση και επέκταση για 60 s στους 60 ° C. SDS λογισμικού (έκδοση 2.4, Life Technologies) χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό του κύκλου ποσοτικοποίησης (C

q) τιμές με αυτόματο βασική γραμμή και ανίχνευση κατωφλίου. ολιγονουκλεοτίδια DNA που παρέχονται με προσδιορισμούς TaqMan microRNA RT-PCR [31] με αριθμούς αναγνώρισης 397, 509, 1097, 398, 526, και 2340 (Life Technologies), χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση ανθρώπινο ώριμο microRNAs

miR-21-5p

–

205-5p

, –

146b-5P

, –

22-3p

, –

223-3p

, και-

423-5p

, αντίστοιχα. Ζευγάρι microRNAs

miR-16-5p

, –

210-3p

, και-

486-5p

μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας προσαρμοσμένες αναλύσεις που σχεδιάστηκαν με βάση την αρχή της TaqMan δοκιμασίες microRNA RT-PCR και στη συνέχεια επικυρώνονται (αναφορές [31, 32] και S1 πίνακα). Όλοι οι προσδιορισμοί RT-PCR διεξήχθησαν σε ένα μόνο πείραμα και το σύνολο δεδομένων των πρώτων C

τιμές q ομαλοποιήθηκαν με τη χρήση της παγκόσμιας μέσης μέθοδο [33].

Επεξεργασία και αναλύσεις των μικροσυστοιχιών

δεδομένων

Πρώτες στοιχεία από όλες τις μικροσυστοιχίες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία μαζί με το πακέτο AgiMicroRna Bioconductor [34] (έκδοση 2.10.0) στο R (έκδοση 3.0.2). Εν συντομία, και σύμφωνα με τη βέλτιστη ροή εργασίας που προσδιορίζονται για την πλατφόρμα μικροσυστοιχιών [35], τη μέθοδο ισχυρό μέσο multi-chip (RMA) [36] χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά για τον ανιχνευτή που περιλήψεων χωρίς διόρθωση υποβάθρου? τα δεδομένα σε συστοιχίες στη συνέχεια κανονικοποιήθηκε με ποσοστημόριο μέθοδο. Μια ενιαία μικροσυστοιχιών ακραία ταυτοποιήθηκε με εξέταση των κανονικοποιημένων δεδομένων χρησιμοποιώντας σχετική έκφραση ημερολόγιο, χωρίς επίβλεψη ιεραρχική ομαδοποίηση, μεταξύ συστοιχία συσχέτισης, και κύρια οικόπεδα συστατικό? τα δεδομένα των πρώτων μικροσυστοιχιών εκ νέου επεξεργασία μετά την αφαίρεση του ακραία. αριθμούς αναγνώρισης ώριμο microRNA (MIMAT IDs) των microRNAs ανιχνεύσιμη με την πλατφόρμα μικροσυστοιχιών ελήφθησαν από το αποθετήριο ακολουθία miRBase microRNA [37] (έκδοση 20). Η αξία των IsGeneDetected σημαία, η οποία deermined από το λογισμικό Feature Extraction Agilent, χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί αν microRNAs είχαν εντοπιστεί από την πλατφόρμα.

Επεξεργασία και ανάλυση του RNA δεδομένα αλληλουχίας

Trimmomatic [38 ] (έκδοση 0.32) χρησιμοποιήθηκε για να τακτοποιήσει διαβάζει του προσαρμογέα και κακής ποιότητας βάσεις με αυτά τα κριτήρια, με σκοπό: (1) την απομάκρυνση ανάγνωσης τμήματα που ταιριάζουν αλληλουχίες των προσαρμογέων και εκκινητών που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή της βιβλιοθήκης αλληλουχίας? (2) αφαίρεση /κάτω βάσεις με Phred

33 βάσεων ποιότητας βαθμολογίας & lt? 3? (3) χρησιμοποιώντας ένα συρόμενο παράθυρο από 4 βάσεις, αφαιρέστε βάση τερματικό 5 ‘αν ο μέσος όρος Phred

33 βαθμολογία των 4 βάσεων ήταν & lt? 15? και (4) εντελώς απορρίψεων στολισμένα διαβάζει με & lt? 16 υπόλοιπες βάσεις. Για τον προσδιορισμό ώριμη έκφραση microRNA, miRExpress [39] (έκδοση 2.0) χρησιμοποιήθηκε για να χαρτογραφήσει την επεξεργασία διαβάζει κατά της ανθρώπινης προ-microRNA και ώριμες αλληλουχίες microRNA (miRBase απελευθερώσει 20). Οι προεπιλεγμένες ρυθμίσεις για miRExpress χρησιμοποιήθηκε κατά τη διάρκεια της διαδικασίας (ταυτότητα 100% μεταξύ ανάγνωσης και προ-microRNA ακολουθία για την ευθυγράμμιση, διαβάστε το μήκος ≥80% των ώριμων μήκους microRNA, και ≤4 επιπλέον ηγετική /πίσω βάσεις σε μια ανάγνωση σε σχέση με ώριμη ακολουθία microRNA ). Για να συνοψίσουμε τιμές καταμέτρηση του αναφέρει ότι αντιστοιχίζονται σε ένα ενιαίο ώριμο microRNA, αλλά πολλαπλές προ-microRNAs, χρησιμοποιήθηκε η στρογγυλεμένη μέση είτε η διάμεση τιμή του αριθμού των προ-microRNA-χαρτογράφηση, όταν η μέγιστη τιμή ήταν & lt? 50% ή ≥50% της ελάχιστης, αντίστοιχα. Η συνοψίζονται πρώτων ώριμων δεδομένα μέτρησης microRNA στη συνέχεια κανονικοποιούνται σε όλη δείγματα χρησιμοποιώντας την αποκομμένη μέση του Μ-τιμές μέθοδο (TMM) κανονικοποίηση, όπως αναφέρεται στο πακέτο Edger Bioconductor [40] (έκδοση 3.2.4). Για τον προσδιορισμό των βιότυποι του RNA (π.χ., mRNA, rRNA, microRNA, κλπ), ότι ο προσδιορισμός της αλληλουχίας διαβάζει εκπροσωπείται, subread-align λειτουργία του λογισμικού Subread aligner [41] (έκδοση 1.4.4) χρησιμοποιήθηκε για την ευθυγράμμιση επεξεργασία διαβάζει-με multi-χαρτογράφηση επιτρέπεται και ένα δείκτη στο ανθρώπινο γονιδίωμα (πρωτοβάθμια συνέλευση Ensembl GRCh37.75) άνευ διαστήματος γονιδιώματος. Η λειτουργία featureCounts [42] της Subread χρησιμοποιήθηκε στη συνέχεια, με multi-επικαλυπτόμενα επιτρέπεται, να προσδιορίσει βιότυπο των RNAs ‘ότι η αλληλούχιση διαβάζει εκπροσωπούνται μέσω εξέτασης των σχολιασμών των θέσεις γονιδιώματος που το διαβάζει χαρτογραφήθηκαν σε. GRCh37.75 δεδομένα γονίδιο σχολιασμού του Ensembl με & gt?. 25 διαφορετικές gene_biotype τιμές ιδιοτήτων χρησιμοποιήθηκε

Άλλες

Για τις αναλύσεις που εμπλέκονται σύγκριση των επαναλήψεων, κανονικοποιημένη μικροσυστοιχιών, και ομαλοποιημένη και συνδεθείτε

2-μετασχηματισμένα (με offset = 0.1) τα δεδομένα προσδιορισμού αλληλουχίας επιπλέον επεξεργασία με την παραμετρική λειτουργία την καταπολέμηση του πακέτου SVA Bioconductor [43] (έκδοση 3.6.0) για να ρυθμίσετε για την επίδραση παρτίδα ξεχωριστά μικροσυστοιχιών ή αλληλουχίας πειράματα που χρησιμοποιούνται για επαναλήψεις. Για τις αναλύσεις συσχέτισης, οι μετρήσεις microRNA κανονικοποιημένη microarray- και αλληλουχίας-based ήταν log

2-μετασχηματιστεί και RT-PCR με βάση κανονικοποιημένη C

μετρήσεις q για microRNAs ήταν αρνητικά-μεταμορφωθεί. Prism λογισμικό (έκδοση 6.0c? GraphPad, La Jolla, USA) χρησιμοποιήθηκε για την αποτύπωση δεδομένων. Ένα

P

-τιμή & lt? 0,05 συνδέθηκε με στατιστική σημαντικότητα. RT-PCR δοκιμασίες και οι αναλύσεις των δεδομένων έγιναν στο Roswell Park Cancer Institute, Buffalo, USA? όλες τις άλλες εργασίες ολοκληρώθηκαν σε MSK.

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Εμείς εξάγεται ολικό RNA από FFPE δείγματα εκτομή όγκων αδενοκαρκινώματος του πνεύμονα σταδίου Ι. RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας σίλικα μήτρα που περιέχει στήλες σπιν από περίπου 3 mm

3 του FFPE ιστού (n = 8) μετά από ολονύκτια χώνευση με πρωτεϊνάση Κ RNA αποδόσεις κυμάνθηκαν από 8.0-59.7 μg, όπως μετράται από την απορρόφηση στα 260 nm, αλλά 6,1 έως 34,6 μg, όπως ποσοτικοποιούνται με RiboGreen βαφής. Αυτό έχει μεγαλύτερη εξειδίκευση για RNA από ό, τι για το DNA (Σχ. 1Α) και υποδηλώνει την παρουσία του DNA στα παρασκευάσματα, όπως έχει παρατηρηθεί από άλλους [32]. Όπως ήταν αναμενόμενο, η δοκιμασία ηλεκτροφόρηση γέλης επί μέσου Bioanalyzer έδειξε ότι το RNA απομονώθηκε από τα δείγματα FFPE ήταν πολύ υποβαθμισμένη (Εικ. 1Β), με τιμές του ακεραιότητα του RNA που κυμαίνονται από 1.9-2.5 [44].

A. Συσχέτιση μεταξύ των μετρήσεων της απόδοσης RNA (μg) που λαμβάνεται χρησιμοποιώντας απορρόφηση στα 260 nm ή φθορισμού με RiboGreen χρωστική (n = 8). Οι γραμμές της ταυτότητας και η γραμμική παλινδρόμηση (μέθοδος ελαχίστων τετραγώνων) και αξίες και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης του συντελεστή Pearson (

r

) και η κλίση της γραμμικής παλινδρόμησης (

m

)?

Οι P-τιμές

σημείωσε επίσης. Β ηλεκτροφόρηση των δειγμάτων 8 RNA (

Μια

–

Η

). Τα δείγματα τρέχουν σε ένα τσιπ Agilent ευκαρυωτικό Ολικό RNA Pico επί Bioanalyzer 2100. Τα μεγέθη των δεικτών μοριακού βάρους και οι αριθμοί ακεραιότητα του RNA σημειώνονται.

Η

βιβλιοθήκες Sequencing δημιουργήθηκαν από 1 μg κάθε του συνόλου των δειγμάτων RNA με απολίνωση των RNAs προσαρμογέα στο 5 ‘και 3’ άκρα, που ακολουθείται από αντίστροφη μεταγραφή και PCR χρησιμοποιώντας το Illumina TruSeq Small RNA Kit προετοιμασία του δείγματος. Οι βιβλιοθήκες επιλεγμένου μεγέθους για αλληλούχηση του RNA θραύσματα 15-25 νουκλεοτίδια. Διεξήχθη αλληλούχιση επί της πλατφόρμας Illumina HiSeq 2000 για να ληφθεί μονής τέλος διαβάζει από 50 βάσεις. Μεταξύ 9,1 και 16,9 εκατ διαβάζει λήφθηκαν για καθένα από τα 8 δείγματα (μέσος όρος = 13,2 εκατομμύρια? SD = 3,5 εκατομμύρια? Πίνακας 1). Αφού το διαβάζει υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για την απομάκρυνση νουκλεοτιδικές αλληλουχίες των προσαρμογέων που χρησιμοποιούνται για την παρασκευή της βιβλιοθήκης και βάσεις χαμηλής ποιότητας, 67.6-% 83,4% (μέσος όρος = 76.8? SD = 4.5) του διαβάζει θα μπορούσε να χαρτογραφηθεί κατά τη συναρμολόγηση αναφοράς hg19 ανθρώπινο γονιδίωμα (Ensembl GRCh37.75 πρωτοβάθμια συνέλευση). Περισσότερο από το 90% του χαρτογραφηθεί αναγνώσεις ευθυγραμμίζονται κατά μεταγραφεί περιοχές του γονιδιώματος. Ωστόσο, μόνο το 0,14% -0,53% (μέση τιμή = 0,29? SD = 0,13) του διαβάζει χαρτογραφηθεί σε τόπους για microRNAs, ενώ 49,4% -54,6% και 34,8% -39,3% αντιστοιχίζονται σε περιοχές που κωδικοποιούνται για rRNAs και mRNA, αντίστοιχα (Πίνακας 1). Έτσι, μόνο ένα πολύ μικρό κλάσμα (περίπου 0,1% -0,5%) των μικρών RNAs των 15-25 νουκλεοτιδίων που απομονώθηκαν από τα δείγματα των ιστών FFPE ήταν microRNAs? η συντριπτική πλειοψηφία αυτών ήταν θραύσματα rRNA και mRNA.

Η

προφίλ έκφρασης microRNA εξήχθησαν από τα δεδομένα μικρά αλληλουχίας RNA χρησιμοποιώντας το εργαλείο miRExpress [39]. MiRExpress χαρτογραφηθεί 0,6% -2,2% του επεξεργασμένου αλληλουχίας διαβάζει για να ωριμάσουν τα ανθρώπινα microRNAs. Ανά miRBase microRNA απελευθέρωση της βάσης δεδομένων ακολουθίας 20 (Ιούνιος 2013), 2.620 ώριμη ανθρώπινη microRNAs ήταν γνωστό [37]. Συνολικά 1.021 microRNAs ανιχνεύθηκαν (χαρτογραφηθεί διαβάσετε καταμέτρηση ≥1) μεταξύ των 8 δείγματα, με 454 – 625 ανιχνεύεται ανά δείγμα (μέση τιμή = 550? SD = 69), και 283 ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα. Για την επικύρωση των μικρών μετρήσεις microRNA RNA αλληλούχιση με βάση, ποσοτικές αναλύσεις RT-PCR χρησιμοποιήθηκαν για την ποσοτικοποίηση 9 αυθαίρετα επιλεγεί microRNAs που κρίθηκαν όπως ανιχνεύεται τόσο από το μικροσυστοιχία και τις μικρές πλατφόρμες αλληλούχιση RNA σε όλα τα δείγματα 8 RNA. Σε Spearman αναλύσεις συσχέτισης των μετρήσεων που λαμβάνονται με microRNA RT-PCR και αλληλούχιση μικρών RNA, οι συντελεστές συσχέτισης ήταν 0,19 – 0,95 (μέσος όρος = 0,73? SD = 0,24). Η τιμή του συντελεστή ήταν & gt? 0.7 για 7 από τις 9 microRNAs (Πίνακας 2), υποδεικνύοντας έτσι μια μέτρια ακρίβεια της μεθόδου προσδιορισμού αλληλουχίας RNA. Για την εκτίμηση τεχνική δυνατότητα επανάληψης των microRNA προφίλ έκφρασης μέσω της μεθόδου προσδιορισμού αλληλουχίας, 2 από τα δείγματα 8 RNA υποβλήθηκαν σε μικρές αλληλούχιση RNA σε ένα διπλούν πείραμα. Η ενδο-αναπαράγουν συντελεστές συσχέτισης Spearman για τις διπλές μετρήσεις microRNA των 2 δειγμάτων ήταν 0,75 και 0,88 (Εικ. 2).

Η

Τα microRNAs σε 2 δείγματα (

Μια

και

Β

) έχουν προφίλ εις διπλούν από δύο μικρές πλατφόρμες αλληλουχίας RNA και μικροσυστοιχιών. Κερδοφόρα-οικόπεδα απεικονίζουν την μεταξύ επαναληπτικές συσχέτιση του κανονικοποιημένου μετρήσεις microRNA. Η αθροιστική κλάσμα microRNAs κατά μήκος του άξονα Χ (

μαύρη

), και οι τιμές του συντελεστή συσχέτισης Pearson των μετρήσεων microRNA σε ένα συρόμενο παράθυρο κατά μήκος του άξονα Χ του μεγέθους 51 στα μέσα του παραθύρου (

γκρι

) παρουσιάζονται επίσης.

η

η ποσοτικοποίηση των microRNAs μέσω υβριδισμού του RNA σε DNA ανιχνευτών σε μικροσυστοιχίες είναι σήμερα η πρότυπη μέθοδος για την παγκόσμια microRNA χαρακτηριστικών των ιστών FFPE. Για να εκτιμηθεί πιο διεξοδικά την απόδοση της μεθόδου προσδιορισμού αλληλουχίας μικρών RNA, μετρήσαμε microRNAs σε 120 ng από κάθε ένα από τα 8 δείγματα FFPE RNA ιστού χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα μικροσυστοιχιών Agilent 8x60k Ανθρώπινα miRNA, η οποία είναι ικανή να ανιχνεύει 1205 ώριμου ανθρώπινου microRNAs. Ένα σύνολο 368 microRNAs ανιχνεύθηκαν (IsGeneDetected αξία σημαία = 1) μεταξύ των 8 δείγματα, με 200-349 ανιχνεύονται ανά δείγμα (μέση τιμή = 286? SD = 45) και 175 ανιχνεύθηκε σε όλα τα δείγματα. Από αυτά τα 175 microRNAs, 126 ανιχνεύθηκαν επίσης σε όλα τα 8 δείγματα με τη μέθοδο μικρό αλληλούχιση RNA. Σε σύγκριση με την sequencing- RNA και μετρήσεις microRNA μικροσυστοιχιών-based, ο μέσος συντελεστής συσχέτισης Spearman Η για τα 126 microRNAs ήταν 0,37 και για τις 63 microRNAs ήταν & gt? 0.5. Συσχέτιση μεταξύ FFPE μετρήσεις microRNA ιστών που προέρχονται από μικρά πλατφόρμες αλληλουχίας RNA και μικροσυστοιχιών έχει επιβεβαιωθεί και από άλλες ομάδες [45-47].

δοκιμασίες microRNA μικροσυστοιχιών που βασίζεται είχαν αναπαραχθεί για 7 από τα 8 δείγματα RNA. Μετρημένες κατά μέσο όρο μεταξύ επαναληπτικές συντελεστής συσχέτισης Spearman 0,81, παρατηρείται με την μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας μικρό RNA, οι συντελεστές συσχετισμού μεταξύ επαναληπτικές για την πλατφόρμα μικροσυστοιχιών ήταν στην περιοχή 0,98 – 0,99 (μέσος όρος = 0,99? SD = 0,01). Ωστόσο, σε συσχέτιση Spearman ο αναλύσεις των μετρήσεων που λαμβάνονται με microRNA προσδιορισμούς RT-PCR και μικροσυστοιχιών, οι συντελεστές συσχέτισης ήταν -0,36 έως 0,84 (μέσος όρος = 0,22? SD = 0,55) και ήταν μικρότερες από αυτές που παρατηρούνται στις μετρήσεις προσδιορισμού αλληλουχίας που βασίζονται σε RNA (Πίνακας 2). Έτσι, ενώ η μικρή πλατφόρμα αλληλουχίας RNA ανιχνεύεται μεγαλύτερη ποσότητα των microRNAs με μεγαλύτερη ακρίβεια από την πλατφόρμα μικροσυστοιχιών, την ακρίβεια της δεν ήταν τόσο καλή. Ο Πίνακας 3 συνοψίζει τα χαρακτηριστικά απόδοσης που παρατηρήθηκαν στις 2 microRNA προφίλ πλατφόρμες που χρησιμοποιούνται στην παρούσα έκθεση.

Η

Συνολικά, τα ευρήματά μας αποδεικνύουν τη σκοπιμότητα των μικρών αλληλουχίας RNA για microRNA προφίλ των FFPE RNA ιστού παρά σε κίνδυνο την ποιότητα και την ακεραιότητά του. Ακόμα κι αν μόνο 1,54% του 12,1 εκατομμύρια μικρές αλληλούχιση RNA διαβάζει ιστών FFPE ταυτοποιήθηκαν ως αντιπροσωπεύει 550 γνωστά microRNAs σε αυτή τη μελέτη, ο αριθμός των microRNAs που ανιχνεύονται και προσδιορίζονται ποσοτικά ήταν περισσότερο από ότι με την πλατφόρμα μικροσυστοιχιών (Πίνακες 1 και 3). Οι συντελεστές συσχέτισης Spearman για τις μετρήσεις που λαμβάνονται από τις πλατφόρμες αλληλουχίας και μικροσυστοιχιών για τα μισά από τα 126 microRNAs που ανιχνεύθηκαν σε όλα τα δείγματα και από τις δύο πλατφόρμες ήταν & gt? 0.5. Σε συσχέτιση αναλύσεις της sequencing- και RT-PCR που βασίζεται σε μετρήσεις της εννέα microRNAs που εξετάστηκαν, οι συντελεστές ήταν & gt? 0,7 επί 7 (Πίνακας 2). Η τεχνική πολλαπλασιασμού της μεθόδου προσδιορισμού αλληλουχίας μικρών RNA ήταν, ωστόσο, σχετικά φτωχή σε σύγκριση με τη μέθοδο των μικροσυστοιχιών (μέσος όρος μεταξύ επαναληπτικές Spearman συντελεστές συσχέτισης των 0,81 και 0,99, αντίστοιχα? Πίνακας 3). Είναι κατανοητό ότι η ακρίβεια της μεθόδου προσδιορισμού αλληλουχίας θα μπορούσε να βελτιωθεί με την αύξηση του βάθους αλληλούχισης για να ληφθεί ένα μεγαλύτερο αριθμό διαβάζει και με τη χρήση μεθόδων προς καταστρέφουν rRNA από τα παρασκευάσματα RNA [48-50] ή να μειώσει την εκπροσώπηση του στην βιβλιοθήκη αλληλούχισης χρησιμοποιώντας στρατηγικές όπως «αστάρι δηλητήριο» αποκλεισμού [24].

Μόνο μία μελέτη [25], είχε αναφέρει ότι η σκοπιμότητα της χρήσης μικρών αλληλουχίας RNA για microRNA προφίλ των FFPE RNA ιστού, όταν ξεκινήσαμε την εργασία που περιγράφεται σε αυτή την χαρτί. Από τότε μέσα στο προηγούμενο έτος, τουλάχιστον 5 άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι η αλληλούχιση RNA μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ακρίβεια το προφίλ microRNAs στα δείγματα FFPE (S2 Πίνακας) [45-47, 51, 52]. Αυτές οι μελέτες πραγματοποιήθηκαν ως επί το πλείστον από κυτταρικές σειρές και ανθρώπινους ιστούς FFPE 2-9 ετών έχουν δείξει ότι τα προφίλ έκφρασης microRNA που προέρχονται από μικρά αλληλούχιση RNA είναι εξαιρετικά συγκλίνουσες μεταξύ FFPE και φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστούς [25, 47, 51, 52], και ότι μικρές αλληλουχίας RNA και μικροσυστοιχιών πλατφόρμες παράγουν παρόμοια προφίλ microRNA των ιστών FFPE [25, 47]. Τα ευρήματα αυτών και τις μελέτες μας πραγματοποιείται σε NSCLC δείγματα των 15 έως 20 ετών, επομένως, να αποδείξει ότι η μικρή αλληλουχίας RNA μπορεί να χρησιμοποιηθούν για την απόκτηση προφίλ microRNA των δειγμάτων ιστού FFPE με χαρακτηριστικά απόδοσης παρόμοια με εκείνα των μικροσυστοιχιών.

Υποστήριξη πληροφορίες

Πίνακας S1. Προσαρμοσμένη TaqMan microRNA αντίστροφης μεταγραφής (RT) -PCR δοκιμασίες για ανθρώπινη ώριμη microRNAs

miR-210-3p

και

miR-486-5p

Η doi:. 10.1371 /journal.pone. 0121521.s001

(DOCX)

S2 πίνακα. Έξι μελέτες που έχουν αξιολογηθεί αλληλουχίας RNA για προφίλ microRNAs σε φορμόλη σταθερά, ιστούς παραφίνης

doi:. 10.1371 /journal.pone.0121521.s002

(DOCX)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Alex Torres της Θωρακοχειρουργική Υπηρεσία σε MSK για την εκδοτική βοήθειά του.