Αφηρημένο

Ο μεταγραφικός παράγοντας, το δάχτυλο του ψευδαργύρου της παρεγκεφαλίδας (ZIC1), παίζει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη των σπονδυλωτών. Πρόσφατα, ZIC1 έχει βρεθεί επίσης να συμμετέχουν στην εξέλιξη ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων μυελοβλαστώματα, του ενδομητρίου, και μεσεγχυματικά νεοπλάσματα. Ωστόσο, η λειτουργία του ZIC1 σε εξέλιξης του καρκίνου του παχέος εντέρου δεν έχει οριστεί. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ZIC1 να σιωπήσουν ή σημαντικά προς τα κάτω σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτά τα αποτελέσματα αντιστράφηκαν με επεξεργασία απομεθυλίωση με 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (Αζα). ZIC1 έκφραση επίσης ρυθμίζεται προς τα κάτω σημαντικά σε πρωτογενή ορθοκολικό καρκινικούς ιστούς σε σχέση προς γειτονικούς ιστούς μη-όγκου (

σ

= 0.0001). Επιπλέον, η μεθυλίωση του γονιδίου υποκινητή ZIC1 συχνά ανιχνεύεται σε ιστούς πρωτογενούς όγκου (85%, 34/40), αλλά όχι σε παρακείμενες μη καρκινικούς ιστούς. Η έκτοπη έκφραση του ZIC1 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και επάγει την απόπτωση, η οποία συνδέεται με ΜΑΡΚ και ΡΙ

3K /Akt οδούς, καθώς και η Bcl-XL /Bad /Caspase3 καταρράκτη. Για τον προσδιορισμό των υποψηφίων στόχος της ZIC1, χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχιών cDNA και διαπίστωσε ότι τα 337 γονίδια μειωτικά και 95 γονιδίων απορυθμίζεται από έκτοπη έκφραση ZIC1, τα οποία επιβεβαιώθηκαν από 10 επιλεγμένα γονιδιακή έκφραση από qRT-PCR. Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ZIC1 μπορεί δυνητικά να λειτουργήσει ως ογκοκατασταλτικό γονίδιο, το οποίο ρυθμίζεται προς τα κάτω μέσω υπερμεθυλίωση προαγωγού σε καρκίνους του παχέος

Παράθεση:. Gan L, Τσεν S, Zhong J, Wang Χ, Lam ΕΚΥ, Liu Χ, et al. (2011) ZIC1 ρυθμίζεται προς τα κάτω μέσω Ανάδοχος υπερμεθυλίωση, και λειτουργεί ως Gene Ογκοκατασταλτικής στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (2): e16916. doi: 10.1371 /journal.pone.0016916

Επιμέλεια: Irina Agoulnik, Διεθνές Πανεπιστήμιο της Φλόριντα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 10 Οκτωβρίου 2010? Αποδεκτές: 3, Ιαν, 2011? Δημοσιεύθηκε: 15 Φεβρουαρίου 2011

Copyright: © 2011 Gan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Φυσικό Επιστημονικό Ίδρυμα της Κίνας (30900676), το Φυσικό Επιστημονικό Ίδρυμα επαρχία Zhejiang της Κίνας (Y206280), και το Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Zhejiang της Κίνας (2009C03012-3). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου, καθώς και την τρίτη συχνότερη αιτία θανάτων από καρκίνο σε όλο τον κόσμο [1]. Η διαδοχική συσσώρευση γενετικών και επιγενετικών αλλοιώσεις οδηγεί στο μετασχηματισμό των κανονικών κολονικό επιθήλιο προς ορθοκολικό καρκίνο [2]. Αυτές οι επιγενετικές αλλαγές, συμπεριλαμβανομένης της μεθυλίωσης του DNA προαγωγέα και ιστόνης τροποποιήσεις, μπορεί να προκαλέσει την απενεργοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων (ΟΚΓ) [3] – [5]. περιοχές του DNA εμπλουτισμένο με CpG δινουκλεοτίδια, που ονομάζεται νησίδες CpG, μπορεί να γίνει υπερμεθυλιωμένων στα καρκινικά κύτταρα και έχει ως αποτέλεσμα την αποσιώπηση των ΕΠΠΕ [5]. Ένα υποσύνολο του ΚΕΣ απεικόνιση μεθυλίωση των πολλαπλών γονιδίων, που ονομάζεται το φαινότυπο νησί methylator CpG (CIMP) [2], [5]. Εμείς και άλλοι έχουν βρεθεί στο παρελθόν ότι αυξάνεται ο αριθμός των ΕΠΠΕ, συμπεριλαμβανομένων APC, CDKN2A /p16, UCHL1 και Tbx5 συχνά σιγήσει μέσω υπερμεθυλίωση προαγωγού σε CRCs [2], [6] – [9]. Αυτά τα γεγονότα μπορούν να συμβούν σε πρώιμο στάδιο CRCs [9], [10], η οποία τονίζει τη σημασία της υπερμεθυλίωση προαγωγού στην ογκογένεση του ΚΕΣ.

Βρίσκεται στο χρωμόσωμα 3q24, ZIC1 κωδικοποιεί ένα C

2Η

2-τύπου παράγοντα μεταγραφής δακτύλου ψευδαργύρου που παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη της νευρική ακρολοφία και την παρεγκεφαλίδα σε σπονδυλωτά [11] – [15]. Όπως παράγοντες μεταγραφής δακτύλου ψευδαργύρου, πρωτεΐνες οικογένειας ZIC μπορούν να δεσμεύονται με την αλληλουχία πλούσια σε GC σε γονίδια στόχους [15]. Παρά το ρόλο της στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος, ZIC1 βρέθηκε επίσης να συμμετάσχουν στην εξέλιξη των ανθρώπινων καρκίνων, όπως μυελοβλάστωμα, του ενδομητρίου, και μεσεγχυματικά νεοπλάσματα [16] – [18]. Έχουμε εντοπίσει ZIC1 ως νέο υποψήφιο TSG σε γαστρικό καρκίνο [19]. Για την υποστήριξη της ρόλο στον καρκίνο, ZIC1 μπορεί να λειτουργήσει ως καταστολέας της προς τα κάτω στόχος του Ηχητικού ακανθόχοιρου (Shh), ΒΜΡ (μορφογενετική πρωτεΐνη οστών), και καθώς και παίζει ένα ρόλο στην οδό σηματοδότησης Notch κατά τη διάρκεια νευρικής ανάπτυξης σωλήνα [14], [15]. Ωστόσο, η βιολογική σημασία της μεθυλίωσης του DNA, και ο μοριακός μηχανισμός υποκείμενο ZIC1 λειτουργεί ως TSG σε CRCs παραμένουν άγνωστοι. Εδώ, αναφέρουμε ότι υποκινητής ZIC1 συχνά μεθυλιωμένη σε ιστούς CRCs και κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου. Η έκτοπη έκφραση του ZIC1 οδηγεί στην κυτταρική αναστολή της ανάπτυξης, και να μεταβάλλουν την έκφραση των γονιδίων δυναμικού στόχο που μπορεί να παίξει σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του παχέος. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ZIC1 μπορεί δυνητικά να λειτουργήσει ως καταστολέας νέα λειτουργικά όγκου σε CRCs.

Αποτελέσματα

Η μεταγραφική αποσιώπηση των ZIC1 συνδέεται με υπερμεθυλίωση του υποκινητή στο παχύ έντερο καρκινικά κύτταρα

Για να προσδιορίσετε αν ZIC1 έχει σιγήσει από υπερμεθυλίωση προαγωγού σε καρκίνο του παχέος εντέρου, εξετάσαμε την έκφραση του ZIC1 mRNA σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου έξι. Ημι-ποσοτική RT-PCR έδειξε ότι ZIC1 μεταγραφής σίγησε ή προς τα κάτω σε όλα κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό κόλου (Σχήμα 1Α). Η θεραπεία με απομεθυλίωση Αζα αποκατασταθεί δραματικά την έκφραση του mRNA ZIC1 σε ένα υποσύνολο καρκινικά κύτταρα κόλου (HCT116, ΗΤ29 και SW620) (Σχήμα 1Β), εμπλέκοντας ότι μεθυλίωση του DNA μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της έκφρασης ZIC1. Επιπλέον, χρησιμοποιούνται μεθυλίωσης ειδική PCR (MSP) και διαπίστωσε ότι τρεις γραμμές κυττάρων καρκίνου του κόλου (HCT116, DLD1 και SW620) ανιχνεύθηκαν με πλήρη μεθυλίωση. Οι άλλες τρεις κυτταρικές γραμμές (ΗΤ29, LS180 και SW480) βρέθηκαν με μερική μεθυλίωση. Δεν μεθυλίωση ανιχνεύθηκε στους φυσιολογικούς ιστούς κόλου (Σχήμα 1 C). Έτσι, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι μεταγραφική σιωπή του ZIC1 σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου μπορεί να προκαλείται από υπερμεθυλίωση προαγωγέα DNA.

(Α) Η έκφραση του ZIC1 σίγηση ή μειωτικά σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, όταν συγκρίνεται με την κανονική ιστού του κόλου με RT-PCR. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. Κανονική παχέος εντέρου: φυσιολογικούς ιστούς του παχέος εντέρου. (Β) έκφραση ZIC1 αποκαθίσταται σε καρκινικά κύτταρα κόλου (HCT116, ΗΤ29 και SW620) μετά από θεραπεία με παράγοντα απομεθυλίωσης 5-Αζα με RT-PCR. ΑΖΑ: 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη. (Γ) Η κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή ZIC1 CpG ανιχνεύεται με μεθυλίωση-ειδική PCR (MSP) σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. Μ: μεθυλιωμένο? U:. Μη μεθυλιωμένα

Η

Ελάττωση και υπερμεθυλίωση υποστηρικτής της ZIC1 στην πρωτοβάθμια παχέος όγκους

Για την περαιτέρω διερεύνηση της σχέσης μεταξύ της έκφρασης ZIC1 και υπερμεθυλίωση προαγωγού, αναλύσαμε ZIC1 mRNA έκφρασης και CpG ιστοσελίδα μεθυλίωσης κατάσταση σε πρωτοπαθή όγκο παχέος εντέρου και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου από qRT-PCR και MSP, αντίστοιχα. Το επίπεδο της ZIC1 mRNA ήταν σημαντικά μειωμένη στους περισσότερους ιστούς του όγκου σε σχέση προς γειτονικούς ιστούς μη-όγκου (

σ

= 0,0001, η = 24) (Σχήμα 2Α). Επιπροσθέτως, η μεθυλίωση προαγωγού ανιχνεύθηκε σε 85% (34/40) ορθοκολικού ιστούς όγκων, αλλά όχι σε παρακείμενες μη καρκινικούς ιστούς με ανάλυση MSP (τα αντιπροσωπευτικά στοιχεία φαίνεται στο σχήμα 2Β), πράγμα που συνεπάγεται μια ογκο-ειδική υπερμεθυλίωση του προαγωγού ZIC1 σε CRCs. Ωστόσο, δεν καταφέραμε να βρούμε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ μεθυλίωσης ZIC1 υποκινητή και κλινικά χαρακτηριστικά, όπως η ηλικία, το φύλο, τη διαφοροποίηση του όγκου, και το στάδιο ΤΝΜ (πίνακας 1).

έκφραση (Α) ZIC1 mRNA προσδιορίστηκε με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου σε είκοσι τέσσερα ζεύγη των πρωτογενών ορθοκολικών όγκων και σύμφωνα παρακείμενους ιστούς μη-όγκου. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με Wilcoxon συμφωνημένα δοκιμή ζεύγη. (Β) Η κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή ZIC1 στην πρωτοβάθμια ορθοκολικού καρκινώματος και των παρακείμενων ιστών μη-όγκου προσδιορίστηκε με MSP. Αντιπροσωπευτική εικόνα φαίνονται. ιστούς όγκων?: Τ Ν: γειτονικούς ιστούς μη-όγκου? Μ: μεθυλιωμένο? U:. Μη μεθυλιωμένα

Η

ZIC1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου

Για να διερευνήσει την επίδραση της ZIC1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων του καρκίνου του παχέος εντέρου, πραγματοποιήσαμε τη βιωσιμότητα των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών δοκιμασίες σε κυτταρικές γραμμές CRC. Πρώτον, η αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης του κατασκευάσματος ZIC1 μας επιβεβαιώθηκε με RT-PCR και στύπωμα Western σε κυτταρικές γραμμές όγκου (HCT116 και ΗΤ29) (Σχήμα 3Α). Στη συνέχεια, αξιολογήσαμε την κατασταλτική επίδραση της υπερέκφρασης ZIC1 στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με τη δοκιμασία κυτταρικής βιωσιμότητας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, έκτοπη έκφραση της ZIC1 ανέστειλε σημαντικά βιωσιμότητα των κυττάρων σε HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα (

ρ

& lt? 0,05). Παρατηρήσαμε επίσης ότι ο αριθμός των αποικιών που επιβιώνουν σχηματίζονται στις πλάκες ήταν σημαντικά μειωμένη σε σύγκριση με τα προϊόντα επιμόλυνσης φορέα ελέγχου (

ρ

& lt? 0,01) (Σχήμα 3C). Επιπλέον, αποκάλυψε ότι η έκτοπη έκφραση της ZIC1 ανέστειλαν την φωσφορυλίωση των ERK1 /2 και κινασών Akt (Σχήμα 3D), δύο βασικές κυτταρικό πολλαπλασιασμό ρυθμιστές οδό. Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν την κατασταλτική δράση του ZIC1 επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων.

(Α) επανέκφραση του ZIC σε σταθερές επιμολύνσεις σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου (HCT116 και ΗΤ29) επιβεβαιώθηκε με RT-PCR (άνω λωρίδα) και τη δυτική blot (χαμηλή λωρίδα), GAPDH και β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος. (Β) δοκιμασία κυττάρων βιωσιμότητας μετά ZIC1 επανέκφραση σε κυτταρικές σειρές παχέος εντέρου (HCT116 και ΗΤ29). Ο αριθμός των βιώσιμων κυττάρων μετρήθηκε με δοκιμασία MTS μετά παροδικά επιμολυσμένα με pCDNA3.1-ZIC1 ή φορέα pCDNA3.1. Η δοκιμασία διεξήχθη εις τριπλούν. Ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα (

σ

& lt? 0,05). (Γ) Η επίδραση της αναστολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού με έκτοπη έκφραση της ZIC1 προσδιορίσθηκε με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου. Η ποσοτική ανάλυση των αριθμών αποικιών που σχηματίζονται σε pCDNA3.1-ZIC1 ή φορέα pCDNA3.1 επιμολύνσεων απεικονίζονται στο δεξί διάγραμμα μπάρα σε τρία ξεχωριστά πειράματα σε HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα. Ο αστερίσκος υποδηλώνει στατιστική σημαντικότητα (

σ

& lt? 0,05). (D) Οι Phos-Akt έκφραση και Phos-Erk1 /2, καθώς και το σύνολο των Akt και Erk1 /2 αναλύθηκαν με western blot. πυκνότητες Band ποσοτικοποιήθηκαν και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (ρ-Akt, ρ-Erk1 /2) ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη. Οι τιμές πυκνότητας (ZIC1 επιμολύνσεις) εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με επιμολύνσεις διάνυσμα τιμές κανονικοποιούνται προς 1.

Η

έκτοπη έκφραση ZIC1 επάγει κυτταρική απόπτωση

Για να διερευνήσει τους μηχανισμούς που διέπουν την αναστολή της κυτταρικού πολλαπλασιασμού με έκτοπη έκφραση της ZIC1, αναλύσαμε την κυτταρική απόπτωση και κυτταρικό κύκλο με κυτταρομετρία ροής δοκιμασίας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Α, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με επάγεται ZIC1 κυτταρικής απόπτωσης. Επιπλέον, τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι η εκ νέου έκφραση του ZIC1 οδήγησε στην ενεργοποίησης καταρρακτών απόπτωση, συμπεριλαμβανομένης της διάσπασης του caspase3, ρύθμιση προς τα κάτω της Bcl-XL, και Bad dephosporylation (Σχήμα 4Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η επαγωγή της κυτταρικής απόπτωσης μέσω υπερέκφραση ZIC1 διαμεσολαβείται από την Bcl-XL /Bad /Caspase3 καταρράκτη. Ωστόσο, η εκ νέου έκφραση του ZIC1 δεν επηρέασε την εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

(Α) Cell απόπτωση ανιχνεύθηκε με την δοκιμασία κυτταρομετρίας ροής Annuexin V-ΡΙ. Τα αντιπροσωπευτικά στοιχεία εμφανίζονται παροδικά επιμολυσμένα με ZIC1 ή φορέα ελέγχου μετά από 48 ώρες σε ΗΤ29 και HCT116 κύτταρα. Περιοχή Α1 δείχνει νωρίς αποπτωτικά κύτταρα, Α2 δείχνει αργά αποπτωτικά κύτταρα. (Β) ανάλυση κηλίδας Western των αποπτωτικών ρυθμιζόμενων πρωτεϊνών. Η έκφραση του φωσφο-Bad και Bad, Bcl-XL, Διασπασμένη-caspase3, και Caspase3 ανιχνεύθηκαν μετά διατέμνεται με ZIC1 ή ελέγχου φορέα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου (ΗΤ29 και HCT116). πυκνότητες Band ποσοτικοποιήθηκαν και τα επίπεδα της πρωτεΐνης (ρ-Bad, Bad, Bcl-XL, και διασπάται-caspase3) ομαλοποιήθηκαν σε β-ακτίνη. Οι τιμές πυκνότητας (ZIC1 επιμολύνσεις) εκφράζονται ως φορές μεταβολής σε σχέση με το φορέα επιμολύνσεων τιμές κανονικοποιούνται προς 1.

Η

προφίλ γονιδιακής έκφρασης αλλαγές από έκτοπη έκφραση εξωγενούς ZIC1

Για να αναζητήσετε γονιδίων στόχων του ZIC1 σε καρκινικά κύτταρα κόλου, χρησιμοποιήσαμε μικροσυστοιχιών cDNA για να αναλύσει τις αλλαγές στο προφίλ γονιδιακής έκφρασης που προκαλείται από έκτοπη έκφραση της ZIC1. Αυτή η ανάλυση αποκάλυψε ότι 337 γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα κάτω και 95 γονίδια απορυθμίζεται με εξωγενή έκφραση του ZIC1 όταν χρησιμοποιούν ένα 2-φορές αλλαγή της έκφρασης, όπως κατωφλίου (εκπρόσωπος γονίδια που φαίνεται στο Σχήμα 5Α). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, πολλά από αυτά τα γονίδια έχουν αναφερθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την απόπτωση. Για να επιβεβαιωθεί το πρότυπο έκφρασης που παρατηρείται στην μικροσυστοιχία, εμείς επικύρωσε την έκφραση του 10 επιλεγμένων γονιδίων σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου επιμολυσμένα με ZIC1 με qRT-PCR. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το

CCNA2

(κυκλίνη Α2) και

IGFBP3

(ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα πρωτεΐνη 3 σύνδεσης) ήταν σημαντικά ρυθμισμένη προς τα πάνω (& gt? 2 αλλαγή φορές), ενώ

ANGPT2

(αγγειοποιητίνη 2),

GADD45B

(αύξηση σύλληψη και βλάβη του DNA επαγόμενο, β),

LAMB2

(λαμινίνη, beta 2),

LAMB3

(λαμινίνη , βήτα 3),

MALAT1

(που συνδέεται μετάσταση του πνεύμονα αδενοκαρκίνωμα μεταγραφή 1),

PNMA2

(παρανεοπλασματική MA2 αντιγόνο),

RPA4

(αντιγραφή πρωτεΐνη Α4), και em

TACSTD2

(που σχετίζεται με όγκο μετατροπέας σήματος ασβεστίου 2) (& lt? -2 αλλαγή φορές) ρυθμίστηκαν προς τα κάτω από την υπερέκφραση του ZIC1 σε HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα (Εικόνα 5Β και Πίνακας S1). Τα δεδομένα αυτά ήταν σύμφωνη με εκείνη που λαμβάνεται από την ανάλυση μικροσυστοιχιών.

(Α) Η διαφορική έκφραση των προφίλ γονιδιακής σε ZIC1 ή φορέα ελέγχου σταθερές επιμολύνσεις οπτικοποιήθηκε χρησιμοποιώντας Java Treeview σε κυτταρικές σειρές HCT116. Αντιπροσωπευτικά γονίδια πάνω από δύο φορές αλλαγή υποδεικνύεται στη δεξιά πλευρά αυτής της εικόνας. (Β) Genes μεταγραφή ποσότητα 10 επιλεγμένων γονιδίων μετρήθηκε με qRT-PCR και υπολογίζεται χρησιμοποιώντας την τιμή 2

– △△ CT. Σχετική έκφραση γονιδίων σε ZIC1 μορφομετατροπείς συγκρίθηκε με κενό φορέα ελέγχου, το οποίο ομαλοποιήθηκε ως τιμή αναφοράς 1,0. Λευκό μπάρες δείχνουν το αποτέλεσμα της ανάλυσης μικροσυστοιχιών και μαύρες μπάρες εκπρόσωπος των δεδομένων qRT-PCR σε HCT116 κυτταρική σειρά.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, διαπιστώσαμε ότι ZIC1 σίγησε ή κατιούσα ρύθμιση σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου, όπως επίσης και σε πρωτογενείς ιστούς του όγκου σε σχέση προς γειτονικούς ιστούς μη-όγκου (

ρ

& lt? 0,05). Επιπλέον, οι παρατηρήσεις μας προσδιορίσει ότι το DNA προαγωγός υπερμεθυλίωση συμβάλλει στην ZIC1 αποσιώπηση ή αρνητική ρύθμιση στην CRCs. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σύμφωνα με προηγούμενη μελέτη μας ZIC1 σε γαστρικό καρκίνο [19], υποδεικνύοντας ότι η προαγωγός CpG methlyation είναι το κυρίαρχο μηχανισμό ZIC1 μειορρύθμιση. Ωστόσο, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την εμφάνιση των άλλων μηχανισμών στην αποσιώπηση των ZIC1, όπως ιστόνη ή νουκλεοσώματος αναδιαμόρφωση. Για παράδειγμα, η έκφραση ZIC1 απέτυχε να αποκατασταθεί μετά την επεξεργασία Αζα σε LS180 και κυτταρικές σειρές SW480 (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι η μεθυλίωση του ιστόνης H

3 στη λυσίνη 27 συνδέεται με ZIC1 σίγηση σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα [18]. αναλύσεις χρωματίνης ανοσοκατακρήμνισης δείχνουν ότι η έκφραση του ZIC1 συνδέεται με ιστόνης H

3 διμεθυλίωση σε λυσίνη 4 desmoids και ΥΠΟΙΟ κύτταρα [18].

Παρά την εικόνα του κρίσιμου ρόλου της ZIC1 σε σπονδυλωτά ανάπτυξη [ ,,,0],13], [15], λειτουργικός χαρακτηρισμός ZIC1 στην καρκινογένεση παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστος. Εδώ, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η εξωγενής ZIC1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω ρ-Ακί και ρ-Erk1 /2 αδρανοποίηση σε καρκινικά κύτταρα κόλου. ΡΙ

3K /Akt και ΜΑΡΚ (μιτογόνα ενεργοποιημένη πρωτεϊνική κινάση) οδών σηματοδότησης είναι καλά γνωστό ότι λειτουργούν ως κρίσιμα στοιχεία του πολλαπλασιασμού των κυττάρων σε κύτταρα όγκου [20], [21]. Akt και Erk1 /2, όταν ενεργοποιηθεί με φωσφορυλίωση, μπορεί να λειτουργήσει ως βασικό τελεστές της ΡΙ

3K και ΜΑΡΚ μονοπάτια σηματοδότησης να προάγουν την επιβίωση και τον πολλαπλασιασμό κυττάρων [20] – [24]. Έτσι, ZIC1 μπορεί να προκαλεί τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω της ΡΙ

3K /Akt και μονοπάτια ΜΑΡΚ σε καρκινικά κύτταρα κόλου. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η έκτοπη έκφραση της ZIC1 μπορεί να διεγείρει απόπτωση των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου. Μεταξύ το ευρύ φάσμα των πρωτεϊνών και γονιδίων που εμπλέκονται στην απόπτωση, τα μέλη της οικογένειας Bcl-2 παίζουν κεντρικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία [25], [26]. Caspase-3 έχει ταυτοποιηθεί ως ένας βασικός μεσολαβητής της απόπτωσης σε κύτταρα θηλαστικών, και ο φωσφορυλίωση της Bad μπορούν να μπλοκάρουν αποπτωτική λειτουργία του [22], [25], [26]. Από αυτή την άποψη, βρήκαμε ότι η έκφραση της διασπασμένης caspase3 και Bad προκλήθηκαν, ενώ φωσφο-Bad και Bcl-XL κατεστάλησαν με εκ νέου έκφραση του ZIC1. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η επαγωγή της απόπτωσης από ZIC1 μπορεί να σχετίζεται με Bcl-XL /Bad /Caspase3 καταρράκτη στα καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου.

Σε μια προσπάθεια να εντοπίσει κατάντη στόχους της ZIC1 στο CRCs, αναλύσαμε τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα με ή χωρίς ZIC1 υπερέκφραση. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι 337 γονίδια ρυθμίστηκαν προς τα κάτω και 95 γονίδια απορυθμίζεται με ZIC1 (εκπρόσωπος νέα γονίδια που φαίνεται στον Πίνακα 2). Πολλά από αυτά τα γονίδια έχουν συνδεθεί με την κυτταρική ανάπτυξη, την απόπτωση, προσκόλληση, την αγγειογένεση, και την μεταγωγή σήματος σε ογκογένεση [27] – [33]. Για παράδειγμα, ZIC1 κατασταλεί η έκφραση του

GADD45B

.

GADD45B

επάγεται από την ενεργοποίηση της ρ38 /ΙΝΚ (c-Jun Ν-τελική κινάση) οδός [27], και ένας σημαντικός μεσολαβητής του ΝΡ-κΒ-ΙΝΚ στιχομυθία και την κυτταρική απόπτωση [28]. JNK είναι ένα άλλο σημαντικό συστατικό κατάντη των καταρρακτών ΜΑΡΚ, και σχετίζεται με την κυτταρική ανάπτυξη και κυτταρική απόκριση σε βλάβη του DNA [21], [23], [24]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι ZIC1 αύξησε την έκφραση του

RSU1

(Ras καταστολέα πρωτεΐνη 1), που αναφέρεται για να ανυψώσει τα επίπεδα του ρ21

αναστολέας CIP CDK, καθώς και αδρανοποιούν Jun και Rho-εξαρτώμενη κινάσες υπό EGF διέγερση [29]. Με το εύρημα μας ZIC καταστολή της p-Erk1 /2, προτείνουμε ότι ZIC1 μπορεί να ρυθμίσει ΜΑΡΚ διαμεσολαβείται από ERK και JNK κινασών. Απαιτείται περαιτέρω μελέτη για την ανάδειξη των μηχανισμών με τους οποίους ZIC1 ρυθμίζει αυτές τις πιθανές πορείες στην εξέλιξη του καρκίνου. Επιπλέον, αποδείξαμε ότι ZIC1 μπορεί να καταστείλει την έκφραση των άλλων νέων γονιδίων (

TACSTD2

,

ANGPT2

,

LAMB2, LAMB3

και

MALAT1

κ.λπ. ) που σχετίζονται με την αγγειογένεση και μετάσταση όγκου.

TACSTD2

έχει βρεθεί συνδέεται με την επιθετικότητα του όγκου και κακή πρόγνωση σε επιθηλιακά καρκινώματα κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων του παχέος εντέρου και του καρκίνου του στομάχου [30], [31].

ANGPT2

αναδύεται ως βασικός ρυθμιστής της αγγειακής αναδιαμόρφωσης κατά τη διάρκεια της αγγειογένεσης των όγκων [32], [33].

Όπως μεταγραφικούς παράγοντες δακτύλου ψευδαργύρου, η οικογένεια ZIC των πρωτεϊνών μπορεί να συνδεθεί με GC-πλούσιες αλληλουχίες σε γονίδια-στόχους [13], [15]. ZIC1 μπορεί να ρυθμίζει γονίδια στόχους σε αμφότερες αλληλουχία-ειδικά και αλληλουχία-ανεξάρτητο ήθη [15]. Ανάλογα με τους εταίρους αλληλεπίδρασης του, ZIC πρωτεΐνες μπορούν να ενεργοποιήσουν ή να καταστείλουν την μεταγραφή των γονιδίων στόχων. Όπως ήταν αναμενόμενο, παρατηρήσαμε ότι ZIC1 ρυθμίζεται η έκφραση σημαντικών μεταγραφικών παραγόντων όπως

RPS2

,

NTF3

,

PRDM16

,

KLF15

,

SHC2

και

FOXJ1

(Πίνακας S2). ZIC1 έχει δειχθεί να εξουδετερώσει με Gli (γλοίωμα που σχετίζεται με ογκογονίδιο ομόλογο 1), η οποία λειτουργεί ως κατάντη του Sonic hedgehog (Shh) μονοπάτι σηματοδότησης και συμμετέχουν στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου [34] – [36]. Εν τω μεταξύ, πολλές κατάντη στόχοι της ZIC1 συμπεριλαμβανομένων Notch, η κυκλίνη D1, και Wnt3A έχουν αναθεωρηθεί στην ανάπτυξη του νευρικού συστήματος και ζωικά μοντέλα [15], [37]. Αυτά τα γονίδια είναι πολύ γνωστές στους διαδραματίζουν ζωτικό ρόλο στην ανάπτυξη του καρκίνου. Η μελέτη των γονιδίων στόχων ZIC1 μπορεί να παράσχει περαιτέρω πληροφορίες για τους πιθανούς μηχανισμούς της ZIC1 υπηρετούν ως καταστολέας των όγκων σε CRCs.

Εν ολίγοις, έχουμε αποκάλυψε ότι ένα νέο ογκοκατασταλτικό γονίδιο ZIC1 αδρανοποιήθηκε μέσω μεθυλίωσης υποστηρικτής στον καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. ZIC1 επίσης μειωτικά και συχνά υπερμεθυλίωση στην πρωτοβάθμια παχέος καρκινικούς ιστούς. ZIC1 αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων μέσω καταστολής της PI

3k και ΜΑΡΚ μονοπατιών, η επαγωγή της κυτταρικής απόπτωσης μέσω της Bcl-XL /Bad /Caspase3 καταρράκτη, ρύθμιση προς τα κάτω τους στόχους και τις οδούς που εμπλέκονται στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου.

Υλικά και μέθοδοι

καλλιέργειας κυττάρων και δείγματα ιστών

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου (HCT116, ΗΤ29, DLD1, LS180, SW480 και SW620) ελήφθησαν από Riken Gene Bank (Ιαπωνία) και American Type Culture Collection (ATCC, USA). HCT116 κυτταρική γραμμή καλλιεργήθηκε σε μέσο 5Α του McCoy (Invitrogen, USA) συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, όλες οι άλλες κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε μέσο DMEM (Invitrogen, USA) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου. Όλες οι κυτταρικές σειρές επωάζονται σε

2, 37 ° C και 95% υγρασία 5% CO.

Σαράντα χειρουργική εκτομή αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου και των παρακείμενων δείγματα μη-όγκου ελήφθησαν από τον Sir Run Run Shaw Νοσοκομείο, Ιατρική Σχολή Πανεπιστήμιο Zhejiang. CRC ταξινομήθηκε σύμφωνα με τη Διεθνή Ένωση κατά του Καρκίνου Κριτήρια και ανέβασε με το σύστημα όγκου-node-μετάσταση (TNM). Τα δείγματα καταψύχθηκαν αμέσως σε υγρό άζωτο και αποθηκεύονται σε -80 ° C μέχρι την περαιτέρω επεξεργασία. Όλοι οι ασθενείς με την προϋπόθεση ενημέρωσε έγγραφη συναίνεση για τη λήψη των δειγμάτων της μελέτης. Το πρωτόκολλο της μελέτης εγκρίθηκε από την Κλινική Επιτροπή Ερευνητικής Δεοντολογίας του Sir Run Run Shaw νοσοκομείο.

Η φαρμακολογική DNA απομεθυλίωση με 5-Aza-2′-δεοξυκυτιδίνη

Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία για 72 ώρες με 5 μΜ 5-

αζα

-2 ‘-

δεοξυκυτιδίνη

(Aza) (Sigma, St Louis, MO, USA), ένα καλά χρησιμοποιείται αναστολέα μεθυλοτρανσφεράσης. Aza ήταν αναπληρώνονται κάθε 24 ώρες. Μια ισοδύναμη συγκέντρωση του φορέα (DMSO) χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

RT-PCR και ποσοτική ανάλυση PCR

Ολικό RNA (1 μg) εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen) ακολουθώντας κατασκευαστή διδασκαλίας, έπειτα μεταγράφηκε ανάστροφα σε cDNA με υψηλής χωρητικότητας cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). RT-PCR διεξήχθη για 35 κύκλους (95 ° C για 30 s, 55 ° C για 30 s, 72 ° C για 30 s). PCR προϊόν υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε 2% αγαρόζη και βάφτηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) πραγματοποιήθηκε με το κιτ SYBR Green Master Mix (Takara, Japan) σε ΑΒΙ 7500 σύστημα PCR. Το σχετικό επίπεδο μεταγραφής γονιδίων ομαλοποιήθηκε για να στεγάσει τη διατήρηση γονίδιο (GAPDH) χρησιμοποιώντας το 2

-ΔΔCt μέθοδο. Όλοι οι εκκινητές οι αλληλουχίες παρατίθενται στον Πίνακα S3.

κατεργασία όξινου θειώδους του DNA και μεθυλίωσης ειδική PCR (MSP)

Γονιδιωματικό DNA (1 μ§) κατεργασμένου με όξινο θειώδες με Kit τροποποίηση Zymo DNA (Zymo Research , ΗΠΑ). κατάσταση μεθυλίωσης του ZIC1 ανιχνεύθηκε με μεθυλίωση-ειδική PCR (MSP) χρησιμοποιώντας το κατεργασμένο με όξινο θειώδες γενωμικό DNA ως μήτρα. MSP εκτελέστηκε για 40 κύκλους με θερμοκρασία αναδιάταξης στους 60 ° C, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [38], [39]. Μεθυλίωσης (Μ) εκκινητών ήταν: F 5′-GGATTTTTTGTTTCGTAATC, R 5′-CCCGTTAACCACGTTAAACG και Unmethylation (U) εκκινητών ήταν:. F 5′-GGGATTTTTTGTTTTGTAATT, R 5′-CCCATTAACCACATTAAACA

τηλέφωνα επιμόλυνση και κυτταρική βιωσιμότητα δοκιμασία

Για την κατασκευή ενός πλασμιδίου έκφρασης ZIC1, ο ZIC1 πλήρους μήκους ανοικτό πλαίσιο ανάγνωσης κλωνοποιήθηκε σε φορέα έκφρασης θηλαστικών pCDNA3.1 ως προηγούμενα περιγράφεται [19]. Για την παραγωγή σταθερά κύτταρα επιμόλυνση, HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα επιμολύνθηκαν με pCDNA3.1-ZIC1 ή φορέα pCDNA3.1 χρησιμοποιώντας Λιποφεκταμίνη 2000 (Invitrogen), και επιλέγονται από G418 (400 μg /ml) για 14 ημέρες σε μια 12 φρεατίων πλάκα. Η υπερέκφραση του ZIC1 επιβεβαιώθηκε με RT-PCR και στυπώματος Western στα επιζόντα αποικίες. Στη συνέχεια, αυτά σταθερός ετερογενείς πληθυσμοί κυττάρων μεταφέρθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων σε συνεχή επιλογή με G418 για περαιτέρω μελέτες.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με 3- (4,5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2- (4-σουλφοφαινυλο) -2Η -tetrazolium (MTS) αντιδραστήρια (Promega, Madison, USA). Εν συντομία, HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν 24 ώρες σε μια 12 φρεατίων πλάκα και παροδικά επιμολυσμένα με pCDNA3.1-ZIC1 ή pCDNA3.1. Στη συνέχεια, αυτά τα κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 96 φρεατίων (2000-4000 κύτταρα /φρεάτιο) για 48 ώρες. Μετά την επώαση με CellTiter 96 Υδατικό αντιδραστήριο ένα λύση για 1 ώρα, η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm σύμφωνα με τις οδηγίες του MTS.

Colony δοκιμασία σχηματισμού

HCT116 και ΗΤ29 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 12 – πλάκα φρεατίων (1.0 χ 10

5 κύτταρα /φρεάτιο) για 24 ώρες και επιμολυσμένα με pCDNA3.1-ZIC1 ή φορέα pCDNA3.1. Μετά από 48 ώρες, τα προϊόντα επιμόλυνσης επανα-επιστρώθηκαν σε πλάκα 6 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν για 12-20 ημέρες σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει G418 (400 μg /ml). Surviving αποικίες βάφτηκαν με γεντιανή Violer μετά μετρήθηκαν σταθεροποίηση μεθανόλη και ορατές αποικίες (≥50 κύτταρα). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν.

απόπτωση των κυττάρων και του κυτταρικού κύκλου ανάλυση

δοκιμασίες κυτταρικής απόπτωσης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας το κιτ αννεξίνη V /PI (Invitrogen) με ανάλυση κυτταρομετρίας ροής (FCA). Εν συντομία, παροδικά επιμολυσμένα κύτταρα (HCT116, ΗΤ29) εναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό αννεξίνης-δέσμευσης, Alexa Fluor 488 αννεξίνης V και διάλυμα εργασίας ΡΙ προστέθηκαν διαδοχικά. Τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν με τελικά ροής FACScan κυτταρομετρία ροής (Becton Dickinson, USA) στα 560 nm. Εν τω μεταξύ, 2 × 10

5 σπαρμένα κύτταρα εκτέθηκαν σε υπεριώδη να επάγει απόπτωση ως θετικός έλεγχος.

Η κατανομή κυτταρικού κύκλου ανιχνεύεται από το κιτ αντιδραστηρίου Cycletest Plus DNA (Becton Dickinson, USA). Εν συντομία, επιμολυσμένα κύτταρα συλλέχθηκαν και πλύθηκαν σε PBS, κυτταρικό DNA χρωματίστηκε με 125 μg /mL ιωδιούχου προπιδίου για 20 λεπτά στους 4 ° C στο σκοτάδι. Τα κύτταρα στη συνέχεια ταξινομήθηκαν με FACS Calibur και διανομή του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας το λογισμικό ModFit LT (Phoenix, ΗΠΑ).

Western ανάλυση κηλίδος

Σύνολο πρωτεΐνες εκχυλίστηκαν από σταθερά επιμολυσμένα κύτταρα χρησιμοποιώντας RIPA ρυθμιστικό λύσης. Προϊόντα λύσης (20-60 μα) διαχωρίστηκαν σε SDS-PAGE γέλη και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore, Bedford, ΜΑ). Τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με ZIC1 (1:500? Abcam), Caspase3 (1:500? Sigma-Aldrich), Bcl-XL (1:500? Sigma), Bad (1:500? Abnova), φωσφο-Bad (1 :1000? κυτταρική σηματοδότηση), Akt (1:500? Abcam), φωσφο-Akt (1:2000? Cell Signaling), Erk1 /2 (ρ44 /42) (1:1000? Cell Signaling), φωσφο-Erk1 /2 (ρ44 /42) (1:2000? Cell Signaling) και β-ακτίνη (1:2500, Multisciences Biotech) αντισώματα. Οι κηλίδες αναπτύχθηκαν χρησιμοποιώντας ένα χημειοφωταύγειας με Las-4000 Σύστημα απεικόνισης (Fujifilm, Ιαπωνία).

ανάλυση cDNA μικροσυστοιχιών και επικύρωση

μελέτες μικροσυστοιχιών διηθούνται να εντοπίσει όσους προφίλ γονιδιακής έκφρασης σε ZIC1 ή φορέα ελέγχου σταθερά επιμολυσμένων κυτταρικής σειράς (HCT116) βασίζεται στην πλατφόρμα Affymetrix. Το cDNA μεταγράφεται σε cRNA με δεσμευτικές aaUTP, τα οποία επιτρέπουν την ενσωμάτωση των φθορίζουσα χρωστική Cy3 (ρΟΟΝΑ3.1-ZIC1) ή Cy5 (ρΟΟΝΑ3.1). Τέλος, επισημασμένα δείγματα υβριδίστηκαν με Agilent ολόκληρο το ανθρώπινο γονιδίωμα περιέχει 41.000 ανιχνευτών και μεταγραφές. Διπλότυπα πειράματα διεξήχθησαν. Έχουμε επιλέξει ημερολόγιο

2 αναλογία ≥1 ή ≤-1 ως όριο για τη ρύθμιση προς τα πάνω ή προς τα κάτω ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης.

Ο υποψήφιος ZIC1 γονιδίων στόχων ταξινομήθηκαν σε διαφορετικές υποομάδες ανάλογα με βιολογικές λειτουργίες τους (τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, μετανάστευση, και αγγειογένεση, κ.λπ.). Δέκα εκπρόσωποι των γονιδίων στόχων:

ANGPT2

,

CCNA2

,

GADD45B

,

IGFBP3

,

LAMB2

,

LAMB3

,

MALAT1

,

PNMA2

,

RPA4

και

TACSTD2

επαληθεύτηκαν με qRT-PCR σε ZIC1 ή φορέα ελέγχου tranfectants σε HCT116 και κύτταρα ΗΤ29.

Η στατιστική ανάλυση

Φοιτητών

t

και Wilcoxon ζεύγη δοκιμές πραγματοποιήθηκαν σε σύγκριση με δύο ανεξάρτητα δεδομένα, ενώ Chi-τετράγωνο ή Fisher μεθόδους ακριβές τεστ για να ανάλυση κατηγορικών μεταβλητών. Ένα

σ

& lt? 0,05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1..

Διπλώστε αλλαγή (FC) των επιλεγμένων γονιδίων σε ZIC1 transfecants είχαν εντοπιστεί από cDNA μικροσυστοιχιών και qRT-PCR. Διπλώστε αλλαγή (FC): ZIC1 έναντι φορέα ελέγχου

doi:. 10.1371 /journal.pone.0016916.s001

(DOC)

Πίνακας S2.

προφίλ έκφρασης του εκπροσώπου του γονιδίου σχετίζεται με ρυθμιστή μεταγραφής και μεταγωγής σήματος σε ZIC1 επιμολύνσεις σε σύγκριση με το κενό φορέα ελέγχου (fold change) από cDNA μικροσυστοιχιών στα κύτταρα HCT116. Διπλώστε αλλαγή:. ZIC1 έναντι φορέα ελέγχου

doi: 10.1371 /journal.pone.0016916.s002

(DOC)

Πίνακα S3.

Primer αλληλουχίες χρησιμοποιούνται για την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου.

doi: 10.1371 /journal.pone.0016916.s003

(DOC)

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε Δρ Λέι Γκούο για τις χρήσιμες υποδείξεις? Ο Δρ Γιαν Shan, Xiaotong Hu και Fubiao Zhang για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια? και ο Δρ Manish Gala για κριτική εξέταση του χειρογράφου.