Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) έχουν αναφερθεί να διαδραματίσει καίριο ρόλο στην ογκογένεση . Γενετικές παραλλαγές σε γονίδια επεξεργασία miRNA και θέσεις πρόσδεσης miRNA μπορεί να επηρεάσει τη βιογένεση των miRNA και τις αλληλεπιδράσεις miRNA-mRNA, ως εκ τούτου, την προώθηση της ογκογένεσης. Στην παρούσα μελέτη, υποθέσαμε ότι πιθανώς λειτουργική πολυμορφισμοί στα γονίδια επεξεργασία miRNA μπορεί να συμβάλει στη καρκίνου κεφαλής και τραχήλου ευαισθησίας (ΕΘΕΓ). Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, είμαστε ο γονότυπος τρεις SNPs σε miRNA περιοχές της miRNA επεξεργασίας γονιδίων (rs1057035 δεσμευτικός ως προς όλα 3’UTR του

Dicer

, rs3803012 στην 3’UTR του

RAN

και rs10773771 στο 3 ‘ UTR του

HIWI

) με μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων, συμπεριλαμβανομένων 397 περιπτώσεις ΕΘΕΓ και 900 ελέγχους συνδυάζεται με την ηλικία και το φύλο στα κινέζικα. Παρά το γεγονός ότι καμία από τις τρεις SNPs συσχετίστηκε σημαντικά με συνολικό κίνδυνο του ΕΘΕΓ, rs1057035 στην 3’UTR του

Dicer

συσχετίστηκε με σημαντικά μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του στόματος (TC /CC έναντι ΤΤ: προσαρμογή OR = 0,65, 95% CI = 0,46 – 0,92). Επιπλέον, δοκιμασία λουσιφεράσης δραστηριότητα έδειξαν ότι αλληλόμορφο rs1057035 παραλλαγή C οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης σε σύγκριση με το αλληλόμορφο Τ, η οποία μπορεί να οφείλεται στην σχετικά υψηλή αναστολή της HSA-miR-574-3p στο

Dicer

mRNA . Τα ευρήματα έδειξαν ότι rs1057035 που βρίσκεται στο 3’UTR του

Dicer

μπορεί να συμβάλλουν στον κίνδυνο του καρκίνου του στόματος, επηρεάζοντας τη σύνδεση των miRNAs στο

Dicer

. Μεγάλης κλίμακας και καλά σχεδιασμένες μελέτες έχουν εγγύηση για την επικύρωση ευρήματά μας

Παράθεση:. Ma H, Yuan Η, Yuan Ζ, Yu C, Wang Ε, Jiang Υ, et al. (2012) Γενετική διακυμάνσεις των βασικών microRNA Επεξεργασία Γονίδια και κίνδυνος καρκίνου κεφαλής και τραχήλου: Μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων στο κινεζικού πληθυσμού. PLoS ONE 7 (10): e47544. doi: 10.1371 /journal.pone.0047544

Επιμέλεια: Brock C. Christensen, Geisel της Ιατρικής Σχολής του Dartmouth, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: May 23, 2012? Αποδεκτές: 12 Σεπτεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 11 του Οκτ 2012

Copyright: © Ma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει από Ακαδημαϊκό προτεραιότητας του Προγράμματος Ανάπτυξης των Jiangsu Ιδρυμάτων Ανώτατης Εκπαίδευσης (PAPD) και του Ιδρύματος Επιστήμης Φυσικής Jiangsu (BK2011764). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος κεφαλής και τραχήλου (ΕΘΕΓ), ιδιαίτερα πλακώδες καρκίνωμα κεφαλής και τραχήλου (SCCHN), είναι η έκτη πιο συχνή κακοήθεια σε όλο τον κόσμο, αντιπροσωπεύοντας κατ ‘εκτίμηση 650 000 νέες περιπτώσεις καρκίνου και 350 000 θάνατοι από καρκίνο κάθε έτος [1], [2]. ΕΘΕΓ περιλαμβάνει καρκίνους που εμφανίζονται στα παραρρινίων κόλπων, ρινική κοιλότητα, στοματική κοιλότητα, φάρυγγα και του λάρυγγα. Καπνού και την κατανάλωση αλκοόλ έχουν αναγνωριστεί ως σημαντικό Καύκασο της ΕΘΕΓ [1], [2]. Επιπλέον, μελέτες ανέφεραν επίσης ότι οι γενετικοί παράγοντες συμπεριλαμβανομένου του οικογενειακού ιστορικού και γενετικές παραλλαγές σε πολλαπλές βιολογικές οδοί που εμπλέκονται στην ανάπτυξη της HNC [3]. Ωστόσο, ο ακριβής μηχανισμός της ανάπτυξης ΕΘΕΓ δεν έχει διερευνηθεί πλήρως.

Τα microRNAs (miRNAs) είναι μια κατηγορία των μη-κωδικοποίησης, μονόκλωνο RNA των ~ 22 νουκλεοτιδίων και δρουν ως ρυθμιστές γονιδίων μέσω της σύνδεσης με το 3 «-untranslated περιοχή (UTR) του μεταγραφές που κωδικοποιεί την πρωτεΐνη, με τη σειρά της ενεργοποιεί την υποβάθμιση του αγγελιαφόρου RNA ή μεταφραστικά καταστολή [4], [5]. Μελέτες έδειξαν ότι οι miRNAs εμπλέκονται σε μία ποικιλία βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης του κυτταρικού κύκλου, διαφοροποίηση, ανάπτυξη, τον μεταβολισμό και τη γήρανση. Επιπλέον, miRNAs έχουν επίσης συνδεθεί με την αιτιολογία, την εξέλιξη και την πρόγνωση του καρκίνου, καθώς και τα προφίλ έκφρασης των miRNAs μπορούν να προσδιορίσουν με μοναδικό τύπους καρκίνου [6], [7]. Η βιογένεση των miRNAs είναι μια σύνθετη διαδικασία που περιλαμβάνει πολλαπλές πρωτεΐνες και τα RNA [8]. Πρώτον, τα μεγάλα πρωτογενή πρόδρομοι των miRNAs (PRI-miRNA) μεταγράφονται κυρίως από την RNA πολυμεράση II και διασπάται σε πρόδρομος miRNA (προ-miRNAs) από το σύμπλοκο πυρηνικό μικροεπεξεργαστή που περιέχει το DROSHA Rnase και το διπλό-κλώνο πρωτεΐνη σύνδεσης RNA DGCR8 [9] . Στη συνέχεια, η προ-miRNA μετατοπίζεται στο κυτταρόπλασμα με τη βοήθεια του Ran-ΟΤΡάσης και Exportin-5 (XPO5), όπου περαιτέρω επεξεργασία από ένα σύμπλοκο πρωτεΐνης συμπεριλαμβανομένων Dicer, οδηγώντας στην παραγωγή του δίκλωνου duplex miRNA. [ ,,,0],10]. Στη συνέχεια, ένας κλώνος του miRNA ενσωματώνεται σε σύμπλεγμα σίγηση του RNA επαγόμενη (RISC) συμπεριλαμβανομένων HIWI, GEMIN3 και GEMIN4, η οποία μεσολαβεί την έκφραση των γονιδίων στόχων. Καλλιέργεια στοιχεία δείχνουν ότι βασικά συστατικά στην βιοσυνθετική οδό των miRNA παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη ή την πρόγνωση των ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων HNC [11], [12], [13].

Πιο πρόσφατα, έχει αναφερθεί ότι η παρουσία πολυμορφισμών απλού νουκλεοτιδίου (SNPs) σε γονίδια microRNA, μηχανήματα επεξεργασίας τους και θέσεις πρόσδεσης στόχου επηρεάζει την ευαισθησία σε καρκίνους με ρύθμιση των επιπέδων έκφρασης των miRNAs και των αλληλεπιδράσεων miRNA-mRNA [14]. Μεταξύ αυτών, κάποιες μελέτες έχουν επικεντρωθεί στην επίδραση των SNPs σε χώρους miRNA-δέσμευσης (miRNA-δεσμευτική SNPs) των γονιδίων επεξεργασία miRNA και τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου. Για παράδειγμα, μια μελέτη με 130 προφορικές προκαρκινικές αλλοιώσεις (OPLs) περιπτώσεις και 136 έλεγχοι διαπίστωσαν ότι το αλληλόμορφο παραλλαγή του rs3742330 στην 3’UTR του

Dicer

αύξησε σημαντικά τον κίνδυνο OPLs σε Αμερικανούς [15]. Δύο άλλες μελέτες ανέφεραν ότι rs11077 στην 3’UTR του

XPO5

και rs14035 στην 3’UTR του

RAN

συσχετίστηκαν με τον κίνδυνο καρκίνου του οισοφάγου [16] ή νεφροκυτταρικό καρκίνωμα [17]. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, δεν υπάρχει καμία αναφορά σχετικά με τη σχέση μεταξύ των γενετικών παραλλαγών στα γονίδια βιογένεση των miRNAs και τον κίνδυνο ΕΘΕΓ. Σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι πιθανώς λειτουργική SNPs στην 3’UTR του miRNA γονιδίων βιογένεση μπορεί να τροποποιήσει τον κίνδυνο ΕΘΕΓ στην κινεζική πληθυσμό. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, πραγματοποιήσαμε μια ανάλυση του γονότυπου των τριών SNPs (rs1057035 στο

Dicer

, rs3803012 στο

RAN

και rs10773771 στο

HIWI

) με μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων από 397 ΕΘΕΓ περιπτώσεις καρκίνου και 900 υγιείς μάρτυρες στην Κινέζων Χαν και να αξιολογούνται μεμονωμένα ή από κοινού επίδραση στην ΕΘΕΓ κίνδυνο. Για να διευκρινιστεί η λειτουργική συνάφεια των επιλεγμένων SNPs με καρκίνο HNC, εξετάσαμε επίσης την δραστικότητα λουσιφεράσης του

Dicer

rs1057035 (Τ και C αλληλόμορφα) με την δοκιμασία κλωνοποίησης και γονίδιο ρεπόρτερ, την εκτίμηση των αποτελεσμάτων της SNP για την δέσμευση του ειδικού miRNAs στην 3’UTR του

Dicer

.

η

Υλικά και Μέθοδοι

Ηθική Δήλωση

Αυτή η μελέτη εγκρίθηκε από το επιτροπή δεοντολογίας της Nanjing Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Ο σχεδιασμός και η εκτέλεση της παρούσας μελέτης αφορούν τα ανθρώπινα υποκείμενα που περιγράφεται με σαφήνεια σε ένα ερευνητικό πρωτόκολλο. Όλοι οι συμμετέχοντες ήταν εθελοντική και θα ολοκληρώσει την ενημερωμένη συγκατάθεση σε γραπτή προτού λάβει μέρος σε αυτή την έρευνα.

Η

πληθυσμός Μελέτη

Όλοι οι ασθενείς ΕΘΕΓ πρόσφατα και ιστολογικά επιβεβαιωμένη είχαν διαδοχικά προσληφθεί από Jiangsu Οδοντιατρικές Νοσοκομείο και η Πρώτη Ενταγμένο Νοσοκομείο Ιατρικό Πανεπιστήμιο Nanjing, Nanjing, Κίνα, από τον Ιανουάριο του 2009 έως τον Απρίλιο του 2011. τα κριτήρια αποκλεισμού που περιλαμβάνονται δεύτερο πρωτογενείς όγκους ΕΘΕΓ ή μεταστάσεις καρκίνου από άλλα όργανα. 420 περιπτώσεις είχαν αρχικά επικοινώνησε για τη συμμετοχή και περίπου το 95% των επιλέξιμων περιπτώσεων (397 περιπτώσεις) συμφώνησαν να συμμετάσχουν στη μελέτη. Χωρίς καρκίνο ελέγχους συχνότητας ταιριάζουν με τις υποθέσεις σχετικά με την ηλικία (± 5 έτη) και το φύλο επιλέχθηκαν τυχαία από μια ομάδα περισσότερων από 30.000 συμμετέχοντες σε ένα πρόγραμμα προσυμπτωματικού ελέγχου με βάση την κοινότητα για τη μη λοιμώδη νοσήματα στην επαρχία Jiangsu, Κίνα. Όλοι οι συμμετέχοντες ήταν γενετικά άσχετη, εθνοτική πληθυσμού Κινέζων Χαν. Όταν λήφθηκε γραπτή συγκατάθεση, ένα δομημένο ερωτηματολόγιο που χρησιμοποιήθηκε από εκπαιδευμένους ερευνητές να συλλέξουν πληροφορίες σχετικά με τα δημογραφικά στοιχεία και την ιστορία περιβαλλοντικής έκθεσης, όπως η ηλικία, το φύλο, το κάπνισμα και την κατανάλωση αλκοόλ. Μετά συνέντευξη, περίπου 5-ml δείγματος φλεβικού αίματος συλλέχθηκε από κάθε συμμετέχοντα. Τέλος, συνολικά 397 περιπτώσεις και 900 έλεγχοι ολοκλήρωσε τη συνέντευξη και δώρισε το δείγμα αίματος.

Η

επιλογή SNP και του γονότυπου

Οκτώ βασικά γονίδια βιογένεση miRNA (

DROSHA

,

DGCR8

,

XPO5

,

Dicer

,

HIWI

,

GEMIN3

,

GEMIN4

και

RAN

) επιλέχθηκαν μέσω μιας εκτεταμένης αναζήτησης βιβλιογραφίας. Για κάθε γονίδιο, που χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά τη βάση δεδομένων NCBI dbSNP (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/χτίσει 131) για να αναζητήσετε SNPs που εντοπίζονται στο 3 ‘UTR των γονιδίων και βρήκε 17 SNPs με συχνότητα έλασσον αλληλόμορφο (MAF ) & gt? 0.05 στο κινεζικού πληθυσμού. Στη συνέχεια, δύο web-based εργαλεία ανάλυσης χρησιμοποιήθηκαν για να προβλεφθεί το αποτέλεσμα των 17 SNPs σε δεσμευτική miRNA (https://snpinfo.niehs.nih.gov/snpfunc.htm? https://miracle.igib.res.in/dbSMR παρέμειναν) [18], [19] και μόνο το 4 SNPs με συνεπή ευρήματα και στα δύο εργαλεία. Μεταξύ αυτών των SNPs (rs11077, rs1057035, rs10773771, και rs3803012), rs11077 αποκλείστηκε επειδή η περαιτέρω έρευνα από τη βάση δεδομένων mirBase (https://www.mirbase.org/search.shtml) έδειξε ότι αυτό το SNP δεν βρισκόταν στην περιοχή δέσμευσης για κάθε miRNA. Ως αποτέλεσμα, εντοπίσαμε 3 SNPs miRNA-δεσμευτική σε τρία γονίδια (rs1057035 στο

Dicer

, rs3803012 στο

RAN

και rs10773771 στο

HIWI

). Μεταξύ αυτών, rs1057035 είχε προβλεφθεί για την επιρροή έχει-miR-574-3p δεσμευτική, rs3803012 συνδιαμόρφωση έχει-miR-199α-3ρ δεσμευτική και 10773771 συνδιαμόρφωση έχει-miR-1264 δεσμευτική

(*, Ρ & lt?. 0,05? **, Ρ & lt?. 0.001)

η

Γονιδιωματικό DNA απομονώθηκε από τα λευκοκύτταρα του φλεβικού αίματος από πέψη με πρωτεϊνάση Κ και εκχύλιση με φαινόλη /χλωροφόρμιο. Η γονοτυποποίηση SNPs διεξήχθη με χρήση TaqMan Δοκιμασία διάκριση αλληλόμορφων σε ένα σύστημα ΑΒΙ 7900 (Applied Biosystems, Foster πόλη, CA). Η γονοτύπηση εκτελέστηκε χωρίς να γνωρίζει την περίπτωση ή τον έλεγχο κατάστασης των υποκειμένων, και δύο αρνητικοί μάρτυρες σε κάθε μορφή 384 φρεατίων χρησιμοποιήθηκαν για τον έλεγχο της ποιότητας. Τα αποτελέσματα του γονότυπου προσδιορίστηκαν με τη χρήση SDS 2.3 Τα αλληλόμορφα Διακρίσεων Λογισμικού (Applied Biosystems). Η συμφωνία επιτεύχθηκε το 100% για τα αντίγραφα του 5% των δειγμάτων για κάθε SNP. Δοκιμασίας

λουσιφεράσης δημοσιογράφο να καθοριστούν οι επιπτώσεις των δεσμευτικών miRNA στην έκφραση Dicer

Η περιοχή 3’UTR του

Dicer

περιέχουν τις υποθετική θέση αναγνώρισης rs1057035 ενισχύθηκε από το DNA του δείγματος, στη συνέχεια κλωνοποιούνται εντός της pMIR-REPORT

TM (Applied Biosystems) φορέα με πέψεις ΜΙυ Ι και Hind III. Οι εκκινητές ήταν: GTAGACGCGTTCAACAGCAAACTTCAGCC (με νόημα) και TCCAAAGCTTGGCAGGGTATCAGAATCTTT (αντιπληροφοριακό). Τα πλασμίδια που περιέχουν τα διαφορετικά αλληλόμορφα του rs1057035 παράχθηκαν χρησιμοποιώντας τοποειδική μεταλλαξογένεση. Όλα τα κατασκευάσματα που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη χαρτογραφήθηκαν περιορισμού και τοποθετήθηκε σε ακολουθία για την επιβεβαίωση της αυθεντικότητάς τους.

ΤΟΑ-8113 (μια ανθρώπινη κυτταρική γραμμή του στόματος πλακώδες καρκίνωμα) [20], 293Τ (μια ανθρώπινη κυτταρική σειρά εμβρυϊκού νεφρού) και Hela (α ανθρώπινου τραχηλικού καρκινώματος κυτταρική γραμμή) κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τροποποιημένο μέσο του Dulbecco Eagle με υψηλή γλυκόζη (Gibco) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο βόειο εμβρυϊκό ορό (Gibco) και 50 μg /ml στρεπτομυκίνη (Gibco) σε επωαστή 37 ° C συμπληρωμένο με 5% CO2. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

5 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες 24 φρεατίων (Βϋ Biosciences, Bedford, ΜΑ). Είκοσι τέσσερις ώρες μετά την επίστρωση, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με Lipofectamine 2000, σύμφωνα με εισήγηση του κατασκευαστή (Invitrogen). Η

Dicer

3’ΙΙΤΡ πλασμίδια λουσιφεράσης (διαφορετικά αλληλόμορφα) και συντεθεί χημικά ώριμη HSA-miR-574-3p συνεπιμολύνθηκαν αντίστοιχα. Το πλασμίδιο pRL-SV40 (Promega) συνεπιμολύνθηκε ως ομαλοποίηση ελέγχου. Έξι επαναλήψεις για κάθε ομάδα και το πείραμα επαναλήφθηκε τουλάχιστον τρεις φορές. Μετά από 24 ώρες επώασης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν για δραστικότητα λουσιφεράσης με το Σύστημα Δοκιμασίας Dual-Luciferase Reporter (Promega).

Στατιστική ανάλυση

Η ισορροπία Hardy-Weinberg υποβλήθηκε σε καλοσύνη -των-fit χ

2 τεστ για να συγκρίνουν τις παρατηρούμενες συχνότητες γονοτύπου με τις αναμενόμενες αυτές μεταξύ των ατόμων της ομάδας ελέγχου. Κατανομές των επιλεγμένων δημογραφικές μεταβλητές, τους παράγοντες κινδύνου, καθώς και τις συχνότητες των γονοτύπων παραλλαγή μεταξύ των περιπτώσεων και των ελέγχων αξιολογήθηκαν με τη χρήση της χ

2 τεστ. Οι ενώσεις της παραλλαγής γονότυπων με ΕΘΕΓ κίνδυνος εκτιμήθηκε υπολογίζοντας αναλογίες πιθανοτήτων (OR) και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης (ΠΙ) από αναλύσεις τόσο μονοπαραγοντική και πολυπαραγοντική λογιστική παλινδρόμηση. Η ανομοιογένεια μεταξύ των υποομάδων εκτιμήθηκε με τη δοκιμασία Q Chi-square-based και η ετερογένεια θεωρήθηκε σημαντική όταν

P

& lt? 0,05. Οι πιθανές γονίδιο-γονιδίων και γονιδίων-περιβάλλοντος (δηλαδή το κάπνισμα και την κατάσταση του πόσιμου) αλληλεπιδράσεις αξιολογήθηκαν από τα μοντέλα λογιστικής παλινδρόμησης. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με το λογισμικό Συστήματος Στατιστικής Ανάλυσης (SAS Institute v.9.1, Cary, NC). Δύο όψεων δοκιμές χρησιμοποιείται γενικά για τη στατιστική ανάλυση και

P

& lt?. 0,05 θεωρήθηκε ως το επίπεδο στατιστικής σημαντικότητας

Αποτελέσματα

Τα επιλεγμένα χαρακτηριστικά των περιπτώσεων και οι έλεγχοι παρουσιάζονται στον πίνακα 1. Δεν υπήρχαν σημαντικές διαφορές στις κατανομές των ηλικία, το φύλο και το κάπνισμα μεταξύ των περιπτώσεων και ελέγχων (

P

= 0.637, 0.263 και 0.580, αντίστοιχα), και η μέση ηλικία ήταν παρόμοια (59,98 ± 11,94 χρόνια για τις περιπτώσεις και 60,65 ± 7,99 χρόνια για τους ελέγχους). Όπως ήταν αναμενόμενο, περισσότερο πότες παρατηρήθηκαν στην ομάδα περίπτωση σε σύγκριση με εκείνη στην ομάδα ελέγχου (45,1% έναντι 32,2%,

P

& lt? 0.001). Από τις 397 περιπτώσεις, 293 (73,8%) ήταν με τον όγκο της στοματικής κοιλότητας, 6 (1,5%) με στοματοφάρυγγα, 86 (22,2%) με λάρυγγα και 10 (2,5%) με τους άλλους. Επιπλέον, 335 περιπτώσεις (84,4%) παρουσιάζονται με ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα.

SNPs ήταν σε ισορροπία Hardy-Weinberg ισορροπία (

P

= 0,14 για rs1057035 και

P

= 0,73 για rs3803012, αντίστοιχα) με εξαίρεση rs10773771 (

P

= 0,01). Ο γονότυπος και αλληλόμορφου κατανομές των

Dicer

rs1057035,

HIWI

rs10773771 και

RAN

rs3803012 στις περιπτώσεις και τους ελέγχους παρουσιάζονται στον Πίνακα 2. Η ενιαία θέση αναλύσεις αποκάλυψαν ότι οι διανομές γονότυπο αυτών των τριών πολυμορφισμών δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ των συνολικά περιπτώσεις και τους ελέγχους (

P

= 0,080 για rs1057035,

P

= 0,397 για rs3803012 και

P

= 0,539 για rs10773771, αντίστοιχα). Για να διερευνήσουν περαιτέρω τις τροποποίηση αποτελέσματα των τριών παραλλαγών για κίνδυνο ΕΘΕΓ με διαφορετικές περιοχές του όγκου, πραγματοποιήσαμε την ανάλυση στρωματοποίησης από τη στοματική κοιλότητα και μη μορφές καρκίνου του στόματος κοιλότητα. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 2, rs1057035 γονότυπους παραλλαγή συσχετίστηκαν με σημαντικά μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του στόματος (TC εναντίον ΤΤ: προσαρμογή OR = 0.65, 95% CI = 0,46 – 0,93, ρυθμίζεται

P

= 0,019? TC /CC εναντίον ΤΤ: προσαρμογή OR = 0.65, 95% CI = 0,46 – 0,92, ρυθμίζεται

P

= 0,016? προσθετικό μοντέλο: προσαρμογή OR = 0.67, 95% CI = 0,48 – 0,93? προσαρμοστεί

P

= 0,018). Καμία από τις σημαντικές συσχετίσεις παρατηρήθηκαν μεταξύ των γονότυπων των άλλων δύο SNPs (rs3803012 A & gt? G, rs10773771 G & gt? Α). Και ο κίνδυνος της ΕΘΕΓ με διαφορετικές θέσεις (Πίνακας 2)

Εμείς περαιτέρω διεξάγεται η ανάλυση της διαστρωμάτωσης για το συσχετίσεις μεταξύ rs1057035 και προφορικές τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου από την ηλικία, το φύλο, το κάπνισμα, το ποτό και ιστολογία. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, ο μειωμένος κίνδυνος καρκίνου του στόματος που σχετίζονται με την παραλλαγή TC /γονότυπους CC ήταν σημαντική μεταξύ του νεότερου (ρυθμισμένο OR = 0,61? 95% CI = 0,38 – 0,97), θηλυκά (ρυθμισμένο OR = 0,53? 95% CI = 0,30 – 0,95), μη-καπνιστές (προσαρμογή OR = 0,50? 95% CI = 0,30 – 0,83) και μη-πότες (προσαρμογή OR = 0,54? 95% CI = 0,33 – 0,89), σε σύγκριση με το γονότυπο ΤΤ. Ωστόσο, δοκιμή ετερογένεια έδειξε ότι δεν υπήρχε σημαντική ετερογένεια (

P

& gt? 0,05) σε κάθε δύο λαϊκών στρωμάτων. Αξιολογήσαμε επίσης την επίδραση της προσθήκης του αλκοόλ, το κάπνισμα και το φύλο στο ΕΑΠ και διαπίστωσαν ότι αυτά ήταν καμία διαφορά εάν αυτές οι μεταβλητές που περιλαμβάνονται στα μοντέλα ή δεν περιλαμβάνονται (Πίνακας S1). Επιπλέον, δεν υπάρχουν σημαντικές αποτελέσματα παρατηρήθηκαν για το γονίδιο-γονίδιο ή γονιδίων-περιβάλλοντος (δηλαδή στο κάπνισμα και το καθεστώς αλκοόλ) αλληλεπιδράσεις (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Επειδή rs1057035 έδειξε σημαντική συσχέτιση με τον κίνδυνο καρκίνου του στόματος και είχε προβλεφθεί για τον εντοπισμό στην υποθετική θέση δέσμευσης miRNA (HSA-miR-574-3p), είναι ενδιαφέρον να ελέγξετε αν rs1057035 επηρεάζει την στόχευση της HSA-miR-574-3p να

Dicer

mRNA in vitro. Έτσι, δημιουργούνται γονίδια δημοσιογράφος για

Dicer

3’ΙΙΤΡ (C ή Τ αλληλόμορφου) που συνεπιμολύνθηκαν με χημικά συντίθεται ώριμη HSA-miR-574-3p στο Tca8113 προφορική πλακωδών κυττάρων γραμμές καρκίνωμα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, συνεπιμόλυνση της HSA-miR-574-3p ανέστειλε σημαντικά την έκφραση του ανταποκριτού που μεταφέρουν αλληλόμορφο rs1057035 C αλλά όχι το Τ αλληλόμορφο (293Τ κυτταρική γραμμή: 0.057 ± 0.002 για αλληλόμορφο C έναντι 0.333 ± 0.089 για το αλληλόμορφο Τ ,

P

= 0,032? Hela κυτταρική σειρά: 0,041 ± 0,007 για το C αλληλόμορφο έναντι 0,357 ± 0,257 για το αλληλόμορφο Τ,

P

= 0.030? κυτταρική σειρά Tca8113: 0,072 ± 0,067 για το αλληλόμορφο C έναντι 0,833 ± 0,120 για το αλληλόμορφο Τ,

P

& lt? 0.001). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το αλληλόμορφο παραλλαγή rs1057035 θα μπορούσε να επηρεάσει διαφορετικά την στόχευση της HSA-miR-574-3p να 3’UTR του

Dicer

στην προφορική καρκινικά κύτταρα.

Συζήτηση

σε αυτή τη μελέτη ασθενών-μαρτύρων των 397 ασθενών ΕΘΕΓ και 900 του καρκίνου χωρίς ελέγχους σε ένα κινεζικό πληθυσμό, ερευνήσαμε τις συσχετίσεις μεταξύ των τριών SNPs στην 3’UTR του miRNA γονιδίων βιοσύνθεσης και τον κίνδυνο της ΕΘΕΓ. Παρά το γεγονός ότι δεν είχαμε βρει αποδείξεις για μια κύρια επίδραση της κάθε SNP στο συνολικό κίνδυνο ΕΘΕΓ, η ανάλυση υποομάδας της ΕΘΕΓ έδειξε ότι παραλλαγή γονότυπους του rs1057035 συσχετίστηκαν με τον κίνδυνο της ΕΘΕΓ που προκύπτουν σε στοματική κοιλότητα. Πρόσθετες λειτουργικές αναλύσεις έδειξαν ότι αλληλόμορφο rs1057035 C οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερη δραστικότητα λουσιφεράσης, σε σύγκριση με το αλληλόμορφο Τ. Αυτά τα ευρήματα προταθεί, για πρώτη φορά, ότι πιθανώς λειτουργική πολυμορφισμοί του

Dicer

μπορεί να παίζει ένα ρόλο στην ανάπτυξη της HNC, ιδιαίτερα εκείνων των όγκων που προκύπτουν κατά τη στοματική κοιλότητα.

Dicer είναι ένα ένζυμο υπεύθυνη για την διάσπαση των προδρόμων miRNA και έχει προηγουμένως εμπλακεί στην ογκογόνο διαδικασία αρκετών καρκίνων [21], [22], [23]. Τα στοιχεία δείχνουν ότι

Dicer

μπορεί να έχει διαφορετικούς ρόλους στην ογκογένεση των διαφόρων μορφών καρκίνου. Για παράδειγμα, ορισμένες μελέτες έδειξαν ότι τα χαμηλότερα επίπεδα του

Dicer

έκφραση του mRNA που σχετίζεται με την ανάπτυξη του καρκίνου του πνεύμονα [24] και την πρόγνωση του καρκίνου των ωοθηκών [11]. Ωστόσο, μελέτες έδειξαν επίσης ότι τα επίπεδα αυξημένη έκφραση του

Dicer

συσχετίστηκαν με αυξημένη κυτταρικού πολλαπλασιασμού από του στόματος καρκινικών κυττάρων [12]. Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι το αλληλόμορφο παραλλαγή rs1057035 C οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης του

Dicer

και παρουσίασε μια προστατευτική επίδραση στην ευαισθησία του καρκίνου του στόματος, η οποία ήταν σύμφωνα με τα πορίσματα του στόματος καρκινικά κύτταρα [12]. Επιπλέον, βρήκαμε ότι η προστατευτική επίδραση του rs1057035 γονότυπων παραλλαγή ήταν στατιστικά σημαντική σε ορισμένες υποομάδες, όπως οι γυναίκες, οι μη καπνιστές και μη-πότες. Ωστόσο, δοκιμή ετερογένεια δεν έδειξε σημαντική ετερογένεια (

P

& gt? 0,05). Μεταξύ κάθε δύο λαϊκών στρωμάτων, υπονοώντας ότι δεν υπάρχει τροποποίηση αποτελέσματος κίνδυνος από αυτές τις μεταβλητές υπό έρευνα

Το σημαντικό SNP (rs1057035 ) που προσδιορίζονται στη μελέτη μας βρίσκεται στο 3 ‘UTR του

Dicer

και προβλέπεται να επηρεάσει τη δέσμευση της HSA-miR-574-3p. HSA-miR-574-3p είναι εξελικτικώς διατηρημένη σε επίπεδο νουκλεοτιδίων από μύγες στον άνθρωπο. Αν και η λειτουργία του HSA-miR-574-3p δεν είναι σαφής, προβλέπεται να στοχεύσει αρκετές εκατοντάδες ανθρώπινων γονιδίων [25]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το

Dicer

αλληλόμορφο rs1057035 C μπορεί να επηρεάσει την στόχευση της HSA-miR-574-3p και έχει ως αποτέλεσμα την μειωμένη έκφραση του

Dicer

mRNA σε προφορική καρκινικά κύτταρα, τα οποία μπορεί να είναι ένας πιθανός υποκείμενος μηχανισμός για την παρατηρούμενη συσχέτιση μεταξύ rs1057035 και το μειωμένο κίνδυνο καρκίνου του στόματος. Ωστόσο, δεν βρέθηκε καμία συσχέτιση μεταξύ rs1057035 και συνολικό κίνδυνο καρκίνου του ΕΘΕΓ ή μη προφορική τον κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου στη μελέτη μας. Η παθογένεση του καρκίνου του στόματος μπορεί να είναι ελαφρώς διαφορετική από τις άλλες μορφές καρκίνου που προκύπτουν στο κεφάλι και το λαιμό. Για παράδειγμα, πρόσφατες επιδημιολογικές και μοριακές μελέτες έχουν προσδιορίσει υψηλού κινδύνου τύπους του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV), όπως το δυναμικό αιτιολογικός παράγοντας στις περιπτώσεις HNC, αλλά είναι πιο εμφανείς στον στοματοφάρυγγα καρκίνο από ότι στο καρκίνο στοματικής κοιλότητας [3], [26 ].

Επιπλέον, βρήκαμε επίσης σημαντικές συσχετίσεις μεταξύ SNPs στην 3’UTR του

RAN

και

HIWI

και τον κίνδυνο ΕΘΕΓ. RAN είναι ένα μοναδικό μέλος της υπεροικογένειας Ras των GTPases, η οποία είναι απαραίτητη για την μεταφορά των προ-miRNAs από πυρήνα στο κυτταρόπλασμα μέσω του πυρηνικού πόρου συγκρότημα σε ένα GTP-εξαρτώμενο τρόπο [27]. HIWI είναι ένα μέρος του RNA Induced κατασιγάσει Complex (RISC) και ένα βασικό ρυθμιστή της βλαστοκυττάρων πλειοδυναμίας ελέγχοντας κύτταρο αυτο-ανανέωσης και της διαφοροποίησης [28]. Ορισμένες μελέτες έχουν ερευνήσει τις συσχετίσεις μεταξύ πολυμορφισμών αυτών των δύο γονιδίων και κίνδυνο πολλών καρκίνων, όπως καρκίνο του οισοφάγου, ο καρκίνος της ουροδόχου κύστης και καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων, αλλά τα αποτελέσματα ήταν ασυνεπής [15], [16], [17], [29] . Στη μελέτη μας βρήκαμε κατ ‘αρχάς ότι

RAN

rs3803012 και

HIWI

rs10773771 παραλλαγή γονότυπους δεν συσχετίστηκαν με τον κίνδυνο της ΕΘΕΓ, προτείνοντας αυτά τα SNPs μπορεί να μην ρυθμίζουν την ευαισθησία του ΕΘΕΓ στην κινεζική πληθυσμού.

Αρκετές πιθανούς περιορισμούς των σημερινών εκτιμήσεων ένταλμα μελέτη. Πρώτα απ ‘όλα, ένα σχετικά μικρό μέγεθος του δείγματος ενδέχεται να περιορίσει τη στατιστική ισχύ της μελέτης μας, ειδικά στην ανάλυση στρωματοποίηση κατά τόπους όγκου. Αξιολογήσαμε τη στατιστική ισχύ για την επίδραση του rs1057035 από το λογισμικό PS (Power και το δείγμα Υπολογισμοί Μέγεθος έκδοση 1.0.17) και διαπίστωσε ότι στην περίπτωση OR = 0,65 (κυρίαρχο μοντέλο), το δείγμα μας θα μπορούσε να φθάσει το 78,8% του στατιστικού αποτελεσματικότητα. Δεύτερον, είναι μια μελέτη ασθενών-μαρτύρων νοσοκομείο με βάση και την εγγενή προκατάληψη επιλογής δεν μπορεί να αποκλειστεί εντελώς. Ωστόσο, εφαρμόσαμε μια αυστηρή επιδημιολογική σχεδιασμός στην επιλογή θεμάτων μελέτης και να χρησιμοποιηθούν περαιτέρω στατιστική προσαρμογή για γνωστούς παράγοντες κινδύνου για την ελαχιστοποίηση των πιθανών προκαταλήψεις. Τρίτον, δεδομένου ότι η ένταση και η διάρκεια του καπνίσματος και το ποτό ήταν απούσες σε αυτήν την μελέτη, ήταν δύσκολο να κάνουμε μελλοντική ανάλυση για τέτοιες μεταβλητές έκθεση. Τέλος, επιλέξαμε μόνο SNPs miRNA-δεσμευτική για γονότυπου και δεν θα μπορούσε να αξιολογηθεί η σχέση μεταξύ άλλων δυνητικά λειτουργικά SNPs σε γονίδια επεξεργασία miRNA και τον κίνδυνο ΕΘΕΓ. έτσι, μεγαλύτερες, καλά σχεδιασμένες επιδημιολογικές μελέτες με εθνοτική πολυμορφία του πληθυσμού δικαιολογείται να επιβεβαιώσει και να επεκτείνουν τα ευρήματά μας.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Πίνακα S1.

Η ανάλυση για την επίδραση των μεταβλητών στις ΕΑΠ στα μοντέλα. ΣΗΜΕΙΩΣΗ:

μια δοκιμή λόγος Πιθανότητα χρησιμοποιήθηκε για να ελέγξετε τη διαφορά μεταξύ -2 * συνδεθείτε Κίνδυνος από τα δύο μοντέλα.

b Σε σύγκριση με το πρώτο μοντέλο όπως η ηλικία, το φύλο, το κάπνισμα και το ποτό

doi:. 10.1371 /journal.pone.0047544.s001

(DOCX)