Αφηρημένο

Αναφέρουμε μηχανικές αλλαγές κυττάρων σε απάντηση μεταβολή της έκφρασης του ανθρώπινου εξισορροπητικού νουκλεοτιδικού transporter- 1 (hENT1), μια πιο άφθονη και ευρέως κατανεμημένη νουκλεοτιδικού μεταφορέα μεμβράνης πλάσματος σε ανθρώπινα κύτταρα και /ή ιστούς. Διαμόρφωση του επιπέδου έκφρασης hENT1 μετέβαλε την ακαμψία του καρκίνου του παγκρέατος Capan-1 και Panc 03,27 κύτταρα, τα οποία αναλύθηκαν με μικροσκοπία ατομικής δύναμης (AFM) και συσχετίζεται με microfluidic πλατφόρμα. Η επαγόμενη hENT1 knockdown μείωση των κυτταρικών ακαμψία τόσο των κυττάρων έως και 70%. Επιπλέον, παρατηρήθηκαν κυτταρικά φαινοτυπικές αλλαγές όπως μορφολογία κυττάρων, μετανάστευση, και το επίπεδο έκφρασης του επιθηλίου-μεσεγχύματος μετάβασης (ΕΜΤ) δείκτες μετά hENT1 knockdown. Κύτταρα με κατέστειλε hENT1 έγινε επιμήκη, μετανάστευσε γρηγορότερα, και είχε μειώσει Ε-καδερίνης και αυξημένα Ν-καντερίνης σε σύγκριση με τα γονικά κύτταρα που συνάδουν με επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ). Αυτές οι κυτταρικές αλλαγές φαινοτυπική συσχετίζονται στενά με τις αλλαγές στην κυτταρική ακαμψία. Αυτή η μελέτη δείχνει ότι το επίπεδο έκφρασης hENT1 επηρεάζει κυτταρικό φαινότυπο και κυττάρων ελαστική συμπεριφορά μπορεί να είναι ένα φυσικό βιολογικό δείκτη για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης hENT1 και τον εντοπισμό φαινοτυπική βάρδια. Επιπλέον, η κυτταρική μηχανική μπορεί να είναι ένα κρίσιμο εργαλείο για την ανίχνευση της εξέλιξης της νόσου και την ανταπόκριση στη θεραπεία

Παράθεση:. Lee Υ, Koay EJ, Zhang W, Qin L, Κιρούι DK, Hussain F, et al. (2014) Ανθρώπινα εξισορροπητικού νουκλεοτιδικού μεταφορέα-1 Νοκ ντάουν Tunes Κυτταρικής Μηχανικής μέσω επιθηλιακά μεσεγχυματικά μετάβαση σε κύτταρα καρκίνου του παγκρέατος. PLoS ONE 9 (10): e107973. doi: 10.1371 /journal.pone.0107973

Επιμέλεια: Xin Yuan-Γκουάν, το Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Κίνα

Ελήφθη: 3 Ιουλίου του 2014? Αποδεκτές: 16 Αυγούστου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 14 Οκτωβρίου του 2014

Copyright: © 2014 Lee et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού και της Υποστήριξη αρχείων Πληροφορίες

Χρηματοδότηση:. Οι συγγραφείς εκφράζουν την ευγνωμοσύνη αναγνωρίζουν την υποστήριξη χρηματοδότησης από τις ακόλουθες πηγές: Υπουργείο Άμυνας χορηγεί W81XWH-09-1-0212 και W81XWH-12-1- 0414, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγεί U54CA143837 και U54CA151668, το CPRIT RP121071 επιχορήγηση από την πολιτεία του Τέξας, και το Ernest Cockrell νεώτερος Διακεκριμένοι Προικισμένο πρόεδρος. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή παγκρεατικό αδενοκαρκίνωμα

(PDAC) είναι μία από τις πιο θανατηφόρες καρκίνους του ανθρώπου με εξαιρετικά φτωχή πρόγνωση [1]. PDAC έχει χαμηλό ποσοστό επιβίωσης, ακόμη και μετά την πλήρη εκτομή του όγκου, η οποία είναι η μόνη πιθανότητα για θεραπεία. Δυστυχώς, οι περισσότεροι των όγκων είναι ανεγχείρητο και μεταστατικό. Έτσι, η χημειοθεραπεία και /ή ακτινοθεραπεία είναι οι μόνες επιλογές [2], [3]. Η γεμσιταβίνη (2 ‘, 2’-διφθοροδεοξυκυτιδίνη) είναι ένας από αποτελεσματικών αντικαρκινικών παραγόντων για τον καρκίνο του παγκρέατος [1]. Είναι ένα κυτταροτοξικό πυριμιδίνης αναλόγου δεοξυνουκλεοζιτών που μεταφέρεται στο κυτταρικό διαμέρισμα μέσω του πρωτεύοντος πρωτεΐνη μεταφοράς, τα ανθρώπινα εξισορροπητικού νουκλεοτιδικού μεταφορέα-1 (hENT1), και τελικά αναστέλλει την αντιγραφή του DNA. Το επίπεδο έκφρασης hENT1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα έχει ήδη συσχετιστεί με θεραπευτική αποτελεσματικότητα, όπου τα κύτταρα με την υψηλότερη έκφραση hENT1 έδειξαν να ανταποκρίνονται καλύτερα στις γεμσιταβίνη. Επιπλέον, μελέτες κυτταρικό επίπεδο έχουν δείξει επίσης ότι τα καρκινικά κύτταρα του παγκρέατος με χαμηλή έκφραση hENT1 είναι ιδιαίτερα ανθεκτικά σε γεμσιταβίνη [4]. Επιπλέον, κλινικές μελέτες έχουν αποδείξει ότι η έκφραση hENT1 επηρεάσει το πώς οι ασθενείς ανταποκρίνονται στη θεραπεία, όπου οι ασθενείς των οποίων ο όγκος εκφράζεται χαμηλή hENT1 βιοδείκτη ανταποκρίθηκαν ανεπαρκώς σε γεμσιταβίνη θεραπεία [3], [5].

Ο καρκίνος του παγκρέατος κύτταρα που αποκτούν γεμσιταβίνη-αντίσταση χαρακτηρίζονται από επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ) φαινότυπο και δείχνουν διακριτές μορφολογικές αλλαγές από επιθηλιακά να ατρακτοειδής και αυξάνοντας την κυτταρική κινητικότητα [6], [7]. EMT είναι μια βιολογική διαδικασία που πολωμένα επιθηλιακά κύτταρα στραφούν σε μεσεγχυματικά φαινότυπο μέσω πολλαπλών βιοχημικών αλλαγών. Αυτή η φαινοτυπική μετάβαση χαρακτηρίζεται από απώλεια της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και δυναμικές αλλαγές στη δομή του κυτταροσκελετού που προκαλούν κύτταρα να αποκολληθούν από επιθήλιο και να αποκτήσουν την ικανότητα να μεταναστεύουν σε μακρινές θέσεις [8], [9]. Έτσι, σε αυτή τη μελέτη, υποθέσαμε ότι η τροποποίηση των επιπέδων έκφρασης hENT1 σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μπορούν να μεταβάλλουν φυσιολογικά χαρακτηριστικά τους, όπως αυτό μπορεί να προκαλέσει φαινοτυπική μεταστροφή από αναστολή πρόσληψης γεμσιταβίνη. Εκτός από τις βιοχημικές μεθόδους για τον εντοπισμό κυτταρικών φυσιολογικές αλλαγές, την κατανόηση της μηχανικής των κυττάρων μπορεί να παρέχει νέες βιολογικές γνώσεις. Πρόσφατες μελέτες δείχνουν ότι οι μηχανικές ιδιότητες των κυττάρων παρέχουν ζωτικής σημασίας πληροφορίες για την κατανόηση διάφορες βιοφυσικές συμπεριφορές που περιλαμβάνουν το σχήμα των κυττάρων, την κινητικότητα, και την προσκόλληση των κυττάρων που παράγουν έναν καταρράκτη βιοχημικών σημάτων που είναι κρίσιμες για βιολογικές αντιδράσεις [10]. Οι μηχανικές υπογραφές των κυττάρων μπορεί να είναι ένα σημαντικό εργαλείο για διάφορες πτυχές: (1) Προσδιορισμός των καρκινικών κυττάρων από τα φυσιολογικά κύτταρα με βάση την σχετικά χαμηλότερη ακαμψία τους [11]? (2) Η πρόβλεψη ενός μεταστατικό δυναμικό των καρκινικών κυττάρων ως κυτταρικό ακαμψία συσχετίζεται αντιστρόφως ανάλογα με τη μετανάστευση και την εισβολή [12] – [14]? (3) Αναγνώριση των φαινοτυπικών αλλαγών που συνδέονται με την αλλαγή στην ενδοκυτταρική δομή και την κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων με μέτρηση της αύξησης ή μείωσης του συντελεστή ελαστικότητας [11], [15] – [18]. Αν και δεν υπάρχει άμεση απόδειξη ότι hENT1 σχετίζεται με φαινοτυπικές εκδηλώσεις σε παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα, μπορούμε να υποθέσουμε ότι η έκφραση hENT1 μπορεί να ρυθμίζει την κυτταρική βιοφυσική συμπεριφορών που βασίζονται στη στενή συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης hENT1 και την ευαισθησία γεμσιταβίνη. Η κυτταρική φαινοτυπική μετάβαση από ανθεκτικά gemcitabine κύτταρα συστάθηκε με καλλιέργεια κυττάρων σε σειριακά αυξανόμενη συγκέντρωση της γεμσιταβίνης υποστηρίζει επίσης την υπόθεσή μας.

Σε αυτή τη μελέτη, δύο διαφορετικές μεθόδους, AFM και ένα microfluidic πλατφόρμα, χρησιμοποιήθηκαν για να αξιολογηθεί πώς διαμόρφωση του hENT1 επιρροές επίπεδο έκφρασης στην ακαμψία των καρκινικών κυττάρων του παγκρέατος. Στη συνέχεια, οι συνημμένες μορφολογικές αλλοιώσεις, κυτταροσκελετού αναδιατάξεις, κυτταρική κινητικότητα, και οι αλλαγές στα επίπεδα έκφρασης δεικτών EMT να ερευνήσει την κυτταρική μετατόπιση φαινοτυπική χαρακτηρίστηκαν (Εικόνα 1). Μαζί τα αποτελέσματά μας σε επίπεδο έκφρασης hENT1 και κυττάρων ακαμψία συσχετίζονται πολύ καλά με τις μηχανιστικές μεταβολές της ενδοκυτταρικής δομής κυτταροσκελετού, την κυτταρική κινητικότητα, και δείχνουν ότι η κυτταρική ελαστικές ιδιότητες μπορεί να εκτιμήσει το επίπεδο έκφρασης hENT1 καθώς και φαινοτυπική βάρδια.

Η hENT1 knockdown προκαλεί αλλαγές στην κυτταρική μηχανική μέσω ΕΜΤ συνοδεύεται από μεταβολές στα επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης και Ν-cadherin, κυτταρική μορφολογία, και την κινητικότητα των παγκρεατικών καρκινικών κυττάρων. Περαιτέρω, hENT1 νοκ ντάουν προκαλεί μείωση στο κελί ακαμψία όπως αποδεικνύεται στις αντιπροσωπευτικές καμπύλες διαχωρισμού ισχύος που λαμβάνεται από Panc 03,27 κύτταρα (άνω γράφημα από ένα μητρικό κύτταρο? Το δεύτερο γράφημα από ένα νοκ ντάουν κύτταρο hENT1). Χρησιμοποιώντας AFM

Η

Υλικά και Μέθοδοι

κυτταρική καλλιέργεια

Όλες οι κυτταρικές σειρές αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA). Η AsPC-1, BxPC-3, MIA Paca 2 και Panc-1 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM, Thermo Scientific Hyclone, Waltham, ΜΑ) με 10% ορό εμβρύου βοός (FBS, ATLAS Biologicals, Fort Collins , CO), Capan-1 σε DMEM με 20% FBS, και Panc 03,27 σε RPMI 1640 (Thermo Scientific Hyclone, Waltham, ΜΑ) με 15% FBS και ανθρώπινη ανασυνδυασμένη ινσουλίνη (10 μονάδες /ml, Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ) υπό την παρουσία 5% CO

2 στους 37 ° C.

hENT1 knockdown με siRNA διαμόλυνση

Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε 6 cm τρυβλίου καλλιέργειας κυττάρων σε μια πυκνότητα 5 × 10

5 κύτταρα /τρυβλίο. Μετά την πλύση με PBS, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία με ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ (Polyplus επιμόλυνση ™) που περιέχει siRNA έναντι hENT1 (SMARTpool: ON-TARGET συν SLC29A, Dharmacon, Inc., Pittsburgh, PA) ή αρνητική siRNA (σιλανσιέ αρνητικού ελέγχου Νο 1 siRNA, AM4635 , Invitrogen, Grand Island, ΝΥ) σε συγκέντρωση 50 ηΜ σε Ορίί-ΜΕΜ (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ). Μετά από 24 ώρες διαμόλυνσης, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επωάστηκαν για 3 ημέρες.

κηλίδωση Western ανάλυση

Τα κύτταρα λύθηκαν με ρυθμιστικό διάλυμα RIPA Pierce (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) με αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ). Τα κυτταρικά λύματα (10 μα) με ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης (ρυθμιστικό δείγματος LDS Μη-αναγωγικές, Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) θερμάνθηκαν για 5 λεπτά στους 95 ° C. λύματα των κυττάρων και πρωτεϊνών σκάλα (Xpert 2 Προχρωματισμένοι Πρωτεΐνη δείκτης, GenDEPOT) φορτώθηκαν σε πήγματα πολυακρυλαμιδίου (Οποιαδήποτε kD Μίνι PROTEAN TGX Προκατασκευασμένα Gel, Bio-Rad, Hercules, CA) και μεταφέρθηκαν σε νιτροκυτταρίνη μεμβράνη (Bio-Rad, Hercules, CA) . Οι κηλίδες μπλοκαρίστηκαν με ρυθμιστικό αποκλεισμού, TBST (20 mM TRIS ρΗ 7.6 /150 mM NaCl /0,05% Tween 20) που περιέχει 5% γάλα για μία ώρα. Τα στυπώματα επωάστηκαν για μια νύχτα με TBST και 5% γάλα που περιέχει πρωτογενή αντισώματα σε ορισμένες αναλογίες: αντι-hENT1 αντίσωμα (1:1000, Abcam, Cambridge, ΜΑ)? αντίσωμα αντι-Ε-καδερίνης (1:1000, Abcam, Cambridge, ΜΑ)? αντίσωμα αντι-Ν-cadherin (1:500, Abcam, Cambridge, ΜΑ)? κυτοκερατίνη 18 (1:1000, Cell τεχνολογία σηματοδότησης, Danvers, ΜΑ)? Lamin A /C (1:1000, Cell τεχνολογία σηματοδότησης, Danvers, ΜΑ)? αντι-GAPDH αντίσωμα (1:2000, Cell τεχνολογία σηματοδότησης, Danvers, ΜΑ). Μετά από πλύση τρεις φορές με TBST, τα στυπώματα επωάστηκαν με TBST και 5% γάλα που περιέχει δευτερεύοντα αντισώματα, αντι-ποντικού IgG, HRP-συνδεδεμένη αντίσωμα (1:5000, Cell τεχνολογία σηματοδότησης, Danvers, ΜΑ) ή αντι-κουνελιού IgG, HRP -συνδεδεμένης αντίσωμα (1:5000, Cell τεχνολογία σηματοδότησης, Danvers, ΜΑ), για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, οι κηλίδες τοποθετούνται πάνω σε ένα μίγμα από Pierce ECL Western blotting υπόστρωμα (Thermo Scientific, Waltham, ΜΑ) και Lumigen TMA-6 (Lumigen, Inc., Southfield, ΜΙ), και ανιχνεύθηκαν πρωτεΐνες.

ανοσοφθορισμού

παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων που περιέχουν αποστειρωμένο, κολλαγόνο Ι (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ) -επικαλυμμένα καλυπτρίδες (22 × 22 mm, που Corning) σε πυκνότητα 2 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο. Τα κύτταρα παρασκευάστηκαν με τρεις ομάδες: 1) έλεγχος (χωρίς θεραπεία)? 2) αγωνίζομαι (επιμολυσμένα με αρνητικό έλεγχο siRNA)? και 3) νοκ ντάουν hENT1. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη (Affymetrix, Santa Clara, CA) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια κατέστησαν διαπερατά με 2% Triton Χ-100 (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ) για 10 λεπτά. Μετά από αποκλεισμό με 2% αλβουμίνη βόειου ορού (Calbiochem) για 1 ώρα, τα κύτταρα επωάστηκαν όλη τη νύκτα με αντι-βινκουλίνης αντίσωμα (1:200, Abcam, Cambridge, ΜΑ), αντι-Ε-καδερίνης (1:200), αντι- Ν-cadhrein (1:100), αντι-cytoketarin 18 (1:200), ή αντι-Lamin A /C (1:200) στους 4 ° C με ήπια ανακίνηση. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS για 10 λεπτά και επωάστηκαν με Alexa 488 ή 594-συζευγμένα δευτερογενή αντισώματα για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Μετά την πλύση με PBS, για χρώση F-ακτίνης, τα κύτταρα επωάστηκαν με Alexa Fluor 488 Φαλλοϊδίνη (1:250, Invitrogen, Grand Island, ΝΥ) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Στη συνέχεια, οι πυρήνες χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας Hoechst 33342 (Molecular Probes, Life Technologies, Grand Island, ΝΥ) για 10 λεπτά. Τα κύτταρα παρακολουθούνται από συνεστιακό μικροσκόπιο σάρωσης με λέιζερ (CLSM, Όλυμπος FluoView FV1000).

μετρήσεις AFM

Κινητά ακαμψία μετρήθηκε με την τεχνική δύναμη καμπύλη σε Bioscope (Bruker Corporation, Billerica, ΜΑ). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν επί 6 cm τρυβλίου καλλιέργειας κυττάρων και όλες οι μετρήσεις έγιναν σε μέσο καλλιέργειας στους 37 ° C. Η AFM ήταν εξοπλισμένο με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο φωτός (Olympus IX81) έτσι ώστε τα κύτταρα παρακολουθούνται συνεχώς. Για να ελαχιστοποιηθεί η βλάβη των κυττάρων, μικροσωματιδίων οξειδίου του πυριτίου (διάμετρος: 5 μm) τροποποιημένο πυρίτιο νιτρίδιο πρόβολοι (Novascan Technologies, Inc., Ames, ΙΑ) με κατά προσέγγιση άνοιξη σταθερές τιμές του ~0.06 N /m χρησιμοποιήθηκαν σε όλες τις πειραματισμούς AFM. Η ακριβής ελατήριο σταθερή τιμή μετρήθηκε με τη μέθοδο θερμικής ρύθμισης. Ανιχνευτές τοποθετήθηκαν σε proximities πυρήνες των κυττάρων κάτω από οπτικό έλεγχο, και οι καμπύλες δύναμης αποκτήθηκαν με ρυθμό δειγματοληψίας του 1 Hz. μέτρο ελαστικότητας του Young, Ε, υπολογίστηκε από ελήφθησαν καμπύλες δύναμης με βάση το μοντέλο Hertz (Εξ. 1) χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα ανάλυσης Νθηοδοορθ από Bruker εταιρία. (1) όπου F = δύναμη, το μέτρο Ε = του Young, ν = λόγος του Poisson (ν = 0,5, σε αυτή τη μελέτη), R = ακτίνα του συμπιεστή (R = 2.500 nm, σε αυτή τη μελέτη), και δ = βάθος οδόντωση.

Για να ληφθεί μέτρο Young, δύο ανεξάρτητα πειράματα και δύναμη καμπύλες από τουλάχιστον 50 κύτταρα συλλέχθηκαν σε κάθε πείραμα.

σχεδιασμό MS-chip και κατασκευή

το πυρίτιο γκοφρέτες (4 ίντσες) από την Corning Inc. SU-8 2015 φωτοευαίσθητου υλικού, και SU-8 developer από MICROCHEM Corp. και πολυδιμεθυλοσιλοξάνιο (PDMS RTV615) από Momentive Performance Materials Inc. χρησιμοποιήθηκαν. Το μοτίβο μικροτσίπ σχεδιάστηκε με το λογισμικό AutoCAD (Autodesk Inc.) και στη συνέχεια να εκτυπωθεί ως 10 μm μάσκες ψήφισμα χρώμιο Φωτογραφία Science Inc. Το μοτίβο φωτο-μάσκα για πρώτη φορά μεταφράζεται σε μια μικροδομή σε ένα 4-σε wafer πυριτίου χρησιμοποιώντας SU-8 του 2015 photoresist, το οποίο είναι ένα καλούπι για χύτευση υλικών PDMS. Εν συντομία, το καλούπι παρασκευάστηκε με επικάλυψη με περιδίνηση SU-8 2015 φωτοανθεκτικού επάνω σε ένα πλακίδιο πυριτίου και εγκάρσια σύνδεση με UV για 180 δευτερόλεπτα. Στη συνέχεια, το σχεδιασμένο πρότυπο αναπτύχθηκε χρησιμοποιώντας SU-8 προγραμματιστή (Microchem Corp.) και καθαρίζονται με ισοπροπυλική αλκοόλη και αέριο άζωτο. Οι οπές για τις εισόδους και εξόδους τρυπήθηκαν χρησιμοποιώντας βελόνες. Το στρώμα PDMS καθαρίστηκε με έκπλυση με ισοπροπυλική αλκοόλη και απιονισμένο νερό, και στέγνωσε με αέριο άζωτο. Μετά τη θεραπεία με πλάσμα οξυγόνου, το στρώμα PDMS συνδέθηκε αμέσως σε ένα γυάλινο πλακίδιο 75 χ 50-mm. Τέλος, το ενωμένο συσκευή ψήθηκε για 2 ώρες στους 80 ° C.

On-chip διαχωρισμού κυττάρων

Τα κανάλια στο MS-chip και σωλήνα Tygon συνδέεται με την είσοδο τσιπ υγράνθηκαν με PBS και στη συνέχεια διατηρείται με 0.5% BSA σε PBS για 1 ώρα. BSA μπλοκ η επιφάνεια και περαιτέρω αποτρέπει μη ειδική προσκόλληση των κυττάρων σε PDMS. Μεμβράνες ελέγχου και hENT1 knockdown κύτταρα χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας Alexa Fluor 594 ή 488 συζευγμένο με συγκολλητίνη φύτρου σιταριού (Invitrogen, Grand Island, ΝΥ), αντίστοιχα. Το μείγμα κυττάρων σε ίσες ποσότητες σε μια τελική πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /ml παρασκευάσθηκε. Αιωρούμενα κύτταρα στη συνέχεια εφαρμόζεται στο MS-τσιπ μέσω ενός σωλήνα Tygon. Κατά τη διάρκεια του πειράματος, συμπιεσμένο αέριο άζωτο εφαρμόσθηκε στο κυτταρικό εναιώρημα σε μια πίεση περίπου 10 psi (69 χ 10

3 Pa). Ένα τυπικό διαχωρισμό διήρκεσε -15 λεπτά και μέσος ρυθμός ροής ελέγχεται σε 1-2 ml /h. Κύτταρα που εφαρμόζεται στο MS-chip απεικονίστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού (IX81, Όλυμπος). Αριθμός των κυττάρων που διατηρούνται επί του τσιπ μετά τον διαχωρισμό μετρήθηκε με εικόνας J.

In vitro

μηδέν

δοκιμασία

Ο προσδιορισμός μηδέν διεξήχθη είτε φυσικά κύτταρα (ελέγχου) ή επιμολυσμένου κύτταρα (αγωνίζομαι και siRNA εναντίον hENT1) για να μελετηθεί η επίδραση της hENT1 νοκ ντάουν για τη μετανάστευση των κυττάρων. Capan-1 ή Panc 03,27 κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκα 24 φρεατίων. Όταν τα κύτταρα είναι περίπου 50-60% συρρέοντα, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ περιέχουν siRNA κατά hENT1 ή αρνητική siRNA σε συγκέντρωση 50 ηΜ σε Ορίί-ΜΕΜ. Μετά από 6 ώρες την επιμόλυνση, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και επωάστηκαν για 2 ημέρες. Μια γρατσουνιά της κυτταρικής μονοστιβάδας δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας ένα άκρο σωληνίσκου. Στη συνέχεια, οι πλάκες πλένονται και είχε αντικατασταθεί με το επιθυμητό μέσο. Το time-lapse μικροσκόπιο (EVOs FL αυτόματο σύστημα απεικόνισης, Life Technologies) με θάλαμο (95% αέρα και 5% CO

2) και τον έλεγχο της θερμοκρασίας (37 ° C) χρησιμοποιήθηκε για την απόκτηση των εικόνων από τον ίδιο τομέα αυτόματα για 18 ώρες. Οι εικόνες που αποκτήθηκαν αναλύθηκαν ποσοτικά με τη χρήση εικόνας J.

Στατιστική ανάλυση

Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος ± τυπική απόκλιση. Η στατιστική σημαντικότητα προσδιορίστηκε από αμφίδρομη ανάλυση ANOVA χρησιμοποιώντας GraphPad Prism 5.0. AP αξία & lt?. 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Για να διερευνηθεί η συσχέτιση μεταξύ του επιπέδου έκφρασης hENT1 και κυτταρική μηχανική, δύο τύποι καρκίνου του παγκρέατος κυτταρικές σειρές, Capan-1 και Panc 03,27 με σχετικά υψηλότερη έκφραση hENT1 (Σχήμα S1 στο αρχείο S1), επιλέχθηκαν. Με siRNA επιμόλυνση, hENT1 μειωτικά κύτταρα καθοριστεί (Σχήμα 2). Στη συνέχεια μετράται αλλαγές στην κυτταρική μηχανική με δύο διαφορετικές μεθόδους, AFM και μικροροής διαχωρισμού. μέτρα AFM ελαστικές ιδιότητες των ζωντανών κυττάρων μέσα από μια άμεση μηχανική αλληλεπίδραση μεταξύ ενός καθετήρα και της κυτταρικής επιφάνειας. Κυττάρων ακαμψία επηρεάζει την έκταση της εκτροπής προβόλου κατά την αλληλεπίδραση με την επιφάνεια των προσκολλημένων κυττάρων [19]. Ένα ζωντανό κύτταρο οδόντωση επάγει παραμόρφωση του κυττάρου διαμερίσματα που περιλαμβάνουν μεμβράνη, cytoskeletons, πυρήνας, και διάφορα οργανίδια. Έτσι, οι ελαστικές ιδιότητες των κυττάρων προκύπτουν από τις συγκεντρωτικές επιπτώσεις της παραμόρφωσης πολυάριθμα κυτταρικά συστατικά. Χρησιμοποιήσαμε ένα μικροσωματιδίων πυριτίου (διάμετρος: 5 μm) τροποποιημένο προβόλου (σχήμα S2 σε S1 File) για τη μείωση της βλάβης της μεμβράνης των κυττάρων κατά τη διάρκεια της επαφής και να παραποιήσει το σύνολο δεδομένων με διαφορετικό τρόπο από ό, τι μια αιχμηρή άκρη. Για τη βελτιστοποίηση δύναμη εσοχή, έχουμε δύναμη εφαρμοζόμενη μέχρι 10 nN όπως φαίνεται στο σχήμα S2 σε S1 αρχείου. μέτρο Μια σταθερή του Young Panc 03,27 κυττάρων που λαμβάνονται στο πλαίσιο των δυνάμεων εσοχή έως 200 PN, υποδεικνύοντας τη μέτρηση της κυτταρικής ακαμψία χρησιμοποιώντας AFM είναι έγκυρη μόνο σε μικρές παραμορφώσεις των ζωντανών κυττάρων. Και οι δύο κυτταρικές σειρές έδειξε μια παρόμοια τάση κάτω από την ίδια δύναμη εσοχή, δηλαδή 100 Pn. Τα κύτταρα ελέγχου και κύτταρα επιμολυσμένα με αρνητική siRNA ήταν σημαντικά πιο δύσκαμπτο από hENT1 knockdown κυττάρων (Σχήμα 2 και Σχήμα S3 σε S1 File). Η μέση κυτταρική ακαμψία των δύο κυττάρων ελέγχου είναι 2,95 ± 1,55 kPa (Capan-1) και 1,91 ± 0,78 kPa (Panc 03,27)? ωστόσο, ότι από hENT1 νοκ ντάουν κύτταρα παρουσίασαν σημαντικά μειωμένη συντελεστές του Young με τιμές 1,50 ± 0,63 kPa (Capan-1) και 0,59 ± 0,22 kPa (Panc 03,27).

(Α) κηλίδες Western hENT1 (55 kDa ) και GAPDH (37 kDa) σε Capan-1 (αριστερά) και Panc 03,27 κύτταρα (δεξιά) χωρίς επεξεργασία (Ctrl) ή μετά την αγωγή του αρνητικού siRNA (SCRL) ή hENT1 siRNA (hENT1 ↓), (Β) ιστογράμματα Bar δείχνουν του Young μέτρο ελέγχου, αρνητικές siRNA επιμολυσμένα, και hENT1 knockdown κυττάρων. (N.s: στατιστικά μη σημαντική)

Η

Από AFM περιορίζεται στην τοπική μέτρηση της κυτταρικής μηχανικής, αξιολογήσαμε επίσης την κυτταρική παραμόρφωσης χρησιμοποιώντας τη μέθοδο μικρορευστονικής διαχωρισμού [20] για να επιβεβαιωθούν τα ευρήματα AFM.. Ένα μηχανικό τσιπ διαχωρισμού (MS-chip, Σχήμα 3Α) σχεδιάστηκε με τεχνητή microbarriers σε συνδυασμό με υδροδυναμική δύναμη για το διαχωρισμό που παραμορφώνεται από άκαμπτο κύτταρα [21]. Για να αποδειχθεί η ικανότητα του MS-τσιπ για να διαχωρίσει κύτταρα με βάση την ικανότητα παραμόρφωσης, ελέγξαμε τον διαχωρισμό ενός μίγματος που περιέχει δύο διαφορετικά κύτταρα: έλεγχος και hENT1 knockdown. Μεμβράνη ελέγχου και hENT1 knockdown κυττάρων χρωματίστηκε χρησιμοποιώντας Alexa Fluor 594 και 488 συζευγμένο συγκολλητίνη φύτρου σιταριού (WGA), αντίστοιχα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S4 στο S1 αρχείου, η επίδραση του WGA σε κυτταρικές ακαμψία είναι αμελητέα. Η αναλογία των δύο κυτταρικών σειρών κυμαίνονταν κατά μήκος του τσιπ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D και 3G, διάμετροι των δύο κυττάρων, τον έλεγχο και hENT1 knockdown, ήταν παρόμοια. Το μείγμα κυττάρων σε ίσες ποσότητες σε πυκνότητα 1 × 10

5 κύτταρα /mL εγχύθηκε σε MS-chip και έρεε για 15 λεπτά. Το χάσμα μεταξύ των θέσεων σειρά σε αυτό το σχεδιασμένο εύρος MS-τσιπ από 22 μm έως 2 μm. Τα κανάλια αποφυγή απόφραξης που εμφανίζεται σε επαναλαμβανόμενες συστοιχίες των θέσεων που ρυθμίζουν και να εξισώσει υδροδυναμική πίεση σε όλο το τσιπ. Υποτίθεται ότι δεν υπάρχει φυσική επαφή μεταξύ των πυλώνων PDMS και τα κύτταρα, επειδή η PDMS είναι επικαλυμμένη με BSA. Η διατμητική τάση είναι ένας κύριος παράγοντας για να αλληλεπιδρούν με τα κύτταρα. Όταν το μέγεθος χάσμα των υστέρων συστοιχίες είναι μεγαλύτερη από τη διάμετρο των κυττάρων, δύναμη πίεσης (F

ρ, 10 psi σε αυτή τη μελέτη) είναι η μόνη δύναμη που ενεργεί επί των κυττάρων. Αν διάμετρος των κυττάρων είναι η ίδια ή μεγαλύτερη από το μέγεθος κενό, δύναμη τριβής (F

στ) αντιτίθεται δύναμη πίεσης (Σχήμα 3Β). Αν τα κύτταρα είναι πιο σκληρή, ωθούν πιο δύσκολο για τις μετα συστοιχίες, και στη συνέχεια, F

f είναι σημαντικά αυξημένη. Εικόνα 3C δείχνει Panc 03,27 κύτταρα παγιδευμένοι σε MS-chip απεικονίστηκαν με μικροσκοπία φθορισμού? κόκκινου φθορισμού δείχνει κύτταρα ελέγχου και πράσινο φθορισμό δείχνει κύτταρα hENT1 νοκ ντάουν. Στην είσοδο, ίσος αριθμός ερυθρών ελέγχου Panc 03,27 (ή Capan-1) κύτταρα και πράσινο hENT1 knockdown Panc 03,27 (ή Capan-1) παρατηρήθηκαν κύτταρα (Σχήμα 3C και 3Ε-I). Στην περιοχή αυτή, κανάλια ήταν πολύ ευρύτερη ότι η διάμετρος των κυττάρων, με αποτέλεσμα καμία σημαντική διαχωρισμό των ευέλικτων και δύσκαμπτο κύτταρα. Λόγω της μικρότερης διαμέτρου των κυττάρων Capan-1 (μέση διάμετρος: 15 μm), ο διαχωρισμός επιτεύχθηκε με 8 μm μέγεθος διακένου των υστέρων συστοιχιών. Αλλά, στην περίπτωση των Panc 03,27 κυττάρων (μέση διάμετρος: 19 μm), η μείζων διαχωρισμός λαμβάνει χώρα σε 12 μm. Σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, τα κύτταρα στην ομάδα ελέγχου είχαν παγιδευτεί με συνέπεια ενώ hENT1 knockdown κυττάρων που διήλθε μέσω των κενών πιο συχνά. Αυτά τα πειράματα αποδεικνύουν την συνολική αποδοτικότητα του διαχωρισμού των δύο διαφορετικών φαινοτύπων με παρόμοια διάμετρο στην MS-chip. Έτσι, καταλήγουμε στο συμπέρασμα και τα δύο κύτταρα ελέγχου είναι σχετικά πιο σκληρή από ό, τι hENT1 νοκ ντάουν κύτταρα, και τα αποτελέσματα αυτά είναι σε συμφωνία με τα ευρήματα AFM.

(Α) φωτογραφία (αριστερά) της μικοτσίπ διαχωρισμού (MS-chip) ορατό με κόκκινο βαφή στο εσωτερικό και ένας εκπρόσωπος ηλεκτρονικής σάρωσης μικροσκοπική (δεξιά) εικόνα της θέσης array (διάμετρος του πυλώνα: 35 μm, ύψος πυλώνα: 30 μm). (Β) Φωτεινό πεδίο εικόνας και το σύστημα των κυττάρων που ρέει στο MS-chip, όταν η διάμετρος των κυττάρων είναι μικρότερη από το μέγεθος του κενού πυλώνα (κόκκινο βέλος δείχνει κύτταρα). Υποτίθεται εδώ ότι η τριβή οφείλεται μόνο στην διατμητική τάση (F

p: δύναμη πίεσης κατά την εφαρμοζόμενη πίεση (10 psi σε αυτή τη μελέτη), F

f: δύναμη τριβής). (Γ) Η εικόνα φθορισμού ενός από τα κανάλια μεταξύ των οκτώ παραστάσεις διατηρούνται Panc 03,27 κύτταρα στο MS-chip μετά τον διαχωρισμό των Panc 03,27-ctrl (ερυθρός φθορισμός) και Panc 03,27-hENT1 νοκ ντάουν (πράσινο φθορισμό). Εκπρόσωπος μεγαλύτερη μεγέθυνση συνεστιακή μικροσκοπική εικόνες του τσιπ MS (μέγεθος κενό από 12 μm έως 6 μm) δείχνουν την αποτελεσματικότητα του διαχωρισμού μέσα από τα κενά. κατανομή μεγέθους των κυττάρων (D: Capan-1, G: Panc 03,27 κύτταρα). Η στατιστική ανάλυση των κυττάρων (Ε: Capan-1, Η: Panc 03,27) και η αναλογία κλάσματος των κυττάρων (F: Capan-1, Ι: Panc 03,27) που διατηρούνται επί του chip. Οι τιμές αντιπροσωπεύουν μέση τιμή ± τυπική απόκλιση.

Η

Για να καταλάβουμε πώς hENT1 επιρροές κυττάρων μηχανικούς, φυσιολογικές αλλαγές στα κύτταρα μετά hENT1 νοκ ντάουν μελετήθηκαν με συνεστιακό μικροσκόπιο. Παρατηρήσαμε ότι οι κυτταρικές μορφολογικές αλλαγές που σχετίζονται με hENT1 νοκ ντάουν. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, τα κύτταρα έγιναν ορατά χρησιμοποιώντας συνεστιακό λέιζερ μικροσκόπιο σάρωσης και το κύτταρο στρογγυλότητα αναλύθηκε ποσοτικά με υπολογισμό μορφή (FF). Η FF λαμβάνεται με την εξίσωση, 4π (περιοχή) /(περιμετρικά)

2, η οποία δίνει την τιμή 1 για μια τέλεια κυκλική περίμετρο και decreasingly μικρότερες θετικές τιμές για λιγότερο κυκλική περίμετρο [22]. Capan-1 και Panc 03,27 κύτταρα είναι επιθηλιακά τύπου και είναι στενά συνδεδεμένα μεταξύ τους μέσω συμπλοκών ενδοκυτταρικής προσκόλλησης. Έχουν squarish σχήματα με τιμές FF 0,74 ± 0,08 και 0,77 ± 0,06, αντίστοιχα (Σχήμα 4Β). Σε αντίθεση, και οι δύο κυττάρων μετά hENT1 knockdown έγινε επίμηκες με πολύ χαμηλότερες FF με τιμές 0,44 ± 0,14 και 0,52 ± 0,16, αντίστοιχα

(Α) Αντιπροσωπευτικά μικρογραφήματα ομοεστιακή παγκρεατικών κυττάρων (πάνω πίνακας:. Capan-1, κάτω πίνακα: Panc 03,27) δείχνει F-ακτίνης διανομής, (Β) μορφή παράγοντας (f = 4πa /p

2? α: περιοχή? p: περίμετρο) αναλύθηκαν με Image J κύτταρα (Capan-1, ctrl: n = 37, SCRL: n = 59, hENT1 ↓: n = 29? Panc 03,27, ctrl: n = 36, SCRL: n = 28, hENT1 ↓: n = 28, NS: στατιστικά μη σημαντική)

Η.

Επιπλέον, η επίδραση της hENT1 νοκ ντάουν οργάνωσης cytoskeletons αξιολογήθηκε. Εμείς χρωματίστηκαν για βινκουλίνης, η οποία ελέγχει το σχηματισμό εστιακών συμφύσεων (FAS) με απ ‘ευθείας αλληλεπίδραση με την ακτίνη και άλλες πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε σχηματισμό FA [23]. ΕΧΟ, θέσεις των συμφύσεων μεταξύ των ινών στρες των κυττάρων και της εξωκυττάριας μήτρας (ECM), και στο περιθώριο έχουν σαφείς ρόλους στη μετακίνηση του κυττάρου προς τα εμπρός [23], [24]. Μελέτες έχουν αναφέρει ότι το μέγεθος FA συσχετίζεται με την ταχύτητα των κυττάρων? μεγαλύτερο ΕΧΟ βρίσκονται στο πιο επιμήκεις και πιο γρήγορα κινούμενα κύτταρα [25], [26]. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε ανακατανομή του F-ακτίνης και οι αλλαγές στη εστιακό χώρο προσκόλληση του hENT1 knockdown κυττάρων (Σχήμα 5). ίνες ακτίνης και στις δύο ομάδες ελέγχου συγκεντρώνεται κυρίως γύρω από την περιφέρεια του κυττάρου, και παρατηρήθηκαν μικρές, εν τη γενέσει ΕΧΟ. Αλλά, μετά από hENT1 knockdown, υπήρξε αύξηση στον αριθμό των ινών στρες καθώς και μετρήσιμη εστιακές περιοχές προσκόλλησης. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν αυξημένη κυτταρική κινητικότητα σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές.

Ομοεστιακή μικρογραφήματα (z-στοίβες των βασικών αεροπλάνο, 0-1,5 μm) που δείχνει βινκουλίνης (κόκκινο) και F-ακτίνης (πράσινο) στο (Α) Capan- 1 και (Β) Panc 03,27 κύτταρα. Περιοχή της εστιακής προσκόλλησης (pixel

2) αναλύεται με εικόνα J.

Η

Επιπλέον, προκειμένου να κατανοήσει τις συνέπειές της hENT1 νοκ ντάουν στην κυτταρική κινητικότητα, εξετάσαμε την επίδραση της προς τα κάτω ρύθμιση των hENT1 για κυτταρική μετανάστευση. Μια γρατσουνιά πληγή εισήχθη σε συρρέουσες κυτταρική μονοστιβάδα, και στη συνέχεια παρατηρήθηκε η σφράγιση πληγή για 18 ώρες (Εικόνα 6). Η περιοχή του κλεισίματος του τραύματος υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας Image J και η ταχύτητα μετανάστευσης (περιοχή κλεισίματος τραύματος (μm

2) /ώρα) υπολογίστηκε όπως φαίνεται στο Σχήμα 6. Η πληγή σφράγιση περιοχή και μετανάστευση ταχύτητα και των δύο κυττάρων ελέγχου και τα κύτταρα επιμολυσμένα με αγωνίζομαι siRNA είναι παρόμοια. Αλλά hENT1 κατέστειλε Capan-1 ή Panc 03,27 κύτταρα μεταναστεύουν 1,8 (1,7) ή 1,5 (1,5) φορές σε γρηγορότερα από τον έλεγχο (επιμολυσμένα αγωνίζομαι siRNA) κύτταρα, αντίστοιχα. Έτσι, επιβεβαιώνουν ότι μειορρύθμιση του hENT1 επάγει σχηματισμό μεγαλύτερων εστιακών συμφύσεων και προάγει την κυτταρική μετανάστευση γρηγορότερα. Με βάση την κυτταρική μορφολογικές αλλαγές και την αυξημένη κινητικότητα κυττάρου, είναι πιθανό ότι και οι δύο των κυττάρων υφίστανται φαινοτυπικές αλλαγές, η οποία συνδέεται με τους ελεύθερους προσκόλληση μεταξύ κυττάρων και cytoarchitectural αναδιάταξη. Κατά την EMT, η αναδιοργάνωση των cytoskeletons μαζί με την αύξηση της FA δυναμική είναι ζωτικής σημασίας για τα κύτταρα να εγκαταλείψει το επιθήλιο και να αρχίσει μεταναστεύουν μέσω της ECM [22], [27], [28]. Για παράδειγμα, μια πρόσφατη μελέτη έδειξε αυξημένη μετανάστευση των κυττάρων μετά ΕΜΤ SKOV-3 το οποίο ο αυξητικός παράγοντας μεταμόρφωσης β (ΤΟΡ-β), που δημιουργούνται μεγαλύτερες μηχανικές δυνάμεις FA από εκείνη των κυττάρων προ-ΕΜΤ [16]. ΤΟΡ-β αναφέρεται ως EMT επαγωγέα σε διάφορες επιθηλιακές κυτταρικές σειρές συμπεριλαμβανομένης της νεφρικής εγγύς σωληνοειδή και κυψελιδικά επιθηλιακά κύτταρα [16], [29], [30]. Αυξημένη αλληλεπίδραση του κυτταροσκελετού της ακτίνης και ενδοκυτταρικά μόρια με ΕΧΟ ξεκίνησε από την ένωση της ιντεγκρίνης α5β1 και ινονεκτίνης αυξημένη κυτταρική κινητικότητα [16].

Οι γρατσουνιές εισήχθησαν σε μονοστιβάδα (Α) Capan-1 και (Δ) Panc 03,27 κύτταρα. Ελήφθησαν φωτογραφίες επαγωγή αμέσως μετά τυλίγεται επί 18 ώρες. Η πληγή σφράγιση περιοχές του (Β) Capan-1 και 03,27 κύτταρα (Ε) Panc υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας Image J και συγκρίθηκαν με τον έλεγχο, σκαρφάλωμα siRNA επιμολυσμένα, και hENT1 knockdown κυττάρων. ταχύτητα μετανάστευσης του (C) Capan-1 και 03,27 κύτταρα (F) Panc υπολογίστηκε.

Η

Για να επιβεβαιώσετε αυτές τις φυσιολογικές μεταβολές που προκαλούνται από hENT1 νοκ ντάουν σχετίζονται με EMT, αναλύσαμε τις αλλαγές στην EMT δείκτη πρωτεΐνες, όπως Ε-καδερίνης και Ν-cadherin, μετά hENT1 knockdown. E-cadherin είναι ένα από τα μόρια προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου. Που διατηρεί επαφές κυττάρου-κυττάρου και των επιθηλιακών αρχιτεκτονική. Εναλλαγή της έκφρασης του καντερίνες από Ε-καδερίνης σε Ν-cadherin, η οποία εκφράζεται κυρίως σε μεσεγχυματικά κύτταρα, εμφανίζεται κατά τη διάρκεια EMT. Αυτό εναλλαγή οδηγεί σε μια δραστική αλλαγή στη συγκολλητικές ιδιότητες των κυττάρων, καθώς χάνει συγγένεια του για τα επιθηλιακά τους γείτονες και τα κέρδη συγγένεια για μεσεγχυματικά κύτταρα, τα οποία είναι nonpolarized, η έλλειψη διακυτταρικές συνδέσεις, και έχουν μια μοναδική ατρακτοειδόμορφα σχήμα [27], [ ,,,0],31], [32]. Μετά hENT1 καθοδική ρύθμιση, και οι δύο κυτταρικές σειρές παρουσίασαν χαμηλή έκφραση Ε-καδερίνης και υψηλή έκφραση του Ν-καδερίνης, τα οποία είναι ένα σημαντικό χαρακτηριστικό γνώρισμα της ΕΜΤ (Σχήμα 7). Η απώλεια της Ε-καδερίνης και κέρδος του Ν-καντερίνης αυξάνει κυτταρική κινητικότητα και μεταστατικό δυναμικό. Αρκετές μελέτες έχουν δείξει ότι η μειωμένη κυτταρική ακαμψία συσχετίζεται άμεσα με την αυξημένη μεταστατικό δυναμικό χρησιμοποιώντας διάφορες in vitro βιο-μηχανικές μεθόδους ανάλυσης [11], [17], [33]. Μείωση στην κυτταρική ακαμψία διαμορφώνει ότι τα κύτταρα που υφίστανται ΕΜΤ αφού hENT1 knockdown όπως αποδεικνύεται στο Σχήμα 2. Ωστόσο, υπάρχουν αμελητέα διαφορά στα επίπεδα έκφρασης των ενδιάμεσων νηματίων, κυτοκερατίνη 18, και την πυρηνική κυτταροσκελετού, λαμίνη A /C και στις δύο κυτταρικές σειρές (Σχήμα S5 σε File S1).

κηλίδες Western και σχετικά επίπεδα έκφρασης Ε-καδερίνης (110 kDa), Ν-cadherin (140 kDa) στο (Α) Capan-1 και (Γ) Panc 03,27 κύτταρα μετά την αγωγή με hENT1 siRNA. Στήλες στα ιστογράμματα είναι ο μέσος όρος δύο ανεξάρτητων πειραμάτων (αναλογία έντασης του GAPDH προς Ε-καδερίνης ή Ν-καντερίνη). Εκπρόσωπος ομοεστιακό εικόνες της E-cadherin (ερυθρός φθορισμός) και Ν-καδερίνη (πράσινος φθορισμός) εκφράσεις (Β) Capan-1 και (Δ) Panc 03,27 κύτταρα.

Η

Για να επιβεβαιώσετε παραπάνω αντιξοότητες μελέτες μας που υποδηλώνουν ότι EMT μπορεί να χαρακτηρίζεται από αλλαγές στην κυτταρική ακαμψία, αξιολογήσαμε φαινοτυπικές αλλαγές του παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα μετά από θεραπεία με ΤΟΡ-β. Το ΤΟΡ-β έχει αναφερθεί σε αρκετές μελέτες για την επαγωγή ΕΜΤ [15], [16], [30]. Επομένως, εξετάσαμε περαιτέρω αυτά τα αποτελέσματα σε άλλο πείραμα με τη χρήση ΕΜΤ-προκληθέντα καρκίνο παγκρεατικά κύτταρα. Panc 03,27 κύτταρα εκτέθηκαν σε ΤΟΡ-β για 2 ημέρες σε μια συγκέντρωση 10 ng /ml για την επαγωγή EMT, και στη συνέχεια μετράται κυτταρική ακαμψία. Ελαφρώς κατέστειλε E-cadherin και αυξημένα Ν-cadherin και εκφράσεις vimentin δείχνουν ότι η EMT επάγεται στο Panc 03,27 κύτταρα (Σχήμα S6a στο S1 αρχείου). Panc 03,27 κύτταρα κατεργασμένα με ΤΟΡ-β αποδείχθηκε από μειωμένη μέτρο του Young (1,42 ± 0,53 kPa) έναντι μη επεξεργασμένα κύτταρα (1,91 ± 0,78 kPa). Το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι οι κυτταρικές ακαμψία μειώνεται όταν τα κύτταρα που υφίστανται EMT. Πρόσφατα, υπάρχει μια έκθεση σχετικά με κυτταρικές αλλαγές ακαμψία σε ΕΜΤ-επαγόμενα κύτταρα Α549 με αγωγή ΤΟΡ-β [15]. Στη μελέτη τους, μέτρησαν τις τοπικές μηχανικές ιδιότητες των κυττάρων Α549 με ένα κοφτερό προβόλου DNP (ακτίνα 20 nm άκρο), η οποία έχει μια μικρότερη περιοχή επαφής σε σύγκριση με ένα μικροσωματίδιο-τροποποιημένο προβόλου. Ακόμα κι αν υπάρχει ζωτικής σημασίας στοιχεία για την αλλαγή του κυττάρου φαινοτυπική από επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά, δηλαδή, κυτταρικές αλλαγές στο σχήμα και την αύξηση ίνες στρες, εξακολουθούν να είναι συνεπείς με τη δουλειά μας.