Αφηρημένο

Εμείς αξιολογούνται εδώ τη δυνατότητα αντι-ορθοκολικό καρκίνο δραστηριότητα από erastin, ένας εξαρτώμενος από την τάση κανάλι ανιόντων ( VDAC) -σύνδεση ένωση. Μας

in vitro

μελέτες έδειξαν ότι erastin εξασκείται ισχυρή κυτταροτοξική δράση έναντι πολλών ανθρωπίνων ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, ενδεχομένως μέσω επαγωγής οξειδωτικό στρες και κασπάσης-9 εξαρτώμενη κυτταρική απόπτωση. Περαιτέρω, μιτοχονδριακό πόρων μετάβαση διαπερατότητας άνοιγμα (ΜΡΤΡ) παρατηρήθηκε σε erastin επεξεργασμένα καρκινικά κύτταρα, η οποία αποδεικνύεται από VDAC-1 και κυκλοφιλίνης-D (CYP-D) ένωση, μιτοχονδριακή αποπόλωση, και την απελευθέρωση κυτοχρώματος C. αναστολείς κασπάσης, ο σαρωτής ROS MnTBAP, και αποκλειστές ΜΡΤΡ (sanglifehrin Α, κυκλοσπορίνη Α και bongkrekic οξύ), καθώς και με τη μεσολάβηση shRNA knockdown του VDAC-1, όλα σημαντικά εξασθενημένο erastin επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και απόπτωση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Από την άλλη πλευρά, η υπερβολική έκφραση της VDAC-1 επαυξημένης erastin επαγόμενη παραγωγή ROS, το άνοιγμα ΜΡΤΡ, και του παχέος απόπτωση των καρκινικών κυττάρων.

In vivo

μελέτες έδειξαν ότι η ενδοπεριτοναϊκή ένεση erastin σε καλά ανεκτές δόσεις δραματικά ανέστειλε την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος ΗΤ-29 σε σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια ποντικούς (SCID). Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα καταδεικνύουν ότι erastin είναι κυτταροτοξικό και προ-αποπτωτικών να ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα. Erastin μπορεί να διερευνηθεί περαιτέρω ως νέο αντι-ορθοκολικού καρκίνου παράγοντα

Παράθεση:. Χούο Η, Zhou Z, Τσιν J, Liu W, Wang Β, Gu Υ (2016) Erastin Διαταράσσει μιτοχονδριακού διαπερατότητα μετάβασης Πόρων (ΜΡΤΡ ) και επάγει αποπτωτικό θάνατο τα κύτταρα του καρκίνου του παχέος εντέρου. PLoS ONE 11 (5): e0154605. doi: 10.1371 /journal.pone.0154605

Επιμέλεια: Cong Cao, Πανεπιστήμιο Suzhou, Κίνα

Ελήφθη: 23 Μαρτίου του 2016? Αποδεκτές: 16, Απρ 2016? Δημοσιεύθηκε: May 12, 2016

Copyright: © 2016 Χούο et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Όλη η δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε από το Ίδρυμα για την Επιστήμη του Νοσοκομείου η ένατη Λαϊκής συνδεδεμένες με Shanghai Jiao Tong-Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου (Νο 2015521, με YG). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η καρκίνο του παχέος εντέρου είναι ο κύριος συντελεστής της θνησιμότητας του καρκίνου που σχετίζονται τόσο στην Κίνα [1] και σε όλο τον κόσμο [2,3]. Εκτιμάται ότι πάνω από 100.000 νέες περιπτώσεις καρκίνου του παχέος διαγιγνώσκονται κάθε χρόνο, τα οποία προκαλούν πάνω από 50.000 θανάτους ετησίως [4]. Η χημειοθεραπεία έχει ευρέως χρησιμοποιηθείσες για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου, ωστόσο αντοχή φαρμάκου και /ή τοξικότητα off-στόχο να περιορίσει την αποτελεσματικότητα των τρεχουσών χημειο-φαρμάκων [5,6,7]. Έτσι, η ομάδα μας [8,9] και άλλοι [10,11] έχουν επίκεντρο την ανάπτυξη νέων και πιο αποτελεσματική αντι-παχέος παράγοντες καρκίνου.

Το μιτοχονδριακό πόρων μετάβαση διαπερατότητας (ΜΡΤΡ) είναι ένα πολυ- σύμπλεγμα κανάλι πρωτεΐνη που βρίσκεται στα μιτοχόνδρια, του οποίου η κύρια λειτουργία είναι να διατηρηθεί η ισορροπία της μιτοχονδριακής αναπνευστικής αλυσίδας [12]. ΜΡΤΡ είναι κατά κύριο λόγο αποτελείται από τρεις πρωτεΐνες: συμπεριλαμβανομένων τάση εξαρτώμενη ανιόν καναλιού (VDAC) στην έξω μιτοχονδριακή μεμβράνη (OMM), νουκλεοτιδίου αδενίνης 1 (ΑΝΤ-1) στην εσωτερική μιτοχονδριακή μεμβράνη (ΙΜΜ) και μήτρα εντοπισμό κυκλοφιλίνης-D ( Cyp-D) [12]. Έχει δειχθεί ότι οι πολλαπλές διεγέρσεις θα επάγει ΑΝΤ-1 και Cyp-D συνδέσμου και το άνοιγμα ΜΡΤΡ, οδηγώντας έτσι σε αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS) παραγωγή, εξάντληση του ΑΤΡ και προ-αποπτωτικό μόριο (

i

.

e

. κυτοχρώματος c) απελευθέρωση [12,13]. Στη συνέχεια, κασπάσες (κυρίως της κασπάσης-9) και την κυτταρική απόπτωση θα ενεργοποιηθεί [12,13].

Πρόσφατες μελέτες έχουν εντοπίσει το πρώτο στην κατηγορία VDAC δέσμευσης μικρό μόριο, δηλαδή erastin [14,15] . Έχει αποδειχθεί ότι erastin είναι επιλεκτικά κυτταροτοξική σε ορισμένες καρκινικές κυτταρικές σειρές [14,15,16,17]. Για παράδειγμα, Γιαγκόντα et al., Έδειξαν ότι erastin δεσμεύεται με VDAC, με αποτέλεσμα θανατηφόρο οξειδωτική βλάβη στα κύτταρα του καρκίνου [18]. Ο πιθανός ρόλος των erastin σε ορθοκολικού καρκίνου, κύτταρα και τους υποκείμενους μηχανισμούς σηματοδότησης δεν έχουν μελετηθεί. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι erastin ήταν κυτταροτοξική και προ-αποπτωτικών να ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα, πιθανόν μέσω διαταράσσοντας ΜΡΤΡ.

Υλικά και Μέθοδοι

2.1. Κυτταρική καλλιέργεια

Όπως περιγράφεται [8,9], ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές, συμπεριλαμβανομένων των ΗΤ-29, DLD-1 και Caco-2, αγοράστηκαν από το κύτταρο τράπεζα της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών (CAS) Σαγκάη Βιολογικά Ινστιτούτο (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε FBS που περιέχει μέσο RPMI /DMEM. Ανθρώπινων επιθηλιακών παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή NCM460 που παρέχονται από το κέντρο τηλέφωνα Fudan IBS (Σαγκάη, Κίνα). Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε F12 θρεπτικό μέσο του Ham (Gibco) [19].

2.2. Αντιδραστήρια και χημικά

Erastin αγοράστηκε από Σέλεκ (Σανγκάη, Κίνα). Οι αποκλειστές ΜΡΤΡ συμπεριλαμβανομένων sanglifehrin Α, κυκλοσπορίνη Α και bongkrekic οξύ αγοράστηκαν από τη Sigma (Shanghai, Κίνα). Το αντι-οξειδωτικό MnTBAP ήταν επίσης από τη Sigma. Η κασπάση-3 ειδικό αναστολέα Ζ-DEVD-fmk και το κασπάσης-9 ειδικός αναστολέας Ζ-LEHD-fmk αγοράσθηκαν από την Calbiochem (Darmstadt, Γερμανία). Όλα τα αντισώματα που εφαρμόζεται σε αυτή τη μελέτη ελήφθησαν από Santa Cruz Biotech (Σαγκάη, Κίνα).

2.3. ΜΤΤ βιωσιμότητα κυττάρου δοκιμασία

Η επιβίωση των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία 3- [4,5-dimethylthylthiazol-2-υλο] -2,5 βρωμιούχου διφαινυλοτετραζολίου (ΜΤΤ, Sigma) [9]. Διαφορετικές πυκνότητες σποράς βελτιστοποιήθηκαν κατά την έναρξη των πειραμάτων.

2.4. Trypan blue χρώση

δοκιμασία

Trypan blue δοκιμασία που περιγράφεται σε προηγούμενες μελέτες μας [9]. Εν συντομία, μετά εφαρμόστηκε θεραπεία erastin, ο αριθμός των νεκρών (trypan blue θετικό) κυττάρων μετρήθηκε. Η αναλογία θανάτου (%) υπολογίσθηκε από τον αριθμό των trypan blue χρωματισμένα κύτταρα διαιρείται με το συνολικό αριθμό των κυττάρων.

2.5. Colony δοκιμασία σχηματισμού

Μετά την θεραπεία erastin, κύτταρα (2 χ 10

3) αρχικά αιωρούνται σε μέσο καλλιέργειας με 0.25% άγαρ (Sigma). Το κυτταρικό εναιώρημα στη συνέχεια planked πάνω από ένα προ-στερεοποιηθεί 0,25% άγαρ σε ένα δίσκο καλλιέργειας 100 mm. Το μέσο αντικαταστάθηκε κάθε δύο ημέρες. Μετά από 10 ημέρες επώασης, οι αποικίες χρώθηκαν επιβίωση και με το χέρι μετρήθηκαν.

2.6. BrdU δοκιμασία ενσωμάτωσης

Τα κύτταρα (3 χ 10

3 ανά φρεάτιο) σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων, μετά εφαρμόστηκε θεραπεία, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αξιολογήθηκε μέσω της ενσωμάτωσης BrdU ELISA χρωματομετρική δοκιμασία (Roche, Indianapolis, IN ) με το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Η αξία ELISA OD της ομάδας θεραπείας κανονικοποιήθηκε με εκείνη της ομάδας ελέγχου άνευ αγωγής.

2.7. δοκιμασία απόπτωσης των κυττάρων μέσω χρώσης αννεξίνης V

Μετά τη θεραπεία, την κυτταρική απόπτωση ανιχνεύθηκε με την δοκιμασία αννεξίνης V FACS όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [9]. καταγράφηκε ο αριθμός των αννεξίνης V χρωματισμένα κύτταρα.

2.8. Η ποσοτικοποίηση της απόπτωσης με ανοσορροφητική δοκιμασία συνδεδεμένη με ένζυμο (ELISA)

Όπως περιγράφεται [8,9], η απόπτωση των κυττάρων ELISA κιτ Ανίχνευσης Plus (Roche, Palo Alto, CA) χρησιμοποιήθηκε για τον ποσοτικό προσδιορισμό κυτταρικής απόπτωσης σύμφωνα με την πρωτόκολλο του κατασκευαστή.

2.9. δράση της κασπάσης δοκιμασία

Μετά τη θεραπεία, κυτταροπλασματικών πρωτεϊνών εξήχθησαν στο ρυθμιστικό περιγράφεται [8,9]. Είκοσι μγρ εκχυλίσματα κυτταρολύματος ανά δείγμα προστέθηκαν σε ρυθμιστικό δοκιμασίας κασπάσης με υποστρώματα της κασπάσης-3 /-8 /-9 (Roche, Σαγκάη, Κίνα). Η απελευθέρωση της 7-αμιδο-4- (τριφθορομεθυλ) κουμαρίνης (AFC) ποσοτικοποιήθηκε μέσω ενός Fluoroskan σύστημα ρυθμιστεί σε μία τιμή διέγερσης 355 nm [8,9]. Τα αποτελέσματα εκφράστηκαν ως σχετικές μονάδες φθορισμού /μα πρωτεΐνης.

2,10. Western blotting

Εν συντομία, τα δείγματα 30 μg των λυμένων πρωτεϊνών εκάστου δείγματος διαχωρίστηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10% SDS και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνες PVDF (Millipore, Bedford, ΜΑ). Μετά τον αποκλεισμό, οι μεμβράνες επωάστηκαν με το πρωτογενές αντίσωμα επί μία νύκτα στους 4 ° C, που ακολουθείται από επώαση με δευτερογενές αντίσωμα για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Το μπουλόνι οπτικοποιήθηκε με ECL (ενισχυμένη χημειοφωταύγεια) της μηχανής. Κάθε μπάντα ποσοτικά μέσω του λογισμικού ImageJ, και η τιμή ομαλοποιήθηκε σε κάθε ζώνη ελέγχου φόρτωσης.

2.11. Αντιδραστικά είδη οξυγόνου (ROS)

ανίχνευσης

Η ενδοκυτταρική ROS μετρήθηκε με κυτταρομετρία ροής μέσω του προσδιορισμού οξείδωσης dichlorofluorescin (DCF). DCFH-DA εισέρχεται παθητικά εντός των κυττάρων και διασπάται από μη ειδική κυτταρική εστεράσες και οξειδώνεται με την παρουσία των ROS. Μετά την επεξεργασία, τα κύτταρα (3 χ 10

5 ανά δείγμα) επωάστηκαν με DCFH-DA (5 μΜ) για μία ώρα στους 37 ° C. Στη συνέχεια, τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και φυλάσσονται σε 1 mL PBS, ROS φθορισμός αναλύθηκε χρησιμοποιώντας το ανωτέρω σύστημα Fluoroskan.

2,12. Ανίχνευση του μιτοχονδριακού δυναμικού μείωσης (ΔΨ

m)

Όπως περιγράφεται [20], η ΔΨ

m μετρήθηκε μέσω χρωστική φθορισμού JC-10. Όταν το μιτοχονδριακό δυναμικό μειώνεται, μονομερής JC-10 θα σχηματισθεί στην κυτοσόλη, το οποίο παρουσιάζει πράσινο φθορισμό [20]. Εν συντομία, μετά εφαρμόστηκε θεραπεία erastin, τα κύτταρα χρωματίστηκαν με 5 μg /mL του JC-10 (Invitrogen) επί 10 λεπτά, και ανιχνεύεται αμέσως σε ένα Fluoroskan σύστημα ρυθμιστεί σε μία τιμή διέγερσης 485 nm [20].

2.13. Μιτοχονδριακή ανοσοκαταβύθιση (ΜΙΤΟ-ΙΡ)

Τα κύτταρα θρυψινοποιήθηκαν, και της μιτοχονδριακής κλάσματα παρασκευάζονται μέσω μιας Μιτοχόνδρια /κυτοσόλιο Κλασμάτωση Kit (BioVision, Σαγκάη, Κίνα) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Διακόσια μα κυτταρολύματα από μιτοχονδριακή κλάσματα προ-καθαριστεί με 20 μL πρωτεΐνης Α /G PLUS-αγαρόζης (Santa Cruz) για 1 ώρα. Το υπερκείμενο στη συνέχεια περιστράφηκε όλη τη νύκτα με 0,25 μg αντι-ΑΝΤ-1 (Santa Cruz Biotech). Στη συνέχεια, τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν για 5 λεπτά στους 4 ° C σε ένα μικρο-φυγόκεντρο προς απομάκρυνση μη ειδικά συσσωματώματα. Η πρωτεΐνη Α /G PLUS-αγαρόζης (35 μΙ) στη συνέχεια προστέθηκε στα υπερκείμενα για 4 ώρες στους 4 ° C. Τα σφαιρίδια πλύθηκαν έξι φορές με PBS, επαναιωρήθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης, και στη συνέχεια αναλύθηκαν με κηλίδωση Western [20].

2,14. Σταθερό νοκ ντάουν της VDAC-1 από λεντοϊού shRNA

Οι δύο ομάδες VDAC-1 μικρό RNAs φουρκέτα φακοϊό-συσκευασμένο (shRNA-1 και shRNA-2, μη-επικαλυπτόμενες ακολουθίες) σχεδιάστηκαν, συντέθηκαν και επαληθεύεται από Genechem (Σαγκάη, Κίνα). Δέκα μL /mL λεντοικής σωματίδια προστέθηκαν σε κύτταρα ΗΤ-29 για 12 ώρες. Στη συνέχεια, φακοϊού που περιέχουν μέσο αντικαταστάθηκε με πλήρες μέσο, ​​και τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν για άλλες 24 ώρες. Στη συνέχεια, πουρομυκίνη (5.0 μg /mL, Sigma) προστέθηκε για την επιλογή ανθεκτικών σταθερώς αποικιών για 2-3 εβδομάδες. Έκφραση VDAC-1 ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. Κύτταρα ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σκαρφάλωμα μη-νόημα shRNA βραδέος ιού σωματιδίων (Santa Cruz Biotech).

2,15 Η υπερέκφραση του VDAC-1 και σταθερώς κύτταρα επιλογή

Το πλήρους μήκους ανθρώπινο VDAC-1 cDNA, που αγοράζονται από Genechem (Σανγκάη, Κίνα), ήταν υπο-κλωνοποιήθηκε σε pSuper-puro-σημαία (δώρο από Lab Δρ Bi του) [21]. Το κενό φορέα (pSuper-puro-σημαία) ή VDAC-1 που εκφράζουν το κατασκεύασμα διαμολύνθηκε σε κύτταρα ΗΤ-29 μέσω πρωτοκόλλου Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Τα σταθερά κλώνοι επιλέχθηκαν μέσω πουρομυκίνης (5 μg /mL). Μετά από 12-14 ημέρες επιλογής, σταθερώς τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε κηλίδωση Western δοκιμασία VDAC-1 έκφρασης.

2,16.

In vivo

αντικαρκινική αποτελεσματικότητα

αξιολόγηση

μελέτες ανάπτυξης των όγκων έγιναν σε σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (SCID) μοντέλο ποντικών ξενομοσχεύματος. Όλα τα ποντίκια είχαν αγοραστεί από την διευκόλυνση των ζώων της Σαγκάης Jiao Tong-Ιατρική Σχολή του Πανεπιστημίου (Σαγκάη, Κίνα). Εν συντομία, 2 χ 10

6 βιώσιμα κύτταρα ΗΤ-29 σε 100 μι μέσου ανάπτυξης (ανά ποντικό) υποδορίως εμβολιάσθηκαν, και ποντίκια που φέρουν ~ 100 mm

3 όγκους χωρίστηκαν τυχαία σε τρεις ομάδες με 10 ποντικούς ανά ομάδα . Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή καθημερινά με 10 ή 30 mg /kg σωματικού βάρους του erastin (ενδοπεριτοναϊκή ένεση, για 4 εβδομάδες) ή έκδοχο (αλατόνερο). Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν με την τροποποιημένη ελλειψοειδές τύπο: (π /6) χ AB

2, όπου το Α είναι η μεγαλύτερη και το Β είναι η συντομότερη κάθετος άξονας μιας μάζας όγκου [22,23]. σωματικά βάρη ποντικοί επίσης καταγράφηκαν κάθε εβδομάδα. Humane τελικά σημεία ήταν πάντα χρησιμοποιηθεί για να ελαχιστοποιήσει τα ποντίκια ταλαιπωρία. Τα ζώα παρατηρήθηκαν σε καθημερινή βάση. Σημεία όπως σημαντική μειωμένης κίνησης, σοβαρή διάρροια, σοβαρή ανόρθωση τριχών ή μια ξαφνική απώλεια βάρους (& gt? 20%) καταγράφηκαν. Εάν τα ζώα έφθασαν αυτές τελικά σημεία που υποβλήθηκαν σε ευθανασία με αφαίμαξη κάτω από 2,2,2-τριβρωμοαιθανόλη αναισθησία (4 mg /10 g σωματικού βάρους, Sigma). Όλες οι ενέσεις έγιναν υπό αναισθησία με τη μέθοδο 2,2,2-τριβρωμοαιθανόλη. Οι μελέτες σε ζώα έχουν εγκριθεί από το Shanghai Jiao Tong-Σχολή του Πανεπιστημίου της επιτροπής Θεσμικό Animal Care και της Επιτροπής Χρήση (IACUC) και Δεοντολογίας Ιατρικής (Υπεύθυνος Επικοινωνίας: Δρ Ιούνιος Wang, 2014126).

2.17. Στατιστική ανάλυση

Όλα τα δεδομένα κανονικοποιήθηκαν για τον έλεγχο των τιμών κάθε δοκιμασία και παρουσιάστηκαν ως μέση τιμή ± τυπική απόκλιση (SD). Τα δεδομένα αναλύθηκαν με μονόδρομη ANOVA που ακολουθείται από f-δοκιμασία κατά Scheffe, χρησιμοποιώντας SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Σημασία επιλέχθηκε ως p & lt? 0.05.

Αποτελέσματα

3.1. Erastin ασκεί κυτταροτοξική, αλλά όχι κυτταροστατική δράση σε καλλιεργημένα κύτταρα ορθοκολικού καρκίνου

Για να δοκιμαστεί δραστηριότητα erastin επί ορθοκολικού επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με αυξανόμενες συγκεντρώσεις erastin (0,1-30 μΜ). δοκιμασία ΜΤΤ διεξήχθη. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, erastin ανέστειλε ισχυρά ΗΤ-29 κυτταρικής επιβίωσης, το οποίο αποδεικνύεται από την μείωση ΜΤΤ OD. Erastin έδειξε μια εξαρτώμενη από τη δόση επίδραση (Σχήμα 1Α), και 30 μΜ erastin εμφανίζεται την πιο δραματική επίδραση (Σχήμα 1Α). Erastin πήρε τουλάχιστον 48 ώρες για να ασκήσει σημαντική κυτταροτοξική δράση σε κύτταρα ΗΤ-29 (Σχήμα 1Α). Η κυτταροτοξική δράση με erastin καταδείχθηκε επίσης από την trypan blue δοκιμασία χρώσης (Σχήμα 1Β) και δοκιμασία σχηματισμού αποικιών (Σχ 1C). Erastin θεραπεία (1-30 μΜ) αύξησε σημαντικά τον αριθμό των θετικών trypan blue ( «νεκρό») ΗΤ-29 κύτταρα (Σχήμα 1Β), whiling μειώνοντας επιβίωση ΗΤ-29 αποικίες (Σχήμα 1 C).

καρκίνος του παχέος κύτταρα (ΗΤ-29, DLD-1 και Caco-2 γραμμές) επιθηλιακών κυττάρων παχέως εντέρου ή NCM460 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με έκδοχο ελέγχου (0,1% DMSO, «Ctrl») ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του erastin για την εφαρμοσμένη φορά, η επιβίωση των κυττάρων ελέγχθηκε με δοκιμασία ΜΤΤ (Α και Ε) και δοκιμασία σχηματισμού αποικίας (C)? Το ποσοστό των θετικών trypan blue ( «νεκρό» κύτταρα) καταγράφηκε (Β)? Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων ελέγχθηκε με δοκιμασία ενσωμάτωσης BrdU (D και F). Για κάθε δοκιμασία, η = 5. Τα δεδομένα που παρουσιάστηκαν ήταν μέση τιμή ± SD. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα που ελήφθησαν. * P & lt? 0,05 vs. ομάδα «Ctrl».

Η

Είναι ενδιαφέρον, erastin (1-30 μΜ) εμφανίστηκε αναποτελεσματική στην αναστολή του πολλαπλασιασμού των ΗΤ-29 κυττάρων, και η ενσωμάτωση BrdU δεν άλλαξε σε ΗΤ-29 κυττάρων μετά από κυτταροτοξικά erastin (1-30 μΜ) αγωγή (Σχήμα 1 D). Ως εκ τούτου, η κυτταροτοξική δράση από erastin είναι απίθανο οφείλεται στην αναστολή του πολλαπλασιασμού. ΜΤΤ αποτελέσματα στο Σχ 1E έδειξε ότι erastin (1-30 μΜ) επίσης κυτταροτοξική σε δύο άλλες κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου: DLD-1 και CaCo2. Ωστόσο, ίδια μεταχείριση erastin ήταν γενικά ασφαλής στα μη καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου επιθηλιακών NCM460 (Σχήμα 1 Ε). Για άλλη μια φορά, BrdU ενσωμάτωση, ο δείκτης του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, δεν επηρεάστηκε από erastin (10 μΜ) στα κύτταρα DLD-1 και CaCo2, ούτε σε NCM460 επιθηλιακά κύτταρα (Σχήμα 1 F). Με βάση τα αποτελέσματα αυτά, δείχνουμε ότι erastin ασκεί κυτταροτοξική, αλλά όχι κυτταροστατική, δραστηριότητα σε καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου.

3.2. Erastin επάγει την παραγωγή ROS και κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση σε καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου

Στη συνέχεια, θα αξιολογηθεί το δυναμικό δραστηριότητα erastin στην κυτταρική απόπτωση. Όπως περιγράφεται σε προηγούμενες μελέτες μας [8,9], διεξήχθησαν διάφορες δοκιμασίες απόπτωσης. Τα αποτελέσματα του προσδιορισμού της κασπάσης έδειξαν ότι η δραστηριότητα της κασπάσης-3 και caspae-9 αυξήθηκε σημαντικά σε κύτταρα ΗΤ-29 μετά από κυτταροτοξική erastin (1-30 μΜ) αγωγή (Σχήμα 2Α), υποδεικνύοντας μιτοχονδριακή ενεργοποίηση απόπτωσης μονοπάτι [24]. Από την άλλη πλευρά, η δραστικότητα της κασπάσης-8, ένας δείκτης της εξωγενούς ενεργοποίηση αποπτωτικής παθολογικής οδού [25,26], ήταν αμετάβλητη σε erastin επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ-29 (Σχήμα 2Α). ενεργοποίηση των κυττάρων απόπτωσης με erastin επιβεβαιώθηκε επίσης από την δοκιμασία αννεξίνης V FACS (Σχήμα 2Β) και ιστόνης DNA απόπτωση ELISA δοκιμασία (Σχήμα 2C). δοσοεξαρτώμενο Erastin αυξημένο ποσοστό αννεξίνης V και ιστόνης DNA OD ELISA σε κύτταρα ΗΤ-29 (Σχήμα 2Β και 2C).

Ο ορθοκολικός καρκίνος κύτταρα (ΗΤ-29, DLD-1 και Caco-2 γραμμές) ή NCM460 κόλον επιθηλιακά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με έκδοχο ελέγχου (0,1% DMSO, «Ctrl») ή ενδεικνυόμενες συγκεντρώσεις του erastin για την εφαρμοσμένη φορά, η κυτταρική απόπτωση εξετάστηκε με δοκιμασίες που απαριθμούνται (AC, G και H)? παραγωγή ROS Εξετάστηκε επίσης (Δ και Ι). ΗΤ-29 κύτταρα προεπεξεργασμένα με Ζ-DEVD-fmk ( «zDEVD», 50 μΜ), ζ-LEHD-fmk ( «zLEHD», 50 μΜ) ή MnTBAP (10 μΜ) για 1 ώρα πριν από την εφαρμογή erastin διέγερση , η επιβίωση των κυττάρων και θάνατο των κυττάρων ελέγχθηκαν με ΜΤΤ δοκιμασία (Ε) και κυανούν τρυπανίου δοκιμασίας (F), αντίστοιχα. Για κάθε δοκιμασία, η = 5. Τα δεδομένα που παρουσιάστηκαν ήταν μέση τιμή ± SD. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα που ελήφθησαν. * P & lt? 0,05 vs. ομάδα «Ctrl».

# p & lt? 0,05 vs. ομάδα erastin μόνο (Ε και F).

Η

Από erastin είναι ένα VDAC δεσμευτική ένωση, η οποία μπορεί να διαταράξει μιτοχονδριακή αναπνευστική αλυσίδα και να προκαλέσει την παραγωγή ROS [18]. Στη συνέχεια εξετάσαμε την οξειδωτική επίπεδο στρες σε erastin επεξεργασμένα κύτταρα ΗΤ-29. Τα αποτελέσματα στο Σχήμα 2D κατέδειξε σαφώς ότι erastin αύξησε το επίπεδο του ROS στα ΗΤ-29 κύτταρα. Για τη μελέτη του ρόλου της απόπτωσης και της παραγωγής ROS σε erastin επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, εφαρμόστηκαν διάφορες φαρμακολογικές αναστολείς. Όπως φαίνεται στο Σχ 2Ε και 2F, κασπάσης-3 ειδικό αναστολέα Ζ-DEVD-fmk, κασπάσης-9 ειδικός αναστολέας Ζ-LEHD-fmk, ή υπεροξειδίου καθαριστή MnTBAP [27] όλες ανακουφίζεται erastin επαγόμενη κυτταροτοξικότητα σε ΗΤ-29 κύτταρα (Σχ 2Ε και 2F). Σε δύο άλλες ορθοκολικού καρκίνου κυτταρικές γραμμές, erastin (10 μΜ) προκάλεσε επίσης κασπάσης-9 (Σχ 2G) και την απόπτωση (Σχήμα 2Η) ενεργοποίηση καθώς και την παραγωγή ROS (Εικ 2I). Τέτοιες επιδράσεις από erastin πάλι δεν παρατηρήθηκε σε επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου NCM460 (Σχήμα 2G-2Θ). Ως εκ τούτου, erastin επάγει παραγωγή ROS και κασπάσης-εξαρτώμενη απόπτωση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

3.3. Erastin επάγει άνοιγμα ΜΡΤΡ σε καλλιεργημένα κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου

Δεδομένου ότι erastin είναι μία ένωση VDAC δέσμευσης [18], η κατάσταση της ΜΡΤΡ σε ορθοκολικό καρκίνο κύτταρα erastin επεξεργασμένα στη συνέχεια αξιολογήθηκαν. Πρώτον, μιτοχονδριακή ανοσοκαταβύθιση (Mito-ΙΡ) δοκιμασία [28,29] κατέδειξε ότι ο ΑΝΤ-1 και Cyp-D σχηματίζεται ένα σύμπλοκο σε κύτταρα ΗΤ-29 erastin φάρμακο (Σχήμα 3Α), η οποία είναι γνωστή ως το αρχικό στάδιο του ανοίγματος ΜΡΤΡ [12,13]. Δεύτερον, το επίπεδο του κυτταροδιαλύματος κυτοχρώματος C ήταν επίσης αυξημένη σε κύτταρα ΗΤ-29 μετά από θεραπεία erastin (Σχήμα 3Β), η οποία είναι ένα γνωστό γεγονός εξής ΜΡΤΡ άνοιγμα [12,13]. Περαιτέρω, η αύξηση του JC-10 πράσινος ένταση φθορισμού έδειξε απώλεια του μιτοχονδριακού δυναμικού (ΔΨ) (Εικ 3C). Όλα αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν σαφώς ότι η ΜΡΤΡ άνοιγμα μετά erastin θεραπεία σε κύτταρα ΗΤ-29. Σημειώστε ότι παρόμοια αποτελέσματα με erastin ελήφθησαν επίσης σε δύο άλλους ορθοκολικό καρκίνο κυτταρικές γραμμές (δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

ΗΤ-29 κύτταρα κατεργάστηκαν με εφαρμοσμένη erastin για προκαθορισμένο χρόνο, το άνοιγμα ΜΡΤΡ αποδεικνύεται από μιτοχονδριακό VDAC-1 -ANT-1 ένωση (Α), κυτόχρωμα C ( «Cyto-C») θέση (Β) και JC-10 αύξηση έντασης (C). ΗΤ-29 κύτταρα προεπεξεργασμένα με sanglifehrin Α (SFA, 2,5 μΜ), κυκλοσπορίνη Α (CsA, 0,5 μΜ) ή bongkrekic οξύ (ΒΑ, 5 μΜ) πριν την erastin (10 μΜ) αγωγή, την επιβίωση των κυττάρων (D) και απόπτωση (Ε) αναλύθηκαν μετά. Σταθερά ΗΤ-29 κύτταρα που εκφράζουν VDAC-1 shRNA-1 /-2 ή ελέγχου σκαρφάλωμα shRNA ( «SCR shRNA») υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με erastin (10 μΜ), VDAC-1 έκφραση (F), την επιβίωση των κυττάρων (G) και την απόπτωση ( Η) δοκιμάστηκαν. ΑΝΤ-1-assocaited Cyp-D (Α), κυτοσόλιο έκφραση κυτοχρώματος C (Β) και VDAC-1 έκφραση (F) προσδιορίστηκαν ποσοτικά. Για κάθε δοκιμασία, η = 4. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται ήταν μέση τιμή ± SD. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα που ελήφθησαν. * P & lt? 0,05 vs. ομάδα «Ctrl».

# p & lt? 0,05 vs. ομάδα erastin μόνο (Δ και Ε) ή την ομάδα «SCR shRNA» (G και H). «Trans» σημαίνει για τον έλεγχο της επιμόλυνσης (FH).

Η

Για να μελετήσει το ρόλο της ΜΡΤΡ σε erastin-προκάλεσε κυτταροτοξικότητα, εφαρμόσαμε αρκετές γνωστές φαρμακολογικές αναστολείς ΜΡΤΡ, συμπεριλαμβανομένων sanglifehrin A (SFA) [30], κυκλοσπορίνη Α (CsA) [31] και bongkrekic οξύ (BA) [28,32]. Όπως αποδεικνύεται, προ-θεραπεία με αυτούς τους αναστολείς ΜΡΤΡ εξασθενημένος σημαντικά erastin επαγόμενη ΗΤ-29 κυτταρικό θάνατο (Σχ 3D) και την απόπτωση (Σχήμα 3Ε). Για να υποστηρίξει περαιτέρω την υπόθεσή μας, η στρατηγική shRNA εφαρμόστηκε επιλεκτικά και σταθερά νοκ ντάουν VDAC-1, το βασικό συστατικό του ΜΡΤΡ και σύνδεση με τις πρωτεΐνες του erastin [12]. Δύο σταθερά ΗΤ-29 γραμμές που εκφράζουν διακριτά VDAC-1 Τα siRNAs (-1 /-2) έχουν καθοριστεί (Σχήμα 3F). Σημαντικά, erastin επαγόμενη κυτταροτοξικότητα (Εικόνα 3G) και την απόπτωση (Σχήμα 3Η) ήταν σημαντικά ανέστειλε σε VDAC-1-σιγήσει ΗΤ-29 κύτταρα. Αυτές οι φαρμακολογικές και γενετικές ενδείξεις δείχνουν ότι erastin επαγόμενη κυτταροτοξικότητα έναντι ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων απαιτεί VDAC-1 δεσμευτική και επακόλουθο άνοιγμα ΜΡΤΡ.

3.4. VDAC-1 υπερέκφραση ενισχύει erastin του κυτταροτοξικότητα

Για να υποστηρίξει περαιτέρω το βασικό ρόλο της VDAC-1 σε erastin επαγόμενη κυτταροτοξικότητα, εμείς εξωγενώς εξέφρασε VDAC-1 σε ΗΤ-29 κύτταρα. Western blotting αποτελέσματα στο Σχ 4Α επιβεβαιώθηκε VDAC-1 υπερ-έκφραση σε σταθερώς ΗΤ-29 κυττάρων με VDAC-1 κατασκεύασμα. Ως αποτέλεσμα, erastin προκαλούμενη μείωση της βιωσιμότητας (Εικόνα 4Β) και την απόπτωση (Σχήμα 4C) έχουν αυξηθεί. Περαιτέρω μελέτες έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του VDAC-1 διευκολύνεται erastin επαγόμενη παραγωγή ROS (Σχ 4D) και JC-10 αύξηση OD (του δείκτη του ανοίγματος ΜΡΤΡ, Σχήμα 4Ε). Είναι ενδιαφέρον, δείξαμε ότι NCM460 επιθηλιακών κυττάρων παχέως εντέρου εξέφρασαν χαμηλά επίπεδα VDAC-1 (Σχ 4F). Ωστόσο, όταν έχουμε υπερεκφράζεται VDAC-1 σε κύτταρα NCM460 (Σχήμα 4F), αυτά τα κύτταρα έγιναν ευάλωτα σε erastin (Σχήμα 4G). Ως εκ τούτου, τα αποτελέσματα αυτά επιβεβαιώνουν επίσης ότι VDAC-1 αποτελεί καθοριστικό παράγοντα της δραστηριότητας erastin του.

Σταθερά ΗΤ-29 κύτταρα ή NCM460 επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου εκφράζουν κενό φορέα (pSuper-puro, «Vec») ή VDAC-1 cDNA ( «VDAC-1») υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με σχεδιαστεί erastin για την εφαρμοσμένη φορά, VDAC-1 έκφραση, κυτταρική επιβίωση και απόπτωση ελέγχθηκαν με κηλίδωση Western δοκιμασίας (Α και F), ΜΤΤ δοκιμασία (Β και G) και ιστόνης DNA δοκιμασία ELISA (C), αντίστοιχα? παραγωγή ROS (D) και JC-10 ένταση (Ε) αναλύθηκαν επίσης. Για κάθε δοκιμασία, η = 4. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται ήταν μέση τιμή ± SD. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα που ελήφθησαν. VDAC-1 έκφραση ποσοτικοποιήθηκε (F) * ρ & lt.? 0,05 vs. ομάδα Ctrl κυττάρων «Vec» (Β-Ε).

# p & lt? 0,05 έναντι erastin ομάδα κυττάρων «Vec» (Β-Ε). «Trans» σημαίνει έλεγχος επιμόλυνσης (D και Ε).

Η

3.5. διοίκηση Erastin καταστέλλει ΗΤ-29 της ανάπτυξης ξενομοσχευμάτων σε SCID ποντίκια

Το

in vivo

δραστηριότητα erastin δοκιμάστηκε επίσης. Εφαρμόστηκε ποντίκια SCID ΗΤ-29 μοντέλο ξενομοσχεύματος. Οι εβδομαδιαίες ανάπτυξη του όγκου καμπύλη αποτελέσματα στο Σχ 5Α κατέδειξαν ότι erastin ενδοπεριτοναϊκή ένεση δραματικά ανέστειλε την ανάπτυξη ξενομοσχεύματος ΗΤ-29 σε ποντίκια SCID. Erastin του

in vivo

δραστηριότητα ήταν και πάλι εξαρτάται από τη συγκέντρωση. Erastin στα 30 mg /kg ήταν σαφώς πιο ισχυρή από 10 mg /kg στην καταστολή ΗΤ-29 ξενομοσχεύματα (Σχήμα 5Α). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι το σώμα ποντίκια βάρους δεν ήταν σημαντική διαφορετική μεταξύ κάθε ομάδων (Σχήμα 5Β). Ούτε κάναμε παρατηρήσετε οποιαδήποτε σημάδια εμφανή τοξικότητα σε αυτά τα ποντίκια. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα ζώα αυτά ήταν καλά ανεκτές στα σχήματα erastin εδώ. Περαιτέρω, όγκου καθημερινά ανάπτυξης, υπολογίζεται ως mm

3 /ημέρα, μειώθηκε με τη χορήγηση erastin (Σχήμα 5C). Στο τέλος των πειραμάτων, τα βάρη του erastin-διαχειριζόμενη ξενομοσχεύματα ήταν επίσης πολύ χαμηλότερη από εκείνη των ποντικών ελέγχου του οχήματος (σχήμα 5D). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η χορήγηση erastin αναστέλλει την ανάπτυξη ΗΤ-29 όγκου

in vivo

.

ΗΤ-29 που φέρουν όγκο ποντικών SCID ενδοπεριτοναϊκώς χορηγείται με erastin (10/30 mg /kg σωματικού βάρους ή » BW «, καθημερινά, για 4 εβδομάδες) ή όχημα (φυσιολογικός ορός) ελέγχου, οι όγκοι του όγκου (Α) και βάρη ποντίκια σώματος (Β) καταγράφηκαν κάθε εβδομάδα για πέντε εβδομάδες? Ημερήσια ανάπτυξης όγκου υπολογίστηκε επίσης (C). Κατά τη λήξη των πειραμάτων, όλα τα ξενομοσχεύματα απομονώθηκαν και σταθμισμένη (D). Για κάθε δοκιμασία, η = 10. Τα δεδομένα που παρουσιάστηκαν ήταν μέση τιμή ± SD. Πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα που ελήφθησαν. * P & lt? 0,05 έναντι της ομάδας του «οχήματος».

# p & lt? 0,05 vs. ομάδα erastin στα 10 mg /kg σωματικού βάρους.

Η

Συζήτηση

Στην παρούσα μελέτη, αποδείξαμε ότι erastin ασκείται ισχυρή κυτταροτοξική δράση εναντίον πολλών ανθρώπινου ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα ενδεχομένως μέσω επαγωγής οξειδωτικό στρες και κασπάσης-9 εξαρτώμενη απόπτωση των κυττάρων. ΜΡΤΡ άνοιγμα παρατηρήθηκε σε erastin-θεραπεία καρκινικών κυττάρων, η οποία αποδεικνύεται από VDAC-1 και του συνεταιρίζεσθαι ΛΚ-D, μιτοχονδριακή αποπόλωση και κυτόχρωμα απελευθέρωση C. αναστολείς κασπάσης, ο σαρωτής ROS MnTBAP, και αποκλειστές ΜΡΤΡ (sanglifehrin Α, κυκλοσπορίνη Α και bongkrekic οξύ), καθώς και με τη μεσολάβηση shRNA knockdown του VDAC-1, όλα σημαντικά εξασθενημένο erastin επαγόμενη κυτταροτοξικότητα και απόπτωση σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα. Από την άλλη πλευρά, η υπερβολική έκφραση της VDAC1 ενισχύεται κυτταροτοξικότητας erastin του. Με βάση αυτά τα αποτελέσματα, προτείνουμε ότι erastin δεσμεύεται με VDAC1 να διαταράξει την κανονική μιτοχονδριακή λειτουργία, προκαλώντας ΜΡΤΡ άνοιγμα, και τελικά οδηγούν στην ενεργοποίηση της απόπτωσης κασπάση-9-εξαρτώμενος σε καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι erastin ήταν μη-κυτταροτοξικές σε επιθηλιακά κύτταρα παχέως εντέρου NCM460. Έχουμε, επίσης, απέτυχε να ανιχνεύσει οποιαδήποτε σημαντική κασπάσης-9 ενεργοποίηση ούτε ΜΡΤΡ δυσλειτουργίας σε erastin-επεξεργασμένα κύτταρα NCM460. Ένας πιθανός λόγος μπορεί να είναι ότι αυτά τα μη καρκινικά επιθηλιακά κύτταρα εκφράζουν ένα πολύ χαμηλό επίπεδο VDAC (-1), επομένως κύτταρα δεν στοχεύονται από erastin (βλέπε Σχήμα 4). Ως Μάλιστα, όταν εξωγενώς υπερεκφράζεται VDAC-1 σε κύτταρα NCM460, αυτά τα κύτταρα, όπως τα καρκινικά κύτταρα, έγινε ευάλωτα σε erastin (βλέπε Σχήμα 4). Μια άλλη πιθανότητα είναι ότι τα καρκινικά κύτταρα είναι όλοι ταχεία αναπτυσσόμενα κύτταρα, που πιθανώς να απαιτούν υψηλό επίπεδο μιτοχονδριακής αλυσίδας αναπνευστικού για την παραγωγή ΑΤΡ. Αυτά τα κύτταρα μπορεί να είναι πιο ευαίσθητα σε VDAC ή αναστάτωση ΜΡΤΡ. Το γεγονός ότι erastin στοχεύει μόνο τα καρκινικά κύτταρα δείχνει ότι θα μπορούσε να είναι ένας ιδανικός υποψήφιος για τη θεραπεία κατά του καρκίνου.

Αν και αρκετές μελέτες έχουν διερευνήσει τη δυνατότητα αντικαρκινική δράση από erastin

in vitro

[ ,,,0],14,16,33], η

in vivo

αποδεικτικά στοιχεία εξακολουθούν να λείπουν. Στην παρούσα μελέτη, δείξαμε ότι ενδοπεριτοναϊκή ένεση erastin σε καλά ανεκτές δόσεις (10 ή 30 mg /kg, ημερησίως) δραματικά ανέστειλε ΗΤ-29 ανάπτυξη ξενομοσχεύματος σε ποντίκια SCID. Είναι σημαντικό, η

in vivo

erastin σχήματα δεν επηρεάζει τα βάρη ποντίκια, ούτε να προκαλέσει οποιεσδήποτε σημαντικές τοξικότητα στα πειραματόζωα. Αυτά τα προκλινικά αποτελέσματα δείχνουν ότι erastin θα μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη αντι-ορθοκολικού καρκίνου παράγοντα.

Συμπεράσματα

Εν ολίγοις, erastin διαταράσσει ΜΡΤΡ και επάγει αποπτωτικό θάνατο του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Erastin μπορεί να διερευνηθεί περαιτέρω ως νέο αντι-ορθοκολικού καρκίνου παράγοντα.