Αφηρημένο

Meprin-α είναι μία μεταλλοπρωτεάση υπερεκφράζεται στα καρκινικά κύτταρα, οδηγώντας στη συσσώρευση αυτή πρωτεάσης σε ένα υποσύνολο των όγκων παχέος εντέρου. Η επίδραση των αυξημένων επιπέδων meprin-α επί της προόδου όγκου δεν είναι γνωστή. Ερευνήσαμε το αποτέλεσμα αυτής της πρωτεάσης για τη μετανάστευση των κυττάρων και την αγγειογένεση

in vitro

και μελέτησαν την έκφραση του meprin α-mRNA, πρωτεΐνες και πρωτεολυτική δραστικότητα σε πρωτογενείς όγκους σε προοδευτικά στάδια και σε ηπατικές μεταστάσεις των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, καθώς επίσης και ανασταλτική δραστηριότητα προς meprin-α σε ορούς ασθενή με καρκίνο, σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Βρήκαμε ότι ο αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF) – επαγόμενη μεταναστευτική απόκριση των επιθηλιακών κυττάρων meprin επιμολυσμένα ήταν αυξημένη σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου υπό την παρουσία πλασμινογόνου, και ότι η αγγειογενετική απόκριση σε όργανο-καλλιεργημένα αρουραίου αορτής μοσχεύματα ενισχύθηκε στο παρουσία εξωγενούς ανθρώπινης meprin-α. Σε ασθενείς, meprin-α mRNA εκφράστηκε σε κολονικό αδενώματα, πρωτογενείς όγκους UICC (Διεθνής Ένωση Cancer κατά) το στάδιο Ι, II, III και IV, καθώς επίσης και σε μεταστάσεις ήπατος. Αντίθετα, η αντίστοιχη πρωτεΐνη συσσωρευτεί μόνο σε πρωτογενείς όγκους και μεταστάσεις ήπατος, αλλά όχι στα αδενώματα. Ωστόσο, ηπατικές μεταστάσεις στερούνταν δραστικότητας meprin-α παρά την αυξημένη έκφραση της αντίστοιχης πρωτεΐνης, η οποία συσχετίζεται με την ενεργοποίηση ζυμογόνου αναποτελεσματική. Οροί από ασθενείς με καρκίνο παρουσίασαν μειωμένη meprin-α αναστολή σε σύγκριση με τους υγιείς μάρτυρες. Εν κατακλείδι, η δραστικότητα meprin-α ρυθμίζεται διαφορετικά σε πρωτογενείς όγκους και μεταστάσεις, οδηγώντας σε υψηλή πρωτεολυτική δραστικότητα σε πρωτογενείς όγκους και χαμηλή δραστηριότητα στις μεταστάσεις ήπατος. Δυνάμει του φιλο-μεταναστευτικών και προ-αγγειογενετική δραστηριότητα, meprin-α μπορεί να προωθήσει την εξέλιξη του όγκου σε καρκίνο του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Lottaz D, Maurer CA, Noël Α, Blacher S, M Huguenin, Nievergelt Α, et al. (2011) Ενισχυμένη δραστηριότητα των Meprin-α, μια Pro-μεταναστευτικών και Pro-αγγειογενετική πρωτεάσης, στον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 6 (11): e26450. doi: 10.1371 /journal.pone.0026450

Επιμέλεια: Hang Thi Πέμ Nguyen, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 6 Σεπτέμβρη 2010? Αποδεκτές: 27 Σεπτεμβρίου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 11 Νοεμβρίου 2011

Copyright: © 2011 Lottaz et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Swiss (www.snf.ch, να χορηγούν # 3100A0-100772 να ΕΣΑ), η Bernese Cancer League (www.bernischekrebsliga.ch, χορηγεί σε DL) και η Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de, DFG BE 4086 /1-1 στην ΚΤ). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Συντονισμένες εξωκυτταρικό πρωτεολυτικά γεγονότα μπορεί να προάγει την εξέλιξη του όγκου διαταράσσοντας φυσικά εμπόδια, όπως η βασική μεμβράνη και με την επεξεργασία εξωκυττάριας μήτρας, αυξητικούς παράγοντες και κυτοκίνες στο στρώμα του όγκου. Οι πρωτεάσες επηρεάζουν την κυτταρική προσκόλληση και ανάπτυξη των κυττάρων, καθώς και της ατομικής και συλλογικής μετανάστευση των κυττάρων [1], [2]. Τα έντονα αποτελέσματα των πρωτεασών που ελέγχεται από τη ρύθμιση της δραστικότητας πρωτεάσης σε πολλαπλά επίπεδα, συμπεριλαμβανομένων των επιπέδων έκφρασης, η ενεργοποίηση των ζυμογόνων μορφών, αναστολέα επίπεδα, και αδρανοποίηση.

προηγουμένως ταυτοποιηθεί meprin-α, μια metzincin πρωτεάσης της αστακίνης οικογένεια [3], ως ένα νέο συστατικό του δικτύου πρωτεάσης σε καρκίνο του παχέος εντέρου [4]. Υπάρχουν δύο ομόλογες ισομορφές meprin: meprin-α, που κωδικοποιείται από

MEP1A

στο χρωμόσωμα 6 και meprin-β, που κωδικοποιείται από

MEP1B

στο χρωμόσωμα 18 [5]. Meprin-α και meprin-β συν-εκφράζονται στο λεπτό έντερο, ενώ μόνο meprin-α εκφράζεται στο κόλον [6]. Meprin-β συσσωρεύεται στο κορυφαίο κυτταρική επιφάνεια επί εντεροκυττάρων στο λεπτό έντερο, ενώ meprin-α εκκρίνεται εκτός αν συγκρατείται στην κυτταρική επιφάνεια μέσω μη ομοιοπολικής σύνδεσης με meprin-β [6]. Οι μονές πολυπεπτιδικές αλυσίδες δεν είναι σταθερά, και οι δύο ισομορφές σχηματίζουν σύμπλοκα πρωτεΐνης του meprin-β διμερή, meprin-α και τετραμερή meprin-β, ή πολυμερή σύμπλοκα έως δέκα meprin-α υπομονάδες [7], [8]. Meprin-α εκφράζεται σε επιθηλιακά κύτταρα του βλεννογόνου του παχέος εντέρου υγιών, καθώς και σε καρκίνο του παχέος εντέρου [6]. Ωστόσο, σε αντίθεση με την κανονική εντερικά επιθηλιακά κύτταρα, τα οποία απελευθερώνουν την πρωτεάση στον αυλό του εντέρου, τα καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν το πρωτεάσης σε ένα μη-πολωμένο μόδα, οδηγώντας σε συσσώρευση και ενεργοποίηση του στο στρώμα του όγκου [4]. Meprin-α διασπά ένα φάσμα διαφορετικών υποστρωμάτων

in vitro

[9], συμπεριλαμβανομένων συστατικά της εξωκυττάριας ουσίας των βασικών μεμβρανών [9], [10] αλλά λίγοι υποστρώματα έχουν περιγραφεί

in vivo

[ ,,,0],11], [12], [13], [14], [15]. Τρεις ενδογενείς αναστολείς meprin περιγράφονται, λεκτίνη μαννάνη δέσμευσης (MBL) [16], fetuin-Α και κυστατίνη C [17].

Meprin-α εκκρίνεται από επιθηλιακά κύτταρα ως ζυμογόνο [18].

In vitro

, το προπεπτίδιο μπορεί να αφαιρεθεί χρησιμοποιώντας θρυψίνη, αποδίδοντας το ενεργό ένζυμο. έτσι θρυψίνη μπορεί να ενεργοποιήσει meprin-α στο έντερο αυλό

in vivo

. Ένα εναλλακτικό σύστημα ενεργοποίησης έχει ταυτοποιηθεί σε συν-καλλιέργειες της κυτταρικής σειράς καρκινώματος κόλου Caco-2 και εντερική ινοβλάστες. ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης ινοβλαστών προερχόμενο (υΡΑ) μετατρέπει πλασμινογόνο σε πλασμίνη, η οποία με τη σειρά της δημιουργεί δραστικές meprin-α [19]. Στο δέρμα η καλλικρεΐνης που σχετίζονται με πεπτιδάσης 5 θα μπορούσε να χαρακτηριστεί ως ένα promeprin-α του μετατρεπτικού ενζύμου της [20].

Εδώ έχουμε παράσχει αποδεικτικά στοιχεία για μια προ-αγγειογενετική και φιλο-μεταναστευτική δραστηριότητα των meprin-α και τη διερεύνηση της έκφρασης , η ενεργοποίηση και η αναστολή αυτής της πρωτεάσης σε πρωτογενείς όγκους, μεταστάσεις ήπατος και αίματος σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος. Τα ευρήματά μας δείχνουν ένα πολύπλοκο πρότυπο της ρύθμισης, η οποία είναι σύμφωνη με την πρωτεάση που εμπλέκεται στην εξάπλωση των καρκινικών κυττάρων από πρωτογενείς sites.

Αποτελέσματα

Meprin-α προάγει την κυτταρική μετανάστευση και την αγγειογένεση

in vitro

Η

Η επίδραση της meprin-α στην κυτταρική μετανάστευση διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας την καλά χαρακτηρισμένη απόκριση σκέδασης κυττάρων Madin-Darby νεφρού σκύλου (MDCK) σε απόκριση προς αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF ) [21]. Η απόκριση των κυττάρων meprin επιμολυσμένα και γονικά κύτταρα MDCK καταγράφηκε χρησιμοποιώντας time-lapse βιντεομικροσκοπία και ποσοτικοποιείται όπως περιγράφεται προηγουμένως (Εικ. 1Α) [22]. Συγκρίναμε μετανάστευση των γονικών MDCK κυττάρων με κύτταρα MDCK επιμολυσμένα με είτε meprin-α μόνο, meprin-β μόνη, ή συν-επιμολύνθηκαν με αμφότερα meprin-α και meprin-β. Τα ανεπεξέργαστα γονικής και meprin-επιμολυσμένα κύτταρα MDCK δεν μεταναστεύουν και να αναπτυχθεί ως σύμπλεγμα κυττάρων που σχηματίζουν τελικά μια κυτταρική μονοστοιβάδα. Μια προ-μεταναστευτική απόκριση προκλήθηκε με προσθήκη HGF. Meprin-επιμολυσμένα και MDCK έλεγχος κυττάρων που μετανάστευσαν παρομοίως με την παρουσία του HGF και μόνο. Μόνο μετά από την προσθήκη πλασμινογόνου ως πηγή για τη δημιουργία πλασμίνης, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί meprin-α [19], η ταχύτητα μετανάστευσης /β συν-επιμολυσμένα κύτταρα meprin-α αυξήθηκε κατά περίπου 50% σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου. Η διαφορά αυτή καταργήθηκε με την προσθήκη του ακτινονίνη αναστολέα meprin. Αξιοσημείωτα, η πρόσδεση του meprin-α στην κυτταρική επιφάνεια μέσω meprin-β είναι απαραίτητη για την ενίσχυση αυτής της προ-μεταναστευτική απόκριση στην παρουσία του HGF και του πλασμινογόνου, τα κύτταρα MDCK επιμολυσμένα με είτε meprin-α ή meprin-β μόνη μετανάστευσαν παρομοίως με τη γονική κυττάρων.

(Α) Η γονική MDCK κύτταρα άγριου τύπου (wt, ανοικτή στήλες) και τα κύτταρα MDCK συν-επιμολύνθηκαν με meprin-α και meprin-β (αβ, αριστερό πάνελ, συμπληρώθηκε μαύρες στήλες) ή επιμολυσμένα με είτε meprin-α (α) ή meprin-β (β) μόνο (δεξιά πάνελ, συμπληρώθηκε γκρι στήλες) καλλιεργήθηκαν επί λαμινίνη 1 επικαλυμμένα πιάτα και εκτέθηκαν σε HGF (20 ηΜ) για να προκληθεί μετανάστευση εν απουσία ή παρουσία του πλασμινογόνου όπως υποδεικνύεται. Επαγόμενο από HGF μετανάστευση παρακολουθούνται για 3-4 ώρες χρησιμοποιώντας βιντεομικροσκοπία. Ορατή είναι η μέση ταχύτητα μετανάστευσης (+/- SEM) των κυττάρων meprin επιμολυσμένα σε σχέση προς ταυτόσημα κύτταρα κατεργασμένα άγριου τύπου. Τα αποτελέσματα είναι ο μέσος όρος από τρεις σε τέσσερις ανεξάρτητα πειράματα για κάθε κατάσταση. Με την παρουσία του πλασμινογόνου (100 ηΜ), επαγόμενο από HGF μετανάστευση /β συν-επιμολυσμένα κύτταρα meprin-α ήταν σημαντικά αυξημένη. Αυτό το αποτέλεσμα επανήλθε με την παρουσία του αναστολέα ακτινονίνη meprin (100 ηΜ). Η μετανάστευση των κυττάρων που επιμολύνθηκαν μόνο με είτε meprin υπομονάδα δεν ήταν διαφορετικά από τα κύτταρα άγριου τύπου. (Β) Meprin-α προάγει την αγγειογένεση. Καθαρισμένη ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ενεργό meprin-α συμπληρώθηκε στο μέσο καλλιέργειας (0,7 μg /ml) στη δοκιμασία αορτικού δακτυλίου αρουραίου και απόφυση των σκαφών στην γέλη κολλαγόνου προσδιορίστηκε ποσοτικά χρησιμοποιώντας ανάλυση εικόνας (βλέπε υλικά και μέθοδοι). Ν

ν: τον αριθμό των σκαφών, Ν

b: ο αριθμός των διακλαδώσεων, L

max: μέγιστο μήκος των σκαφών. * P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον πολιτισμό χωρίς θεραπεία οργάνου. Τα αποτελέσματα είναι από τρία ανεξάρτητα πειράματα με εις τριπλούν για κάθε κατάσταση.

Η

Η καθαρισμένη ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ενεργό meprin-α προώθησε την αγγειογενετική απόκριση στην ανίχνευση αορτικού δακτυλίου αρουραίου [23] (Εικ. 1Β). Με τη βοήθεια υπολογιστή ανάλυση εικόνας του αρουραίου αορτικών μοσχευμάτων σε 3-διαστάσεων καλλιέργεια πηκτής κολλαγόνου έδειξε ότι meprin-α αύξησε την έκφυση των τριχοειδών σε σύγκριση με καλλιέργειες ελέγχου όσον αφορά τόσο το μήκος (αύξηση κατά 44%, ρ & lt? 0,05) και ο αριθμός των διακλαδώσεων (3-φορές αύξηση, ρ & lt? 0,05)

Meprin-α έκφρασης σε καρκίνο του παχέος εντέρου σε προοδευτικά στάδια του όγκου

Μεταβλητό επίπεδα ενός ενιαίου 3,5-kb mRNA meprin-α ανιχνεύθηκαν σε. δείγματα ασθενών σε όλα τα στάδια, συμπεριλαμβανομένων αδενώματα, που δεν συσχετίζονται σημαντικά με τα στάδια του όγκου (Σχ. 2Α, Β). Το εναλλακτικό μάτισμα του meprin-β στον καρκίνο έχει αναφερθεί προηγουμένως [24]. Δεν υπάρχουν ενδείξεις για μια εναλλακτικά ματισμένο mRNA ισομορφή του meprin-α βρέθηκε σε όγκους. Στις ανοσοστυπώματα meprin-α πρωτεΐνης ήταν μόνο ασθενώς ανιχνεύσιμη ή απούσα στα αδενώματα, ενώ ένα υποσύνολο δειγμάτων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένων των σταδίων πρωτογενούς όγκου Ι έως IV και ηπατικές μεταστάσεις, περιείχε υψηλές ποσότητες meprin-α πρωτεΐνης (Εικ. 2C). Καθαρισμένα σύνορα βούρτσα μεμβράνες από ανθρώπινο έντερο, τα οποία περιέχουν τόσο meprin-α και meprin-β, αναλύθηκαν ως θετικός έλεγχος. Όπως περιγράφηκε προηγουμένως [4], τα μοριακά είδη meprin-α σε όγκους ήταν 10 έως 25 kDa μικρότερο από το επικρατέστερο πρωτεΐνη 100 kDa από σύνορα βούρτσα μεμβράνες. Η ανοσοχρώση για meprin-α σε πρωτογενείς όγκους και μεταστάσεις ήπατος αποκάλυψε συστάδες των καρκινικών κυττάρων με ισχυρά σήματα που γειτνιάζουν με αρνητικά καρκινικά κύτταρα (Σχ. 3). Όλα τα αδενώματα, αλλά ένα γκολ την ελάχιστη τιμή 1 (Σχήμα 4Α.), Ενώ πρωτοπαθείς όγκους και μεταστάσεις στο ήπαρ σημείωσε υψηλότερη (p & lt? 0,025 για πρωτογενείς όγκους στάδια Ι έως IV σε σύγκριση με ηπατικές μεταστάσεις και αδενώματα).

(Α ) Εκπρόσωπος κηλίδα Northern για meprin-α σε ολικό RNA (12 μg) που εξάγεται από τα δείγματα όγκων των ασθενών με διάφορα στάδια όγκου (A αδένωμα, πρωτογενείς όγκους στάδια UICC μπορώ να UICC IV, Μ ηπατικές μεταστάσεις). Κανονική RNA ελέγχου από τον υγιή βλεννογόνο του παχέος εντέρου φαίνεται επίσης (λωρίδα C). ανιχνεύθηκαν ποικίλα επίπεδα ενός μοναδικού είδους mRNA 3,5 kb. Η ποσότητα του φορτωμένου RNA εκτιμήθηκε με της ανιχνεύσεως της κηλίδος για 7S RNA. (Β) Ποσοτικοποίηση των επιπέδων meprin-α mRNA σε σχέση με 7S RNA. Θηκόγραμμα εκπροσώπηση της πυκνομετρικές τιμές που λαμβάνονται από τη Βόρεια κηλίδες. Κουτί περιλαμβάνει χαμηλότερο τεταρτημόριο, διάμεσο και το ανώτερο τεταρτημόριο, μουστάκια δείχνουν 5-95 φάσμα εκατοστημόριο (Ν = 12 σε κάθε ομάδα). Δεν υπάρχουν σημαντικές διαφορές μεταξύ των διαφόρων ομάδων. (C) Εκπρόσωπος κηλίδα Western για meprin-α σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα από δείγματα όγκου (40 μg). Ως έλεγχος, καθαρισμένες συνόρων βούρτσα μεμβράνες ανθρωπίνων από το λεπτό έντερο (20 μα) αναλύθηκαν επίσης (ΒΒΜ), όπου meprin-α σχετίζεται με διαμεμβρανικές meprin-β σε ετεροδιμερών συμπλοκών πρωτεΐνης. Meprin-α ανιχνεύθηκε σε ένα υποσύνολο των όγκων. Για να αποκαλυφθούν τα αδύναμα σήματα, η μεμβράνη υπερέκθεση σε σχέση με τα δείγματα όγκων που επέδειξαν ισχυρή έκφραση.

Η

Η ανοσοχρώση για meprin-α σε τομές ιστών από δείγματα ορθοκολικού ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και χρησιμοποιώντας ένα κουνέλι πολυκλωνικό πρωτογενές αντίσωμα μαζί με ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση και διαμινοβενζιδίνη ως χρωμογόνο υπόστρωμα. Μετρητής λεκέ: αιματοξυλίνη. Στόχος μεγέθυνση: 40 ×. Bar = 50 μm. (Α) Σε κανονική βλεννογόνο του παχέος εντέρου meprin-α είναι ελάχιστα ανιχνεύσιμη. Περιστασιακά, τα σήματα ανιχνεύθηκαν στη βάση των περιοχών κρύπτη στο κυτταρόπλασμα των κυττάρων με ακρορριζικά εντοπισμένη πυρήνες (αστερίσκοι). Η ειδικότητα αυτών των σημάτων και την ταυτότητα των κυττάρων δεν εξετάστηκε περαιτέρω. (Β) Αντιπροσωπευτικό δείγμα ενός meprin-α φάση θετικών πρωτοπαθούς όγκου III. Οι όγκοι εμφανίζουν ένα μωσαϊκό μοτίβο έκφρασης. Σε καρκινικό κύτταρο συστάδες, τα κύτταρα με ισχυρά σήματα για meprin-α (βέλη) αναμειγμένα με κύτταρα που παρουσιάζουν αδύναμο σήμα ή καθόλου σήμα. Τα κύτταρα στο στρώμα δεν εκφράζουν meprin-α (C) Αντιπροσωπευτικό δείγμα του meprin-α θετικό πρωτογενούς όγκου στάδιο IV δείχνει συστάδες meprin-α θετικά καρκινικά κύτταρα (βέλη). κύτταρα (D) Cancer εκφράζουν meprin-α (βέλη) σε μεταστάσεις ήπατος (Met). Η γύρω φυσιολογικό ιστό του ήπατος (ηπατίτιδα) είναι μόνο ασθενώς χρωματισμένο.

Η

(Α) Ημι-ποσοτική αξιολόγηση των meprin-α έκφραση σε ορθοκολικό καρκίνωμα χρησιμοποιώντας μια ανοσοϊστοχημική βαθμολογίας (ελάχιστη βαθμολογία 1, μέγιστη βαθμολογία 16) . + = Μέσες τιμές. (Β) Αυξημένη πρωτεολυτική δραστικότητα του meprin-α σε πρωτογενείς όγκους στάδια Ι έως IV, σε σύγκριση με αδενώματα και μεταστάσεις. Η πρωτεολυτική δραστικότητα της meprin-α μετρήθηκε χρησιμοποιώντας το τεχνητό υπόστρωμα Ν-βενζοϋλ-L-τυροσυλ-ρ-αμινο βενζοϊκό οξύ (ΡΑΒΑ-πεπτιδίου). Η τιμή κατωφλίου του /h /g πρωτεΐνης 2.5 μmol αντιστοιχεί σε δύο τυπικές αποκλίσεις πάνω από την μέση τιμή στην ομάδα αδενώματος. Μια αύξηση των πρωτεολυτικών δραστηριοτήτων ανωτέρω όριο βρέθηκε στο 36%, 40%, 44% και 33% των δειγμάτων πρωτογενούς όγκου στα στάδια UICC I, II, III και IV, αντίστοιχα, αλλά όχι σε ηπατικές μεταστάσεις. Η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε μεταξύ πρωτογενείς όγκους στάδια Ι έως IV UICC ως μία ομάδα και αδενώματα, ή μεταστάσεις (μονόπλευρη Wilcoxon δοκιμή κατάταξης άθροισμα των ανεξάρτητων δειγμάτων). + = Διάμεσες τιμές.

Η

δραστικότητα Meprin-α, ενεργοποίηση ζυμογόνου και αναστολή

Meprin-α δραστικότητα μετρήθηκε ειδικά σε εκχυλίσματα πρωτεΐνης από τα δείγματα ιστού με την παρουσία ενός ευρέως φάσματος αναστολέα πρωτεάσης που στοχεύουν όλες πρωτεάσης κλάσεις εκτός μεταλλοπρωτεάσες. Meprin-α δραστηριότητα ήταν χαμηλή στα αδενώματα, ενώ σημαντικά βελτιωμένη δραστικότητα μετρήθηκε σε μία υποομάδα (33 έως 44%) των πρωτογενών όγκων των φάσεων Ι έως IV (Σχήμα 4Β, ρ & lt?. 0.01 για τις φάσεις Ι έως IV σε σύγκριση με αδενώματα). Σε ηπατικές μεταστάσεις, αναπάντεχα, τα επίπεδα δραστηριότητας meprin-α ήταν τόσο χαμηλά όσο εκείνα στα αδενώματα, παρά τη σημαντική έκφραση της πρωτεΐνης (ρ & lt? 0,01 σε σύγκριση με πρωτογενή στάδια όγκους Ι έως IV)

Η εμφανής διαφορά μεταξύ των χαμηλών. τα επίπεδα δραστηριότητας και υψηλής meprin-α επίπεδα πρωτεΐνης σε ηπατικές μεταστάσεις (Εικ. 2C και 3) μπορεί να οφείλεται στην έλλειψη ενεργοποίησης ζυμογόνου meprin-α, ή ένας αναστολέας ειδικά παρούσα σε ηπατικές μεταστάσεις. Για να προσδιοριστεί η έκταση της ενεργοποίησης ζυμογόνου σε δείγματα όγκων πρέπει πρώτα ανοσοκαταβυθίστηκαν ζυμογόνου και δραστικές μορφές του meprin-α και μετρούμενη δραστικότητα απευθείας πάνω στα σφαιρίδια. Η τιμή αυτή, η οποία αντιπροσώπευε το ενδογενώς ενεργοποιημένο πισίνα πρωτεάσης, συγκρίθηκε με την δραστηριότητα σε ανοσοϊζήματα μετά μέγιστη ενεργοποίηση ζυμογόνου με περιορισμένη κατεργασία με θρυψίνη [18]. Η μορφή ζυμογόνου της meprin-α κυριάρχησαν σε όλα τα δείγματα. Ωστόσο, η ενδογενής ενεργοποίηση της meprin-α ήταν σημαντικά υψηλότερη σε πρωτογενείς όγκους από ηπατικές μεταστάσεις (Εικ. 5Α). Σε πρωτογενείς όγκους I-IV, όσο το 20% των συνολικών meprin-α ενεργοποιήθηκε ενδογενώς, και όλα εκτός από ένα δείγμα εμφανίζεται ενδογενή ενεργοποίηση άνω του 5%. Αντιστρόφως, η ενδογενής ενεργοποίηση ήταν κάτω από 5% σε όλα εκτός από δύο δείγματα από ηπατικές μεταστάσεις. Συμπερασματικά, αυξημένη ενεργοποίηση ζυμογόνου μπορεί να συμβάλλει στην αυξημένη δραστικότητα meprin-α σε πρωτογενείς θέσεις όγκου σε σύγκριση με μεταστατικές θέσεις στο ήπαρ.

Meprin-α ανοσοκαταβυθίστηκε από δείγματα όγκου, διαιρούνται σε δύο κλάσματα να αντλήσει ενδογενείς και συνολική δραστηριότητα, όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. (Α) Αναλογία της ενδογενούς δραστικότητας meprin-α έναντι συνολική δραστικότητα σε πρωτογενείς όγκους (Ρ, Ν = 7) και ηπατικών μεταστάσεων (Μ, Ν = 10). ενεργοποίηση ζυμογόνο ενισχύεται σημαντικά σε πρωτογενείς όγκους σε σύγκριση με ηπατικές μεταστάσεις. δείγματα (Β) Ορός από ασθενείς με καρκίνο του παχέος παρουσιάζουν χαμηλότερη ανασταλτικές δραστικότητες έναντι meprin-α. Η πρωτεολυτική δραστικότητα της καθαρισμένης ανθρώπινης ανασυνδυασμένης meprin-α (800 ng /ml) δοκιμάστηκε υπό την παρουσία ανθρώπινου ορού 20%. Οι δραστηριότητες που φαίνεται σε σχέση με την δοκιμασία αναφοράς με 20% ρυθμισμένο με φωσφορικό αλατούχο ρΗ 7.3 (= 1). N: Κανονική υγιείς μάρτυρες (Ν = 19), NC: ομάδα ασθενών Μη καρκίνου, η οποία περιλαμβάνει δείγματα από 22 inviduals με φλεγμονώδεις διαταραχές του εντέρου, CRCI-ΙΙΙ: ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο (Ν = 15) για τα στάδια Ι-ΙΙΙ. CRCIV: ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο (Ν = 9) το στάδιο IV. Σημαντικά μειωμένη αναστολή της meprin-α σε ορό από ασθενείς με καρκίνο του παχέος.

Η

Μειωμένη αναστολή της meprin-α σε ορούς από ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο

Τα κυκλοφορούντα καρκινικά κύτταρα μπορεί να συναντήσει παράγοντες στο αίμα ότι ρυθμίζουν τη δράση meprin-α. Πράγματι, ένας προσδιορισμός δραστικότητας της ανασυνδυασμένης meprin-α με την παρουσία 20% ανθρώπινους ορούς από υγιείς ελέγχους και μια ομάδα ασθενών με φλεγμονώδη νόσο του εντέρου ενδείκνυται η αναστολή κατά 35% (εύρος 5-50%) και 22% (εύρος 0-59 %), αντίστοιχα. Σε αντίθεση, οι οροί από ασθενείς με ορθοκολικό καρκίνο (στάδια Ι-IV) ανέστειλε meprin-α με σημαντικά μικρότερο βαθμό (12% κατά μέσο όρο, 0-37%, p = 2,8 * 10

-6 σύγκριση με υγιείς μάρτυρες, σ = 0.013 σε σύγκριση με ασθενείς με φλεγμονώδεις διαταραχές) (Εικ. 5Β). Οροί από ασθενείς σε φάσεις Ι-ΙΙΙ έδειξαν μειωμένη ανασταλτική ικανότητα σε σύγκριση με φυσιολογικούς ασθενείς που δεν ήταν σημαντικά διαφορετική από ασθενείς στο στάδιο IV. Η αναστολή στον ορό ήταν ανεξάρτητη του MBL, ως συγκεντρώσεις MBL ορό δεν διέφεραν σημαντικά μεταξύ των ομάδων μελέτης και, επίσης, δεν συσχετίζεται με την αναστολή meprin-α (που δεν φαίνεται). Επιπλέον, η ανασυνδυασμένη MBL δεν αναστέλλει ανθρώπου, ποντικού και αρουραίου meprin στην δοκιμασία (Πίνακας S1) Ν-βενζοϋλ-L-τυροσυλ-π-αμινο-βενζοϊκό οξύ (ΡΑΒΑ-πεπτιδίου).

Εν περιλήψει, υπάρχει είναι μια δυναμική και πολύπλοκο πρότυπο ρύθμισης για τη δραστηριότητα του meprin-α σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Αυξημένη ενεργοποίηση ζυμογόνου μπορεί να συμβάλει στην αύξηση πρωτεολυτική δραστηριότητα στην πρωτοβάθμια στάδια όγκους Ι έως IV, και η ανασταλτική δράση έναντι meprin-α μειώνεται στο αίμα σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου.

Συζήτηση

Αυτή η μελέτη συνεπάγεται ότι meprin-α είναι ενεργή κατά τη μετάβαση από καλοήθη ανάπτυξη (αδενώματα) σε κακοήθεις πρωτοπαθείς όγκους. PABA-πεπτίδιο δραστηριότητα στον ιστό καρκίνου είναι ειδικό για meprin σε δοκιμασία μας, καθώς φρόντισε να καταστείλει οποιαδήποτε μη ειδική δραστηριότητα με τη συμπλήρωση της δοκιμασίας με ένα ευρύ φάσμα πρωτεάσης αναστολέα κοκτέιλ. Αξιοσημείωτα, χυμοθρυψίνη πρωτεασών, οι οποίες είναι οι μόνες γνωστά ένζυμα είναι σε θέση να διασπούν ΡΑΒΑ-πεπτιδίου εκτός από meprin [25], αναστέλλονται υπό τις συνθήκες αυτές. πρωτεΐνη Meprin-α και η δραστηριότητα αυξήθηκε στην τελευταία ομάδα, ακόμη και αν δεν υπήρχε σημαντική διαφορά των αντίστοιχων επιπέδων mRNA μεταξύ των διαφόρων ομάδων. Τα αδενώματα εξ ορισμού χαρακτηρίζεται από αυξημένο ρυθμό ανάπτυξης των κυττάρων με φυσιολογική διαφοροποίηση και κυτταρική πόλωση [26]. Ως εκ τούτου, παρόμοια με την κανονική βλεννογόνο του παχέος εντέρου, meprin-α μπορεί να εκκρίνονται και ακολούθως χάνεται μέσα στον αυλό του εντέρου, ενώ η πρωτεάση συγκρατείται μέσα στον ιστό του όγκου σε καρκίνο του παχέος εντέρου, λόγω παρεκκλίνουσα μη πολωμένο έκκριση, ενός μηχανισμού που περιγράφεται από εμάς προηγουμένως [ ,,,0],4]. Επιπλέον υπάρχουν ενδείξεις για μια μετα-μεταγραφική ρύθμιση της meprin-α από μια προηγούμενη μελέτη, όπως meprin-α mRNA ήταν ανιχνεύσιμο από το

in situ υβριδισμού

στις δύο κρύπτης και λάχνης περιοχές, ενώ η πρωτεΐνη που ανιχνεύεται από ανοσοχρώση ήταν παρόν μόνο στα εντεροκύτταρα λάχνης [6].

ορθοκολικό καρκίνο, πρωτογενείς όγκοι περιείχαν αυξημένη meprin-α δραστηριότητα και συχνά έτρεφε ένα υποπληθυσμό καρκινικών κυττάρων με ισχυρή έκφραση της πρωτεΐνης meprin-α, ιδιαίτερα σε UICC στάδια III και IV, δηλαδή μετά την εξέλιξη σε μετάσταση στους λεμφαδένες και απομακρυσμένες περιοχές (Εικ. 2 και 3). Η διάδοση των καρκινικών κυττάρων έτσι συσχετίζεται με αυξημένη πρωτεΐνη meprin-α και τη δραστηριότητα. Ωστόσο, οφείλουμε να παρατηρήσουμε ότι η συσχέτιση μεταξύ των σημάτων ανοσοαποτύπωση, ανοσοχρώση βαθμολογίες και τα επίπεδα meprin-α-δραστηριότητα στις ομάδες των πρωτοπαθών όγκων δεν είναι σφιχτό. Η βαθμολογία ανοσοχρώση θεωρεί τη συχνότητα και την ένταση των σημάτων meprin-α μεταξύ καρκινικά κύτταρα μόνο σε τοπικά περιορισμένη περιοχή του δείγματος, ενώ το σήμα ανοσοαποτύπωση είναι ο μέσος όρος του συνολικού δείγματος συμπεριλαμβανομένων εκκρίνεται meprin-α συσσωρεύεται στο στρώμα του όγκου [4] . Το επίπεδο δραστικότητας meprin-α επιπρόσθετα επηρεάζεται από ζυμογόνο ενεργοποίηση και παρουσία αναστολέων.

Οι οροί από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου εμφανίζεται σημαντικά χαμηλότερη ανασταλτική δραστηριότητα προς meprin-α από τους υγιείς μάρτυρες και ασθενείς με εντερικές φλεγμονώδεις νόσους, υποδεικνύοντας ότι η μετανάστευση των κυκλοφορούντων meprin-α που εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα από τα αιμοφόρα αγγεία μπορεί να διευκολύνεται. Η ανασταλτική δραστικότητα στον ορό δεν οφειλόταν σε μαννάνη δεσμεύσεως λεκτίνης, ένας ενδογενής αναστολέας meprin ήδη αναφερθεί [16], και έτσι συνεισφέρει από ένα ή περισσότερα επιπλέον αναστολέα (ων). Σε μια πρόσφατη έκθεση, fetuin-Α και κυστατίνη C έχουν αναφερθεί ως τέτοιες ενδογενείς meprin αναστολείς [17]. Στην πραγματικότητα, χρησιμοποιώντας ανασυνδυασμένη ανθρώπινη MBL, βρήκαμε καμία αναστολή meprin (Πίνακας S1). Αυτό το εύρημα έρχεται σε αντίθεση με την έκθεση του Hirano et al. [16]. Ωστόσο, τα στοιχεία μας είναι σύμφωνα με την έλλειψη ενός συσχετισμού μεταξύ αναστολής από ορούς ασθενών και συγκέντρωση MBL. Δεύτερον, όπως Hirano et al. μεταχειρισμένα MBL καθαρίζεται από ανθρώπινο ορό για προσδιορισμούς τους αναστολής meprin, εμείς εικάζουν ότι η απόκλιση μεταξύ μας και τα δεδομένα τους οφείλεται σε μολυσματικές παράγοντες από τον ανθρώπινο ορό, όπως fetuin-Α και /ή Γ Cystatin

Υπάρχουν είναι μια δυναμική και πολύπλοκο πρότυπο ρύθμισης της δραστικότητας του meprin-α σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Αυξημένη ενεργοποίηση ζυμογόνου συμβάλλει στην υψηλότερη πρωτεολυτική δραστικότητα σε πρωτογενείς όγκους στάδια Ι έως IV (Σχ. 5Α), και η ανασταλτική δραστικότητα έναντι meprin-α μειώνεται στο αίμα σε ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου (Εικ. 5Β). Η ανεπαρκής ενεργοποίηση στις μεταστάσεις ήπατος είναι σύμφωνα με την προηγούμενη παρατήρηση ότι το υΡΑ-σύστημα, ένας ενεργοποιητής meprin-α, είναι αδρανής στις μεταστάσεις ήπατος, λόγω της έλλειψης της ενεργοποίησης υΡΑ και η υπερ-έκφραση του αναστολέα του ενεργοποιητή του πλασμινογόνου [27] , [28]. Ακόμα κι αν πολλοί μεταλλοπρωτεασών μήτρας (MMPs) είναι γνωστό ότι αυξάνεται σε επεμβατικές πρωτογενών όγκων σε καρκίνο του παχέος εντέρου [29], υπάρχουν λίγες αναλύσεις που περιλαμβάνουν μεταστάσεις ήπατος. Σε μια τέτοια μελέτη, ΜΜΡ-9 έχει δειχθεί ότι αυξάνεται σε πρωτογενείς όγκους, αλλά όχι ηπατικών μεταστάσεων [30]. Η μελέτη και το σημείο δεδομένα μας σε σημαντικές διαφορές μεταξύ των δικτύων πρωτεάσης σε πρωτοπαθείς όγκους και μεταστάσεις στο ήπαρ, το οποίο είναι σχετικό για τις θεραπευτικές προσεγγίσεις που χρησιμοποιούν αναστολείς πρωτεάσης.

Μελετήσαμε τη μετανάστευση των κυττάρων σε κύτταρα MDCK που εκφράζουν meprin-α στην επιφάνεια του κυττάρου δεσμεύονται σε ετεροδιμερική σύμπλοκα πρωτεΐνης με διαμεμβρανική meprin-β [31]. κύτταρα που εκφράζουν Meprin μετανάστευσε σημαντικά πιο γρήγορα σε λαμινίνη 1 επικαλυμμένα πιάτα παρουσία πλασμινογόνου και HGF. Meprin-α θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί κατά την κυτταρική επιφάνεια με πλασμίνη, που παράγεται από το πλασμινογόνο μέσω της δραστηριότητας του ενεργοποιητή πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης (υΡΑ) δεσμεύεται στον υποδοχέα του (υ-ΡΑΡ), που και οι δύο είναι γνωστό ότι είναι προς τα πάνω ρυθμισμένα με HGF σε MDCK κύτταρα [32]. Αυτό το σύστημα πιθανότατα συμβάλλει επίσης στην ενεργοποίηση του meprin-α σε όγκους

in vivo

, όπως υ-ΡΑ και υ-ΡΑΡ είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε καρκίνο του παχέος εντέρου [33], [34], [35] , [36]. Σε δοκιμασία η μετανάστευση μας, η φιλο-μεταναστευτική επίδραση οφείλεται πράγματι σε meprin-α, όπως πλασμίνη ενεργοποιεί meprin-α αλλά όχι meprin-β [7] και επειδή ακτινονίνη, η οποία αντιστρέφει την φιλο-μεταναστευτική επίδραση, δεν αναστέλλουν meprin-α με περίπου 100-φορές υψηλότερη ισχύ (Κ

i 2 * 10

-8 Μ) από ό, τι meprin-β (Κ

i 2 * 10

-6 Μ) [10].

Τόσο λαμινίνη-1 και λαμινίνη-5 διασπώνται από meprin-α

in vitro

[37], και εμείς εικάζουν ότι meprin-α θα μπορούσε να εκθέσει κρυπτικά προμεταναστευτικές επιτόπων με παρόμοιο τρόπο όπως έχει προηγουμένως εμφανίζεται με λαμινίνη-5 και λαμινίνη-1 για ΜΤ1-ΜΜΡ [38] και ελαστάση [39], αντίστοιχα. Το σύστημα υΡΑ-πλασμινογόνου είναι επίσης ζωτικής σημασίας στην αγγειογένεση [23], [40], και η πλασμίνη με τη σειρά του θα μπορούσε να ενεργοποιήσει meprin-α ως μεταγενέστερος αγγειογενετική τελεστή σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Σύμφωνα με τα δεδομένα μας, μια προ-αγγειογενετική δράση της meprin-α έχει επίσης παρατηρηθεί σε ένα νοκ ντάουν μορφολινο στο zebrafish [14].

Το pro-αγγειογενετική δραστηριότητα ήταν εμφανής με εξωκυττάριο διαλυτό meprin-α, ενώ προ-μεταναστευτική επίδραση του ήταν εμφανής σε κύτταρα με meprin-α στην κυτταρική τους επιφάνεια. Επομένως, η προ-αγγειογενετική δράση του meprin-α απελευθερώνεται από τα καρκινικά κύτταρα μπορεί να προάγεται με πρωτεολυτική δραστικότητα της έξω και μακριά από προ-αγγειογενετική /αγγειογενείς κύτταρα. Εκκρίνεται meprin-α μπορεί έτσι να ελέγχεται ο όγκος του περιβάλλοντος για την προώθηση της ενισχυμένης αγγειογένεσης μαζί με άλλα προ-αγγειογόνοι παράγοντες, ενώ meprin-α προσδεδεμένα στην κυτταρική επιφάνεια μπορεί να προάγει τη μετανάστευση των ίδιων καρκινικών κυττάρων. Και οι δύο διαδικασίες meprin εξαρτώμενη αναμένεται να προωθήσουν από κοινού την εξέλιξη του όγκου.

Εν κατακλείδι, η μελέτη αυτή αποκαλύπτει μια σύνθετη και δυναμική μοτίβο ρύθμιση για meprin-α στην πρόοδο του όγκου. Η μετάβαση σε κακοήθη στάδια σε όγκους παχέος εντέρου συσχετίζεται με αυξημένη δραστικότητα σε πρωτοβάθμιο meprinα καρκινικές θέσεις, σύμφωνα με ένα ρόλο στην εισβολή και τη μεταστατική διάδοση καρκινικών κυττάρων. Ένας ρόλος για meprin-α στη διαδικασία αυτή υποστηρίζεται περαιτέρω από προ-αγγειογόνο και υπέρ-μεταναστευτική δραστηριότητα της. Τα δεδομένα μας δείχνουν επίσης ότι η προώθηση της μετανάστευσης εξαρτάται από την έκφραση του simultanous meprin-β πρόσδεση meprin-α στην επιφάνεια των κυττάρων. Η έλλειψη ανιχνεύσιμων mRNA meprin-β σε ολόκληρη όγκου δεν αποκλείει την επαγωγή της σε ένα υποπληθυσμό καρκινικών κυττάρων. Τα στοιχεία μας είναι σε συμφωνία με την άποψη ότι οι meprin-α /β συν-εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα είναι πιθανό να μεταναστεύσουν μακριά από την μάζα του όγκου. Περιγράψαμε προηγουμένως ότι meprin-β αποδυναμώνει διακυτταρικές συνδέσεις [41]. Μελλοντικές μελέτες θα πρέπει να επικεντρωθεί στην ανάλυση του ρόλου των meprins στη μετανάστευση των καρκινικών κυττάρων. Η ανασταλτική δραστικότητα έναντι meprin-α είναι χαμηλότερη σε ορούς από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου, η οποία μπορεί να διευκολύνει τη διάδοση των meprin εκφράζουν τα καρκινικά κύτταρα. Θεραπευτικές προσεγγίσεις με αναστολείς πρωτεάσης στόχευση meprin-α σε πρωτογενείς όγκους και στην κυκλοφορία του αίματος θα μπορούσε να αντενεργούν στην εξέλιξη του όγκου. Από την άλλη πλευρά, meprin-α δραστηριότητα είναι χαμηλή σε ηπατικές μεταστάσεις, και ως εκ τούτου η αναστολή αυτής της πρωτεάσης σε αυτή τη θέση δεν αναμένεται να είναι μια αποτελεσματική θεραπεία.

Υλικά και Μέθοδοι

Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη meprin

η ανασυνδυασμένη δραστική meprin-α και meprin-β καθαρίστηκε από κύτταρα εντόμων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [7], [42]. Αριθ υπολειμματική δραστικότητα θρυψίνης ήταν ανιχνεύσιμη στα καθαρισμένα ανασυνδυασμένα meprins.

Μετανάστευση κυττάρων

δοκιμασία κυττάρων

Madin-Darby νεφρού σκύλου (MDCK) αναπτύχθηκαν σε ελάχιστο βασικό μέσο (ΜΕΜ) συμπληρωμένο με 5% FCS , 100 U /ml πενικιλλίνης και 100 μg /ml στρεπτομυκίνης (μέσα κυτταρικής καλλιέργειας και συμπληρώματα από την Invitrogen, Basel, Switzerland). Meprin-επιμολυσμένα κύτταρα MDCK [31] και άγριου τύπου πατρικών κυττάρων MDCK σπάρθηκαν σε πλάκες 12-φρεατίων λαμινίνη-1 επικαλυμμένο σε πυκνότητα 10.000 κύτταρα /φρεάτιο (12 φρεατίων από την Costar, Cambridge, ΜΑ, USA, καθαρισμένο λαμινίνη-1 από σάρκωμα Engelbreth-Holm-Swarm ποντικού, Sigma, St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ Α) και επωάστηκαν για μία νύχτα σε ΜΕΜ με 5% FCS. Μετά από μια προεπώαση 48 ώρες σε μέσο χωρίς ορό (Advanced DMEM, Invitrogen) που περιείχε 20 ηΜ αυξητικού παράγοντα ηπατοκυττάρων (HGF), μεταναστεύουν κύτταρα καταγράφηκαν χρησιμοποιώντας χρόνος βιντεομικροσκοπία μεσολάβηση για 3-4 ώρες. Πλασμινογόνου (American Diagnostica, Pfungstadt, Γερμανία) και ακτινονίνη (Sigma) προστέθηκαν και τα δύο σε 100 ηΜ. διαδρομές μετανάστευσης αξιολογήθηκαν όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [22]. HGF επαγόμενη μετανάστευση των κυττάρων MDCK σε ταχύτητες μεταξύ 27 και 84 μm /h. Σε περίπτωση απουσίας HGF, τα κύτταρα MDCK αναπτύσσονται σε συστάδες και δεν μεταναστεύουν. Λόγω της τεχνικής περιορισμό της πειραματικής διάταξης που χρησιμοποιείται, τα πειράματα πολλαπλές μετανάστευση έπρεπε να διεξάγονται διαδοχικά σε διαφορετικές ημέρες. Δεδομένου ότι οι μέσες ταχύτητες μετανάστευσης ποικίλλει σημαντικά μεταξύ των πειραματικών συνεδρίες, ανεξάρτητα από τις συνθήκες αξιολογούνται. οι μετρήσεις κανονικοποιήθηκαν στη μετανάστευση των κυττάρων άγριου τύπου που παρατηρείται σε κάθε πειραματική συνεδρία.

προσδιορισμό αγγειογένεσης (δοκιμασία αορτικού δακτυλίου)

Δακτύλιοι θωρακικής αορτής αρουραίου (1 mm μήκος) καλλιεργήθηκαν σε 3-διαστάσεων πηκτές κολλαγόνου (ουράς αρουραίου γέλη διάμεσο κολλαγόνο, 1,5 mg /ml, Serva, Heidelberg, Germany) [23]. Οι καλλιέργειες διατηρήθηκαν για 9 ημέρες στους 37 ° C σε 6 ml MCDB 131 (Invitrogen) με 25 mM NaHCO3, 1% γλουταμίνη, 100 U /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη, παρουσία ή απουσία 0.7 μg /ml καθαρισμένου ανασυνδυασμένη ανθρώπινη ενεργό meprin-α. Η αγγειογενετική απόκριση ποσοστώθηκε χρησιμοποιώντας ανάλυση εικόνας με το λογισμικό Aphelion 3.2 (Adcis) σε τρία ανεξάρτητα πειράματα (το καθένα εις τριπλούν). Μετά από γεωμετρικά και μορφολογικές παράμετροι προσδιορίστηκαν:. Αριθμός μικροαγγείων (NV), μήκους μέγιστη μικροαγγείων (Lmax) και ο συνολικός αριθμός των καταστημάτων στην μικροαγγείων (Nb) [43]

Ασθενείς

Συλλογή δείγματα όγκων κατά τη διάρκεια χειρουργικών επεμβάσεων εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της Ιατρικής Σχολής του Πανεπιστημίου της Βέρνης, στην Ελβετία. Γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από όλους τους ασθενείς. Καρκινώματα οργανώθηκαν σύμφωνα με την ονοματολογία UICC. Η μελέτη συμπεριέλαβε 72 ασθενείς (49/23 αρσενικό /θηλυκό, διάμεση 64,5 έτη, εύρος 20-90 έτη), με 12 ασθενείς σε κάθε μία από τις ακόλουθες έξι ομάδες: αδενώματα (5/7 m /f, διάμεση 68,5 έτη, εύρος 20 -89 ετών), οι πρωτογενείς όγκοι σταδίου Ι (7/5 m /f, διάμεση 72,5 έτη, εύρος 60-90 έτη), το στάδιο ΙΙ (7/5 m /f, η διάμεση 73 έτη, εύρος 50-82 έτη), το στάδιο ΙΙΙ (10/2 αρσενικό /θηλυκό, η διάμεση 64 έτη, εύρος 48-84 έτη), το στάδιο IV (9/3 m /f, διάμεση 60,5 έτη, εύρος 43-84 έτη) και μεταστάσεις στο ήπαρ (11/1 m /f , διάμεση 57,5 ​​έτη, εύρος 31-84 ετών). Τα δείγματα αυτής της ομάδας μελέτης αναλύθηκαν από Northern και Western blotting, ανοσοϊστοχημεία και υποβλήθηκαν σε δοκιμασίες δραστικότητας meprin. Πειράματα που φαίνεται στο Σχ. 5Α /Β περιλαμβάνονται επιπλέον οκτώ δείγματα από μεταστάσεις στο ήπαρ (6/2 m /f, η διάμεση 68 έτη, εύρος 37-82 ετών).