Αφηρημένο

Οι μελέτες έχουν δείξει μια πιθανή συσχέτιση μεταξύ του πρόσφατα εντοπίστηκαν πρωτεΐνη Ε3 ουμπικουιτίνης δαχτυλίδι λιγάση δάχτυλο 146 (RNF146) και την ανάπτυξη των όγκων. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, οι μελέτες για RNF146 έχουν περιοριστεί σε πολυ (ADP-ριβοσυλικό) ίωση και ουβικιτίνης απολίνωση, ενώ ο ρόλος της RNF146 στη βιολογία του όγκου έχει σπάνια αναφερθεί. Στην παρούσα μελέτη, ο ρόλος των RNF146 σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα (NSCLC) ερευνήθηκε. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η έκφραση του RNF146 αυξήθηκε σε κλινικά δείγματα καρκίνου του πνεύμονα και κυτταρικές σειρές. RNF146 έκφραση συσχετίζεται με το μέγεθος του όγκου, το επίπεδο της διαφοροποίησης, λεμφικό μετάσταση, pTNM στάσης, και πρόγνωση των ασθενών στην έκφραση RNF146 στάδιο Ι σχετίστηκε αρνητικά με την έκφραση Axin αλλά συσχετίζεται θετικά με την πυρηνική έκφραση της β-κατενίνης σε ιστούς NSCLC. RNF146 μειωτικά την έκφραση αξίνης σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα και προκάλεσε την έκφραση και την πυρηνική διανομή των β-κατενίνης. Η υπερέκφραση του RNF146 σε κυτταρικές σειρές NSCLC αύξησε τα επίπεδα της cyclinD1, κυκλίνη, και CDK4, προωθείται κυτταρικού κύκλου G

0 /G

1-S μεταβάσεις, και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων οργανωμένη. Η υπερέκφραση του RNF146 οδήγησε στην προς τα πάνω ρυθμισμένη επίπεδα μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας 2 και 7 και ενισχυμένη καρκίνος του πνεύμονα διεισδυτικότητα, γεγονότα που προκαλούνται από την κλασική /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης Wnt. Συνοπτικά, τα δεδομένα στην παρούσα μελέτη υποδεικνύει ότι RNF146 ρυθμίζεται η ανάπτυξη και η εξέλιξη των NSCLC ενισχύοντας την κυτταρική ανάπτυξη, την εισβολή και την επιβίωση, γεγονός που υποδηλώνει ότι RNF146 μπορεί να είναι ένας πιθανός στόχος της θεραπείας σε NSCLC

Παράθεση:. Gao Υ, Τραγούδι C, Hui L, Li Cy, Wang J, Tian Y, et al. (2014) Η υπερέκφραση του

RNF146

σε μη-μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα ενισχύει τον πολλαπλασιασμό και την εισβολή των Όγκων μέσω της Wnt /β-κατενίνης μονοπάτι σηματοδότησης. PLoS ONE 9 (1): e85377. doi: 10.1371 /journal.pone.0085377

Επιμέλεια: Τάνια Β Kalin, Ιατρικό Κέντρο Νοσοκομείο Σινσινάτι των παιδιών, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 5 Σεπ 2013? Αποδεκτές: 26 Νοεμ 2013? Δημοσιεύθηκε: 14 Ιανουαρίου του 2014

Copyright: © 2014 Gao et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών της Κίνας (Αρ 30972967 και 30973502), Εξειδικευμένες Ταμείο Έρευνας για τον Διδακτορικό πρόγραμμα της Ανώτατης Εκπαίδευσης (Αρ 20092104110018), πρόγραμμα για Λιαονίνγκ εξαιρετικά ταλέντα στο Πανεπιστήμιο και Liaoning επαρχιακή Επιστήμης και του προγράμματος σχέδιο τεχνολογίας (Νο 2012225072). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

λιγάσες Ε3 ουμπικουιτίνης παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση κυτταρικές λειτουργίες, συμπεριλαμβανομένων του πολλαπλασιασμού, διακοπή του κυτταρικού κύκλου και της απόπτωσης. Μπορούν επίσης να έχουν πρόσθετες λειτουργίες που εξαρτώνται από την ταυτότητα των υποστρωμάτων τους. Για παράδειγμα, εάν ένας Ε3 ουμπικουιτίνης λιγάση στοχεύει σε ογκογονίδιο για την αποικοδόμηση, μπορεί να θεωρηθεί ως καταστολέας όγκου. Ομοίως, εάν ένας Ε3 uniquitin λιγάση αποδομεί μία πρωτεΐνη καταστολής όγκου, μπορεί να θεωρηθεί ως ογκογονίδιο. Πολλές πρωτεΐνες που περιέχουν περιοχές-δακτύλου διαθέτουν δράση λιγάσης ουβικιτίνη, μερικά από τα οποία συμμετέχουν στην ογκογένεση και τη μετάσταση του όγκου. Το πρόσφατα ταυτοποιημένα πρωτεΐνη δακτύλου Ε3 ουμπικουιτίνης λιγάση RING 146 (RNF146) αλληλεπιδρά με πολυ (ADP-ριβόζη) (PAR) μέσω ενός PAR-μοτίβο σύνδεσης στον τομέα Trp-Trp-Glu (WWE). Η

RNF146

γονίδιο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 6q22 ανθρώπινο, 33 [1]. RNF146 έχει νευροπροστατευτική δράση οφείλεται στην αναστολή της Parthanatos μέσω δέσμευσης με PAR [2]. RNF146 μπορεί να διευκολύνει την επιδιόρθωση του DNA έναντι του κυτταρικού θανάτου που επάγεται από παράγοντες που βλάπτουν το DNA ή [3] γ-ακτινοβολία. Σε απάντηση στην κυτταρική βλάβη, RNF146 μετατοπίζεται στον πυρήνα και αυξάνει την ουβικιτινίωση και την υποβάθμιση των διαφόρων νουκλεοπρωτεΐνες που συμμετέχουν στην επιδιόρθωση της βλάβης του DNA. Επιπλέον, όπως πολυ (ADP-ριβοσυλ) ίωση (PARsylation) που κατευθύνεται Ε3 ουμπικουιτίνης λιγάση, RNF146 ρυθμίζει την τανκυράσης εξαρτώμενη αποδόμηση αξίνης και θετικά ρυθμίζει την μονοπάτι σηματοδότησης Wnt [1].

Η σηματοδότηση Wnt οδός είναι πολύ δραστική στον καρκίνο του πνεύμονα κύτταρα, οδηγώντας σε μετάσταση και τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων αυτών [4]. Σηματοδότηση Wnt μπορεί να ενεργοποιηθεί με παρεκκλίνοντα με διάφορους μηχανισμούς, και ένας κύρια λειτουργία τους είναι να αναστέλλουν την πρωτεόλυση της β-κατενίνης, η οποία ελέγχεται από τη φωσφορυλίωση [5]. Δωρεάν β-κατενίνης μπορεί να εισέρχεται στον πυρήνα και να ενεργοποιήσει τα γονίδια-στόχους του Wnt. Σταθερής κατάστασης επίπεδα Axin είναι πολύ σημαντικό, καθώς η πρωτεΐνη αυτή σκαλωσιές έναυσμα για τον σχηματισμό του συμπλέγματος υποβάθμιση της β-κατενίνης. Οι ερευνητές απέδειξαν ότι η μεταβίβαση του PAR σε υπολείμματα αξίνης καταλύεται από τανκυράσης οδηγεί στην PARsylation αξίνης [1], [6]. RNF146 συμμετέχει στην αποικοδόμηση του PARsylated Axin μέσω μοτίβου PAR-δέσμευσης της. Αυτή η αλληλεπίδραση οδηγεί στην καταστροφή του συμπλόκου αποικοδόμησης β-κατενίνης, η συσσωμάτωση των ενδοκυτταρικών β-κατενίνης, καθώς και αυξημένη σηματοδότηση μέσω του μονοπατιού Wnt [1].

Παρά τις πολλές μελέτες σχετικά με RNF146, ακριβής ρόλος του στην ογκογένεση παραμένει ασαφής . Στην παρούσα μελέτη, οι ρόλοι των RNF146 στον καρκίνο του πνεύμονα διερευνήθηκαν.

Υλικά και Μέθοδοι

NSCLC δείγματα ιστών

δείγματα Πρωτοβάθμια NSCLC και ιστών ελέγχου συλλέχθηκαν από 133 ασθενείς . Κανονική δείγματα πνεύμονα ελήφθησαν από ιστό πνεύμονα πάνω από 5 cm από τη θέση του καρκίνου εκτομή. Διαδικασίες έλαβε χώρα κατά την τέταρτη συνδεδεμένες νοσοκομείο της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου. Οι ασθενείς δεν έλαβαν καμία ακτινοβολία ή χημειοθεραπεία πριν την επέμβαση. NSCLC στάσης βασίστηκε στην ταξινόμηση ΤΝΜ των κακοήθων όγκων, έβδομη έκδοση [7]. Ο χρόνος επιβίωσης υπολογίστηκε από την ημέρα της επέμβασης στο θάνατο μέσω της αξιολόγησης της υποτροπής και της μετάστασης ή μέχρι την τελευταία παρακολούθηση ημερομηνία. Φρέσκα δείγματα καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C. Για τα πειράματα που αφορούν τους ανθρώπινους ιστούς, η έγκριση ελήφθη από την θεσμική επιτροπή επανεξέτασης της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου. Γραπτή συγκατάθεση δόθηκε σύμφωνα με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι.

Αντισώματα και Αντιδραστήρια

Το κουνέλι αντι-ανθρώπινο RNF146 πολύκλωνο αντίσωμα αγοράστηκε από Abcam (Επιστημονικό Πάρκο Cambridge). Αντι-Axin και αντισωμάτων αντι-β-κατενίνης αγοράσθηκαν από BD Transduction Laboratories (San Jose, CA, USA). Αντι-κυκλίνη, αντι-CyclinB, αντι-CyclinD1, και αντι-pRB αντισώματα ήταν από την Cell Signaling Technology, Inc. (Boston, MA, USA). Αντι-CDK4, αντι-CDK6, αντι-TIMP-1, αντι-κυκλίνη, siAxin, siβ-κατενίνης και siTCF4 ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Αντισώματα έναντι RhoA, RhoB, RhoC και Rock1 ήταν από Proteintech (Chicago, IL 60612, USA). Αντισώματα έναντι CDK2, Ρ21, μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης 2 (ΜΜΡ2), ΜΜΡ7, και ΜΜΡ9 ήταν από NeoMarkers (Palo Alto, CA, USA). Anti-P27 και αντι-Ρ53 ήταν από την Thermo Fisher Scientific (Fremont, CA, USA). Τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια υπερέκφραση pEX4-hRNF146 και pGPHI-shhRNF146 και ελέγχου άδειο πλασμίδια κατασκευάστηκαν από GenePharma (Σαγκάη, Κίνα). Η ανοσοϊστοχημική κιτ δευτερεύον αντίσωμα αγοράστηκε από την Dako (Κοπεγχάγη, Δανία).

Γραμμές καλλιέργειας κυττάρων και κυττάρων

Η κανονική βρογχικών επιθηλιακών κυτταρική σειρά HBE, το ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα πνεύμονα Α549 κυτταρικές σειρές και Η1299 ήταν αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές NSCLC LK2, LH7, LTE, και SPC αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Κυττάρων Τράπεζα της Κινεζικής Ακαδημίας Επιστημών. Οι κυτταρικές σειρές καλλιεργήθηκαν σε Τροποποίηση Kaighn του Ham F-12 Medium, Roswell Memorial Institute Park (RPMI) -1640 ή τροποποιημένο μέσον Eagle’s-F12 κατά Dulbecco με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) που περιείχε 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μονάδες /ml στρεπτομυκίνη (Sigma, St. Louis, ΜΟ, USA) στους 37 ° C με 5% CO

2.

ανοσοϊστοχημική χρώση

παραφίνης τμήματα με πάχος από 4 μm παρασκευάστηκαν και χρωματίστηκαν με ανοσοϊστοχημικά Envision όπως περιγράφηκε προηγουμένως [8] – [9]. δείγματα παραφίνης επωάστηκαν με αντισώματα αντι-RNF146 (1:100), αντι-Axin (1:200), και αντι-β-κατενίνης (1:200) στους 4 ° C όλη τη νύκτα. PBS-επωάζονται δείγματα χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί μάρτυρες.

Δύο γιατροί παθολογία αξιολόγησε τα αποτελέσματα χρώσης σε μια ημιποσοτική κλίμακα. Πέντε πεδία υψηλής μεγέθυνσης επιλέχθηκαν τυχαία από κάθε τμήμα, και 100 καρκινικών κυττάρων σε κάθε πεδίο μετρήθηκαν για να αξιολογηθεί η ένταση και το εύρος της χρώσης RNF146. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα δόθηκε μια βαθμολογία από το 0 (καμία χρώση), αχνό κίτρινο χρώση καταγράφηκε ως 1, κίτρινο βαθμολογήθηκε ως 2, και το βαθύ καφέ χρώση καταγράφηκε ως είχαν ανατεθεί ένα 3. βαθμολογίες Ποσοστό ως εξής: 0.05.

doi:10.1371/journal.pone.0085377.s003

(TIF)

Acknowledgments

We