Αφηρημένο

φορμόλη σταθερής και παραφίνη-ενσωματωμένες ανθρώπινο ιστό εκτομή κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης του καρκίνου είναι απαραίτητη για διαγνωστικούς και θεραπευτικούς σκοπούς και αντιπροσωπεύει ένα τεράστιο και σε μεγάλο βαθμό ανεκμετάλλευτο πόρο για την έρευνα. Οπτική μικροσκοπία τέτοιων δείγμα περιορίστηκε από την περίθλαση περιορισμένη ανάλυση των συμβατικών οπτική μικροσκοπία. Για να ξεπεραστεί αυτός ο περιορισμός, χρησιμοποιήσαμε sted υπερ-ανάλυση μικροσκοπία επιτρέποντας οπτική ανάλυση αρκετά κάτω από το φράγμα περίθλασης. Εμείς οπτικοποιείται νανοκλίμακας κατανομές πρωτεΐνης σε τμήματα καλά σχολιασμένα ανθρώπινο ιστό καρκίνου του ορθού εγκλεισμένα σε παραφίνη αποθηκεύονται σε ένα κλινικό χώρο αποθήκευσης. Χρησιμοποιώντας αντιορούς έναντι αρκετών μιτοχονδριακών πρωτεϊνών, sted μικροσκοπία αποκάλυψε διακριτά υπο-μιτοχονδριακή κατανομές πρωτεΐνης, υποδηλώνοντας ένα υψηλό επίπεδο διαρθρωτικών διατήρησης. Ανάλυση των ανθρώπινων ιστών αποθηκεύονται για μέχρι και 17 ετών έδειξε ότι αυτά τα δείγματα ήταν ακόμα επιδεκτικά για μικροσκοπία υπερ-ανάλυση. Sted μικροσκόπιο των τμημάτων του HER2 θετικό ορθού αδενοκαρκίνωμα αποκάλυψε λεπτομέρειες στην επιφάνεια και ενδοκυτταρική κατανομή HER2 που θολή στις αντίστοιχες συμβατικές εικόνες, αποδεικνύοντας τις δυνατότητες της μικροσκοπίας υπερ-ανάλυση για να εξερευνήσετε την μέχρι στιγμής σε μεγάλο βαθμό ανεκμετάλλευτες νανοκλίμακας καθεστώς στους ιστούς αποθηκεύονται σε biorepositories.

Παράθεση: Ilgen P, Stoldt S, Conradi LC, Wurm CA, Rüschoff J, Ghadimi ΒΜ, et al. (2014) sted Super-ψήφισμα Μικροσκοπίας Κλινικής εμπεδωθεί με παραφίνη Ανθρωπίνων ορθού ιστών. PLoS ONE 9 (7): e101563. doi: 10.1371 /journal.pone.0101563

Επιμέλεια: Αντώνης W. Ι Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 12 του Μαρτίου του 2014? Αποδεκτές: 9, Ιουνίου, 2014? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Ilgen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Η συγγραφείς επιβεβαιώνουν ότι όλα τα δεδομένα που διέπουν τα ευρήματα είναι πλήρως διαθέσιμα χωρίς περιορισμούς. Όλα τα στοιχεία που περιλαμβάνονται στο έγγραφο

Χρηματοδότηση:. Μέρος του έργου υποστηρίχθηκε από την Deutsche Forschungsgemeinschaft μέσω του Cluster of Excellence «νανοκλίμακα Μικροσκοπίας και Μοριακής Φυσιολογίας του Εγκεφάλου» και το IMAGINT προγράμματος της ΕΕ (Υγεία-F5 -2011-259881) (τόσο για SJ), καθώς και μέσω της KFO179 «βιολογική βάση των Ατομικών ανταπόκρισης του όγκου σε ασθενείς με καρκίνο του ορθού.» Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Ο αριθμός των δείγμα ανθρώπινου ιστού αποθηκεύονται σε (κλινικές) biorepositories εκτιμήθηκε. σε περισσότερα από 300 εκατομμύρια ήδη πριν από 15 χρόνια στις ΗΠΑ και μόνο [1], [2]. Πολλά από αυτά τα δείγματα έχουν σταθεροποιημένα με φορμαλίνη και ενσωματωμένα σε παραφίνη, μια τυποποιημένη μέθοδος κλινική διατήρησης η οποία είναι σε χρήση για περισσότερο από έναν αιώνα. Σε πολλές κλινικές ρυθμίσεις, ιστό που λαμβάνεται από ασθενείς με καρκίνο κατά τη διάρκεια ογκολογική χειρουργική αποθηκεύονται σε μπλοκ παραφίνης για τη διάγνωση, απόφαση για μετεγχειρητική στρατηγικές θεραπείας και μελετών παρακολούθησης, που αντιπροσωπεύει ένα τεράστιο και πολύτιμο πόρο για τη μελέτη της παθολογίας και λειτουργική βάση πολλών κακοηθειών.

Για τις αναλύσεις, η αποθηκευμένη και σχολιασμένη παραφίνη-ενσωματωμένες ιστός μπορεί να χωριστεί, αποκηρωμένα, βάφονται και, στη συνέχεια, απαθανατίστηκε από το συμβατικό οπτικό μικροσκόπιο. Στην κλασική (φθορισμού) μικροσκοπία η εφικτή ανάλυση περιορίζεται από την περίθλαση σε περίπου 250 nm, περιορίζοντας το εξαγόμενο πληροφορίες από ένα δείγμα. Κατά την τελευταία δεκαετία, διάφορες τεχνικές υπερ-ανάλυση μικροσκοπίας (νανοσκοπίας) έχουν αναπτυχθεί που επιτρέπουν να ξεπεράσουμε ριζικά το όριο διάθλασης, επιτρέποντας μακρινού πεδίου μικροσκοπία με σημαντικά βελτιωμένη ανάλυση [3] – [5].

από αυτές τις τεχνικές, διεγερμένα εξάντληση των εκπομπών (sted) μικροσκοπία ξεχωρίζει ως μια προσέγγιση που μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε συνδυασμό με ανοσοσημασμένες δείγματα και ότι δεν απαιτεί υπολογιστική προσπάθειες για τη δημιουργία της τελικής εικόνας [6], [7]. Σε sted μικροσκοπία, ένα ελαφρύ πρότυπο χρησιμοποιείται για να αναστείλει φθορισμού σε καλά καθορισμένες συντεταγμένες δείγμα έτσι ώστε γειτονικά χαρακτηριστικά εκπέμπουν διαδοχικά. Η αναστολή του φθορισμού επιτυγχάνεται με εξαναγκασμένη εκπομπή του ενθουσιασμένοι φθοροφόρων στη θεμελιώδη κατάσταση. Σε μία τυπική εφαρμογή sted μικροσκοπία οι φθοροφόρα βρίσκονται στο εξωτερικό χείλος ενός σάρωσης εστιακό σημείο του φωτός διέγερσης παροδικά απενεργοποιηθεί μέσω αποδιέγερσης μέσω εξαναγκασμένης εκπομπής με ένα ντόνατ σχήματος sted πορείας που διαθέτει ένα κεντρικό μηδέν. Κατά συνέπεια, φθοροφόρα μόνο εντός μιας αποτελεσματικής εστίαση με διάμετρο είναι σε θέση να φθορίζουν. Εδώ,

λ

είναι το μήκος κύματος,

I

s

είναι ένα χαρακτηριστικό του φθοροφόρου, και

I

max

υποδηλώνει την ένταση της κορυφής πλαστικοποιήσεως το μηδέν. Για

max

/

s

& gt? & Gt? 1, η αποτελεσματική εστίαση γίνεται πολύ μικρότερο από το όριο διάθλασης. Κατά συνέπεια, σε αντίθεση με τα συμβατικά οπτικά μικροσκόπια φακό με βάση, το ψήφισμα δεν περιορίζεται πλέον από το μήκος κύματος.

sted μικροσκόπιο ως εκ τούτου δανείζει τον εαυτό της ως ένα ισχυρό εργαλείο για να ανοίξει η μέχρι σήμερα σε μεγάλο βαθμό ανεκμετάλλευτες νανοκλίμακας καθεστώς στην αρχειοθετούνται υλικό ανθρώπινο ιστό. Προηγουμένως, έχουν διάφορες τεχνικές υπερ-ανάλυση έχει χρησιμοποιηθεί για να εντοπισμοί πρωτεΐνη εικόνα σε χημικά σταθερό τμήματα vibratome ή κρυοστάτη τομές ιστών ποντικού ή αρουραίου [8] – [10], καθώς και σε τμήματα των πλαστικών ενσωματωμένων ιστών από τρωκτικά που εκφράζουν φθορίζουσες πρωτεΐνες, όπως ετικέτες [11], [12]. Sted μικροσκοπία έχει επίσης χρησιμοποιηθεί για την απεικόνιση ζωντανού ιστού [13] – [15]. Καμία από αυτές τις προσεγγίσεις θα μπορούσαν αμέσως να μεταφερθεί σε καθιερωμένη κλινική διαδικασίες που απαιτούν τυποποιημένες διαδικασίες και τη δυνατότητα για αποθήκευση μακράς διάρκειας δείγμα.

Για να διερευνηθεί εάν sted μικροσκόπιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να απεικονίσει τις διανομές πρωτεΐνη σε παραφίνη-ενσωματωμένες ιστού, εμείς μεταχειρισμένα αρχειοθετηθεί ορθού καρκινικό ιστό που είχαν υποστεί εκτομή κατά την διάρκεια τυποποιημένων σύνολο mesorectal εκτομή (TME-χειρουργική) και αποθηκεύτηκε σε θερμοκρασία δωματίου για έως 17 χρόνια σε μια κλινική αποθετήριο παθολογία. Αυτός ο ιστός επελέγη για τη μελέτη αυτή επειδή με μια συνεχώς αυξανόμενη συχνότητα, ορθοκολικό καρκίνο έχει καταστεί μία από τις τρεις πιο συχνές μορφές καρκίνου στο δυτικό κόσμο [16]. Το ένα τρίτο των καρκίνων του παχέος εντέρου είναι του ορθού και παρά της προόδους στη διάγνωση και τη θεραπεία της πολυτροπικότητας χρησιμοποιώντας προεγχειρητική (εισαγωγική) χημειοραδιοθεραπεία που ακολουθείται από εκτεταμένη ογκολογική TME-χειρουργική, η μακροπρόθεσμη πρόγνωση των ασθενών με τοπικά προχωρημένο καρκίνο του ορθού περιορίζεται από το εμφάνιση απομακρυσμένων μεταστάσεων σε σχεδόν 30% των ασθενών [17] – [19]

Απελευθέρωση της σηματοδότησης μέσω του υποδοχέα του ανθρώπινου επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (HER? επίσης γνωστή ως ERBB) οικογένεια πρωτεϊνών έχει ένα περίπλοκο ρόλο. η παθογένεση των πολυάριθμων ανθρώπινων καρκίνων [20]. Πρόσφατα, αποδείχθηκε ότι HER2 υπερεκφράζεται σε περίπου 30% της πρωτογενούς τοπικά προχωρημένο ορθού αδενοκαρκίνωμα, κλινικά ανέβηκε ως Ένωση για τη Διεθνή Έλεγχο του Καρκίνου (UICC) στάδια ΙΙ και ΙΙΙ [21]. Λίγα είναι γνωστά σχετικά με το υποκυτταρικό εντοπισμό του HER2 σε ιστούς όγκων.

Σε αυτό το χειρόγραφο ερευνήσαμε τη δυνατότητα οπτικοποίησης τη διανομή νανοκλίμακα των HER2 και άλλων πρωτεϊνών χρησιμοποιώντας sted μικροσκόπιο υπερ-ανάλυση σε αρχειοθετημένα ορθού καρκινικό ιστό. Έχουμε αποδείξει ότι ακόμη και ιστοί αποθηκεύονται για περισσότερο από μια δεκαετία στην κλινική αποθετήριο είναι δεκτικά για sted απεικόνισης υπερ-ανάλυση.

Αποτελέσματα

φθορισμού μικροσκόπιο των λεπτών τομών

HER2 θετικό ορθού ιστού καρκινώματος, αρχειοθετούνται μετά την καθήλωση φορμόλης και παραφίνη εμπέδωσης, ήταν χωρισμένο σε 2 μm χοντρές φέτες. Οι τομές ιστών αποκηρώθηκαν και σε θερμική επεξεργασία για 45 λεπτά για ανάκτηση αντιγόνου [22]. Μετά από αυτό, οι τομές χρωματίστηκαν με ϋΑΡΙ να αναδείξει τους πυρήνες και διακοσμημένα με αντιορούς έναντι της εσωτερικής μεμβράνης πρωτεΐνη HER2 και έναντι της μιτοχονδριακής πρωτεΐνης εξωτερικής μεμβράνης Tom20, ένα ουσιαστικό πρωτεΐνη που εκφράζεται σε όλα τα ανθρώπινα κύτταρα. Ομοεστιακό μικροσκόπιο κατέδειξε την ισχυρή έκφραση του HER2 στον ιστό του όγκου, ενώ τα φυσιολογικά κύτταρα που περιβάλλουν στρώμα δεν εκφράζουν σχετικό ποσό του HER2 (Σχήμα 1). Μιτοχονδριακή μάζα ήταν υψηλότερη στα κακοήθη κύτταρα και κατά συνέπεια Tom20 ήταν πιο άφθονη, αν και, όπως ήταν αναμενόμενο, τα σήματα Tom20 ήταν επίσης ανιχνεύσιμη στα φυσιολογικά κύτταρα στρώματος. Επίσης, το σήμα DAPI ήταν αναγνωρίσιμη τόσο σε καρκινικά κύτταρα και φυσιολογικό ιστό. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η επισήμανση multi-χρώμα ανοσοφθορισμό και συνεστιακή μικροσκοπία είναι εφικτή για αρχειοθετούνται συστηματικά επεξεργασία κλινικών παραφίνη-ενσωματωμένες ιστού.

Ομοεστιακή επισκόπηση της εικόνας μιας περιοχής ενός θετικού HER2 τμήμα ορθού ιστού επισημαίνονται με DAPI (μπλε) για να τονίζουν τους πυρήνες και διακοσμημένα με αντιορούς έναντι Tom20 (φωτιά) και HER2 (πράσινο). (Α) επικάλυψης, (Β) Tom20, και (Γ) HER2. Ράβδοι κλίμακας:. 25 μm

Η

Διαρθρωτικά διατήρηση σε νανοκλίμακα

Η οπτική ανάλυση των συμβατικών ομοεστιακό μικροσκόπιο περιορίζεται από την περίθλαση σε -200 nm στην αξονική αεροπλάνο, συχνά κρύβει πολύτιμες πληροφορίες . Ιστούς παραφίνης που φέρεται να παρουσιάζει έντονη αυτοφθορισμό [23] και, αν και η εφικτή δομική διατήρηση παραφίνης σε παραφίνη ιστός είναι επαρκής για το συμβατικό μικροσκόπιο φωτός (Σχήμα 1? [24]), αρχειοθετούνται ιστούς μπορεί να είναι ακατάλληλη για να ανταποκριθεί στις υψηλές απαιτήσεις της περίθλασης απεριόριστη μικροσκόπιο υπερ-ανάλυση. Για να διερευνηθεί εάν συνήθως σε επεξεργασία αποθηκεύονται εγκλεισμένο σε παραφίνη κλινική ανθρώπινο ιστό είναι κατάλληλο για sted μικροσκοπία, αποφασίσαμε να αναλύσουμε υπο-μιτοχονδριακή κατανομές πρωτεΐνης στα μιτοχόνδρια. Αυτά τα οργανίδια προκλητική κυτταρικές δομές για μικροσκοπία υπερ-ανάλυση λόγω του μικρού μεγέθους τους, σύνθετη εσωτερική οργανιδιακά αρχιτεκτονική τους και την πολύ πυκνή συσκευασία των πρωτεϊνών στα μιτοχονδριακών μεμβρανών [25]. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήσαμε εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό ορθού καρκίνου που αποθηκεύτηκε για περίπου 1 έτος σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα κλινικό αρχείο παθολογία. Τομές ιστού που περιέχει μία διαμήκη τομή του εσωτερικού κυκλικού μυός στρώμα του ορθού (

Muscularis εξωτερική

) έχουν διακοσμηθεί με αντιορούς έναντι τεσσάρων διαφορετικών μιτοχονδριακών πρωτεϊνών: Tom20, ένα περιφερειακό υποδοχέα της μεταθετάσης ΤΟΜ στη μιτοχονδριακή εξωτερικής μεμβράνης? Mic60 (mitofilin), ένα συστατικό του συμπλέγματος MINOS εντοπισμένη προτίμηση στις διασταυρώσεις ακρολοφίες στην εσωτερική μεμβράνη? ακονιτάση, ένα ένζυμο μήτρα του κύκλου τρικαρβοξυλικού οξέος καταλύει τον ισομερισμό του κιτρικού να ισοκιτρικό? και κυκλοφιλίνη Α, μια ισομεράση πεπτιδυλπρολύλ εντοπίζεται στη μιτοχονδριακή μήτρα.

Η μιτοχόνδρια στα

Muscularis εξωτερική

αποτελούν μεγάλο επίμηκες σωληναρίων. Όταν τα τεμάχια ιστού κόπηκαν κατά μήκος του διαμήκη άξονα των εκτομή ορθού δείγμα, η πλειοψηφία των οργανιδίων τεντώθηκε έξω μέσα στο επίπεδο τμήμα (Εικόνα 2Α). Σε ένα μεγάλο sted εικόνα μεγέθους 120 μm χ 100 μm, Tom20 έδειξε μία διακριτή εντοπισμό στικτή εντός των μιτοχονδρίων (Εικόνα 2Α), το οποίο είναι σε πλήρη συμφωνία με προηγούμενες μελέτες που χρησιμοποιούν διάφορες μορφές μικροσκοπία υπερ-ανάλυση σε καλλιεργημένα κύτταρα θηλαστικών [26] , [27]. Η επίτευξη ανάλυση, όπως καθορίζεται στο φόντο-clusters, ήταν σταθερά ~ 40 nm σε όλα τα εγγεγραμμένα τμήματα ιστού (Σχήμα S1). Ενώ την αντίστοιχη καταγραφές συνεστιακή οι κατανομές των Tom20, Mic60, ακονιτάση και κυκλοφιλίνη D ήταν σχεδόν δυσδιάκριτες, η υψηλότερη ανάλυση που παρέχεται από το μικροσκόπιο sted απέδειξε διαφορές στην υπο-μιτοχονδριακή κατανομές των αντίστοιχων πρωτεϊνών (Σχήμα 2Β-Ε). Tom20, ακονιτάση και κυκλοφιλίνη Α γενικά βρίσκεται σε ομοιόμορφα κατανεμημένη ομάδες, αν και σε διαφορετικές ποσότητες. Τμήματα διακοσμημένο με αντιορό κατά κυκλοφιλίνη Α παρουσίασαν το πυκνότερο ομαδοποίησης (Σχήμα 2Ε), ενώ ένας αντιορός κατά ακονιτάση είχε ως αποτέλεσμα την επισήμανση των αραιών συστάδων (Σχήμα 2D). Όπως φαίνεται προηγουμένως για Mic60 σε καλλιεργημένα κύτταρα [28], αυτή η πρωτεΐνη φαίνεται να έχει επίσης μια πιο παραγγείλει διανομής σε ανθρώπινο ιστό (Σχήμα 2C). Η συνολική υπο-μιτοχονδριακή διανομή των αντίστοιχων πρωτεϊνών στον ιστό ήταν συγκρίσιμη με τον εντοπισμό παρατηρήθηκε σε καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα (Σχήμα S2).

sted καταγραφές διεξήχθησαν σε 2 μm πάχους τομές αποκηρωμένο κοπεί κατά μήκος του διαμήκους άξονα του το ορθό. (Α) Αριστερά: sted επισκόπηση εικόνα μιας περιοχής του εσωτερικό κυκλικό στρώμα του ορθού

Muscularis εξωτερική

διακοσμημένο με αντιορό έναντι Tom20. Δεξιά: μεγεθύνσεις των περιοχών που υποδεικνύονται διακεκομμένες πλατείες που δείχνει την κατανομή των συστάδων TOM εντός των μιτοχονδρίων. (Β-Ε) sted εικόνες των τομών ιστού διακοσμημένα με αντιορούς έναντι Tom20 (Β), Mic60 (mitofilin) ​​(C), ακονιτάση (D), και κυκλοφιλίνη D (Ε). Σε κάθε πίνακα η συνεστιακή (κορυφή, αριστερά) και η αντίστοιχη sted εικόνα (πάνω δεξιά) θα εμφανιστεί. Κάτω: Η μεγέθυνση της εικόνας sted όπως υποδεικνύεται από μία διακεκομμένη τετράγωνο. Σημειώστε τις διαφορετικές διανομές των τεσσάρων πρωτεϊνών εντός των μιτοχονδρίων. Ράβδοι κλίμακας: 20 μm (Α, αριστερά)? 1 μm (Α, δεξιά) και (Β-Ε, άνω μέρος)? 200 nm (Β-Ε, κάτω).

Η

Στο σύνολό τους, τα στοιχεία αυτά υποδηλώνουν μια επαρκή δομική συντήρηση ρουτίνας κλινικής παραφίνη-ενσωματωμένες ιστού που τυγχάνουν αυτό για χρήση σε sted μικροσκόπιο υπερ-ανάλυση.

sted υπερ-ανάλυση μικροσκοπία του HER2 επισημασμένου ορθού καρκινικό ιστό

για να αξιολογηθεί το όφελος της sted μικροσκοπία σχέση με τα συμβατικά μικροσκοπία, εμείς ορατή την κατανομή των HER2 σε τμήματα του ορθού ιστού καρκίνου που βαθμολογήθηκε ως HER2 -θετικό βάση την ανοσοχημεία και in situ υβριδισμού [21], [29]. Τρεις διαδοχικές 2 μm πάχους τμήματα του εγκλεισμένο σε παραφίνη ιστό κόπηκαν και αντιμετωπίζονται με τον ίδιο για αποκήρωση και ανάκτησης αντιγόνου. Τα τρία τμήματα καλύπτουν την ίδια περιοχή, επιτρέποντας να συγκρίνουν άμεσα τις ιδιότητες των διαφόρων διαδικασιών χρώσης. Το πρώτο τμήμα κηλιδώνεται με μία πρότυπη κλινική αιματοξυλίνης-Ηωσίνη (ΗΕ) διαδικασία. Ως αποτέλεσμα, οι πυρήνες χρωματίστηκαν με μπλε, ενώ το κυτταρόπλασμα και το εξωκυτταρικό πλέγμα εμφανίστηκε σε διάφορες αποχρώσεις του ροζ (Εικόνα 3Α). Τα άλλα δύο τμήματα ήταν διακοσμημένα με έναν αντιορό εναντίον HER2, αλλά με διαφορετικά δευτερεύοντα αντισώματα. Για τις τυπικές ανοσοϊστοχημεία, χρησιμοποιήσαμε ένα δευτερεύον αντίσωμα συζευγμένο με υπεροξειδάση, καταλύει την οξείδωση της 3, 3′-διαμινοβενζιδίνη, με αποτέλεσμα ένα καφέ ίζημα (Σχήμα 3Β). Για μικροσκοπία φθορισμού, δευτερογενή αντισώματα σημασμένα με το κόκκινο φθορίζον βαφή KK114 [30] που χρησιμοποιείται (Εικόνα 3C).

Σημειώστε ότι οι τρεις διαδοχικές τομές καλύπτουν την ίδια περιοχή στον ιστό. Οι εικόνες ελήφθησαν με περίθλαση περιορισμένη Widefield (Α, Β) ή ομοεστιακή (C) μικροσκοπία. (D, Η) και (Ε, Ι): που αντιστοιχεί μεγεθύνσεις από (Β) και (C), αντίστοιχα, σε θέσεις που υποδεικνύεται από τα βέλη. (F, G, J, K): σύγκριση περίθλαση περιορισμένη συνεστιακή μικροσκοπία με sted μικροσκοπία υπερ-ανάλυση επί τομή αποθηκεύονται καρκινικό ιστό. Ορατή είναι μεγεθύνσεις των περιοχών που υποδεικνύεται από τις διακεκομμένες τετράγωνα. Top-δεξιά γωνίες: συνεστιακής απεικόνισης. Αριστερά-κάτω περιοχή: sted απεικόνισης. Τα βέλη δείχνουν προς κύστη-όπως δομές HER2-θετικό που επιλύονται στις εικόνες sted. Ράβδοι κλίμακας:. 1 mm (A-C), 50 μm (D, E, H, I), 2 μm (F, J), και 500 nm (G, Κ)

Η

Η HE χρώση παρέχει μια επισκόπηση του ιστού, ενώ οι εικόνες ανοσοϊστοχημεία και ανοσοφθορισμού δείχνουν ισχυρή έκφραση HER2 στα καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι στον περιβάλλοντα μη κακοήθη στρώμα ιστού. Στη συνέχεια, σε σύγκριση με τη χρώση ανοσοϊστοχημείας με την επισήμανση ανοσοφθορισμού όπως καταγράφεται από συνεστιακή και sted μικροσκόπιο (Εικόνα 3Β-K). Για το σκοπό αυτό, επιλέξαμε αντίστοιχες περιοχές στα δύο διαφορετικά σημασμένα τμήματα ιστών. Ενώ οι εικόνες ομοεστιακό της επισήμανσης ανοσοφθορισμού παρέχουν μια μεγαλύτερη αντίθεση και οι μεμβράνες είναι πιο απότομα οριοθετείται όπως στις εικόνες της χρώσης ανοσοϊστοχημεία, το συνολικό περιεχόμενο πληροφοριών εμφανίζεται συγκρίσιμες (Σχήμα 3D, E, H, I). Πιθανώς, η εικόνα εμφανίζεται ανοσοφθορισμό ευκρινέστερη, διότι στην περίπτωση της ανοσοϊστοχημείας η επιτεύξιμη ανάλυση τελικά περιορίζεται από την διάχυση του καφέ ίζημα. Και οι δύο προσεγγίσεις αποδεικνύουν ότι HER2 βρίσκεται κυρίως στη μεμβράνη του ορθού καρκινικών κυττάρων του πλάσματος. Sted μικροσκοπία επιτρέπει την οπτικοποίηση των πρόσθετες λεπτομέρειες, τα οποία αποκρύπτονται στα ομοεστιακή εικόνες περίθλασης-περιορισμένη (Σχήμα 3F, G, J, Κ? Σχήμα S3). Η sted εικόνα δείχνει σαφώς ~ 450 nm μεγέθους HER2 θετικό κυστίδια όπως δομές, η οποία μπορεί να οφείλεται σε HER2 εσωτερίκευσης. Οι εικόνες sted προτείνουν ακόμη και την ύπαρξη των επιμέρους σχηματισμών πρωτεΐνη HER2, που κρύβονται πλήρως στις συμβατικές εικόνες περίθλασης περιορισμένη.

Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η υπο-κυτταρική κατανομή του HER2 μπορεί να απεικονιστεί σε τμήματα του αρχειοθετημένα κλινική παραφίνης -embedded ορθού καρκινικούς ιστούς. Sted μικροσκόπιο αποκαλύπτει δομικές λεπτομέρειες, συμπεριλαμβανομένων των HER2 θετικό κύστη-όπως δομές στο αποθηκευμένο υλικό που είναι θολή όταν χρησιμοποιούν state-of-the-art συμβατική μικροσκοπία φωτός.

sted μικροσκόπιο super-ψήφισμα για αρχειοθετημένα κλινικό υλικό μετά από μακρά -Term αποθήκευσης

το δυναμικό της υπερ-ανάλυση μικροσκοπίας σε παραφίνη-ενσωματωμένες ιστού μπορεί να εξερευνηθεί μόνο ευρέως αν η μέθοδος θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε πρότυπο κλινικά δείγματα που είναι αποθηκευμένα σε πολυάριθμες κλινικές αρχεία σε όλο τον κόσμο. Για να προσδιοριστεί η επίδραση της παρατεταμένης αποθήκευσης για την χρηστικότητα του αρχειοθετημένων ιστού για μικροσκοπία sted, χρησιμοποιήσαμε εγκλεισμένοι σε παραφίνη, πρωκτική καρκινικούς ιστούς που αποθηκεύθηκαν σε θερμοκρασία δωματίου σε ένα συνήθη κλινική αρχείο παθολογίας για έως 17 χρόνια. Οι ιστοί εμπεδωθεί με παραφίνη υπέστησαν προκαταρκτική κατεργασία όπως προηγουμένως και επισημάνθηκαν με αντισώματα έναντι της μιτοχονδριακής πρωτεΐνης Tom20 (Σχήμα 4). Βρήκαμε ότι ακόμα και 17 ετών ιστός θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την επισήμανση ανοσοφθορισμού, αν και με αυξανόμενη την αποθήκευση φορά η φωτεινότητα των σημασμένων τμημάτων μειώθηκε, αντανακλώντας προφανώς μείωση προσβάσιμων επιτόπων στα ηλικίας δείγματα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, ακόμα και στο παλαιότερο δείγμα ιστού, μεμονωμένες συστάδες Tom20 θα μπορούσε να επιλυθεί με sted μικροσκόπιο, οι οποίες δεν είχαν διακριτό στις αντίστοιχες αντίστοιχη συνεστιακή εικόνες περίθλασης περιορισμένη, αποδεικνύουν ότι ακόμη και δεκαετίες παραφίνη-ενσωματωμένες ανθρώπινοι ιστοί είναι δεκτικά για sted υπερ-ανάλυση μικροσκοπία.

Αντιπροσωπευτικές εικόνες ιστών όγκου αποθηκεύονται σε θερμοκρασία δωματίου για λιγότερο από 1 έτος (Α), 11 ετών (Β) ή 17 έτη (C), κόπηκαν σε τομές, αποκηρωμένα, διακοσμημένο με ένα αντιορό έναντι Tom20 και απεικόνιση. Αριστερά: Εκπρόσωπος ομοεστιακό εικόνες. Το ίδιο πίνακα χρωμάτων χρησιμοποιήθηκε για τις τρεις εικόνες, προκειμένου να απεικονίσει τις σχετικές αποτελεσματικότητες χρώση. Μέση /Δεξιά: Σύγκριση των sted (μέση) και συνεστιακή (δεξιά) μικροσκοπία των τμημάτων ιστού διαφορετικής ηλικίας. Εδώ, οι πίνακες χρωμάτων προσαρμόστηκαν στις εντάσεις σήματος που λαμβάνονται. Ράβδοι κλίμακας:. 10 μm (αριστερά) και 1 μm (μέση, δεξιά)

Η

Συζήτηση

καρκινικό ιστό εκτομή κατά τη διάρκεια ογκολογική χειρουργική επέμβαση είναι πολύ σημαντικό για τη διάγνωση. Για ανάλυση ρουτίνας, τα επίπεδα έκφρασης των ειδικών βασικών πρωτεϊνών είναι γενικά προσδιορίζεται με τον όγκο ή κυτταρικό επίπεδο. Πρωτεΐνες, ωστόσο, εκτελούν τις λειτουργίες τους σε τοπικό επίπεδο, και ως εκ τούτου η κατανομή νανοκλίμακα βασικών πρωτεΐνες μπορεί να περιέχουν πολύτιμα υπογραφές, οι οποίες μέχρι στιγμής δεν έχουν εξεταστεί για την κλινική διάγνωση. Στην παρούσα μελέτη δείξαμε ότι sted μικροσκοπία υπερ-ανάλυση είναι κατάλληλη για να αποκαλύψει νανοκλίμακα διανομές πρωτεΐνης σε ιστούς που αποθηκεύονται για δεκαετίες στο biorepositories, ανοίγοντας έτσι το νανοκλίμακας σε αυτά τα δείγματα.

Υπάρχει ένα τεράστιο και ταχέως αναπτυσσόμενη ποσότητα δείγματα ιστού αποθηκεύονται σε διάφορες βιοτράπεζες. Biospecimen ποιότητα θεωρείται ως ένα κρίσιμο ζήτημα [2], [31] και την ποιότητα του δείγματος θα είναι επίσης κρίσιμη για τα δεδομένα που μπορούν να εξαχθούν με μικροσκοπία υπερ-ανάλυση. Παρ ‘όλα αυτά, λόγω πρακτικών περιορισμών, η δομική συντήρηση του δείγματος εκτομή κατά τη συνήθη χειρουργική επέμβαση είναι απίθανο να έχουν το επίπεδο ποιότητας που είναι εφικτό υπό αυστηρά ελεγχόμενες εργαστηριακές συνθήκες. Υπάρχουν περαιτέρω δυνατότητες, αν και προφανώς υπερνικηθούν, τις προκλήσεις, συμπεριλαμβανομένης της ποιότητας και της διαθεσιμότητας των κατάλληλων αντισωμάτων και την πρόκληση να συνδυάσει στοιχεία απεικόνισης, για παράδειγμα, μεταβολικές υπογραφές των δειγμάτων. Οραματιζόμαστε ότι οι μελλοντικές εξελίξεις στον τομέα υπερ-ανάλυση, συμπεριλαμβανομένου του παραλληλισμού της λήψης εικόνας [32], [33], καθώς και αυτοματοποιημένη ανάλυση εικόνας θα επιτρέψει κλίμακας ανάλυση των biobanked ιστών με τη χρήση τεχνικών sted και άλλες υπερ-ανάλυση μεγάλο.

Υλικά και Μέθοδοι

ηθική Δήλωση

Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή ιατρικής δεοντολογίας του Πανεπιστημίου του Γκέτινγκεν (28 του Ιουνίου, 2006? # 9/8 /08). Η προέλευση των συγκεκριμένων δειγμάτων χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη έχει περιγραφεί σε προηγούμενη δημοσίευση [21].

καθήλωσης ιστών και ενσωμάτωση

Φρέσκο ​​εκτομή ιστού ορίστηκε σε 4,5% ρυθμιστικό διάλυμα φορμόλης (Θ. Geyer, Renningen, Γερμανία) σε θερμοκρασία δωματίου για 12 έως 24 ώρες. Το σταθερό ιστός εμπεδώθηκε σε παραφίνη αυτομάτως (Süsse Labortechnik, Gudensberg, Γερμανία) χρησιμοποιώντας έναν επεξεργαστή ιστών (Leica ASP 300? Leica Biosystems, Wetzlar, Germany). Τα μπλοκ παραφίνης ήταν αποθηκευμένα στο σκοτάδι σε θερμοκρασία δωματίου.

Προετοιμασία των διαφανειών ιστού

μπλοκ παραφίνης ψύχεται στους -10 ° C σε μια πλάκα ψύξης (ΔΔΟ Medical AG, Κολωνία, Γερμανία ). Τα ψυχθέντα μπλοκ παραφίνης κόπηκαν σε 2 μm τομές πάχους του ιστού με μικροτόμο (ΗΜ 430, microM International, Walldorf, Γερμανία) και μεταφέρεται με μια βούρτσα μέσα σε νερό σε θερμοκρασία δωματίου πριν να τοποθετηθεί πάνω σε γυάλινες πλάκες. Να τεντώσει το χωρισμένο δείγματα ιστού, τα γυάλινα πλακίδια τοποθετήθηκαν πάνω σε ένα τραπέζι θέρμανσης (MEDAX, Kiel, Germany) στους 37 ° C και ξηραίνεται σε θέρμανση επωαστήρα στους 37 ° C όλη τη νύκτα.

αποκήρωση

Τα αποξηραμένα πλάκες αποπαραφινοποιήθηκαν με ξυλόλιο (2 χ 8 λεπτά) που ακολουθείται από μια σειρά φθίνουσα συγκεντρώσεις αλκοόλης (2 × 2 min 100% EtOH, 2 × 2 λεπτά 96% EtOH, 1 × 2 λεπτά 75% EtOH) και τέλος ξεπλένονται 3 φορές στο νερό.

Automated ανοσοϊστοχημεία

Τυποποιημένα ανοσοϊστοχημική χρώση πραγματοποιήθηκε σε ένα σημείο αναφοράς Ventana XT ανοσοκηλιδωτή (Ventana, Ventana Medical Systems, Mannheim, Germany). Χρησιμοποιώντας την ανοσοκηλιδωτή, η ανάκτηση θερμότητας επίτοπο διεξήχθη αυτομάτως σε τομές ιστών σε CC1 (Cell Conditioning 1 διάλυμα, Ventana Medical Systems, Mannheim, Germany) διάλυμα για 60 λεπτά στους 100 ° C. Στη συνέχεια, οι τομές ιστών επωάστηκαν με αυτόματα η οδός της αντι-HER-2 /neu (4B5) μονοκλωνικό αντίσωμα κουνελιού στους 37 ° C για 32 λεπτά. Στη συνέχεια, οι τομές είναι διακοσμημένα με δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση αρμορακίας και χρωματίστηκαν με 3,3′-διαμινοβενζιδίνη (DAB ultraView καθολική Detection Kit? Ventana Medical Systems, Mannheim, Germany). Όπως αντιχρωστική, το αντιδραστήριο αντιχρωστική αιματοξυλίνη II (Ventana Medical Systems, Mannheim, Germany) χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση των πυρήνων. Τέλος, τα πλακίδια αντικείμενο ήταν χειροκίνητα αφυδατώθηκαν σε μια σειρά από αύξουσα αλκοολικού συγκεντρώσεις (2 χ 1 min 75% EtOH, 2 χ 1 min 96% EtOH, 2 χ 1 min 100% EtOH) με μια τελική 2 λεπτά επώαση σε Ξυλόλη. Τα πλακίδια τοποθετούνται σε Vitro-clud (Langenbrinck, υπεβλήθησαν und Medizintechnik, Emmending, Germany). Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για το Σχήμα 3Β, D, Η.

Manual αιματοξυλίνη και ηωσίνη (ΗΕ) χρώση

HE χρώση πραγματοποιήθηκε σε τομές του αποπαραφινωθείσες ιστού. Οι πλάκες ιστού ξεπλύθηκαν σε νερό και στη συνέχεια βυθίζεται σε διάλυμα Hemalum (Carl Roth GmbH + Co. KG, Καρλσρούη, Γερμανία) για 10 λεπτά. Για να επιτραπεί η ανάπτυξη του κυανού χρώματος των χρωματισμένων πυρήνων, τα πλακίδια ιστού ξεπλύθηκαν σε καρτέλα νερό για 10 λεπτά. Ακολούθως, τα δείγματα βάφτηκαν αντίθετα για 30 δευτερόλεπτα σε ένα διάλυμα Ηωσίνη (1% Εοσίνης σε 37.5% EtOH, Merck Millipore), ξεπλύθηκε σε καθαρό H

2Ο και αφυδατώνονται σε μια σειρά από αύξουσα αλκοολικού συγκεντρώσεις (2 χ 1 min 75% EtOH, 2 χ 1 min 96% EtOH, 2 χ 1 min 100% EtOH) με μια τελική 2 λεπτά επώαση σε Ξυλόλη. Τα πλακίδια τοποθετούνται σε Vitro-clud (Langenbrinck, υπεβλήθησαν und Medizintechnik, Emmending, Germany). Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιήθηκε για το Σχήμα 3Α.

Εγχειρίδιο ανάκτησης αντιγόνου

Τμήματα μεταφέρθηκαν σε ένα θάλαμο διαφάνεια, βυθίζεται σε διάλυμα CC1 (Cell Conditioning 1 λύση, Ventana Medical Systems, Mannheim, Germany) και στη συνέχεια θερμάνθηκε για 45-60 λεπτά στους 100 ° C σε ατμιστή (Multi Gourmet συν, Braun, Kronberg, Γερμανία). Μετά την ψύξη για 20 λεπτά, τα πλακίδια ξεπλύθηκαν σε νερό.

Manual ανοσοσήμανση

Οι τομές δεσμεύτηκαν με 5% ή 10% (β /ο) BSA σε PBS (137 mM NaCl, 3 mM ΚΟΙ, 8 mM Να

2HPO

4, 1,5 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4, ρΗ 7.4) για 5 λεπτά και επωάστηκαν για 1 ώρα με την παθολογική οδό μονοκλωνικό αντίσωμα πρωτογενούς κουνελιού αντι-HER-2 /neu (4B5) (Ventana Medical Systems, Mannheim, Γερμανία? Αριθμός Καταλόγου: 790-2991) (αραίωση: 1: 50), πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού έναντι Tom20 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA? sc-11415) (αραίωση: 1:200), πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι Mic60 /mitofilin (Abcam, Cambridge, Ηνωμένο Βασίλειο? ab48139) (αραίωση: 1:200), πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού που κατευθύνονται έναντι ακονιτάση (Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA? HPA001097) (αραίωση: 1:400) ή μονοκλωνικά αντισώματα έναντι κυκλοφιλίνης D (που ονομάζονται επίσης κυκλοφιλίνης 3 ή κυκλοφιλίνης F? Abcam, Cambridge, UK? ab110324) (αραίωση: 1:400), αντίστοιχα, σε RT. Τα πρωτογενή αντισώματα ανιχνεύτηκαν με δευτερογενή αντισώματα (αντι-ποντικού προβάτου ή κατσίκας αντι-κουνελιού? Jackson ImmunoResearch Laboratories) έθιμο επισήμανση με την κόκκινη βαφή που εκπέμπει KK114 [30] (αραίωση: 1:200) ή ένα δευτερογενές αντίσωμα (προβάτου αντι-ποντικού ? Dianova, Αμβούργο, Γερμανία) έθιμο επισημαίνονται με την κίτρινη χρωστική ουσία που εκπέμπει Atto532 (ATTO-TEC, Siegen, Γερμανία) (αραίωση: 1:100). Μετά ανοσοϊστοχημικής, τα δείγματα ιστού στερεώθηκαν σε Mowiol συμπληρωμένο με 0.1% (βάρος /όγκο) DABCO (1,4-διαζαδικυκλο [2.2.2] οκτάνιο? Sigma Aldrich, St. Louis, ΜΟ, USA) και 2.5 μg /mL ϋΑΡΙ (4 ‘, 6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη? Sigma-Aldrich).

Μικροσκοπία

Όλες οι εικόνες που εμφανίζονται αντιπροσωπεύουν αντιπροσωπευτικό εικόνες. Τμήματα από περισσότερα από 10 διαφορετικά μπλοκ παραφίνης αναλύθηκαν, επίμονα παρέχουν παρόμοια αποτελέσματα. Οι τομές χρωματίστηκαν ανοσοϊστοχημεία-και ΗΕ-χρώση ιστού απεικονίστηκαν με ένα Axio Imager 2 εφοδιασμένο με Axio-Cam MRC (Zeiss, Jena, Germany). Για συνεστιακή μικροσκοπία, μια Leica TCS SP5 μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε (Leica Microsystems, Wetzlar, Γερμανία). Για sted και η αντίστοιχη συνεστιακή μικροσκοπία, ένα έθιμο χτίστηκε sted μικροσκόπιο χρησιμοποιήθηκε [26], [34]. επιτεύχθηκε Μια ανάλυση των -250 nm στα συνεστιακή εικόνες και ~ 40 nm στις εικόνες sted. Η ανάλυση προσδιορίστηκε μετρώντας το πλήρες πλάτος στο ήμισυ μέγιστο (FWHM) στην χ και του άξονα y επί περισσότερα από 100 συστάδες φόντο, οι οποίες απορρέουν από πιθανώς καταβυθίζεται δευτερογενή αντισώματα. Απεικόνιση εκτελέσθηκε ουσιαστικά όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26], [34]. Εκτός από την αντίθεση που εκτείνεται καμία περαιτέρω επεξεργασία εικόνας εφαρμόστηκε.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Μετρημένες διάμετρος των συστάδων φόντο που λαμβάνονται από το Σχήμα 2. (α) το πλήρες εύρος στο μέγιστο ήμισυ (FWHM) σε όλο το χ και τους άξονες y περισσότερων από 100 μεμονωμένες συστάδες προσδιορίστηκε. Σημειώστε ότι αναλύθηκαν επίσης συστάδες φόντο που ήταν σωματικά μεγαλύτερα από την ανάλυση του μικροσκοπίου. Ως εκ τούτου, η καθορίστηκε μέση FWHM μπορεί να είναι χειρότερη από την πραγματική ανάλυση του μικροσκοπίου που χρησιμοποιείται. (Β) Εκπρόσωπος συστάδες φόντο. bar Κλίμακα: 100 nm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101563.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Υπο-μιτοχονδριακή κατανομές πρωτεΐνης σε καλλιεργημένα ανθρώπινα κύτταρα καταγράφηκαν με sted (αριστερά) και συνεστιακή (δεξιά) μικροσκόπιο. Λεπτομέρεια των μιτοχονδρίων είναι διακοσμημένα με αντιορούς έναντι Tom20 (Α), ακονιτάση (Β), Mic60 /mitofilin (C), ή κυκλοφιλίνη D (D). Ανθρώπινα πρωτογενείς ινοβλάστες (A, C) ή U2OS (ανθρώπινο οστό οστεοσαρκώματος επιθηλιακά κύτταρα) (Β, D). Ράβδοι κλίμακας: 500 nm

doi:. 10.1371 /journal.pone.0101563.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3. Το προφίλ

Γραμμή μέσω μιας περιοχής που λαμβάνονται από το Σχήμα 3F. Η υπερ-ανάλυση sted εικόνα (Α) αποκαλύπτει HER2 θετικό κύστη-όπως δομές που είναι θολή στο αντίστοιχο ομοεστιακό εικόνα (Β). (C) Κανονικοποιημένη φθορισμού προφίλ ένταση του σήματος κατά μήκος τις υποδεικνυόμενες γραμμές στην sted (κόκκινο) και τα (μαύρο) εικόνες συνεστιακού. Το διάγραμμα διασποράς δείχνει τα σήματα φθορισμού κατά μέσο όρο πάνω από 3 συνεχόμενα προφίλ ένταση. Οι συνεχείς γραμμές αντιπροσωπεύουν τις αντίστοιχες κρίσεις χρησιμοποιώντας μια συνάρτηση Lorentz. μπαρ κλίμακα:. 500 nm

doi: 10.1371 /journal.pone.0101563.s003

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Είμαστε υπόχρεοι προς τον Stefan W. κόλαση για συζητήσεις και υποστήριξη. Ευχαριστούμε Jaydev Jethwa για κριτική ανάγνωση του χειρογράφου και Birgit Jünemann και Hanna styczeń από το Τμήμα Γενικής, σπλαγχνική και Παιδοχειρουργικής, για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια και τις αναλύσεις του προτύπου χρώσεις ιστού.