Αφηρημένο

Ιστορικό

Οι PTEN φωσφατάση πράξεις για φωσφατιδυλινοσιτόλη 3,4,5-τριφωσφορικά που προκύπτουν από φωσφατιδυλοϊνοσιτόλης 3-κινάση (PI3K) ενεργοποίηση. ΡΤΕΝ έκφρασης έχει αποδειχθεί ότι είναι μειωμένη σε καρκίνο του παχέος εντέρου. Λίγα είναι γνωστά, ωστόσο, όπως στην ειδική κυτταρική ρόλο της ΡΤΕΝ σε ανθρώπινα εντερικά επιθηλιακά κύτταρα. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει το ρόλο της PTEN σε ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Caco-2/15, HCT116 και CT26 κύτταρα μολύνθηκαν με ανασυνδυασμένο φακοϊών εκφράζουν ένα shRNA σχεδιαστεί ειδικά για να knock-down PTEN. Ο αντίκτυπος της ΡΤΕΝ αρνητική ρύθμιση αναλύθηκε σε κύτταρο πόλωση και τη διαφοροποίηση, μεσοκυττάρια ακεραιότητα διασταύρωση (έκφραση των πρωτεϊνών προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, λειτουργία φραγμού), μετανάστευση (δοκιμασία τραύματος), εισβολή (matrigel επικαλυμμένα transwells) και επί του σχηματισμού όγκων και μεταστάσεων σε ποντίκια . ανάλυση ηλεκτρονικό μικροσκόπιο έδειξε ότι λεντοϊού μόλυνση του PTEN shRNA ανέστειλε σημαντικά Caco-2/15 πόλωσης κυττάρων, λειτουργική διαφοροποίηση και σύνορα βούρτσα ανάπτυξης. Μια ισχυρή μείωση της κλαουδίνης 1, 3, 4 και 8 παρατηρήθηκε επίσης, καθώς και τη μείωση της διεπιθηλιακής αντίστασης. Η απώλεια της έκφρασης ΡΤΕΝ αύξησε την εξάπλωση, τη μετανάστευση και την εισβολή των ικανοτήτων του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων

in vitro

. ΡΤΕΝ μειορρύθμιση αύξησε επίσης το μέγεθος του όγκου μετά από υποδόρια ένεση του ορθοκολικού καρκίνου κυττάρων σε γυμνά ποντίκια. Τέλος, η απώλεια της έκφρασης ΡΤΕΝ σε HCT116 και CT26, αλλά όχι σε Caco-2/15 οδήγησε σε αύξηση του μεταστατικού δυναμικού τους μετά τις ενέσεις φλέβα της ουράς σε ποντίκια.

Συμπεράσματα /σημαντικότητα

Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι το ΡΤΕΝ ελέγχει την κυτταρική πολικότητα, την εγκατάσταση του κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις, παρακυτταρικής διαπερατότητας, η μετανάστευση και ογκογόνο /μεταστατικό δυναμικό των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του παχέος

Παράθεση:. Langlois MJ, Bergeron S, Bernatchez G , Boudreau F, saucier C, Perreault Ν, et al. (2010) Το PTEN φωσφατάση Controls εντερικά επιθηλιακά κυττάρων πολικότητα και λειτουργία φραγμού: Ρόλος σε καρκίνο του παχέος εντέρου Εξέλιξη. PLoS ONE 5 (12): e15742. doi: 10.1371 /journal.pone.0015742

Επιμέλεια: Hang Thi Πέμ Nguyen, Πανεπιστήμιο Emory, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 31 Αυγούστου 2010? Αποδεκτές: 22, Νοεμβρίου του 2010? Δημοσιεύθηκε: 23 Δεκεμβρίου του 2010

Copyright: © 2010 Langlois et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα υποστηρίχθηκε από τις καναδικές Ινστιτούτα Ερευνών Υγείας (CIHR: www.cihr-irsc.gc.ca) (CTP-82942) και ΜΤ-14405 (για να NR). N.R. είναι αποδέκτης μιας καναδικής έρευνας πρόεδρος στη σηματοδότηση και του πεπτικού Φυσιοπαθολογία. J.C., C.S. και F.B. είναι επιστήμονες από το Fonds de la Recherche en Santé du Québec. S.B. είναι αποδέκτης μιας μετα-διδακτορική υποτροφία από το Καναδικό Σύλλογο Γαστρεντερολογίας /CIHR /CCFC. N.R., J.C., C.S., Ν.Ρ., και F.B. είναι μέλη της FRSQ που χρηματοδοτούνται «Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel». Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με το θάνατο στις δυτικές χώρες. Ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι η απώλεια της κυτταρικής οργάνωσης. Η ιστολογική βαθμός ορθοκολικά καρκινώματα είναι ένα σημαντικό προγνωστικό μεταβλητή και εξαρτάται από το βαθμό της αδενικής διαφοροποίησης και της κυτταρικής πολικότητας. Υψηλής ποιότητας, χαμηλής διαφοροποίησης του παχέος νεοπλάσματα είναι συνήθως πιο επιθετικοί από τους χαμηλού βαθμού, καλά διαφοροποιημένο ομολόγους [1].

επιθηλιακά κύτταρα, προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου και ακραία-βασική πολικότητα διατηρούνται μέσω του σχηματισμού των διαφόρων συστημάτων ενδοκυτταρικής προσκόλλησης, όπως σφιχτό κόμβους (TJS). Το TJ ρυθμίζει διάχυση παρακυτταρική και λειτουργικά απομονώνει την μεμβράνη του πλάσματος σε δύο διαμερίσματα, το οποίο αποτελεί προϋπόθεση για την πλήρη πόλωση των επιθηλιακών κυττάρων [2]. Τα νεοπλασματικά κύτταρα συχνά παρουσιάζουν δομικές και λειτουργικές ανεπάρκειες τόσο σφιχτό και προσκολλημένα διασταυρώσεις [3] – [5]. Όπως αναθεωρήθηκε από τον Martin και Jiang [4], η έκφραση πολλών σφιχτό πρωτεϊνών διασταύρωση απορρυθμίζεται στην παχέος εντέρου. Η adherens διασταύρωση πρωτεΐνη Ε-καδερίνης επίσης μειωθεί σε επεμβατικές ορθοκολικούς καρκίνους [6]. Επιπλέον, το πρότυπο έκφρασης του hDlg και hScribble, είναι γνωστό ότι ελέγχουν τη δημιουργία του κορυφαίου-βασικής πολικότητας σε επιθηλιακά κύτταρα [7], αλλάζει σημαντικά κατά τη διάρκεια του παχέος εξέλιξης του όγκου με ρύθμιση προς τα κάτω των δύο πρωτεϊνών που συνδέονται με την έλλειψη των επιθηλιακών κυττάρων πολικότητας και αποδιοργανωμένη αρχιτεκτονική ιστού [8].

φωσφοϊνοσιτίδιων έχουν επίσης αναδειχθεί τα τελευταία χρόνια ως γενική καθοριστικούς παράγοντες τόσο της πολικότητας και της ταυτότητας πολλών μεμβρανών. Πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι PtdIns (4,5) P2 αποτελεί καθοριστικό παράγοντα της κορυφαίας επιφάνειας σε επιθηλιακά κύτταρα [9]. Πράγματι, σε μη πολωμένο MDCK κύτταρα, και οι δύο PtdIns (4,5) P2 και PtdIns (3,4,5) P3 αποικίζει τις κυττάρου-κυττάρου και τις επαφές κυττάρου-εξωκυτταρικής μήτρας. Ωστόσο, κατά τα πρώτα στάδια της πόλωσης, PtdIns (4,5) P2 γίνεται ως επί το πλείστον συγκεντρώθηκε σε ακραία μεμβράνη των κυττάρων, ενώ PtdIns (3,4,5) P3 παραμένει εντοπισμένη στην βασεοπλευρική μεμβράνη και αποκλείονται από την ακραία μεμβράνη. Η ΡΤΕΝ λιπίδιο φωσφατάση εντοπίζεται στην κορυφαία περιοχή και είναι απαραίτητη για το διαχωρισμό των PtdIns (4,5) P2 στην κορυφαία επιφάνεια λόγω δράση αποφωσφορυλιωτικό του σχετικά με την ομάδα D3-φωσφορική του PtdIns (3,4,5) P3 [10 ]. Επιπλέον, ΡΤΕΝ λειτουργεί ως αρνητικός ρυθμιστής της φωσφατιδυλο ινοσιτόλη 3-κινάση (ΡΙ3Κ) /μονοπάτι σηματοδότησης Akt και έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν πολλές διαδικασίες απορυθμισμένη στην ογκογένεση όπως πολλαπλασιασμό, κυτταρική επιβίωση, μετανάστευση και εισβολή [11], [12] .

ΡΤΕΝ κωδικοποιείται από το

φωσφατάση και tensin ομόλογο διαγράφονται στο χρωμόσωμα 10

(

ΡΤΕΝ

) ογκοκατασταλτικό γονίδιο, το οποίο είναι η δεύτερη πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο σε ανθρώπινους καρκίνους μετά από

TP53

[12]. Επιπλέον, η απώλεια του ΡΤΕΝ ανοσοχρώση σε ορθοκολικούς καρκίνους ιστούς έχει συσχετισθεί με προχωρημένη νόσο, μετάσταση ήπατος και κακή επιβίωση των ασθενών [13] – [16], υποδηλώνοντας δυνητικό ρόλο της προστατευτικής έναντι εξέλιξης της ανθρώπινης παχέος καρκινογένεσης. Από ΡΤΕΝ ελέγχει την πολικότητα σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα, θα μπορούσε κανείς να υποθέσει ότι η απώλεια αυτής της πρωτεΐνης μπορεί να είναι επαρκής για να προκαλέσει επιθηλιακά-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), ένα κρίσιμο πρώιμο γεγονός στην εισβολή και τη μετάσταση των πολλών τύπων καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του CRC. Σε προηγούμενες μελέτες, τα αποτελέσματα της απώλειας ΡΤΕΝ έχουν πρωτίστως έχουν μετρηθεί σε καρκινικές κυτταρικές σειρές που φιλοξενούν πολυάριθμες άλλες μετασχηματισμού και ογκογόνες μεταλλάξεις και τα οποία έχουν χάσει επιθηλιακά φαινότυπο τους [17] – [19]. Μια τέτοια προσέγγιση έχει καταστήσει δύσκολο να καθοριστεί ποια είναι φαινότυποι που παρέχονται άμεσα από την απώλεια του PTEN και για τον καθορισμό των στάδια της ογκογένεσης που έχουν αλλοιωθεί ειδικά σε κύτταρα με απώλεια PTEN. Για να χαρακτηριστεί περαιτέρω η σχέση μεταξύ της απώλειας ΡΤΕΝ, απώλεια της πολικότητας και του παχέος εξέλιξης του καρκίνου, χρησιμοποιήσαμε το Caco-2/15 κυτταρική γραμμή που λαμβάνεται από ένα σχετικά καλά διαφοροποιημένο ανθρώπινο ορθοκολικό αδενοκαρκίνωμα. Αυτός ο κλώνος της μητρικής Caco-2 κυτταρική σειρά έχει χαρακτηριστεί εκτενώς για την ικανότητά του να προβεί σε πλήρη μορφολογική και λειτουργική εντερικά επιθηλιακά διαδικασία διαφοροποίησης που λαμβάνει χώρα αυθόρμητα μία φορά συρροή έχει επιτευχθεί και το οποίο ολοκληρώνεται μετά από 15-20 ημέρες μετά τη συμβολή . Πιο συγκεκριμένα, αυτά τα κύτταρα σχηματίζουν κολονικό κορυφής σφιχτό και προσκολλημένα συνδετική σύμπλοκα και σχηματίζουν ένα πολωμένο μονοστιβάδα μετά από αρκετές ημέρες μετά την συρροή, η οποία εμφανίζει διεπιθηλιακό ηλεκτρική αντίσταση (TEER) παρόμοια με

in vivo

παρατηρήσεις [20] – [22 ]. Τα ακόλουθα «de-διαφοροποιούνται» κυτταρικές σειρές CRC Αναλύθηκαν επίσης: το HCT116, μία μικροδορυφόρων-ασταθής ανθρώπινη κυτταρική σειρά CRC και CT26, ένα μεταστατικό παχέος εντέρου κυτταρική γραμμή καρκινώματος του ποντικιού. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι ΡΤΕΝ μπορεί να δρα ως εμπόδιο για την ανάπτυξη του καρκίνου, ελέγχοντας την κυτταρική πολικότητα, την εγκατάσταση του κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις, παρακυτταρικής διαπερατότητας, η μετανάστευση και μεταστατικό δυναμικό των ανθρωπίνων ορθοκολικού καρκίνου κύτταρα.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικό και αντισώματα

Τα αντισώματα για την ανίχνευση του PTEN (A2B1), HNF1α (C-19) και HNF4α (C-19) αγοράστηκαν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Αντισώματα που εγείρονται εναντίον E-cadherin και βιλλίνη ήταν από BD Biosciences (Mississauga, ON, Καναδάς). Τα αντισώματα για την ανίχνευση της φωσφο-ΑΚΤ (Ser473) και ΑΚΤ ήταν από τη Cell Signaling Technology (Danvers, ΜΑ). Το αντίσωμα β-ακτίνης ήταν από την Chemicon (Temecula, CA). Η occludin, claudins και τα αντισώματα ΖΩ-1 ήταν όλα από τη Zymed Laboratories (Invitrogen, Burlington, ON, Καναδάς). Μονοκλωνικό αντίσωμα ΕΒΖ-14 εναντίον σακχαράσης-ισομαλτάσης παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr Andrea Quaroni (Πανεπιστήμιο Cornell, Ithaca, NY). CDX2 ανοσοκηλίδωση διεξήχθη με ένα πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού έναντι CDX2 προηγουμένως χαρακτηριστεί [23]. Όλα τα άλλα υλικά που λήφθηκαν από Sigma-Aldrich (Oakville, ON), εκτός αν αναφέρεται διαφορετικά

καλλιέργειας κυττάρων

Τρεις καρκίνου του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα μελέτη:.

1-Η κυτταρική σειρά ορθοκολικού αδενοκαρκινώματος Caco-2/15, που λαμβάνεται από Α Quaroni (Πανεπιστήμιο του Cornell, Ithaca, ΝΥ). Αυτή η κυτταρική σειρά παρέχει ένα μοναδικό και καλά χαρακτηρισμένο μοντέλο για τη μελέτη της διαφοροποίησης του επιθηλίου του εντέρου αφού αυτά τα κύτταρα υφίστανται λειτουργική και μορφολογική διαφοροποίηση σε ένα φαινότυπο εντεροκυττάρων με μικρολάχνες, σχηματισμός θόλου, και η έκφραση της σακχαράσης-ισομαλτάσης αρκετές ημέρες μετά την επίτευξη συρροής [20] – [22]. Αυτά τα κύτταρα εκφράζουν περικοπεί

APC

και μεταλλαγμένα

p53

αλλά παρουσιάζουν άγριου τύπου

K-Ras

,

β-κατενίνης

και επισκευή ασυμφωνία (MMR) πρωτεΐνες; είναι ως εκ τούτου μικροδορυφορικών σταθερές (MSS) [24], [25]. Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο Eagle τροποποιημένο κατά Dulbecco (DMEM, Invitrogen ™) που περιέχει 10% ορό εμβρύου βοός (FBS). 2- Τα κύτταρα HCT116 λήφθηκαν από ATCC (CCL-247). Αυτά τα κύτταρα αναπτύσσονται σε πολλαπλά στρώματα και είναι ανίκανοι να πόλωσης ή εντερικών επιθηλιακών διαφοροποίηση [20]. Αυτά τα κύτταρα είναι hMLH1 ανεπάρκεια, εκφράζουν άγριου τύπου

p53

, άγριου τύπου

APC

και να φέρουν την ενεργοποίηση

K-Ras

,

pi3kca

, και

β-κατενίνης

της μεταλλάξεων [26]. Αυτά τα κύτταρα είναι μεταστατικά [27], [28] που μας επιτρέπει να αναλύσει τον αντίκτυπο της απώλειας ΡΤΕΝ έκφρασης σε προχωρημένα στάδια του καρκίνου του παχέος εντέρου. Αυτά τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy (Wisent, St-Bruno, Κεμπέκ, Καναδάς) που περιέχει 10% FBS. 3- CT26 κύτταρα (ευγενώς από Pr Nicole Beauchemin, Université McGill, Canada) που προέρχεται από ένα μη διαφοροποιημένο αδενοκαρκίνωμα ποντικού που επάγεται από το ορθό ένεση του

N

-nitroso-

N

-methylurethane σε ποντικούς Balb /c. Τα κύτταρα αυτά μεταφέρουν την ενεργοποίηση

K-Ras

μεταλλάξεις [29], άγριου τύπου

p53

και δεν εκφράζουν Ε-καντερίνη ή ZO-1 [30]. κύτταρα CT26 διατηρήθηκαν σε μέσο RPMI (Invitrogen ™) που περιέχει 10% FBS και πενικιλίνη-στρεπτομυκίνη.

Κατασκευές πλασμιδίων και φακοϊούς παραγωγή

Ο φορέας έκφρασης λεντοϊού shRNA (pLenti6-U6) δομήθηκε ως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. ShRNA ολιγονουκλεοτίδια κατά της ανθρώπινης ΡΤΕΝ σχεδιάστηκαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές Ambion (δελτίο τεχνικών # 506) χρησιμοποιώντας το siRNA αλληλουχίες gctaagtgaagatgacaatca (# 1), gcacaagaggccctagatttc (2 #), gccagctaaaggtgaagatat (3 #) με ttcaagaga ως αλληλουχία βρόχου. Οι ολιγονουκλεοτιδίων-συγκολλημένων προϊόντων υποκλωνοποιήθηκαν σε pLenti6-U6 μεταξύ του

Bam HI

και

Xho

Ι θέσεις. Ένα άσχετο Plenti-shGFP (gccacaacgtctatatcatgg) ή ένα μεταλλαγμένο Plenti-shPTEN (shMUT) χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Το μεταλλαγμένο Plenti-shPTEN δημιουργήθηκε με την αλλαγή 3 νουκλεοτίδια στην αλληλουχία του με τον πλέον αποτελεσματικό shRNA έναντι ΡΤΕΝ (2 #) με αποτέλεσμα την gcacaagataacctagatttc αλληλουχία siRNA. Η shRNA έναντι του ποντικού μορφή ΡΤΕΝ (TRCN0000028992) και ένα αντίστοιχο έλεγχο shRNA (shTGFP) έναντι TurboGFP ™ (SHC004) ελήφθησαν από την Sigma-Aldrich. Λεντιϊοί που παράγονται σε κύτταρα 293Τ χρησιμοποιήθηκαν για τη μόλυνση κυττάρου σύμφωνα με τις συστάσεις Invitrogen (ViraPower λεντοϊών Expression System). Αριθ επαγωγή

OAS1

γονιδιακή έκφραση ανιχνεύθηκε με ανάλυση Q-PCR στα πειράματα που περιλαμβάνουν μόλυνση φακοϊών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

OAS1

(συνθετάση 2050-ολιγοαδενυλικού) είναι ένα κλασικό γονίδιο στόχο ιντερφερόνης και έχει προταθεί ως μια σημαντική δοκιμασία για την επαγωγή ιντερφερόνης πριν αποδώσουμε μια συγκεκριμένη απάντηση στο γονίδιο στοχευμένες [32].

Πρωτεΐνη εκχύλισης και κηλίδα Western ανάλυση

εκχυλίσεις πρωτεϊνών και ανάλυση κηλιδώσεως Western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22].

ηλεκτρονική μικροσκοπία

τα δείγματα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [22] και παρατηρήθηκαν σε ένα Hitachi Η-7500 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.

ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης

Η Caco-2/15 κύτταρα σπάρθηκαν σε μικρά ελάσματα 12 mm σε διάμετρο και σταθερό όπως περιγράφηκε προηγουμένως για ηλεκτρονικό μικροσκόπιο [22] μέχρι το στάδιο αφυδάτωσης σε αιθανόλη. Τα δείγματα στη συνέχεια κρίσιμο σημείο αποξηράνθηκε με CO

2 και καλύπτονται με χρυσό-παλλάδιο με ένα επιστρωτή επιμετάλλωσης. Τα επικαλυμμένα κύτταρα στη συνέχεια παρατηρήθηκαν με ένα JEOL ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (μοντέλο: JSM-840).

Προσδιορισμός της ηλεκτρικής αντίστασης των επιθηλίων

Caco-2/15 κύτταρα απλώθηκαν σε διαπερατά TRANSWELL® μεμβράνες ( Corning, Acton, ΜΑ). TEER μετρήθηκαν 3 και 9 ημέρες μετά τα κύτταρα έφθασαν συρροή με ένα επιθηλιακό Voltommeter (World Precision Instrument, μοντέλο EVOM-G).

RNA ανάλυση

Σύνολο απομόνωση RNA, RT-PCR και Q-PCRs διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31]. έκφραση στόχος ποσοτικά σε σχέση με την έκφραση PDGB. Εκκινητές για κάθε γονίδιο σχεδιάστηκαν στο εξόνιο-εξόνιο κόμβους χρησιμοποιώντας το λογισμικό Primer3 [33]. Primer ακολουθίες και τις προϋποθέσεις Q-PCR είναι διαθέσιμα κατόπιν αιτήματος.

δοκιμασίες Μετανάστευση

Οι δοκιμασίες διεξήχθησαν σύμφωνα με την απότομη τεχνική ξυράφι, όπως έχει ήδη αναφερθεί [34].

Δοκιμασίες των Rac και δραστηριοτήτων Cdc42

GTP-δεσμευμένη επίπεδα Rac και Cdc42 αναλύθηκαν με ένα G-LISA κιτ βιοχημεία δοκιμασία ενεργοποίησης (Cytoskeleton, Denver, CO) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

δοκιμασίες εισβολής

δοκιμασίες εισβολής διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας BD BIOCOAT ™ Matrigel ™ εισβολή Επιμελητήρια με 8-μm πολυκαρβονικό φίλτρα (BD Biosciences). Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε μέσο χωρίς ορό με την παρουσία 2 mM υδροξυουρία, ένα φαρμακολογικό αναστολέας των κυτταρικών αναγωγάσης ριβονουκλεοσιδικού να συλλάβει τον κυτταρικό κύκλο σε G1 /S φάσης [35]. Τα μέσα που περιέχουν 20% FBS χρησιμοποιήθηκε ως χημειοπροσελκυστικό. Μετά από επώαση 48 ώρες στους 37 ° C, μη επεμβατική κύτταρα απομακρύνθηκαν σύμφωνα με τη διαδικασία του κατασκευαστή και εισβάλλοντας κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με μεθανόλη 100%. Τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίζονται με κρυσταλλικό ιώδες 1%.

Τα ζωικά μοντέλα

Γυναικεία γυμνά ποντίκια CD1

nu /nu

και Fox Chase SCID μπεζ ποντίκια αγοράστηκαν από την Charles River (Wilmington , ΜΑ). Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την Επιτροπή Δεοντολογίας για τα πειράματα σε ζώα από το Université de Sherbrooke.

Η ανάπτυξη του όγκου

: Ένα σύνολο 2 × 10

6 κύτταρα αιωρούνται σε 100 μΙ ϋΜΕΜ εγχύθηκαν στο ραχιαίο υποδόριο ιστό του 5-εβδομάδων θηλυκά ποντίκια CD1

ηυ /ηυ

. Οι ποντικοί θανατώθηκαν μετά από 42 ημέρες μετά την ένεση για Caco-2/15 και 30 ημέρες μετά την ένεση για HCT116. Οι όγκοι αποκόπηκαν και ζυγίστηκαν.

Πειραματικές δοκιμασίες φλέβα της ουράς:

Η ουρά-φλέβα 5 εβδομάδων θηλυκό CD1

nu /nu

ποντίκια ή Fox Chase SCID μπεζ ποντίκια εγχύθηκε με 10

6 Caco-2 /15, HCT116 ή κύτταρα CT26 εναιωρήθηκαν σε 100 μΙ ϋΜΕΜ. Τα ζώα θυσιάστηκαν σε οποιοδήποτε σημάδι δυσφορίας ή απώλεια βάρους του αναπνευστικού, ή μετά από 14 ημέρες μετά την ένεση για CT26, 75 και 35 ημέρες μετά την ένεση για HCT116 ένεση αντίστοιχα CD1

nu /nu

και Fox Chase SCID Μπεζ ποντικούς και 60 ημέρες μετά την ένεση για 2-Caco /15 κύτταρα εγχύθηκαν σε ποντίκια Fox Chase SCID μπεζ. Οι πνεύμονες διατηρήθηκαν σε στερεωτικό Bouin για 24 ώρες. Μεμονωμένα λοβούς στη συνέχεια διαχωρίστηκαν και προσδιορίστηκε ο συνολικός αριθμός των επιφανειακών-ορατού μεταστάσεις.

ανθρώπινοι όγκοι

Δείγματα των καρκίνων του παχέος εντέρου και αντιστοιχισμένο φυσιολογικούς ιστούς κόλου (τουλάχιστον 10 cm από τον όγκο) έχουν έχουν ληφθεί από ασθενείς που υποβάλλονται σε χειρουργική εκτομή. Οι ασθενείς δεν λαμβάνουν εισαγωγική χημειοθεραπεία ή ακτινοθεραπεία. Οι ιστοί ελήφθησαν μετά από γραπτή συγκατάθεση του ασθενούς, σύμφωνα με το πρωτόκολλο που εγκρίθηκε από το Θεσμικό Ανθρωπίνων Θέμα Review Board του νοσοκομειακό κέντρο de Sherbrooke. Κλινικές και παθολογικές πληροφορίες ελήφθησαν από τα ιατρικά αρχεία. δείγματα αδενώματος ήταν ενδοσκοπικά ανεγχείρητο και ορίζονται ως προηγμένη λόγω του μεγέθους τους, μεγαλύτερο από 1 cm, είτε από την παρουσία υψηλού βαθμού δυσπλασία ή λαχνών συστατικό. καρκίνοι του ασθενούς ήταν ιστολογικά ταξινομούνται και βαθμολογούνται σύμφωνα με τα γενικά κριτήρια ΤΝΜ σταδιοποίηση (με βάση την από όγκο, λεμφαδένες σμού κόμβων και Metastatic- κατάστασης). Όλοι οι ιστοί καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο εντός 15 λεπτών από εκτομή, όπως συνιστάται από το Καναδικό Tumor Repository Network (www.ctrnet.ca). Για εκχύλιση πρωτεϊνών, ζεύγη ιστοί λύθηκαν εντός ρυθμιστικού διαλύματος δείγματος Triton (100 mM NaCl, 5 mM EDTA [ρΗ 8,0], 50 mM Tris-HCI [ρΗ 7.5], 1% Triton Χ-100, 5% γλυκερίνη, 1 mM PMSF, 0.2 mM ορθοβαναδικό, 40 mM β-γλυκεροφωσφορικό, 50 mM NaF, και 2% κοκτέιλ αναστολέα πρωτεάσης [Ρ 8340, Sigma-Aldrich]) και ανοσοστυπώθηκαν όπως περιγράφεται προηγούμενα [22].

παρουσίαση δεδομένων

Τυπικά αποτελέσματα που παρουσιάζονται είναι αντιπροσωπευτικά 3 ανεξάρτητων πειραμάτων. Στατιστικά υπολογίστηκαν χρησιμοποιώντας Student δύο ουρών t-test. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές στο * p ≤ 0,05 ή *** p≤0.005. Πυκνομετρικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού J Image.

Αποτελέσματα

PTEN ελέγχει παχέος επιθηλιακών κυττάρων πόλωση και τη διαφοροποίηση

Για να διερευνηθεί η επίδραση της απώλειας ΡΤΕΝ έκφρασης για τη διαφοροποίηση και την πόλωση της καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα, ανασυνδυασμένο φακοϊούς κωδικοποιεί μικρό RNAs φουρκέτα (τα siRNAs) αναπτύχθηκαν για πρώτη φορά, προκειμένου να καταστείλει σταθερά επίπεδα ΡΤΕΝ mRNA σε Caco-2/15 κύτταρα. Αρκετές λεντοϊού κατασκευάσματα εξετάσθηκαν για την ικανότητά τους να knock-down ΡΤΕΝ. Ο πιο αποτελεσματικός shRNA ορίστηκε shPTEN (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Caco-2/15 κύτταρα μολύνθηκαν με πλέον shPTEN φακοϊών ή με άσχετο φακοϊών shGFP ή φακοϊούς εκφράζουν ένα shPTEN με 3 νουκλεοτίδια αναντιστοιχία (shMUT) ως αρνητικοί έλεγχοι. Η pLenti6-U6 φορέα λεντοϊού που coexpresses γονίδιο ανθεκτικότητας ενός βλαστισιδίνη S, επέτρεψε την επιλογή των καθαρών πληθυσμών μετασχηματισμένων κυττάρων εντός 7 ημερών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1Α, τα επίπεδα πρωτεΐνης ΡΤΕΝ ήταν σχεδόν εντελώς νοκ-κάτω σε Caco-2/15 κύτταρα που εκφράζουν τον shPTEN (& gt? 90%)? αυτή η μείωση διατηρήθηκε κατά τη διάρκεια της μετα-συρροή. Αξίζει να σημειωθεί, ΡΤΕΝ ρύθμιση προς τα κάτω συσχετίστηκε επίσης με μια αύξηση στη φωσφορυλίωση της ΑΚΤ, η κύρια κατάντη τελεστής της ΡΙ3Κ, επιβεβαιώνοντας ότι η οδός ΡΙ3Κ ενεργοποιήθηκε σε shPTEN εκφράζουν-κύτταρα.

Caco-2/15 κύτταρα ήταν μολυνθεί είτε με ανασυνδυασμένο φακοϊούς που κωδικοποιεί μια shRNA που χτυπά προς τα κάτω ειδικά PTEN (shPTEN) ή αρνητικό μάρτυρα Τα siRNAs (shGFP ή shMUT). Α και C. Μετά την επιλογή των επιμολυσμένων κυττάρων, Caco-2/15 ήταν υπό λύθηκαν σε -2, 0, 3, 6, 9 και 12 ημέρες μετά τη συρροή. Οι πρωτεΐνες στη συνέχεια αναλύθηκαν με στύπωση Western. B. Αριστερό πάνελ: Καινούριο συρρέουν Caco-2/15 κύτταρα που εκφράζουν shGFP ή shPTEN παρατηρήθηκαν με οπτικό μικροσκόπιο. Ράβδοι κλίμακας = 100 μm. Μέση πάνελ: Πρόσφατα συρρέουν /15 κύτταρα που εκφράζουν shGFP ή shPTEN 2 Caco-μονιμοποιήθηκαν και παρατηρήθηκαν με ηλεκτρονική μικροσκοπία μετάδοσης. Ράβδοι κλίμακας = 2 μm. Δεξιά πάνελ: Πρόσφατα συρρέουν shGFP ή shPTEN εκφράζουν κύτταρα παρατηρήθηκαν με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. Ράβδοι κλίμακας = 1 μm.

Η

Για να αναλυθεί το κατά πόσον PTEN έχει αντίκτυπο στις Caco-2/15 πόλωση κύτταρο, η μορφολογία των κυττάρων για πρώτη φορά εξετάστηκε σε διαφορετικές ημέρες της συμβολής. Όπως παρατηρήθηκε με οπτικό μικροσκόπιο, οι κυτταρικές superficy αυξήθηκε σημαντικά κατά 5,3 φορές (ρ & lt? 0.005 αναλύθηκαν με λογισμικό Metamorph) σε πρόσφατα συρρέοντα Caco-2/15 κύτταρα που εκφράζουν shPTEN σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (Εικόνα 1Β, αριστερά πάνελ). Επιπλέον, η ανάλυση μετάδοση ηλεκτρονικό μικροσκόπιο έδειξε ότι πρόσφατα συνενωμένα κύτταρα ελέγχου είχαν ήδη αρχίσει να πολώσει ενώ PTEN ανεπάρκεια κύτταρα διατηρούνται ακόμα μια πεπλατυσμένη εμφάνιση (Σχήμα 1Β, μεσαίο πάνελ). Στις 3 ημέρες μετά την συρροή, τα κύτταρα με μειωμένη έκφραση ΡΤΕΝ άρχισε να πολώσει ενώ τα κύτταρα ελέγχου είχε ήδη αποκτήσει κυλινδρικό σχήμα τους (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Κάτω ρύθμιση του ΡΤΕΝ οδήγησε επίσης σε μια μείωση του αριθμού των μικρολαχνών στο ακραία μεμβράνη των κυττάρων όπως παρατηρείται με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (Σχήμα 1Β, δεξιά πάνελ). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης των λειτουργικών δεικτών διαφοροποίησης σακχαράσης-ισομαλτάσης και βιλλίνη ήταν επίσης σημαντικά μειωμένη σε κύτταρα PTEN-εξαντλημένο (Σχήμα 1C).

επόμενο επαληθεύεται εάν PTEN αποσιώπηση μεταβάλλει την έκφραση των ηπατοκυττάρων πυρηνικών παραγόντων 1α ( HNF1α) και 4 (HNF4α), καθώς και το ουραίο συγγενή παράγοντα μεταγραφής ομοιοακολουθίας 2 (CDX2) τα οποία είναι γνωστό ότι ελέγχουν εντερικά επιθηλιακά κυτταρική διαφοροποίηση [36]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1 C, ενώ τα επίπεδα έκφρασης του HNF4α ήταν μετρίως μειωμένη σε συρρέουσες ΡΤΕΝ ανεπάρκεια Caco-2/15 κύτταρα, η έκφραση της HNF1α και CDX2 ήταν σημαντικά μειωμένη (Σχήμα 1 C). Λαμβανόμενα μαζί, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το ΡΤΕΝ είναι σημαντικό για επιθηλιακό κύτταρο πόλωση καθώς και τη λειτουργική και μορφολογική διαφοροποίηση των εντερικών επιθηλιακών κυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί ότι αυτά τα αποτελέσματα δεν φαίνεται να είναι μια έμμεση συνέπεια της μεταβολής του κυτταρικού πολλαπλασιασμού από τις 2-Caco /15 κύτταρα που εκφράζουν shPTEN παρουσίασαν τον ίδιο ρυθμό πολλαπλασιασμού από ότι τα κύτταρα ελέγχου και να σταματήσει να πολλαπλασιάζονται μόλις έφθασαν σε συρροή (τα δεδομένα δεν φαίνονται) .

PTEN κάτω ρύθμιση μειώνει σφιχτά ακεραιότητα διασταύρωση στα επιθηλιακά κύτταρα του παχέος εντέρου

από μεσοκυττάρια κόμβους είναι ρυθμιστές της κυτταρικής πολικότητας [2], [5], έχουμε την επόμενη ελέγξει αν η έκφραση της shPTEN είχε ένα αποτέλεσμα στο κελί διασταυρώσεις. Σύμφωνα με ηλεκτρονική μικροσκοπία διάδοσης, ενώσεις προσφύσεως εμφανίστηκε αμετάβλητη (Σχήμα 2Α, βέλη) σε ΡΤΕΝ ανεπάρκεια Caco-2/15 κύτταρα ενώ στενοσυνδέσεων εμφανίστηκε λιγότερο οργανωμένη σε 3 ημέρες μετά την συρροή (Σχήμα 2Α, παρένθεση). Ως Μάλιστα, αδόμητη μάζα των πρωτεϊνών συστηματικά παρατηρήθηκαν χωρίς σύσφιξη της μεμβράνης στη συνηθισμένη θέση του σφικτών συνδέσμων. Κατά συνέπεια, η λειτουργία του φραγμού των σφικτών συνδέσμων επίσης σε κίνδυνο όπως αποδεικνύεται από τη μείωση της TEER που μετράται σε shPTEN εκφράζουν κυττάρων σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου στις 3 και 9 ημέρες μετά την συρροή (Σχήμα 2Β). Προκειμένου να αποκτήσουν περαιτέρω κατανόηση του τρόπου με τον οποίο PTEN ελέγχει την ακεραιότητα διασταύρωση, τα επίπεδα έκφρασης των διαφόρων βασικών κομβική πρωτεΐνες όπως occludin, ZO-1 και claudins [2] αναλύθηκαν. Πρωτεΐνη έκφραση claudins 1, 3, 4 και 8 μειώθηκε σημαντικά και στις δύο υποσυρρέοντα και μετα-συρρέοντα κύτταρα shPTEN (Σχήμα 2C). Αξίζει να σημειωθεί ότι η έκφραση της προσφύσεως διασταύρωση πρωτεΐνη Ε-καδερίνης επίσης εξασθενημένος σε μετα-συρρέοντα κύτταρα shPTEN (Σχήμα 2C).

A. Caco-2/15 κύτταρα που εκφράζουν shMUT ή shPTEN σταθεροποιήθηκαν μετά από 3 ημέρες μετά τη συρροή και παρατηρήθηκαν με μικροσκοπία μετάδοσης ηλεκτρονίου. Ράβδοι κλίμακας = 500 nm. Τα βέλη δείχνουν adherens διασταυρώσεις ενώ παρενθέσεις δείχνουν σφιχτό κόμβους. Β Caco-2/15 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πορώδεις μεμβράνες μετά από το οποίο η αντίσταση των επιθηλίων μετρήθηκε εις τριπλούν 3 και 9 ημέρες μετά τα κύτταρα έφθασαν συρροή. *** Σημαντικά διαφορετική σε p≤0.005 (t-test του Student). Γ Caco-2/15 κύτταρα που εκφράζουν shGFP ή shPTEN λύθηκαν σε -2, 0, 3, 6, 9 και 12 ημέρες μετά τη συρροή ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος Western των πρωτεϊνών των στενών τμημάτων.

Η

απώλεια της έκφρασης ΡΤΕΝ σε 2 Caco-/15 κύτταρα διεγείρει τη μετανάστευση /την εισβολή, προωθεί την ανάπτυξη του όγκου, αλλά δεν αρκεί για να προσδώσει μεταστατικό δυναμικό

in vivo

η

Απώλεια μεσοκυττάρια κόμβους είναι γνωστό ότι σχετίζεται με αυξημένη κυτταρική μετανάστευση και εισβολή των ικανοτήτων [4]. Επιπλέον, ΡΤΕΝ έχει δειχθεί ότι ελέγχουν τέτοιες διεργασίες σε άλλους τύπους κυττάρων [11]. Χρησιμοποιώντας τους προσδιορισμούς πληγή-κλείσιμο, η μετανάστευση των προσφάτως συρρέοντα κύτταρα ελέγχου συγκρίθηκε με εκείνη του shPTEN εκφράζουν πληθυσμούς. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Α, η ικανότητα των shPTEN εκφράζουν 2 Caco-/15 κύτταρα να μεταναστεύουν ήταν σημαντικά αυξημένη σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, όπως προσδιορίζεται με μέτρηση της σχετικής περιοχής που καλύπτεται από μεταναστεύοντα κύτταρα. Παρατηρήσαμε επίσης ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του ΡΤΕΝ αισθητά διεγείρεται Caco-2/15 αποκόλληση των κυττάρων μετά από θρυψινοποίηση (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το ΡΤΕΝ μεταγραφής γονιδίου σίγηση σε κύτταρα CRC ενισχύει την ικανότητά τους να εξαπλώνονται και να μεταναστεύσουν. Από ΡΤΕΝ έχει αποδειχθεί ότι επηρεάζουν τη μετανάστευση μέσω της ενεργοποίησης των μικρών ΟΤΡασών Rac1 και Cdc42 [37], από την επόμενη ανέλυσε εάν αντίστοιχες έκφραση και η δραστικότητα τους επηρεάστηκε από την απώλεια της έκφρασης ΡΤΕΝ. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Β, και τα δύο Rac και Cdc42 εμφανίζονται υψηλότερες GTP-δεσμευμένη επίπεδα σε υποσυρρέοντα και συρρέοντα shPTEN κύτταρα που εκφράζουν σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου.

A. Αριστερά πλαίσια: μορφολογία των κυττάρων αναλύθηκε με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης σε συρροής. Δεξιά πλαίσια: Καινούριο συρρέοντα κύτταρα που εκφράζουν σταθερά shMUT ή shPTEN τραυματίστηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2 mM υδροξυουρία. Μετά από 48 ώρες, η κίνηση του συνεκτικό φύλλο σε όλη τη γραμμική περιθώριο του τραύματος (λευκή γραμμή) αξιολογήθηκε με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Το γράφημα στα δεξιά απεικονίζει τη σχετική περιοχή που καλύπτεται από μεταναστευτικά κύτταρα όπως εκτιμάται σε 5 διαφορετικά πειράματα πληγή ανά συνθήκη χρησιμοποιώντας το λογισμικό J Image. Ράβδοι κλίμακας = 100 μm. Β Ενεργός επίπεδα GTP-δεσμεύεται Rac ή Cdc42 αναλύθηκαν με την ενεργοποίηση G-LISA κιτ βιοχημεία δοκιμασία για υποσυμβάλλουσες (SC) και πρόσφατα συρροή (C) Caco 2-/15 κύτταρα. Γ Εισβολή των κυττάρων μελετήθηκε χρησιμοποιώντας επικαλυμμένα με Matrigel Transwells. Μετά από 48 ώρες, εισβάλλοντας κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες 1% και μετρώνται. Δ Υποσυρρέουσες shMUT και shPTEN εκφράζουν Caco-2/15 κύτταρα λύθηκαν και το ολικό RNA απομονώθηκε για γονιδιακή έκφραση αναλύθηκε με Q-PCRs. Το σχετικό επίπεδο κάθε RNA υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας την πρότυπη μέθοδο καμπύλη και ομαλοποιήθηκε ως προς το αντίστοιχο επίπεδο PDGB RNA. Ε 2 × 10

6 πολλαπλασιαζόμενα Caco-2/15 κύτταρα που εκφράζουν shMUT ή shPTEN ενέθηκαν υποδορίως σε 5 γυμνούς ποντικούς ανά συνθήκη. Το βάρος του όγκου εκτιμήθηκε 42 ημέρες μετά την ένεση. * P ≤ 0,05, *** p≤0.005, στατιστικές διαφορές προσδιορίζονται χρησιμοποιώντας έλεγχος τ.

Η

Το αποτέλεσμα της ανεπάρκειας PTEN στην εισβολή επίσης προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας θαλάμους εισβολή BD Biocoat Matrigel. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3C, Caco-2/15 κύτταρα που εκφράζουν τα shPTEN σαφώς εμφάνισαν αυξημένη επεμβατική ικανότητες σε σύγκριση με shMUT-εκφράζοντα κύτταρα. Εισβολή περιλαμβάνει όχι μόνο διάσπαση του κυττάρου-κυττάρου διασταυρώσεις και αυξημένη κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων, αλλά και εστιακή πρωτεόλυση της εξωκυτταρικής μήτρας. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3D, Q-PCR αναλύσεις αποκάλυψαν ότι τα επίπεδα έκφρασης των μεταλλοπρωτεϊνασών μήτρας 2 και 9 (ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9), οστεοποντίνη (ΟΡΝ) και (ενεργοποιητής πλασμινογόνου τύπου ουροκινάσης) υΡΑ ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε shPTEN εκφράζουν Caco- 2/15 κύτταρα.

Η καρκινογένεση από Caco-2/15 πληθυσμούς κυττάρων επόμενη αξιολογήθηκε μετά από υποδόρια ένεση στο πλευρό των άτριχων ποντικών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3Ε, προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΡΤΕΝ σε Caco-2/15 κυττάρων αυξήθηκε σημαντικά την ικανότητά τους να επάγουν όγκους in vivo.

Τέλος, διερευνήσαμε κατά πόσον η μείωση ΡΤΕΝ σε 2 Caco-/15 κύτταρα είναι επαρκής για να επάγει μετάσταση όγκου

in vivo

, μέσω της χρήσης ανάλυσης φλέβα της ουράς πειραματική μετάσταση. Fox Chase SCID μπεζ ποντίκια που ενέθηκαν με έλεγχο ή ΡΤΕΝ ανεπάρκεια Caco-2/15 κύτταρα μέσα στην φλέβα της ουράς απέτυχε να αναπτύξει μεταστάσεις ακόμα και σε 60 ημέρες μετά την ένεση (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα), υποδεικνύοντας ότι ΡΤΕΝ προς τα κάτω ρύθμιση δεν είναι επαρκής για να προσδώσει μεταστατικό δυναμικό σε καλά διαφοροποιημένα κύτταρα CRC.

Η απώλεια της έκφρασης ΡΤΕΝ διεγείρει τη μετανάστευση /την εισβολή, ενισχύει την ανάπτυξη των όγκων και επάγει μεταστατικό δυναμικό των κυττάρων HCT116

in vivo

Η

Ο αντίκτυπος της PTEN σίγηση αξιολογήθηκε επίσης στο μικροδορυφορικού-ασταθή αποδιαφοροποιημένων γραμμή κυττάρων HCT116. Σε αυτά τα κύτταρα, ΡΤΕΝ σίγηση οδήγησε επίσης σε αυξημένη φωσφο-Ακί (Σχήμα 4Α), ενισχυμένη ικανότητα τόσο της μετανάστευσης κατά τον τραυματισμό (Σχήμα 4Β) και εισβολή (Σχήμα 4C), εκτός του ότι συνδέεται με μια σημαντική αύξηση στη δραστηριότητα Rac (1,5 φορές σε, ρ & lt? 0.005) και την έκφραση OPN (1,9-φορές, ρ & lt? 0.005) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Αξίζει να σημειωθεί ότι τα επίπεδα έκφρασης της ΜΜΡ-2, ΜΜΡ-9 και υΡΑ σε κύτταρα HCT116 ελέγχου είχαν ήδη αξιοσημείωτα αυξημένα και ΡΤΕΝ σίγηση δεν περαιτέρω ενίσχυση των επιπέδων mRNA των μορίων αυτών (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα). Η ογκογονικότητα των κυτταρικών πληθυσμών HCT116 αξιολογήθηκε επίσης μετά από υποδόρια ένεση στο πλευρό γυμνών ποντικών. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4D, προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης ΡΤΕΝ σε κύτταρα HCT116 αυξημένη ικανότητα τους να επάγουν όγκους

in vivo

.

A. κύτταρα HCT116 μολύνθηκαν είτε με ανασυνδυασμένο φακοϊών κωδικοποιεί shMUT ή shPTEN. Μετά την επιλογή των μολυσμένων κυττάρων, πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα λύθηκαν και η έκφραση πρωτεΐνης αναλύθηκε με στύπωμα Western. B. Αριστερό πάνελ: η μορφολογία των κυττάρων αναλύθηκε με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης σε συρροής. Δεξιά πλαίσια: Καινούριο συρρέοντα κύτταρα τραυματίστηκαν και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 2 mM υδροξυουρία. Μετά από 48 ώρες, η κίνηση του συνεκτικό φύλλο σε όλη τη γραμμική περιθώριο του τραύματος (λευκή γραμμή) αξιολογήθηκε με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης. Το γράφημα στα δεξιά απεικονίζει τη σχετική περιοχή που καλύπτεται από μεταναστευτικά κύτταρα, όπως αξιολογείται με 5 διαφορετικά πειράματα πληγή ανά συνθήκη χρησιμοποιώντας το λογισμικό J Image. Ράβδοι κλίμακας = 100 μm. Γ Εισβολή των κυττάρων μελετήθηκε χρησιμοποιώντας επικαλυμμένα με Matrigel Transwells. Μετά από 48 ώρες, εισβάλλοντας κύτταρα σταθεροποιήθηκαν, χρωματίστηκαν με κρυσταλλικό ιώδες 1% και μετρώνται. D. 2 × 10

6 πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα HCT116 που εκφράζουν shMUT ή shPTEN ενέθηκαν υποδορίως σε 5 γυμνούς ποντικούς ανά συνθήκη. Το βάρος του όγκου εκτιμήθηκε 30 ημέρες μετά την ένεση. * Σημαντικά διαφορετικό σε p ≤ 0,05.

Η

Τέλος, διερευνήσαμε κατά πόσον η μείωση ΡΤΕΝ σε κύτταρα HCT116 είναι επαρκής για να επάγει μετάσταση όγκου

in vivo

, μέσω της χρήσης ανάλυσης φλέβα της ουράς. Τ: όγκου.