Αφηρημένο

Ιστορικό

Το κλινικό όφελος του guaiac κοπράνων εξετάσεις αίματος (FOBT) έχει πλέον καθιερωθεί για τον ορθοκολικό προσυμπτωματικό έλεγχο του καρκίνου. Αυξανόμενες ενδείξεις απέδειξε ότι οι επιγενετικές τροποποιήσεις και κοπράνων αλλαγές microbiota, επίσης γνωστή ως dysbiosis, που συνδέονται με την CRC παθογένεια και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως υποκατάστατο δείκτες της CRC.

Ασθενείς και Μέθοδοι

Πραγματοποιήσαμε μια συγχρονική μελέτη που περιελάμβανε όλες τις διαδοχικές θέματα που αναφέρονται (2003-2007) για τη διαλογή κολονοσκοπήσεις. Πριν από την κολονοσκόπηση, λύματα (νωπά κόπρανα, οροί-S και ούρων-U) συλλέχθηκαν και FOBTs εκτελούνται. επίπεδα μεθυλίωσης μετρήθηκαν στα κόπρανα, S και U για 3 γονίδια (Wif1, ALX-4, και βιμεντίνης) που επιλέγεται από ένα πάνελ 63 γονιδίων? μεταλλάξεις KRAS και επτά κυρίαρχο και δευτερευούσης βακτηριακών πληθυσμών στα κόπρανα ποσοτικά. Βαθμονόμησης εκτιμήθηκε με την Hosmer-Lemeshow chi-square, και των διακρίσεων καθορίστηκε με τον υπολογισμό του C-στατιστικό (περιοχή κάτω από την καμπύλη) και τα καθαρά δείκτη Βελτίωση Ανακατάταξη.

Αποτελέσματα

Υπήρχαν 247 άτομα (μέση ηλικία 60,8 ± 12,4 χρόνια, το 52% των ανδρών) στην ομάδα μελέτης, και 90 (36%) των ατόμων αυτών ήταν ασθενείς με προχωρημένο πολύποδες ή επεμβατική αδενοκαρκινώματα. Ένα πολυπαραγοντικό μοντέλο προσαρμοσμένο για την ηλικία και το FOBT οδήγησε σε μια C-στατιστική 0,83 [0,77 – 0,88]. Μετά από συμπληρωματική διαδοχική (ένα-ένα) προσαρμογή, Wif-1 μεθυλίωσης (S ή U) και κοπράνων dysbiosis μικροχλωρίδας οδήγησε σε αυξήσεις της C-στατιστική με 0,90 [0,84 – 0,94] (p = 0,02) και 0,81 [0.74- 0.86] (p = 0.49), αντίστοιχα. Όταν ρυθμιστεί από κοινού για FOBT και Wif-1 μεθυλίωση ή κοπράνων dysbiosis microbiota, η αύξηση της C-στατιστική ήταν ακόμα πιο σημαντική (0,91 και 0,85, p & lt? 0.001 και p = 0,10, αντίστοιχα)

Συμπέρασμα

Η ανίχνευση του μεθυλιωμένου Wif-1 είτε S ή U έχει μεγαλύτερη ακρίβεια την απόδοση σε σύγκριση με guaiac FOBT για τις προηγμένες παχέος νεοπλασία. Αντίθετα, κοπράνων ανίχνευση μικροχλωρίδας dysbiosis δεν ήταν πιο ακριβής. Του αίματος και εξέταση ούρων θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν σε αυτά τα άτομα διστάζουν να υποβάλλονται σε τεστ κοπράνων

Παράθεση:. Amiot Α, Mansour Η, Baumgaertner Ι, Delchier J-C, Tournigand C, Furet J-P, et al. (2014) Η ανίχνευση των μεθυλεστέρων Wif-1 γονίδιο είναι πιο ακριβή από μια εξέταση αίματος Κρυφού για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 9 (7): e99233. doi: 10.1371 /journal.pone.0099233

Επιμέλεια: Αντώνης W. I. Lo, το Κινεζικό Πανεπιστήμιο του Χονγκ Κονγκ, Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 3 Φεβρουαρίου 2014? Αποδεκτές: 13 του Μαΐου του 2014? Δημοσιεύθηκε: 15 Ιουλίου 2014

Copyright: © 2014 Amiot et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Cancéropole Ιλ de France, CoMiCa 2007-2010 του έργου, (Charles Debray ένωση-ACD)? LNCC (γαλλικό Εθνικό Λιγκ κατά του Καρκίνου), CCR INSERM Προώθηση (2004-2006). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή δεδομένων, την ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεις: Ανταγωνιστικά συμφέροντα υπάρχουν για Ι Sobhani και το δείκτη δοκιμή Wif1 (Εγγεγραμμένοι ευρεσιτεχνίας), και για την JP Carrau για το τεστ FOB (επικεφαλής του εργαστηρίου).

Εισαγωγή

Καρκίνος του παχέος εντέρου (CRC) είναι μια σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας στις ανεπτυγμένες χώρες. Η συχνότητα εμφάνισης της CRC έχει αυξηθεί κατά 3 έως 4% ετησίως από το 1970 [1], [2]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η φυσική ιστορία της CRC περιλαμβάνει μια εξέλιξη από πολύποδες στην προηγμένη CRC που επιτρέπει την έγκαιρη ανίχνευση σε ασυμπτωματικούς ασθενείς. Η κολονοσκόπηση διαλογής, το «χρυσό πρότυπο μέθοδο», σιγμοειδοσκόπηση, και υπολογίζονται colonography τομογραφία έχουν δειχθεί ότι είναι αποτελεσματικές για CRC έλεγχο αποδεικνύοντας μείωση CRC επίπτωσης και θνησιμότητας [3], [4], [5], [ ,,,0],6]. Ωστόσο, στις περισσότερες χώρες, καμία από αυτές τις μεθόδους συνιστώνται επί του παρόντος για CRC μαζικής διαλογής, λόγω των εγγενών περιορισμών, οι οποίες περιλαμβάνουν την προετοιμασία του εντέρου, το υψηλό κόστος, τα χαμηλά ποσοστά συμμετοχής, και περιστασιακά ανεπιθύμητες ενέργειες. Τις τελευταίες δεκαετίες, έχουν γίνει προσπάθειες για να δημιουργηθεί ελάχιστα επεμβατικές εξετάσεις για CRC έλεγχο. Η guaiac κοπράνων δοκιμή λανθάνουσας αιμορραγίας (FOBT) έχει αποδειχθεί ότι μειώνει CRC που σχετίζονται με τη θνησιμότητα σε τρεις τυχαιοποιημένες ελεγχόμενες μελέτες και μια μελέτη βασισμένη στον πληθυσμό [7], [8], [9], [10]. Ωστόσο, FOBT έχει χαμηλή ευαισθησία και πολύ περιορισμένο αντίκτυπο όσον αφορά τη μετάβαση αδένωμα-καρκίνωμα, πιθανότατα επειδή νωρίς προκαρκινικές αλλοιώσεις παράγουν μόνο χαμηλές συγκεντρώσεις του αίματος στα κόπρανα [11], [12]. Η ποσοτική ανοσοχημική FOBT απέδειξε πρόσφατα μια υψηλότερη ευαισθησία στην ανίχνευση των προηγμένων νεοπλασιών [13]. Ωστόσο, εξακολουθεί να υπάρχει ανάγκη για μια πιο ακριβής εξέταση για τη βελτίωση της εξέτασης των επιδόσεων.

Στην πλειονότητα των περιπτώσεων, κληρονόμησε γενετικοί παράγοντες κάνουν μια μικρή συμβολή στην ευαισθησία για την ανάπτυξη CRC, ενώ οι κύριοι συντελεστές είναι οι περιβαλλοντικοί παράγοντες [14]. Πράγματι, προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η ανάπτυξη CRC ήταν σχετίζονται με τη γήρανση, αλλά και με τη σύγχρονη δυτική τρόπο ζωής και διατροφικών συστατικών [1], [15].

Η παρεκκλίνουσα μεθυλίωση των CpG πλούσιων σε αλληλουχίες (CpG νησιά) είναι μια επιγενετικές αλλαγή που επάγει την μεταγραφική αποσιώπηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων [16]. Αυτά τα γονίδιο μεταβολές μπορεί να προκληθεί από χημική ή /και περιβαλλοντικών παραγόντων. [1] Η υπερμεθυλίωση των CpG νησίδων σε ογκοκατασταλτικά γονίδια έχει αναφερθεί στο νεοπλασματικό ιστό των ασθενών CRC, καθώς και σε προκαρκινικές αλλοιώσεις [17]. Είναι γνωστό ότι υπάρχει παρεκκλίνουσα μεθυλίωση των κυκλοφορούντων DNA, όπως αυτό που βρέθηκε στα κόπρανα, ορός, ούρα, και άλλα σωματικά υγρά, και θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί ως βιολογικός δείκτης για τον καρκίνο διαλογή [18], [19].

Πιο πρόσφατα, τα μικρόβια που αποικίζουν το γαστρεντερικό σωλήνα, οι οποίες αποτελούν σημαντικό παράγοντα σε βιολογικά περιβάλλοντα, έχουν υποψίες να παίζουν ρόλους στην εμφάνιση της CRC [20]. Πράγματι, οι μεταβολές στην αυλού προσφυόμενο εντερική μικροχλωρίδα, τα λεγόμενα dysbiosis, έχουν δειχθεί σε ασθενείς CRC [21], [22]. Σε ζωικά μοντέλα, η συμβολή των βακτηρίων στην αιτιολογία του CRC έχει μελετηθεί και έχει προταθεί ότι θα μπορούσαν να δρουν μέσω φλεγμονώδη μονοπάτια, αν και μια άμεση γονοτοξική δράση των βακτηριδίων θα μπορούσε επίσης να υπάρχει υποψία [23]. Πρόσφατα, αποδείξαμε ότι η μεταμόσχευση κοπράνων από ανθρώπους ασθενείς με CRC να ελεύθερα μικροβίων ποντικούς θα μπορούσε να επάγει αυξήσεις εντερική προκαρκινικών γεγονότα μέσα στο γονίδιο ξενιστή αλλοίωση, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων και ο μεταβολισμός στον βλεννογόνο [24]. Ως εκ τούτου, οι αλλαγές στο κοπράνων μικροχλωρίδα θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για CRC έλεγχο.

Στην παρούσα μελέτη διερευνούμε την ακρίβεια απόδοσης των νέων δοκιμών προσυμπτωματικού ελέγχου για CRC στοχεύουν τα επίπεδα μεθυλίωσης του πίνακα των 63 γονιδίων στα κόπρανα , το αίμα και τα ούρα, και η σύνθεση των κοπράνων μικροχλωρίδας εκτιμήθηκε με qPCR. Οι τελευταίες δοκιμές σε σύγκριση με guaiac FOBT σε ένα νοσοκομείο με βάση τον πληθυσμό των ατόμων που ανήκουν σε ομάδες με μέσο ή υψηλό κίνδυνο για CRC.

Ασθενείς και Μέθοδοι

πληθυσμός Μελέτη

από το 2003 έως το 2007, 247 συνεχόμενες εκτός ασθενείς (μέση ηλικία 60,8 ± 12,4, 129 άνδρες), με μέσο ή υψηλό κίνδυνο CRC (ιστορικό καρκίνου σε συγγενείς, προσωπική ιστορία παρελθόν πολυπόδων, κοιλιακό ή σχετίζονται με εντερική συμπτώματα, ή αναιμία ότι απαιτείται κολονοσκόπηση), συμπεριλήφθηκαν σε μια μελέτη συλλογή τράπεζας δείγματος. Για να είναι επιλέξιμες για ένταξη, οι ασθενείς έπρεπε να έχουν καμία προηγούμενη ιστορία από τα ακόλουθα: παχέος εντέρου χειρουργική επέμβαση, ασθένειες όπως φλεγμονώδεις ή λοιμώδεις τραυματισμοί του εντέρου, ή μια ανάγκη για μια κολονοσκόπηση έκτακτης ανάγκης. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε δύο τμήματα (Γαστρεντερολογίας και Ογκολογία) της διδασκαλίας νοσοκομείο στην περιοχή της Γαλλίας στο Παρίσι.

Δύο εβδομάδες πριν από την κολονοσκόπηση και αφού δώσει γραπτή συγκατάθεση, οι ασθενείς συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη και ήταν ζήτησε να δώσει νέα κόπρανα, τα ούρα και τα δείγματα αίματος μέσα σε 2 εβδομάδες, αλλά μέχρι και τρεις ημέρες πριν από την κολονοσκόπηση. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα δείγματα κοπράνων συλλέχθηκαν πριν εντέρου καθαρισμού για κολονοσκόπηση. Τυχόν ιδιαίτερη δίαιτες (διαβητικοί, χορτοφάγοι) και τα φάρμακα (αντιδιαβητικά φάρμακα, hypocholesterolemics, και καθαρτικά) κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου καταγράφηκαν. Η μελέτη εγκρίθηκε από την Επιτροπή Δεοντολογίας της περιοχής Val de Marne Paris-EST που επέτρεψε την εγγραφή των ασθενών σε όλα συνδέονται κέντρα (αριθμός 2004-4 CCPPRB). Όλοι οι ασθενείς έλαβαν πληροφορίες σχετικά με τη μελέτη, τους στόχους της, και τα δείγματα που θα δώσει. Όλες οι πληροφορίες που δόθηκαν από επιστολή δακτυλογραφημένη γραμμένο στα γαλλικά, και επίσημη γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε σε ένα τριπλό έντυπο αντίγραφο? ένα αντίγραφο του εντύπου έγινε δεκτή από τον ασθενή, θα διατηρηθεί ένα αντίγραφο στο τμήμα της κλινικής έρευνας (CIC) και έγινε το τελευταίο αντίγραφο φυλάσσεται από τον υποκινητή (Εθνικό Ινστιτούτο επιστημονικής έρευνας στον τομέα της ιατρικής-INSERM). Έτσι, μία τυπική συγκατάθεση ήταν διαθέσιμη για κάθε ασθενή. Λεπτομερείς συνεντεύξεις για το ιατρικό ιστορικό και τη φυσική εξέταση εκτελέσθηκαν.

guaiac Τεστ Κρυφού Αίματος

Η δοκιμή guaiac Hemoccult εκτελέστηκε (που εκτελούνται σε ένα πιστοποιημένο εργαστήριο από τις γαλλικές αρχές στο Παρίσι) σε όλα τα θέματα συμφωνώντας να ενταχθούν στην μελέτη. Για το FOBT, απαιτήθηκε 1 δείγμα ανά κοπράνων από 3 συνεχόμενες κινήσεις του εντέρου. Σύμφωνα με το εν εξελίξει πρόγραμμα, μια ειδική διατροφή (νηστίσιμα για 3 ημέρες) συστήθηκε. Θέματα που συλλέγονται τα ίδια τα 3 δείγματα στο σπίτι (χρησιμοποιώντας την κάρτα κιτ για Hemoccult), καταγράφεται η ημερομηνία κάθε κίνηση του εντέρου που εμπλέκονται, και έστειλε τις δοκιμές με το ταχυδρομείο. Η ανάγνωση Hemoccult έγινε τυφλά από πιστοποιημένους τεχνικούς χωρίς ενυδάτωσης, σύμφωνα με τα πρωτόκολλα που καθορίζονται από το εθνικό πρόγραμμα οργανωμένου προσυμπτωματικού ελέγχου. Διαλογή θεωρήθηκε θετική εάν η δοκιμή Hemoccult ήταν θετική (τουλάχιστον 1 από τις 6 υποδοχές ήταν θετική).

Screening κολονοσκόπηση

Όλα τα άτομα που υποβλήθηκαν σε κολονοσκόπηση εξέταση υπό αναισθησία. Δεξιά και αριστερά θέσεις του παχέος εντέρου, καθώς και το ορθό, εξετάστηκαν πλήρως σε όλους τους ασθενείς. Τα κολονοσκόπηση αποτελέσματα καταγράφηκαν μετά τη συνήθη διαδικασία για ένα οργανωμένο πρόγραμμα προσυμπτωματικού ελέγχου στη Γαλλία. Οι πολύποδες απομακρύνθηκαν πλήρως κατά την εξέταση ενδοσκόπηση χρησιμοποιώντας mucosectomy, εάν απαιτείται. Η κολονοσκόπηση θεωρήθηκε η τυπική μέθοδος χρυσού. Οι κολονοσκόπηση ευρήματα κατατάσσονται σύμφωνα με την πιο προηγμένη παθολογική βλάβη που βρέθηκαν. Σύνθετη νεοπλάσματα περιλαμβάνονται προηγμένα αδενώματα (αδενώματα μέτρησης & gt? 10 χιλιοστά ή αδενώματα με υψηλού βαθμού δυσπλασία ή in situ καρκίνωμα) και επεμβατική CRC (εισβολή των κακοήθων κυττάρων πέραν του μυϊκού βλεννογόνου). Υπερπλαστικού πολύποδες δεν συμπεριλήφθηκαν ως νεοπλάσματα.

Η ποσοτικοποίηση της μεθυλίωσης με ποσοτική PCR

Ολικό DNA απομονώθηκε από δείγματα ούρων, ορού και κόπρανα χρησιμοποιώντας το κιτ Qiamp DNA Mini (Qiagen) και, στη συνέχεια, μετατρέπεται με όξινο θειώδες νάτριο και ενισχύονται χρησιμοποιώντας ειδικής θέσεως αρχικά τεμάχια PCR που πλευρίζουν έναν ανιχνευτή MGB. Το επίπεδο μεθυλίωσης για κάθε ασθενή προσδιορίσθηκε όπως περιγράφεται από τους Eads κ.ά. [25]. Οι συνθήκες της PCR ήταν 94 ° C για 10 λεπτά για την ενεργοποίηση του ενζύμου, 45 κύκλοι των 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 60 δευτερόλεπτα για την συγκόλληση και την επιμήκυνση PCR. Έχουμε επιβεβαιωμένα αποτελέσματα της μεθυλίωσης με άμεση θειώδους γονιδιωματικής αλληλουχίας στο 5% των προσβεβλημένων ασθενών ερευνήθηκαν για τους ιστούς τους για να αποκλείσουν ένα τεχνικό τεχνούργημα. Μια ομάδα 63 γονιδίων (τα δεδομένα δεν φαίνονται) που εξάγεται από τη βιβλιογραφία για πρώτη φορά αξιολογήθηκε, και στη συνέχεια 3 γονίδια που μας ενδιαφέρουν (Wif-1, ALX-4 και βιμεντίνης) επιλέχθηκαν με βάση την διακριτική αξίες τους που προσδιορίστηκαν με συγκρίσεις μεταξύ όγκου και φυσιολογικό ομόλογο εντερικούς ιστούς [26]. Η αποτελεσματικότητα των εκκινητών των γονιδίων στόχων (Wif1, ALX4 και βιμεντίνης) και το γονίδιο καθαριότητα (Αλβουμίνη BSP) για την είσοδο του τροποποιημένου DNA εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας σειριακές αραιώσεις του μεθυλιωμένου τροποποιημένου ελέγχων DNA όπως φαίνεται στο Σχήμα S1). Μετά από μια σκοπιμότητα σειρά πειραμάτων πραγματοποιήθηκαν σε κόπρανα, ούρα και ορό δείγματα 48 ασθενών, αποφασίσαμε να μετρούν μόνο επίπεδα μεθυλίωσης Wif-1 στο σύνολο επικύρωσης σύμφωνα με τις υψηλότερες ταχύτητες ευαισθησία και ειδικότητα του γονιδίου Wif-1 σε σύγκριση με ALX- 4 και βιμεντίνης. Οι αλληλουχίες εκκινητή και ανιχνευτή για μεθυλίωση των γονιδίων στόχων που παρατίθενται στον Πίνακα S1.

Η βακτηριακή ανάλυση των δειγμάτων κοπράνων χρησιμοποιώντας ποσοτική PCR

Ολόκληρα νωπά κόπρανα συλλέχθηκαν σε αποστειρωμένα κουτιά, και, μέσα σε 4 ώρες , 10 g καταψύχθηκαν στους -80 ° C για ανάλυση. Το βακτηριακό DNA εκχυλίστηκε από κλάσματα των κοπράνων, και μετά από την τελική καθίζηση, το DNA επαναιωρήθηκε σε 150 μΐ ΤΕ ρυθμιστικού και φυλάσσεται στους -80 ° C για περαιτέρω ανάλυση, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Χρησιμοποιήσαμε ένα πραγματικό χρόνο τεχνική qPCR να διερευνήσει την διαφορά σε βακτηριακά πυκνότητες εντός της μικροχλωρίδας μεταξύ των κανονικών και των προηγμένων νεοπλασίας και τα κόπρανα ασθενών με καρκίνο ». Οι εκκινητές και ανιχνευτές που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη έχουν περιγραφεί αλλού [26] και παρουσιάζονται στον Πίνακα S2. Σε πραγματικό χρόνο qPCR διεξήχθη χρησιμοποιώντας ΑΒΙ 7000 Sequence Detection System με λογισμικό έκδοσης 1.2.3 (Applied Biosystems-, Foster City, CA, USA), και το συνολικό αριθμό των βακτηρίων συναχθεί από τις κατά μέσο όρο πρότυπες καμπύλες και εκφράζονται ως log10 αξίες, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. τιμές qPCR ελήφθησαν ανά ασθενή και για κάθε συστατικό έντερο μικροχλωρίδας. Για να αντισταθμιστεί το γεγονός ότι τα δείγματα κοπράνων μπορεί να περιέχει περισσότερο ή λιγότερο νερό, τα δεδομένα για κάθε δείγμα κοπράνων κανονικοποιήθηκαν, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [26]. Το επίπεδο βρέθηκαν για κάθε συγκεκριμένο κυρίαρχο και υπο-κυρίαρχο πληθυσμό βακτηρίων αφαιρέθηκε από τις all-βακτήρια περιεχόμενο, και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως ο λογάριθμος του αριθμού των βακτηρίων ανά γραμμάριο κοπράνων. Αυτές οι δοκιμασίες χρησιμοποιήθηκαν για να συγκρίνουν τη σύνθεση της εντερικής μικροχλωρίδας όλων των θεμάτων, και τα αποτελέσματα εκφράζονται ως μέσοι όροι ± SD.

KRAS ανάλυση μετάλλαξης

DNA ενισχύθηκε σε διπλότυπα με PCR με ένα αλληλόμορφο-ειδική ομάδα εναρκτήρα που καλύπτει εξόνια 12 και 13 του γονιδίου Kras [27]. Οι συνθήκες PCR ήταν 94 ° C για 10 λεπτά, 45 κύκλοι των 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα και 60 ° C για 60 δευτερόλεπτα για την συγκόλληση και την επιμήκυνση PCR. Χρησιμοποιήθηκαν δύο ομάδες εκκινητών PCR και ανιχνευτές: ένα σετ ήταν ειδική για τα άγρια ​​αλληλόμορφο DNA και το δεύτερο σετ αντιπροσώπευε το αλληλόμορφο μετάλλαξη. Οι αλληλουχίες εναρκτήρα και διερευνητή που παρατίθενται στον Πίνακα S3.

Στατιστική ανάλυση

Τα χαρακτηριστικά του κάθε ασθενούς που περιγράφεται ως αριθμός (%) για ποιοτικά δεδομένα και ως διάμεσος (διατεταρτημοριακό εύρος, IQR) ή μέση (± 1 τυπική απόκλιση, SD) για ποσοτικών δεδομένων, σύμφωνα με την κατανομή τους. Συγκρίναμε τα αρχικά χαρακτηριστικά των ασθενών και των δύο ομάδων (προηγμένη νεοπλασία και ελέγχου ομάδες) χρησιμοποιώντας το τεστ chi-square Pearson ή ακριβές τεστ του Fisher για ποιοτικές μεταβλητές και μη παραμετρικές Wilcoxon ή δοκιμές Kruskal- Wallis για τις ποσοτικές μεταβλητές. δίπλευρη τεστ Spearman χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση των συσχετίσεων.

Οι αναλογίες πιθανοτήτων (OR) και 95% διαστήματα εμπιστοσύνης (ΠΙ) της κάθε παραμέτρου εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας ξεχωριστά λογιστικής παλινδρόμησης αναλύσεις. Τα περιττώματα αποτελέσματα μικροχλωρίδας dysbiosis δόθηκαν για 1 SD των log-μετασχηματιστεί επίπεδα υπολογίζονται για κάθε ομάδα ελέγχου. Η ανάλυση ήταν συστηματικά ηλικία προσαρμοσμένο να εκτιμηθεί ανεξάρτητα την ακρίβεια των επιδόσεων του κάθε τεστ προσυμπτωματικού ελέγχου. Ηλικία διακινούνται σε συνεχή αφού επαληθεύσουν υπόθεση ομαλότητας. Βαθμονόμηση του κάθε μοντέλου εκτιμήθηκε από την στατιστική Hosmer-Lemeshow στην οποία ένα

σ

τιμή μεγαλύτερη από 0,20 υποδεικνύει επαρκής προσαρμογή. Η διάκριση του μοντέλου μας εκτιμήθηκε από το C-στατιστικό (περιοχή κάτω από την καμπύλη ROC), η οποία υπολογίζεται από το πολυπαραγοντικό μοντέλο λογιστικής παλινδρόμησης. Τα C-στατιστικά στοιχεία από τα μοντέλα με και χωρίς την προηγμένη νεοπλασία συγκρίθηκαν χρησιμοποιώντας μια μη παραμετρική δοκιμασία που αναπτύχθηκε από Delong et al και κατάλληλα για τη μη ανεξάρτητων δεδομένων [28]. Μια αναδειγματοληψία bootstrap ανάλυση με 1000 επαναλήψεις του αρχικού συνόλου δεδομένων έγινε για να εκτιμηθεί το 95% των πιστωτικών ιδρυμάτων της C-statitistics των πολυπαραγοντικά μοντέλα. Η διάκριση έγινε επίσης ποσοτικά με τον υπολογισμό του δείκτη Καθαρό Βελτίωση Ανακατατάξεις (NRI) [29].

Όλες οι συγκρίσεις ήταν 2 όψεων και ένα

σ

τιμή μικρότερη του 0,05 έδειξε μία στατιστικά σημαντική διαφορά . Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας την έκδοση του λογισμικού STATA 12.0 (Stata- Corp, College Station, TX, USA).

Αποτελέσματα

πληθυσμός Μελέτη

Διακόσια σαράντα επτά ασθενείς συμπεριλήφθηκαν στη μελέτη. Τα χαρακτηριστικά του πληθυσμού της μελέτης παρατίθενται στον Πίνακα 1. Όλα τα άτομα υποβλήθηκαν σε κολονοσκόπηση με πλήρη εξέταση του δεξιού και του αριστερού κόλον και το ορθό. Οι ασθενείς στη συνέχεια ταξινομούνται ως εξής: φυσιολογικά άτομα που παρουσιάζονται είτε με κανονική κολονοσκόπηση (n = 123) ή μικρό αδενώματα λιγότερο από 1 cm σε διάμετρο (n = 34) έχουν εδώ θεωρούνται ότι είναι οι έλεγχοι και οι ασθενείς με νεοπλασία που παρουσιάζονται με CRC ( n = 66) ή μεγάλα (& gt? 1 cm σε διάμετρο) αδενώματα (n = 24) έχουν εδώ θεωρούνται περιπτώσεις. Η μέση υπόθεση ήταν περισσότερο από 10 χρόνια μεγαλύτερος από τον μέσο ασθενή ελέγχου. Οι ασθενείς της ομάδας ελέγχου αναφέρθηκαν λιγότερο συχνά μια προηγούμενη προσωπική ιστορία των πολυπόδων και καρκίνου του παχέος εντέρου στην οικογένειά τους σε σύγκριση με τις περιπτώσεις. Οι δύο ομάδες ήταν εξίσου ισορροπημένη ως προς το ΒΜΙ, συνοδά νοσήματα, την πρόσληψη ιατρική και θεραπευτική τροφή (Πίνακας 1).

Η

Ανάλυση του Κρυφού Αίματος Hemoccult

Η δοκιμή Hemoccult guaiac-based δεν ήταν ερμηνεύσιμο σε 2 περιπτώσεις. Συνολικά, η FOBT ήταν θετική σε 46 ασθενείς από τους οποίους 36 (78%) είχαν προχωρημένο νεοπλασία, συμπεριλαμβανομένων 33 (72%) CRCs. Μεταξύ των 199 ασθενών με αρνητικό FOBTs, 146 (73%) ασθενείς είχαν φυσιολογική κολονοσκοπήσεις ή μικρά αδενώματα, ενώ 53 (27%) είχαν προηγμένη νεοπλασία, εκ των οποίων 33 (17%) με CRC. Έτσι, η ευαισθησία και η ειδικότητα της FOBT για προχωρημένους νεοπλάσματα ήταν 40,4% και 93,6%, αντίστοιχα.

Methylated Wif-1, ALX-4, και βιμεντίνης στον ορό, ούρα και κόπρανα

Τα επίπεδα μεθυλίωσης του Wif-1, ALX-4 και τα γονίδια βιμεντίνης αρχικά εκτιμήθηκαν σε δείγματα κοπράνων. Στο συνολικό πληθυσμό, υπερμεθυλίωση Wif-1, ALX-4 και τα γονίδια βιμεντίνης παρατηρήθηκε στο 7,3%, 4,5% και 0,8%, αντίστοιχα (Πίνακας 2). Για κάθε γονίδιο (Wif-1, ALX-4 και βιμεντίνης), παρεκκλίνουσα μεθυλίωση ήταν σημαντικά πιο συχνή σε ασθενείς περίπτωση σε σχέση με τον έλεγχο των ασθενών (19,3%

vs.

0,6%, 10,6%

vs.

1,3% και 32,6%

vs

. 0,0%, αντίστοιχα) (Πίνακας 2). Για κάθε γονίδιο, η εξειδίκευση ήταν πάνω από 98%, αλλά με μια χαμηλή ευαισθησία κάτω από 25%. Για την Wif-1 και ALX-4 γονίδια, αλλά όχι το γονίδιο βιμεντίνης, το επίπεδο μεθυλίωσης ήταν σημαντικά πιο αυξημένα σε ασθενείς περίπτωση σε σύγκριση με τον έλεγχο άτομα (Σχήμα 1).

Η

Η μεθυλίωση επίπεδα Wif-1, ALX-4, και βιμεντίνης στη συνέχεια αξιολογήθηκαν σε δείγματα ούρων και ορού. Wif-1 φαίνεται να είναι η πιο ευαίσθητος δείκτης των προηγμένων νεοπλασίας σε δείγματα ούρα ή στον ορό (52% και 29%) σε σύγκριση με ALX-4 και βιμεντίνης (23% και 15% έναντι 4% και 8%, αντίστοιχα). Ιδιαιτερότητα ήταν υψηλότερη από 93% σε όλες τις περιπτώσεις. Ο συνδυασμός των ούρων και το επίπεδο WIF-1 μεθυλίωση ορού οδήγησε σε υψηλότερο ποσοστό ευαισθησία 60,4% [30].

Το επίπεδο της μεθυλίωσης του Wif-1 στη συνέχεια αξιολογήθηκε σε δείγματα ούρα ή ορό για ολόκληρη την επικύρωση ομάδα, η οποία περιελάμβανε 247 ασθενείς. Η υπερμεθυλίωση Wif-1 παρατηρήθηκε στα δείγματα ούρων και ορού σε 26,7% και 32,6% των περιπτώσεων και σε 1,3% και 1,3% των ατόμων ελέγχου, αντίστοιχα (ρ & lt? 0.001 και ρ & lt? 0.001). Ο συνδυασμός του ορού και ούρων αύξησε το ποσοστό ανίχνευσης νεοπλασία στο 47,8% των περιπτώσεων, σε σύγκριση με το 2,5% σε ελέγχους (Πίνακας 2). Το επίπεδο μεθυλίωσης ήταν σημαντικά πιο αυξημένα σε περιπτώσεις σύγκριση με τους ελέγχους είτε ορό ή δείγματα ούρων (Σχήμα 1). Δεν διαπιστώθηκε καμία διαφορά για τα διάφορα στάδια καρκίνου του παχέος εντέρου, σύμφωνα με τη Μικτή Επιτροπή αμερικανική σχετικά με την ταξινόμηση του καρκίνου

κοπράνων μικροχλωρίδας dysbiosis σε προχωρημένο αδενώματα (& gt? 10 mm). Και του παχέος εντέρου

Η κοπράνων μικροχλωρίδας σύνθεση ήταν διαθέσιμη για όλα τα θέματα και παρουσιάζεται στον πίνακα 3. Στους ασθενείς περίπτωση, κοπράνων μικροχλωρίδας dysbiosis χαρακτηριζόταν από μια υψηλότερη πυκνότητα από είδη που ανήκουν στο

Bacteroides /Prevotella

ομάδα vs. μάρτυρες. Λαμβάνοντας υπόψη όλα τα άτομα μαζί, το

Bacteroides /Prevotella

ομάδα που δεν συνδέονται με την ηλικία (r = 0,09? P = 0,62) ή ΒΜΙ (r = 0,20 και p = 0,24)

Η

ανάλυση μετάλλαξης Kras σε δείγματα κοπράνων

Kras μεταλλάξεις (εξόνιο 12 και 13) σε δείγματα κοπράνων βρέθηκαν σε 16 (18%) ασθενείς με προχωρημένο νεοπλασία σε σύγκριση με 16 (10%) άτομα στην ομάδα ελέγχου. Η ευαισθησία και η ειδικότητα ήταν 17.8% και 89.8% για β Kras μεταλλάξεων, αντίστοιχα. Δεν βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ μεταλλάξεων Kras και αλλαγές μικροχλωρίδας ή Wif-1 μεθυλίωση όποτε κρίθηκε στα κόπρανα, αίμα ή ούρα.

Ακρίβεια δοκιμασίες προσυμπτωματικού ελέγχου για τον εντοπισμό προηγμένες νεοπλασία

Οι πολυπαραγοντική OR για κάθε παράμετρος για την παρουσία των προηγμένων νεοπλασίας δείχνονται στον πίνακα 4. σε ένα πολυμεταβλητό μοντέλο ρυθμίστηκε για την ηλικία, το άρρεν φύλο [OR = 2,02? CI 95% (1,07 – 3,82), p = 0,03], ιστορικό πολυπόδων [OR = 0,24? CI 95% (0,11 – 0,55), p = 0.001] και οικογενειακό ιστορικό CRC [OR = 0,50? CI 95% (0,27 – 0,95), p = 0.03) συσχετίστηκαν ανεξάρτητα με την παρουσία των προηγμένων νεοπλασίας.

Η

Όταν η ηλικία και τα αποτελέσματα του FOBT θεωρήθηκαν στο ίδιο μοντέλο (υπόδειγμα 1) , ένα θετικό FOBT συσχετίστηκε ανεξάρτητα με προχωρημένο νεοπλασία. Σε ένα παρόμοιο μοντέλο με τα αποτελέσματα των ούρων ή δοκιμασία μεθυλίωσης ορού Wif-1 (υπόδειγμα 2), ένα θετικό τεστ μεθυλίωση Wif-1 συσχετίστηκε ισχυρώς με προηγμένες νεοπλασία (Χαμηλότερο όριο του 95% CI: 18.7). Προσαρμογή τόσο με FOBT και ούρων ή η δοκιμή Wif-1 μεθυλίωση του ορού (μοντέλο 3) έδειξε ότι τα ούρα ή δοκιμασία Wif-1 μεθυλίωση ορό παρέμεινε σε μεγάλο βαθμό συνδέονται με την προηγμένη νεοπλασία (κατώτερο όριο του 95% CI: 14.41), ενώ η FOBT δεν ήταν πλέον σημαντική.

Όταν θεωρήθηκαν ηλικία και κοπράνων dysbiosis microbiota, μόνο το

Bacteroides /Prevotella

ομάδα που συνδέεται με την προηγμένη νεοπλασία (μοντέλο 4). Όταν ο κοπράνων dysbiosis μικροχλωρίδα και τα αποτελέσματα του FOBT θεωρήθηκαν στο ίδιο μοντέλο (μοντέλο 5), μόνο το FOBT συνδέθηκε με την προηγμένη νεοπλασία.

Συμβολή του κάθε μοντέλου σε προηγμένες πρόβλεψη νεοπλασία

Η καλοσύνη της προσαρμογής του μοντέλου πρόβλεψης που περιλάμβανε μόνο την ηλικία και το FOBT ήταν επαρκής (

σ

αξία της στατιστικής Hosmer Lemeshow = 0,58). Όπως φαίνεται στον Πίνακα 4, η ακρίβεια (αξιολογήθηκε από C-στατιστική) του εν λόγω μοντέλου ήταν σημαντικά χαμηλότερη από ό, τι στα ούρα ή /και δοκιμασία μεθυλίωσης ορού Wif-1 (μοντέλο 2 αύξησε την C-στατιστική 8,6%). Η βελτίωση αυτή (που αξιολογήθηκε από C-στατιστική και Net Ανακατατάξεις Δείκτης Βελτίωση) ήταν σημαντικά υψηλότερο στο μοντέλο που συνδύαζε τα ούρα ή /και δοκιμών Wif-1 μεθυλίωση του ορού και το FOBT (μοντέλο 3 αύξησε τη C-στατιστική του 9,8% και του NRI 22,8%). Δοκιμές για κοπράνων μικροχλωρίδας dysbiosis (μοντέλο 4) είχαν ακρίβεια παρόμοια με το FOBT. Συνδυάζοντας FOBT και δοκιμών για κοπράνων μικροχλωρίδας dysbiosis δεν αύξησε την τελευταία ακρίβεια του μοντέλου (μοντέλο 5 δεν αυξάνουν την C-στατιστική και την NRI).

Συζήτηση

CRC είναι μια σημαντική αιτία της θνησιμότητας και την οικονομική επιβάρυνση στις ανεπτυγμένες χώρες. Η προσπάθεια για τη μείωση της θνησιμότητας από την ασθένεια έχει οδηγήσει τα συστήματα δημόσιας υγείας να δώσουν προτεραιότητα στις μαζικές προβολές χρησιμοποιώντας FOBT σε ασυμπτωματικά άτομα. Πράγματι, έχει αποδειχθεί ότι FOBTs μειωμένη CRC-σχετίζεται θνησιμότητα [7], [8], [9], [10]. Αν και ανοσοχημική μέτρηση της αιμοσφαιρίνης έχει δειχθεί ότι είναι πιο ευαίσθητη από FOBT με παρόμοια εξειδίκευση, ο μεγάλος αριθμός των ατόμων που είναι απρόθυμοι να εκτελέσει την κοπράνων δοκιμή μπορεί να περιορίσουν τη χρήση της. Η αποτελεσματικότητα των στρατηγικών αυτών εξαρτάται κυρίως από την αποδοχή και τη σχέση κόστους-αποτελεσματικότητας της μεθόδου διαλογής. Σε αυτή τη ρύθμιση, το αίμα και εξέταση ούρων θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε άτομα ενδεχομένως απρόθυμοι να υποβληθούν σε κόπρανα δοκιμές.

Στην παρούσα μελέτη, συγκρίναμε την διαγνωστική απόδοση του μεθυλιωμένου Wif-1, μια εκκρινόμενη ανταγωνιστής του μονοπατιού σηματοδότησης Wnt , ως βιοδείκτη της προηγμένης παχέος νεοπλασίας σε δείγματα κοπράνων, ορό και τα ούρα. Έχουμε περιλαμβάνονται επίσης κλινικά χαρακτηριστικά στη διαδικασία ελέγχου και πραγματοποιείται υποψήφιους FOBTs ως ένα χρυσό πρότυπο. Βρήκαμε ότι μεθυλιωμένα Wif-1 είχε την υψηλότερη διαγνωστική απόδοση για να προβλέψει την προηγμένη νεοπλασία σε σχέση με τα κλινικά χαρακτηριστικά, FOBTs και αλλαγές microbiota, μόνα τους ή σε συνδυασμό. Αυτό το εύρημα έχει μεγάλο ενδιαφέρον επειδή ένα σημαντικό αριθμό ασθενών να αρνηθεί να εκτελέσει το FOBT [31].

Έτσι, για την εκτέλεση FOBT στην παρούσα μελέτη, Wif-1 χρησιμοποιήθηκε για να ξεπεραστούν οι περιορισμοί της FOBT επειδή παρόμοιων διαγνωστική απόδοση της, με 47,8% ευαισθησία και 97,5% ειδικότητα. Καρκίνος του παχέος εντέρου νεοπλασματικά κύτταρα έχει αποδειχθεί ότι είναι ένα μεγάλο παράδειγμα, λόγω της ετερογένειας των μοριακών οδών που εμπλέκονται στην ανάπτυξη τους [32], [33], [34], [35]. Στις περισσότερες περιπτώσεις, η αρχική γονιδιωματική μεταβολή του

APC /Wnt

μονοπάτι σηματοδότησης ακολουθείται από την συσσώρευση πρόσθετες μεταλλάξεις οδηγού [36]. Η σχέση αυτή έχει οδηγήσει τους ερευνητές να πιστεύουν ότι ένα ενιαίο δείκτη DNA δεν μπορεί να είναι ένα πολύτιμο δείκτη για CRC έλεγχο. Στη μελέτη μας, ο έλεγχος για την Kras μεταλλάξεων σε δείγματα κοπράνων έχει επιβεβαιώσει αυτό το δόγμα, δείχνοντας πολύ συγκεκριμένο, αλλά πολύ κακώς ευαίσθητα αποτελέσματα. Η χρήση ενός πάνελ κοπράνων DNA της 21ης ​​μεταλλάξεις γονιδίων έδειξε υψηλότερη ευαισθησία από ό, τι το FOBT αλλά έχει ένα σημαντικό περιορισμό του κόστους [12]. Ανίχνευση παρεκκλίνουσα μεθυλίωση έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι είναι πιο ευαίσθητη από την ανίχνευση του γονιδίου μετάλλαξης [37]. Επιπλέον, παρεκκλίνουσα μεθυλιώσεις μπορούσε επίσης να ανιχνευθεί στην κυκλοφορία του DNA, όπως αυτό που βρέθηκε στα κόπρανα, ορό, ούρα και άλλα υγρά του σώματος [39]. Σε αυτή τη μελέτη, δείχνουμε ότι η δοκιμή μεθυλίωση Wif-1 είναι μια ακριβής δείκτης της προηγμένης παχέος νεοπλασίας σε ένα αρχικό σετ των αξιολογήσεων. Επιπλέον, δείχνουμε επίσης ότι είτε τα ούρα ή το αίμα δείγματα θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για να προσδιοριστεί το επίπεδο μεθυλίωσης. Ειδικότερα, ο δείκτης αυτός μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε άτομα που είναι απρόθυμα να πραγματοποιήσει δοκιμές σκαμνί. Αξίζει να σημειωθεί ότι, η απόδοση των FOBT αποκαλύπτεται μια χαμηλότερη ευαισθησία από ό, τι προηγουμένως. Αυτή η διαφορά θα μπορούσε να εξηγηθεί από την επιλογή ενός πρωτογενούς αποτελέσματος που έχουν συμπεριλάβει ασθενείς με προχωρημένο νεοπλασία η οποία είναι πολύ μεγαλύτερη σημασία στην κλινική πράξη και από τον πληθυσμό της μελέτης που περιελάμβανε ασθενείς με μέση ή υψηλού κινδύνου του CRC. Αυτή η διαφορά θα μπορούσε να εξηγήσει με την επέκταση του αποτελέσματος σε ασθενείς με προχωρημένο νεόπλασμα το οποίο είναι πολύ πιο αξιόπιστο στην κλινική πρακτική και από τον πληθυσμό της μελέτης, συμπεριλαμβανομένων των ασθενών με μέσο έως υψηλό κίνδυνο CRC. Ωστόσο, η επέκταση ενός τέτοιου τεστ για τα προγράμματα μαζικής διαλογής απαιτεί περαιτέρω επικύρωση σε ασυμπτωματικά άτομα, καθώς και αναλύσεις κόστους-αποτελεσματικότητας σε ένα μοντέλο προσομοίωσης, όπως έχει ήδη αναφερθεί [38].

Επιπλέον, για να βελτιωθεί η ακρίβεια των βιολογικών δοκιμών για την πρόβλεψη της νεοπλασιών κατά την διάρκεια κολονοσκοπήσεις, ερευνήσαμε δείκτες στο microbiota, το οποίο καθίσταται ένα νέο πεδίο για μελέτες ανθρώπινη ασθένεια. Η συμβολή της εντερικής μικροχλωρίδας στο CRC ογκογένεση είναι πλέον πλήρως αποδεκτή [39]. Οι τεχνικές προσδιορισμού αλληλουχίας High throughput για το ανθρώπινο microbiome έχουν χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση αλλαγές στο βακτηριακό φυλογενετικό πυρήνα σε φυσιολογικά άτομα και σε ασθενείς CRC, είτε σε κόπρανα ή τον βλεννογόνο που σχετίζεται μικροχλωρίδας [21], [22]. Αρκετά βακτηρίδια ομάδες, δηλαδή,

Bacteroides /Prevotella

[21],

Fusobacterium

,

Faecalibacterium

και ιδιαίτερα

Coriobacteridae

και

είδη Roseburia

[22], έχει αποδειχθεί ότι σχετίζονται με CRC, και πειραματικά μοντέλα έχουν υποστηρίξει αυτή την αιτιώδη συνάφεια υπόθεση [24].

Fusobacterium nucleatum έχουν

στελέχη έχουν δειχθεί ότι προάγει παχέος καρκινογένεση από την εισβολή των επιθηλιακών κυττάρων με την παραγωγή genotoxin σχετίζονται βλάβη άμεση DNA ή με επαγωγή φλεγμονής [23], [40], [41]. Στην παρούσα μελέτη, επιβεβαίωσε μια συγκεκριμένη dysbiosis που σχετίζονται με την προηγμένη παχέος νεοπλασία χαρακτηρίζεται από υψηλότερη πυκνότητα των ειδών που ανήκουν στο

Bacteroides /Prevotella

ομάδα. Ωστόσο, το αποτέλεσμα αυτό δεν βελτίωσε την απόδοση προβολή της FOBT ή τη δοκιμή Wif-1. Οι μελλοντικές μελέτες που χρησιμοποιούν βαθύτερα μεθόδους αλληλούχισης και /ή μεταγονιδιωματική προσεγγίσεις δικαιολογείται να ενεργοποιήσετε ένα εργαλείο διαλογής με βάση κοπράνων μικροχλωρίδας.

Συμπέρασμα

Σε αυτή τη μελέτη, η ανίχνευση μεθυλιωμένων Wif-1 στα κόπρανα, ούρα ή τα δείγματα ορού έχει μεγαλύτερη ακρίβεια τη διάγνωση για τον εντοπισμό προηγμένες νεοπλασία σε σχέση με FOBT (0,90 [0,84 – 0,94] έναντι 0,83 [0,77 – 0,88], p = 0.02). Απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να διερευνηθεί κατά πόσο οι αλλαγές στη μικροχλωρίδα μπορεί να είναι βιολογικοί δείκτες των προηγμένων παχέος νεοπλασίας, ιδιαίτερα με τη χρήση υποψήφια βακτήρια και μεταγονιδιωματική μελέτες. Wif-1 τεστ μεθυλίωση του ορού και ούρων θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί σε άτομα διστάζουν να υποβάλλονται σε τεστ κοπράνων και θα πρέπει να αξιολογούνται τώρα στο πλαίσιο του ελέγχου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Αποδοτικότητα των εκκινητών των γονιδίων στόχων (Wif1, ALX-4 και βιμεντίνη) και το γονίδιο καθαριότητας (αλβουμίνη BSP) που χρησιμοποιούνται για μεθυλίωση ποσοτικοποίηση χρησιμοποιώντας διαδοχικές αραιώσεις μεθυλιωμένο τροποποιημένων ελέγχου του DNA. Για κάθε σημείο δεδομένων διεξήχθησαν τρία ανεξάρτητα ανάλυση. Η εξίσωση της γραμμικής καμπύλης παλινδρόμησης, καθώς και ο συντελεστής συσχέτισης που αναγράφεται σε κάθε γράφημα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0099233.s001

(DOC)

Πίνακα S1. .

Methylated γονίδιο στοχευμένες εκκινητών και ανιχνευτών

doi: 10.1371 /journal.pone.0099233.s002

(DOCX)

Πίνακας S2.

Ομίλου και συγκεκριμένα είδη γονίδιο στοχευμένες εκκινητών και ανιχνευτών 16S rRNA

doi:. 10.1371 /journal.pone.0099233.s003

(DOCX)

Πίνακα S3.

Kras εκκινητές μετάλλαξης και ανιχνευτές

doi:. 10.1371 /journal.pone.0099233.s004

(DOC)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε Μ Goossens , Κ Leroy, R. Inchitti, Β Coste, Β Ghaleh-Marzban, O. Montagne, ML. Auriault, MT. Chaumette, Σ Vialette, F. Bouabbas, J. Francese, R. Jian, Τ Aparicio, Δ Abdelrahman, H. Hagège, Α Courillon Mallet, JL. Dupas, R. Benamouzig, Μ Cavicchi, Cl. Altman, Ε Zrhien, Γ Tordjman, F. Venezia, F. Uzzan, Δ Ζιλό, P. De Fleury, Μ Algard, Μ Prieto, Μ Petit, J. Samama, Δ Lucienne, JC. Delchier, Μ Levy, και Α Charachon για χρήσιμες συμβολή τους στην παρούσα μελέτη.