Abstract

Ιστορικό

Διφθερίτιδα τοξίνη (DT) έχει χρησιμοποιηθεί ως ένα υποψήφιο αντι-καρκινικό παράγοντα για τη στοχευμένη διανομή της κυτταροτοξικής θεραπείας για διαφορετικά ανίατες νεοπλασία. DT είναι μια εξαιρετικά ισχυρή τοξίνη, για τα οποία η είσοδος ενός μορίου σε ένα κύτταρο μπορεί να είναι θανατηφόρα. DT έχει γίνει στόχος στα καρκινικά κύτταρα με τη διαγραφή του τομέα κυτταρικής δέσμευσης υποδοχέα και συνδυάζοντας το υπόλοιπο καταλυτικό τμήμα με στόχευση πρωτεϊνών που δεσμεύονται επιλεκτικά στην επιφάνεια των καρκινικών κυττάρων. Έχει υποτεθεί ότι «receptorless» DT δεν μπορεί να συνδεθεί με και να σκοτώσει κύτταρα. Στην παρούσα μελέτη, αναφέρουμε ότι «receptorless» ανασυνδυασμένη DT385 είναι στην πραγματικότητα κυτταροτοξική σε μια ποικιλία κυτταρικών σειρών καρκίνου.

Μέθοδοι

In vitro

κυτταροτοξικότητα της DT385 ήταν μετράται από τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, χρώση των κυττάρων και δοκιμασίες απόπτωσης. Για

in vivo μελέτες

, το σύστημα χοριοαλλαντοϊκή μεμβράνη όρνιθας (CAM) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η επίδραση της DT385 επί της αγγειογένεσης. Το CAM και το μοντέλο ποντικού σύστημα χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η επίδραση της DT385 επί ΗΕρ3 και Lewis καρκίνωμα του πνεύμονα (LLC) την ανάπτυξη του όγκου, αντίστοιχα.

Αποτελέσματα

Από τις 18 ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, 15 επηρεάστηκαν από DT385 με IC

50 κυμαίνονται 0,12 – 2,8 μΜ. Επιπλέον, οι υψηλές συγκεντρώσεις DT385 απέτυχε να επηρεάσει την ανάπτυξη συνελήφθη κύτταρα. Η κυτταρική τοξικότητα του DT385 οφειλόταν στην αναστολή της σύνθεσης πρωτεϊνών και επαγωγή απόπτωσης.

In vivo

, DT385 μειωμένη αγγειογένεση και μειωμένη ανάπτυξη του όγκου στο σύστημα CAM, και ανέστειλε την υποδόρια αύξηση όγκων σε ποντίκια LLC.

Συμπέρασμα

DT385 διαθέτει αντι-αγγειογενετική και αντι-όγκου και μπορεί να έχει δυναμικό ως θεραπευτικός παράγοντας

Παράθεση:. Zhang Υ, Schulte W, ροζ D, Phipps Κ, Zijlstra Α, Lewis JD, et al. (2010) ευαισθησία των κυττάρων του καρκίνου στο περικομμένο Διφθερίτιδα τοξίνη. PLoS ONE 5 (5): e10498. doi: 10.1371 /journal.pone.0010498

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Ίδρυμα Bauer Έρευνας, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: πέμπτης Νοέμβρη του 2009? Αποδεκτές: 14η Απριλίου 2010? Δημοσιεύθηκε: 5 Μάη 2010

Copyright: © 2010 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από μια επιχορήγηση από το Ίδρυμα Nova Scotia Ερευνών Υγείας (NSHRF). YZ υποστηρίζεται από μια υποτροφία από το Πρόγραμμα Έρευνας για τον Καρκίνο Εκπαίδευσης, Πανεπιστήμιο Dalhousie. JDL υποστηρίζεται από επιχορήγηση # 018176 από το Ίδρυμα NCIC /Terry Fox. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τοξίνη διφθερίτιδας (DT) συντίθεται σε

Corynebacterium diphtheriae

ως ένζυμο απλής αλυσίδας 535 αμινοξέων με ένα μοριακό βάρος από 63.000 [1], [2]. DT αποτελείται από τρεις βασικές περιοχές: η αμινοτελική C, ή καταλυτική, τον τομέα (υπολείμματα 1-186)? το ενδιάμεσο Τ, ή διαμεμβρανική περιοχή (υπολείμματα 202-381)? και το καρβοξυλ-τερματικό R, ή δέσμευσης υποδοχέα, περιοχή (κατάλοιπα 391-535). Ο καταλυτικός τομέας συνδέεται με τον τομέα Τ από μία πλούσια σε αργινίνη βρόχου και μία άμεσα αναγώγιμα γέφυρα δισουλφιδίου (σύνδεση C186 έως C201). DT έχει δειχθεί ότι εισέρχονται σε κύτταρα θηλαστικών τοξίνη ευαίσθητα με ενδοκυττάρωση με μεσολάβηση υποδοχέα η οποία περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση της περιοχής δέσμευσης υποδοχέα της πρωτεΐνης με μία επιφάνεια διαμεμβρανική κυτταρικής πρόδρομο της δέσμευσης ηπαρίνης επιδερμικού αυξητικού παράγοντα αυξητικού παράγοντα [3] , [4]. Μετά δέσμευση σε αυτόν τον υποδοχέα κυτταρικής επιφάνειας, DT ενδοκυτταρώνεται και διακινείται σε ένα όξινο κυστικό διαμέρισμα, όπου υποβάλλεται σε μια εξαρτώμενη από το ρΗ διαμορφωτική αλλαγή, διάσπαση και απελευθέρωση του καταλυτικού τομέα. Η περιοχή Τ εισάγει μέσα στην φυσαλιδώδους μεμβράνη και το προκύπτον κανάλι χρησιμοποιείται για την μετατόπιση της καταλυτικής περιοχής στο κυτοσόλιο. Εκεί, η καταλυτική υπομονάδα καταλύει την ΑϋΡ-ριβοσυλίωση του παράγοντα επιμηκύνσεως 2, με αποτέλεσμα την αναστολή της σύνθεσης πρωτεϊνών και κυτταρικού θανάτου (που επισκοπείται στο [5]).

έχουν παραχθεί ένας αριθμός περικομμένο, ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών DT στην οποία η περιοχή δέσμευσης υποδοχέα έχει γενετικά αντικατασταθεί από συνδέτες που μπορούν να στοχεύσουν επιλεκτικά κακοήθη κύτταρα. Αυτές οι πρωτεΐνες σύντηξης αντιπροσωπεύουν μία νέα κατηγορία κυτταροτοξικών παραγόντων που, σε αντίθεση με chemotherapeuticDT έχει δειχθεί ότι εισέρχονται σε κύτταρα θηλαστικών τοξίνη ευαίσθητα με ενδοκυττάρωση με μεσολάβηση υποδοχέα η οποία περιλαμβάνει την αλληλεπίδραση της περιοχής δέσμευσης υποδοχέα της πρωτεΐνης με φάρμακα, σκοτώνουν στοχευμένα κύτταρα μέσω της αναστολής πρωτεϊνική σύνθεση και έτσι να επάγει απόπτωση [6]. Αυτές οι πρωτεΐνες σύντηξης περιλαμβάνουν DT508-ΓΧΣ [7], DT486-IL-2 [8], DT486-GM-CSF [9], DT390-IL3 [10], DT388-GM-CSF [11] – [13], DT388 -IL-3 [14], [15], DT385-VEGF [16], [17] και DT388 σε συνδυασμό με τον τομέα ATF του υΡΑ [18]. Μεταξύ των προκυπτόντων φάρμακα, DT388IL-3 έχει δείξει κάποια υπόσχεση σε κλινικές δοκιμές [19], [20], ενώ το DT389-IL-2 ανασυνδυασμένη τοξίνη (DAB389-IL-2, denileukin diftitox-Ontak) έχει εγκριθεί από το FDA για κλινική χρήση σε προχωρημένο Τ-κυττάρων στάδιο δερματικού λεμφώματος (που επισκοπείται στο [21] – [23]

είναι ευρέως αποδεκτό ότι η αποτελεσματικότητα των πρωτεϊνών σύντηξης DT έγκειται στην ικανότητα του συστατικού συνδέτη στόχευσης σε. κατευθύνουν την DT στα καρκινικά κύτταρα με αποτέλεσμα την στοχευμένη κυτταρική τοξικότητα. Επιπλέον, η αφαίρεση της περιοχής δέσμευσης υποδοχέα DT αναμένεται να οδηγήσει σε μια κολοβωμένη DT που δεν είναι σε θέση να αλληλεπιδρά με τον υποδοχέα του στην επιφάνεια των ευκαρυωτικών κυττάρων και ως εκ τούτου δεν μπορεί να δεσμεύσει και να σκοτώνουν τα κύτταρα. Αυτή η έννοια έχει ενισχυθεί από την έκθεση ότι η κομμένη DT (DT385) δεν είναι κυτταροτοξική [16].

στην παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι σε αντίθεση με προηγούμενες εκθέσεις, το ανασυνδυασμένο περικομμένο DT , DT385 είναι κυτταροτοξική σε πολλά καρκινικά κύτταρα. επίσης παρατηρήσαμε ότι DT385 αναστέλλει την ανάπτυξη των ανθρώπινων και ποντικού όγκων. Τα ευρήματά μας αποδεικνύουν την αποτελεσματικότητα του DT385 ως δυνητικό αντικαρκινικό μέσο.

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές Γραμμές

Ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVEC) ελήφθησαν από την Cell Applications, Inc. και αναπτύχθηκαν σε ένα μέσο ανάπτυξης ενδοθηλιακού κυττάρου με πλήρη συμπληρώματα ανάπτυξης (Cell Applications, Inc.). Βοοειδή ενδοθηλιακών κυττάρων πνευμονικής αρτηρίας (BPAEC) και ανθρώπινα δερματικά μικροαγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα (HDMEC) ελήφθησαν από την Lonza και αναπτύχθηκαν σε ένα μέσο ΕΒΜ συν EGM SingleQuots των συμπληρωμάτων ανάπτυξης και ΕΒΜ-2 μέσο συν EGM-2 SingleQuots συμπληρωμάτων ανάπτυξης (Lonza) , αντίστοιχα. Γλοιώματος κυτταρικές σειρές U-87 MG και U251 ευγενικά την παροχή από τον Dr. V. Wee Yong (Πανεπιστήμιο του Calgary, Calgary, Alberta, Καναδάς). Η ανθρώπινη επιδερμικού κυτταρική γραμμή καρκινώματος ΗΕρ3 ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Dr. Andries Zijlstra (Vanderbilt University, USA). κύτταρα Mouse εμβρυϊκών ινοβλαστών (MEF) απομονώθηκαν από έμβρυα ποντικού και χρησιμοποιήθηκαν σε πρώιμη περάσματα τους (λιγότερο από πέρασμα 4). U-87 MG, U251, ΗΕρ3 και MEF κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ που περιέχει 10% (ν /ν) εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS, Invitrogen) και 1% πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη μείγματα (Invitrogen). Όλες οι άλλες κυτταρικές γραμμές ελήφθησαν από την American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) και αναπτύχθηκαν σε DMEM, ΜΕΜ ή RPMI (Invitrogen) που περιέχει μίγματα πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη 10% (ν /ν) ορό εμβρύου μόσχου και 1% σύμφωνα με την οδηγίες ATCC του. Όλα τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε ένα επωαστήρα στους 37 ° C που περιέχει 5% CO2. Όλα τα ενδοθηλιακά κύτταρα και τα πρωτογενή κύτταρα ινοβλαστών διατηρήθηκαν και να χρησιμοποιηθεί πριν την ένατη πέρασμα.

Επαγωγή και τον καθαρισμό των ανασυνδυασμένων πρωτεϊνών

Το πλασμίδιο pET17b-DT385 έκφραση «receptorless» DT385 γενναιόδωρα από τον Dr. Sundaram Ramakrishnan (Τμήμα Ιατρικής, Πανεπιστήμιο της Μινεσότα Ιατρικής Σχολής, Minneapolis, MN). Το πλασμίδιο pET17b-p22 κατασκευάστηκε με κλωνοποίηση του ανθρώπου Ρ22 θραύσμα πλασμινογόνου σε pET17b (EMD Biosciences) στις θέσεις περιορισμού NdeI και BamHI. Το πλασμίδιο pLIC-DT385-p22 κατασκευάστηκε με κλωνοποίηση ανθρώπινου πλασμινογόνου θραύσμα Ρ22 στο πλασμίδιο pLIC-DT385 στις θέσεις περιορισμού NcoI και HindIII, ενώ ο πλασμίδιο pLIC-DT385 δομήθηκε με εισαγωγή DNA που κωδικοποιεί DT385 αλλά λείπει το κωδικόνιο τερματισμού μέσα στο pET -30 EK /LIC φορέα ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Novagen). Το πλασμίδιο pSUMO κωδικοποιεί το cDNA για SUMO (μικρό ουβικιτίνης που σχετίζονται με τροποποιητή, Saccharomyces cerevisiae, Smt3 γονίδιο) παρασχέθηκε ευγενώς από τον Dr. Kaisong Zhou (Πανεπιστήμιο Dalhousie). Όλα τα πλασμιδικά κατασκευάσματα επιβεβαιώθηκαν με αλληλούχιση DNA (DalGEN, η εγκατάσταση προσδιορισμού αλληλουχίας Dalhousie University DNA). Ανασυνδυασμένη Ρ22, SUMO, DT385 και DT-Ρ22 εκφράστηκαν στο

Ε. coli

και καθαρίστηκε με στήλη Νί-ΝΤΑ συγγένειας (Qiagen), συνενώθηκαν και υποβλήθηκαν σε διαπίδυση όλη τη νύκτα έναντι αλατόνερου ρυθμισμένου με φωσφορικό (PBS). Όλες οι ανασυνδυασμένες πρωτεΐνες καθαρίστηκαν ως μία μοναδική ζώνη, όπως αποκαλύπτεται με ανάλυση SDS-PAGE. LPS αφαιρέθηκε από καθαρισμένες πρωτεΐνες χρησιμοποιώντας σφαιρίδια πολυμιξίνη Β (Detoxi-Gel ενδοτοξίνη Αφαίρεση Gel, Pierce) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Πολλαπλά περάσματα μέσω της στήλης διεξήχθησαν μέχρι το επίπεδο LPS ήταν λιγότερο από 30

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε από το κινητό Titer96 Υδατικό One Λύση Κυττάρου Δοκιμασία Πολλαπλασιασμού (δοκιμασία MTS ΕΕ /mg. -Promega) χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Τα IC

50 τιμές υπολογίστηκαν με μη γραμμική ελαχίστων τετραγώνων τοποθέτηση της καμπύλες δόσης-απόκρισης χρησιμοποιώντας το open source πρόγραμμα υπολογιστή QTI ΟΙΚΟΠΕΔΟ. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με το τεσσάρων παραμέτρων λογιστική εξίσωση f = (α – δ) /[1 + (x /c) b] + d, όπου

α

είναι η ασυμπτωτική μέγιστο,

b

είναι μια παράμετρος κλίση,

γ

είναι η τιμή στο σημείο καμπής (IC

50) και

δ

είναι η ασυμπτωτική ελάχιστο. Για τον έλεγχο, 0.4 μΜ ή 1.2 μΜ DT385 προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας ιστού με την απουσία των κυττάρων που ακολουθείται από επώαση με το αντιδραστήριο MTS /PMS. Μείωση της MTS δεν παρατηρήθηκε κάτω από αυτές τις συνθήκες, επιβεβαιώνοντας ότι DT385 δεν παρεμβαίνει με αυτόν τον προσδιορισμό.

Κρυστάλλινα βιολετί λεκέ

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε επίσης με χρώση κρυσταλλικού ιώδους. Στο τέλος της θεραπείας με DT385, τα κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 100% μεθανόλη, και χρωματίστηκαν με 0,5% κρυσταλλικό ιώδες σε 20% μεθανόλη για 15 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Βαμμένα κύτταρα φωτογραφήθηκαν σε 25 × μεγέθυνση σε ένα Zeiss Axiover 200 ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Carl Zeiss, Germany).

Απόπτωσης και Δοκιμασία Νέκρωσης

Τα αποπτωτικά και νεκρωτικά κύτταρα έγιναν ορατά με τη δοκιμασία απόπτωσης και νέκρωσης kit (Biotium, Inc) ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή. Βαμμένα κύτταρα φωτογραφήθηκαν σε ένα μικροσκόπιο φθορισμού Zeiss Axioplan II (Carl Zeiss, Germany), με τις κατάλληλες ρυθμίσεις φίλτρου για ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) και ερυθρό του Τέξας φθορισμού. Ψηφιακές εικόνες υποβλήθηκαν σε επεξεργασία σε Adobe Photoshop (Adobe Inc.).

Protein σύνθεση δοκιμασίας

U-87 MG ή Hela κύτταρα σπάρθηκαν σε αναλογία 1:10 σε 1 ml DMEM συν 10% FBS ανά φρεάτιο σε μια 12 φρεατίων πλάκα όλη τη νύχτα. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1 μΜ DT385 για τον υποδεικνυόμενο χρόνο, επωάστηκαν για 15 λεπτά στους 37 ° C με 0,5 ml μέσου σήμανσης (ελεύθερο μεθειονίνης ϋΜΕΜ, 10% FBS και διαπίδυση 50-100 μθί Pro-Mix L – [

35 -S] – (Amersham)) και τα κυτταρολύματα αναλύθηκαν με SDS-PAGE. Ραδιενεργό ζώνες έγιναν ορατές με ραδιογραφία χρησιμοποιώντας ένα Phosphorimager μετά από ολονύκτια έκθεση σε οθόνη φωσφόρου. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό, [

35S] ενσωμάτωση μετρήθηκε με μέτρηση υγρού σπινθηρισμού.

Chick χοριοαλλαντοϊκής μεμβράνης (CAM) δοκιμασία αγγειογένεσης

Η αντι-αγγειογενετική δραστικότητα των πρωτεϊνών ελέγχθηκε στην CAM, όπως περιγράφεται [24]. Κατά την ανάλυση προκαλούμενη από όγκο αγγείωση, 50.000 κύτταρα ΗΕρ3 αντικαθίσταται bFGF /VEGF ως αγγειογόνου ερεθίσματος [25]. Τέσσερις εμφυτεύματα τοποθετήθηκαν σε κάθε CAM και δέκα έμβρυα χρησιμοποιήθηκαν για κάθε πειραματική ένωση.

CAM ανάπτυξης όγκου δοκιμασίας

καρκινικά κύτταρα

ΗΕρ3-GFP (100.000 κύτταρα /10 μΐ μέσου DMEM) εφαρμόστηκαν άμεσα σε ένα φίλτρο-δίσκο λειασμένη περιοχή της CAM των 9 ημερών έμβρυα όρνιθας ηλικίας όπως περιγράφεται από [26]. Chicks επωάστηκαν υπό πρότυπες συνθήκες έως την Ημέρα 15, όταν απεικονίστηκαν και ταξινομημένο για τυχαία κατανομή για τον έλεγχο και τις ομάδες θεραπείας όγκων. Ημερήσια συστημική ενδοφλέβιες ενέσεις DT385 (2 μg σε 50 μL PBS) ή PBS (50 μΙ) πραγματοποιήθηκαν κατά την ημέρα 15, 16 και 17. Την ημέρα 18, οι όγκοι αποκόπηκαν, καθαρίστηκαν από CAM και στη συνέχεια ζυγίζεται. Εναλλακτικά, φθορισμού (GFP) Hep3 όγκους απεικονίστηκαν

in vivo

χρησιμοποιώντας ένα στερεοσκοπικό μικροσκόπιο φθορισμού Zeiss Lumar. Το περίγραμμα του όγκου προσδιορίστηκε με τη χρήση του σήματος φθορισμού των κυττάρων του όγκου (κανάλι GFP (ex470 /em525)). Συγκεκριμένα, το λογισμικό Volocity είχε βαθμονομηθεί για να επιλέξετε τις περιοχές με ένταση φθορισμού που αντιστοιχεί σε 1 ή περισσότερες τυπικές αποκλίσεις πάνω από το υπόβαθρο. Η περιοχή του όγκου ορίστηκε και υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας λογισμικό Improvision Volocity (Perkin Elmer, Inc.) (Έκδοση 5.3.0 Δόμηση 0). Μια μονάδα μέτρησης (1 mm) ήταν διακριβώνεται χρησιμοποιώντας το πλέγμα των αιμοκυτταρόμετρο. Ο προσδιορισμός του όγκου του όγκου αναλαμβάνει το σχήμα να είναι hemiellipsoidal και η εξίσωση για τον όγκο του όγκου είναι: V = π /6 • (μήκος) • (πλάτος) • (ύψος) όπου το ύψος = 1.63√ (Μήκος • Πλάτος). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας Students t-test.

Ποντίκι μοντέλο όγκου

Όλες οι εργασίες των ζώων πραγματοποιήθηκε στις εγκαταστάσεις ζώων του Πανεπιστημίου Dalhousie, σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που ορίζονται στην Φροντίδα και Χρήση ΠΕΙΡΑΜΑΤΟΖΩΑ από το Πανεπιστήμιο Dalhousie. Όλες οι έρευνες που έχουν εγκριθεί από το Διοικητικό Συμβούλιο Dalhousie Animal Research Δεοντολογίας. Χρησιμοποιήθηκαν Θηλυκά 6 έως 8 εβδομάδων ποντίκια C57BL6 /J (Jackson Laboratories). Οι όγκοι επάγονται με υποδόρια ένεση κυττάρων LLC (10

6 κύτταρα) σε 100 μΙ αποστειρωμένου PBS. Ψηλαφητών όγκων καθορίστηκαν τρεις έως τέσσερις ημέρες μετά την ένεση, σημείο στο οποίο τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο πειραματικές ομάδες, εκείνες που έλαβαν ανασυνδυασμένη SUMO (έλεγχος) και εκείνων που έλαβαν ανασυνδυασμένη θεραπεία DT385. SUMO και DT385 χορηγήθηκαν σε ποντίκια, περιογκικώς την ημέρα 5 (25 μg σε 100 μΙ PBS), και στις ημέρες 9, 12 και 15 (10 μg σε 100 μΙ PBS κάθε ένεση).

Πρωτεΐνη Labeling με FITC

DT385 και BSA ήταν σημασμένο με FITC με χρήση του EZ-ετικέτας FITC κιτ επισήμανσης πρωτεΐνη ακολουθώντας το πρωτόκολλο του κατασκευαστή (Pierce).

μελέτες έκπλυσης χλωριούχο αμμώνιο

κύτταρα U87 επωάστηκαν εν απουσία ή παρουσία του DT385 (2 μΜ) μόνη ή σε συνδυασμό με 10 mM χλωριούχο αμμώνιο. Το μέσο απομακρύνθηκε σε διάφορα χρονικά σημεία και αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο. Τριάντα έξι ώρες μετά την προσθήκη των δοκιμαζόμενων ενώσεων, η βιωσιμότητα των κυττάρων μετρήθηκε με τη δοκιμασία MTS.

Στατιστική Ανάλυση

Η σημασία των δεδομένων προσδιορίστηκε χρησιμοποιώντας t-test του Student (one-tailed ). τιμές P n = 23) και 23,33 ± 4,3 mg, (μέσος όρος ± S.E .; n = 12), αντίστοιχα, ρ = 0.012. (C), DT385 μειώθηκαν σημαντικά τον όγκο του όγκου. όγκος του όγκου Hep3 στο σύστημα CAM αξιολογήθηκε όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι. Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± S.E. Οι μέσες τιμές του μεγέθους του όγκου για DT385 ή τον έλεγχο θεραπείες ήταν 8,86 × 10

9 ± 2,42 μm

3 (μέση τιμή ± SE? N = 18) και 2,97 × 10

9 ± 0,49 μm

3 (μέσος όρος ± SE? n = 8). αντίστοιχα, p = 0,02

η

για να διερευνηθεί αν DT385 θα μπορούσε να μειώσει την ανάπτυξη του όγκου, ΗΕρ3 όγκοι αναπτύχθηκαν επί της CAM και τα παλιά όγκους 6 ημερών μετά υποβλήθηκαν σε αγωγή με 2 μg DT385 ενδοφλέβια ένεση καθημερινά για τρεις ημέρες.