Αφηρημένο

αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο ή αποτυχημένη αυτοφαγία έχει προταθεί για την εξάλειψη καταστραφεί, καθώς τα καρκινικά κύτταρα, αλλά εξακολουθεί να υπάρχει ένα κρίσιμο κενό στην γνώσεις μας για το πώς αυτή η διαδικασία ρυθμίζεται. Ο στόχος αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει διαμορφωτές της αυτοφαγικά μονοπάτι κυτταρικού θανάτου και να διασαφηνίσει τις επιπτώσεις τους στην κυτταρική σηματοδότηση και τη λειτουργία. Το αποτέλεσμα των siRNA προβολές της βιβλιοθήκης μας δείχνουν ότι ένα άθικτο συγκρότημα coatomer Ι (COPI) είναι υποχρεωτική για την παραγωγική αυτοφαγία. Εξάντληση των πολύπλοκων μέλη COPI μειωμένη επιβίωση των κυττάρων και μειωμένη παραγωγική αυτοφαγία που προηγήθηκε ενδοπλασματικό άγχος δίκτυο. Περαιτέρω, άκαρπη αυτοφαγία προκλήθηκε από την εξάντληση COPI σημαντικά μεταβληθεί αυξητικό παράγοντα σηματοδότηση σε πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές σειρές. Τέλος, δείχνουμε ότι οι COPI συγκρότημα μελών υπερεκφράζεται σε μια σειρά από καρκινικές κυτταρικές γραμμές και διάφορους τύπους ιστών καρκίνο συγκριτικά με φυσιολογικό κύτταρο γραμμές ή ιστούς. Σε καρκινικούς ιστούς, η υπερέκφραση των μελών COPI συνδέεται με κακή πρόγνωση. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι το σύμπλοκο coatomer είναι απαραίτητη για την παραγωγική αυτοφαγία και κυτταρική επιβίωση, και ως εκ τούτου η αναστολή των μελών COPI μπορεί να προάγει κυτταρικό θάνατο των καρκινικών κυττάρων όταν απόπτωση διακυβεύεται

Παράθεση:. Claerhout S, Dutta Β, Bossuyt W , Zhang F, Nguyen-Charles C, Dennison JB, et al. (2012) Αποτυχημένη Autophagy Προκαλεί Ενδοπλασμικό Δίκτυο άγχος και θάνατο των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα. PLoS ONE 7 (6): e39400. doi: 10.1371 /journal.pone.0039400

Επιμέλεια: Gordon Langsley, Institut national de la Santé et de la recherche médicale – Institut Cochin, Γαλλία

Ελήφθη: 22 του Μαρτίου του 2011? Αποδεκτές: 21 του Μάη 2012? Δημοσιεύθηκε: 26 του Ιουνίου, 2012 |

Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης, χωρίς όλα τα πνευματικά δικαιώματα, και δεν μπορεί να αναπαραχθεί ελεύθερα, διανεμηθεί, να μεταδοθεί, τροποποιηθεί, χτισμένο πάνω, ή ειδάλλως να χρησιμοποιηθεί από οποιονδήποτε για οποιονδήποτε νόμιμο λόγο. Το έργο γίνεται διαθέσιμα υπό την Creative Commons CC0 αφοσίωση δημόσιο τομέα

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από τις επιχορηγήσεις από το Ίδρυμα Komen (KG 081.694 και FAS0703849), την πρόληψη του καρκίνου και Ερευνητικό Ινστιτούτο του Τέξας, και καρκίνου των ωοθηκών Ταμείο Έρευνας για GBM, και από το MD Anderson Cancer Κέντρο υποστήριξης Grant CA016672. SC υποστηρίζεται από το Πρόγραμμα Οδύσσεια και τον Θεόδωρο Ν Νόμου Κληροδότημα για επιστημονικό επίτευγμα στο Πανεπιστήμιο του Τέξας MD Anderson Κέντρο Καρκίνου. JBD υποστηρίζεται από το πρόγραμμα υποτροφιών MD Anderson GlaxoSmithKline TRIUMPH και BD από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας siRNA κοινοπραξία για θεραπευτική. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Τα καρκινικά κύτταρα αντιμετωπίζουν πολλά εμπόδια, όπως οι αλλαγές του pH και περιορισμένη παροχή θρεπτικών ουσιών και οξυγόνου κατά την έναρξη του καρκίνου, την εξέλιξη και διάδοση [1]. Να αποκαταστήσει τη σωστή κυτταρική λειτουργία και την ομοιόσταση υπό χαμηλή έως μέτρια επίπεδα στρες, τα καρκινικά κύτταρα ενεργοποιούν προστατευτικά κυτταρικές διαδικασίες όπως αυτοφαγία. Autophagy είναι μία εντόνως διατηρημένη διαδικασία βρέθηκε από ζύμη σε θηλαστικά. Είναι μια μοναδική διαδικασία υποβάθμισης που χαρακτηρίζεται από την απομόνωση του χύμα κυτταρόπλασμα συμπεριλαμβανομένων των πρωτεϊνών και οργανιδίων, τα οποία παραδίδονται στο σύστημα λυσοσωμικού για την τελική πέψη [2]. Απομάκρυνση και υποβάθμιση αυτών των κυτταρικών συστατικών παράγει ενέργεια και τα δομικά στοιχεία είναι απαραίτητα για την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων κατά την διάρκεια μεταβολικό στρες. Η ολοκλήρωση αυτής της διαδικασίας έχει οριστεί παραγωγική αυτοφαγία ή αυτοφαγικά ροή [2]. Ωστόσο, μη παραγωγικός, ανεξέλεγκτη, ή παρατεταμένη αυτοφαγία οδηγεί σε ό, τι έχει οριστεί «αυτοφαγικά κυτταρικό θάνατο» [3], [4], ή, όπως θα αναφερθεί σε «αποτυχημένο αυτοφαγία» [5].

Στον καρκίνο, η διαδικασία της autophagy έχει προταθεί να συμβάλουν τόσο στην καταστολή και την εξέλιξη του όγκου. Από τη μία πλευρά, autophagy καταστέλλει τους όγκους, περιορίζοντας την έναρξη και την εξέλιξη. Η έκφραση του Beclin 1, το ομόλογο θηλαστικού του γονιδίου Atg6 αυτοφαγία ζύμης η οποία είναι κρίσιμη για την επαγωγή της αυτοφαγία, μειώνεται σε πολλούς καρκινικούς ιστούς και κυτταρικές σειρές καρκίνου [6]. Επιπλέον, η υπεριώδης ακτινοβολία αντίσταση σχετιζόμενη γονίδιο (

UVRAG

), είναι αναγκαία για την λειτουργία καταστολής του όγκου του Beclin 1, είναι επίσης monoallelically μεταλλαγμένο σε πολλούς ανθρώπινους καρκίνους [7]. Επιπλέον, autophagy καταστέλλει επίσης την ογκογένεση με την παροχή της ΑΤΡ που απαιτείται για την επιδιόρθωση του DNA [8] ή εξαλείφοντας την μακρόβια πρωτεΐνη ρ62 [9]. Από την άλλη πλευρά, μπορεί να προάγει autophagy ογκογένεση με την εξάλειψη του στρες που προκαλείται από την έλλειψη θρεπτικών ουσιών και οξυγόνου σε προ-επεμβατική και ταχέως αναπτυσσόμενους όγκους. εργαστήριο μας έχει δείξει ότι ο LKB1-ΑΜΡΚ μονοπάτι-εξαρτώμενη φωσφορυλίωση του ρ27 σε θρεονίνη 198 σταθεροποιεί ρ27 και επιτρέπει στα κύτταρα να επιβιώσουν απόσυρση αυξητικό παράγοντα και μεταβολικό στρες με διέγερση autophagy [10]. Αυτή η απόκριση αυτοφαγικά μπορεί να συνεισφέρει στην επιβίωση καρκινικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης παράγοντας στέρηση ή διαταράσσεται θρεπτικών συστατικών και το μεταβολισμό της ενέργειας. Έτσι, ανάλογα με το κυτταρικό περιβάλλον και την αντοχή και τη διάρκεια των σημάτων στρες, autophagy είτε προλαμβάνει ή προάγει την καρκινογένεση.

Εκτός από το ρόλο της στην καρκινογένεση, autophagy ρυθμίζει επίσης την αποτελεσματικότητα των θεραπευτικών φαρμάκων. Επαγωγή μιας «παραγωγική» διαδικασία αυτοφαγικά από χημειοθεραπεία και ακτινοβολία επιτρέπει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων [11]. Αυτό υποδηλώνει ότι οι διαμορφωτές autophagy μπορεί να ευαισθητοποιήσουν καρκινικά κύτταρα σε συμβατικές θεραπείες του καρκίνου [11], [12]. Με τη στόχευση κλειδιού πρωτεΐνες σε παραγωγικές αυτοφαγία, τα κύτταρα μπορούν να υποβληθούν σε «αποτυχημένο αυτοφαγία», έναν εναλλακτικό μηχανισμό θανάτου για τα καρκινικά κύτταρα ανθεκτικά σε παράγοντες που προκαλούν απόπτωση [11], [13]. Παρά το γεγονός ότι η διαδικασία της παραγωγικής αυτοφαγία έχει μελετηθεί εκτενώς, δεν είναι σαφές ποιοι παράγοντες ρυθμίζουν την αποτυχημένη αυτοφαγία. Ο εντοπισμός αυτών των ρυθμιστών θα μπορούσε να βελτιώσει την αποτελεσματικότητα της συμβατικής θεραπείας και να συμβάλει στην ανακάλυψη νέων θεραπειών για τους ασθενείς με καρκίνο.

Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να προσδιορίσει τις ρυθμιστικές αρχές των άκαρπη αυτοφαγία και τη διαλεύκανση επίδρασή τους στους μηχανισμούς της σηματοδότησης και της κυτταρικής επιβίωσης σε καρκινικά κύτταρα. Εμείς που απασχολούνται μικρό παρεμβαλλόμενο RNA (siRNA) οθόνες σε συνδυασμό με την επικύρωση και λειτουργικές μελέτες. Τα μέλη του συγκροτήματος coatomer Ι (COPI), τα οποία εμπλέκονται στην κυτταρική διακίνηση, αναδείχθηκε ως κορυφαία hits από τις οθόνες μας διαμορφώνοντας αυτοφαγία και θάνατο των κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα. Άκαρπη αυτοφαγία και ενδοπλασματικό δίκτυο (ER) στρες παρατηρήθηκε μετά από νοκ ντάουν των συστατικών COPI. Επιπλέον, η εξάντληση COPI επηρεάζονται φωσφοϊνοσιτίδη 3-κινάση (PI3K) /AKT σηματοδότησης οδό. Συνολικά, τα αποτελέσματα της COPI επί του κυτταρικού θανάτου, αυτοφαγία και ER στρες ήταν εντονότερη σε καρκινικά κύτταρα από ότι στα φυσιολογικά κύτταρα. Αυτό είναι σύμφωνο με την υπερέκφραση των πρωτεϊνών και των γονιδίων COPI δει σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές και δείγματα ασθενούς.

Υλικά και Μέθοδοι

Γραμμές κυττάρων και αντιδραστήρια

Το ανθρώπινο κύτταρο καρκίνου του μαστού γραμμές MDA-MB-231 [10], MDA-MB-468 [10], ΒΤ549 (American Type Culture Collection (ATCC)? Manassas, VA), T47D [10], SKBR3 (ATCC), HCC1428 (ATCC) και MCF7 [10], το καρκινικό κύτταρο ωοθηκών SKOV3 γραμμές (ATCC), και OVCAR3 (ATCC) διατηρήθηκαν σε RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) και 5% FBS. MDA-MB-231, ΜϋΑ-MD468, και SKOV3 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με GFP-LC3 αναπτύχθηκαν στο ίδιο μέσο. Η κυτταρική σειρά οστεοσαρκώματος U2OS (ATCC) και U2OS GFP-LC3 [10] καλλιεργήθηκαν σε ϋΜΕΜ και 10% FBS. ΜΟΡ10Α (ATCC) καλλιεργήθηκε σε DMEM /F12 και 5% ορό αλόγου με 20 ng /ml EGF, 0,5 mg /ml υδροκορτιζόνη, 100 ng /ml τοξίνης χολέρας, και 10 μg /ml ινσουλίνη. GFP-LC3 σταθερές κυτταρικές σειρές δημιουργήθηκαν όπως περιγράφεται στο [10]. Οι κυτταρικές σειρές που επικυρώθηκαν από STR αποτύπωμα DNA χρησιμοποιώντας το κιτ AmpFℓSTR Identifiler σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Applied Biosystems γάτα 4322288). Τα προφίλ STR συγκρίθηκαν με τις γνωστές δακτυλικά αποτυπώματα ATCC (ATCC.org), με την κυτταρική γραμμή βάσης δεδομένων Ολοκληρωμένη Μοριακής ταυτότητας (CLIMA) έκδοση 0.1.200808 [14], καθώς και με τη βάση δεδομένων δακτυλικών αποτυπωμάτων MD Anderson. Imatinib, ένα είδος δώρο από τον Dr. S. Kondo στο MD Anderson Κέντρο Καρκίνου, και βαφιλομυκίνη Α1 (Sigma-Aldrich, St. Louis, ΜΟ) διαλύθηκαν σε DMSO. Μπρεφελδίνης Α (Sigma-Aldrich) και η ραπαμυκίνη (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ) διαλύθηκε σε μεθανόλη.

Οθόνες siRNA

Accell siRNA οθόνη για ρυθμιστές αυτοφαγία.

MDA-MB-231, κύτταρα U2OS, και SKOV3 σταθερά επιμολυσμένα με GFP-LC3 σπάρθηκαν σε πλάκες 96-φρεατίων στα 2500 κύτταρα /φρεάτιο για τα κύτταρα MDA-MB-231 και SKOV3 ή 1.000 κύτταρα /φρεάτιο για τα κύτταρα U2OS. Μετά από 24 ώρες μέσο αλλάχθηκε σε μέσο Accell περιείχε 0,05% FBS (80 μΐ /φρεάτιο) (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO). Accell siRNAs (G-201000 Ανθρώπινη RNAi Global, Lot 08103, σε πλάκες 96-φρεατίων) διαλύθηκαν σε 10 μΐ ρυθμιστικού διαλύματος 1χ siRNA και επωάζονται σε έναν αναδευτήρα σε θερμοκρασία δωματίου για 30 λεπτά. Accell μέσα (200 μλ) που περιέχει 0.05% FBS προστέθηκε σε κάθε φρεάτιο και αναμίχθηκε με σιφωνισμό πέντε φορές. Τα διαλυμένα siRNAs (20 μΐ) προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο για να κάνει μια τελική συγκέντρωση siRNA 1 μΜ (100 μl /φρεάτιο). Τα κύτταρα επωάστηκαν με siRNA για 48 ώρες. Φάρμακα αραιώνονται σε δέκα φορές συγκέντρωση εργασίας και προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο, όπως αναφέρεται (11 μΐ /φρεάτιο) για να αποκτηθούν τελικές συγκεντρώσεις 2 mM 2-δεοξυ-D-γλυκόζη (2DG), 100 ηΜ ραπαμυκίνη, και 10 μΜ imatinib. Τα κύτταρα πλύθηκαν με PBS και σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεϋδη σε PBS για 45 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα πλύθηκαν τρεις φορές με PBS, οι πυρήνες χρωματίστηκαν με Hoechst 33342 για 5 λεπτά και πλύθηκαν και πάλι με PBS, και 250 μΙ PBS προστέθηκε στα κύτταρα. σχηματισμό Autophagosome προσδιορίστηκε με ένα αναλυτή κυττάρων 1000 Κυτταρικής απεικόνισης και το σύστημα Ανάλυσης (GE Healthcare, Piscataway, New Jersey). Τα αποτελέσματα παρουσιάζονται ως% αυτοφαγία. Επιπλέον, όλα τα γονίδια συνενώνονται μαζί για τον υπολογισμό z-score. Z-score του γονιδίου

i

υπολογίστηκε από το

z

i

= (

x

i κατασκευαστής –

μ

) /

σ

, όπου,

x

i

είναι η% αυτοφαγία από την οθόνη αυτοφαγία, και

μ

και

σ

είναι η μέση τιμή και τυπικές αποκλίσεις με βάση όλα τα γονίδια που υπάρχουν στην οθόνη.

οθόνη siRNA για διαμορφωτές της βιωσιμότητας.

Χρησιμοποιήσαμε μια παρατάσσονται βιβλιοθήκη 779 πισίνες siRNA (https://www.dharmacon.com/product /Productlandingtemplate.aspx?id=225 tab=1 για λίστα γονίδιο) που καλύπτει το ανθρώπινο kinome και γονίδια που σχετίζονται κινάση (βιβλιοθήκη Dharmacon SMARTpool, Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) σε MDA-MB-231, ΜϋΑ-ΜΒ-468 , κυτταρικές σειρές SKOV3 και OVCAR3. Κάθε δεξαμενή συνθετικών siRNAs ήταν ντυμένη με μορφή 96 φρεατίων, και επιμολύνσεις πραγματοποιήθηκαν σε πλάκες εις τριπλούν χρησιμοποιώντας 25 ηΜ siRNA που παραδίδονται από DharmaFECT Ι (Dharmacon). Έξι αντίγραφα του RISC χωρίς μη στόχευση siRNA και siRNA κατά PLK (τοξικό έλεγχος) σε κάθε πλάκα παρέχεται αρνητικοί και θετικοί έλεγχοι για τον κυτταρικό θάνατο σε ολόκληρη την οθόνη, αντίστοιχα. Εν συντομία, DharmaFECT Ι εφαρμόστηκε σε 0,15 μl /φρεάτιο για 25 παράδοση ηΜ siRNA σε κατάσταση αντίστροφης διαμόλυνση. Μετά από τρεις ημέρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ένα κύτταρο Titer Μπλε Βιωσιμότητας Κυττάρων Δοκιμασία (Promega, Madison, WI). Κυττάρων Titer Μπλε αντιδραστήριο (ρεσαζουρίνη 5 μl /φρεάτιο) συμπεριλήφθηκε στην τελευταία 3 ώρες επώασης. Βιώσιμα κύτταρα ανάγουν ρεσαζουρίνη σε ρεσορουφίνη, το οποίο είναι εξαιρετικά φθορισμού. Η ένταση φθορισμού μετρήθηκε χρησιμοποιώντας έναν αναγνώστη μικροπλακών σε μήκος κύματος διέγερσης 530 nm και μήκος κύματος εκπομπής 604 nm. Interplate προκατάληψη αποβλήθηκε με κανονικοποίηση τιμές κυτταρικής βιωσιμότητας με μέση κεντράρισμα και κλιμακώνεται να έχουν ίση διακύμανση και στη συνέχεια μετατρέπονται στα αντίστοιχα Ζ-βαθμολογίες για κάθε ένα από τα τρία αντίγραφα πειραμάτων. Το z-score του γονιδίου

«i»

για επαναληπτικές

«ι» στο πιάτο

«k»

υπολογίστηκε ως

z

ij

= (

x

ij

–

μ

jk

) /

σ

JK

, όπου,

x

ij

είναι η πρώτη τιμή έντασης, και

μ

jk

και

σ

JK

είναι η μέση τιμή και την τυπική απόκλιση των εντάσεων για όλα τα δείγματα στην πλάκα

k

, αντίστοιχα. Στη συνέχεια, η μέση z-score υπολογίζεται πάνω από όλες τις επαναλήψεις του κάθε γονιδίου σε κάθε κυτταρική σειρά, και τα siRNA με

z

i

ave

τιμές χαμηλότερες από -2 θεωρήθηκαν ως σημαντικά ανασταλτικά «χτυπήματα «για την αντίστοιχη κυτταρική γραμμή

Επιμόλυνση και siRNA Αντιδραστήρια

siRNAs. (Dharmacon? Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO) επιμολύνθηκαν με DharmaFECT Ι (Dharmacon) ή Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) με χρησιμοποίηση πρωτόκολλα των κατασκευαστών. Οι αλληλουχίες των siRNAs είναι οι εξής: έλεγχος RISC χωρίς nontargeting siRNA (D-001220-01-05), COPA (L-011835-00), COPB1 (L-017940-01), COPB2 (L-019847-00 ), COPG1 (L-019138-00), COPG2 (L-019988-01), ΧΑΠ (L-013063-01), COPE (L-017632-01), COPZ1 (L-020293-01), PLK1 (Μ -003290-01), BiP1 (L-008198-00-0005), Atg5 (L-004374-00), και Atg12 (L-010212-00).

Μικροσκοπία Ηλεκτρονική

τα κυτταρικά δείγματα σταθεροποιήθηκαν με ένα διάλυμα που περιέχει 3% γλουταραλδεΰδη συν 2% παραφορμαλδεϋδη σε 0,1 Μ ρυθμιστικό κακοδυλικού, ρΗ 7,3, για 1 ώρα. Μετά τη σταθεροποίηση, τα δείγματα πλύθηκαν και κατεργάστηκαν με 0,1% Millipore-φιλτράρεται κακοδυλικό ρυθμιστικό ταννικό οξύ, μετασταθεροποιήθηκε με 1% τετροξείδιο του οσμίου ρυθμιστικό για 30 λεπτά, και χρωματίστηκαν en bloc με 1% Millipore-φιλτράρεται οξικό ουρανύλιο. Τα δείγματα αφυδατώθηκαν σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις αιθανόλης, διεισδύσει, και ενσωματωμένο σε μέσο LX-112. Τα δείγματα πολυμερίζονται σε ένα φούρνο 70 ° C για 2 ημέρες. Εξαιρετικά λεπτές τομές κόβονται σε μικροτόμο Leica Ultracut (Leica, Deerfield, IL), χρωματίστηκαν με οξικό ουρανύλιο και κιτρικό μόλυβδο σε ένα χρώσης Leica ΕΜ, και εξετάστηκαν σε ένα JEM 1010 ηλεκτρονικό μικροσκόπιο (JEOL, USA, Inc., Peabody, ΜΑ ) σε μία επιταχυνόμενη τάση των 80 kV. Ψηφιακές εικόνες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας ένα σύστημα ΑΜΤ Imaging (Advanced Techniques Microscopy Corp, Danvers, ΜΑ).

SDS-PAGE και Western Blot ανάλυση

κηλίδωση Western πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν: Ρ62 (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ), LC3 (Novus Biologicals, Littleton, CO), IRE1α, ΣΣΕ, καλνεξίνης, Atg5, Atg12, pSer473AKT, pThr308AKT, AKT, pSer235 /236 S6, pSer65 4ΕΒΡ και 4ΕΒΡ (όλα από την Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ), COPB1 (Fisher Scientific, Lafayette, CO), και β-ακτίνης (Sigma-Aldrich). Αντισώματα έναντι COPA, COPB2, ΧΑΠ, COPG1 και COPG2 ήταν ένα είδος δώρο από τον Δρ Wieland (Πανεπιστήμιο της Χαϊδελβέργης, Heidelberg, Germany). Ποσοτικοποίηση της έντασης μπάντα που εκτελούνται από το λογισμικό τζελ Un-Scan-It (έκδοση 5.1, μετάξι Scientific Corporation) και εκφράζεται σε όρους φορές αύξηση του ελέγχου.

Ομοεστιακή και φθορισμού μικροσκοπία

ομοεστιακό μικροσκόπιο .

η ανοσοχρώση για LAMP2 (BD Biosciences? 1/200) ή COPB2 (1/1000) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών. Για τη δοκιμασία tfLC3, τα κύτταρα που εκφράζουν παροδικά tfLC3 [15] αναπτύχθηκαν επί μία νύκτα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία όπως περιγράφεται. Τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με 4% παραφορμαλδεΰδη και χρωματίστηκαν με 4′-6-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (ϋΑΡΙ). Για Annexin-V-Alexa χρώση 568, κύτταρα που εκφράζουν σταθερά GFP-LC3 καλλιεργήθηκαν σε οκτώ πλάκες καλά θάλαμο (BD Biosciences) και υποβάλλεται σε επεξεργασία όπως υποδεικνύεται. Annexin-V-Alexa 568 χρώσης (Roche, Mannheim, Germany) πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Όλες οι εικόνες ελήφθησαν με ένα μικροσκόπιο Olympus FV1000 με φακό 100Χ (Ν.Α. 1.30). Εικόνες αποκτήθηκαν και επεξεργασία χρησιμοποιώντας το λογισμικό Fluoview και ImageJ

φθορισμού μικροσκόπιο

εικόνες ανοσοφθορισμού για ρ62 (BD Biosciences? 1/200).. Αποκτήθηκαν με τη χρήση μικροσκοπίου Nikon Eclipse TE200-Ε και IPLab λογισμικό απεικόνισης (BioVision Technologies, Exton, ΡΑ).

κρυστάλλινα Violet τηλέφωνα Βιωσιμότητας δοκιμασία

δοκιμασία Βιωσιμότητας (crystal violet) πραγματοποιήθηκε με τη χρήση τυποποιημένων διαδικασιών.

δοκιμασία κλωνογόνος επανεπίστρωσης

τα κύτταρα αναπτύχθηκαν υπό διάφορες συνθήκες και όλα τα κύτταρα συλλέχθηκαν με θρυψινοποίηση και απλώθηκαν σε 100-400 κύτταρα ανά φρεάτιο σε πλάκες καλλιέργειας ιστών έξι φρεατίων. Οι αποικίες αναπτύχθηκαν για 11-14 ημέρες σε πλήρες μέσο ανάπτυξης και χρωματίστηκαν με 0,5% διάλυμα κρυσταλλικού ιώδους (80% dH

2O, 20% μεθανόλη, 0.5% κρυσταλλικό ιώδες). Εικόνες από τις αποικίες ελήφθησαν χρησιμοποιώντας σύστημα απεικόνισης FluorChemE (Cell Biosciences, Inc.), και ο αριθμός των αποικιών αναλύθηκε χρησιμοποιώντας AlphaVIEW SA (έκδοση 3.2.3.0? Κυττάρων Biosciences, Inc.). Το πείραμα πραγματοποιήθηκε εις τριπλούν και επαναλήφθηκε δύο φορές.

RPPA Ανάλυση

Οι διαδικασίες RPPA για χρώση αντισώματος και ανίχνευση σήματος διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10], [16].

Oncomine Βάση δεδομένων

ο Bittner multicancer σύνολο δεδομένων είναι διαθέσιμο στο δημόσιο τομέα σε https://www.oncomine.org/main/index.jsp [17], και ως εκ τούτου δεν απαιτήθηκε IRB έγκριση. Ιστούς με διαφορική έκφραση των σύνθετων μελών COPI (P≤10

-6) επιλέχθηκαν.

Στατιστική και Ανάλυση Δεδομένων

Όλα τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το λογισμικό GraphPad Prism 5 (GraphPad Software , Inc., San Diego, CA, USA). Συγκρίσεις μεταξύ των δύο ομάδων αξιολογήθηκαν στατιστικά με δύο ουρών paired t-test. Μια ρ-τιμή μικρότερη από 0.05 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική. Να συγκρίνουν τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης σε καλοήθη και τον καρκίνο των ομάδων, χρησιμοποιήθηκε t-test του Student δύο δείγματος. Χρησιμοποιήσαμε το μοντέλο παλινδρόμησης αναλογικών κινδύνων κατά Cox για μονοπαραγοντική ανάλυση επιβίωσης. Αποκοπές των υψηλών και χαμηλών ομάδες έκφρασης βελτιστοποιηθεί ώστε να επιτευχθεί η χαμηλότερη τιμή p. Όλες οι στατιστικές αναλύσεις, οικόπεδα κουτί, και οικόπεδα επιβίωσης Kaplan-Meier πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση R Λογισμικού (https://www.r-project.org).

Αποτελέσματα

siRNA Screening Προσδιορίζει Coatomer Complex μέλη ως ρυθμιστές της βιωσιμότητας και Autophagy

για την ταυτοποίηση νέων μοριακών παίκτες στον έλεγχο της αυτοφαγικά κυτταρικού θανάτου, πραγματοποιήσαμε δύο τύποι παρεμβολής RNA (RNAi) οθόνες για να βρουν γονίδια που, όταν γκρέμισε ως αποτέλεσμα τόσο μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων και το σχηματισμό της αυτοφαγοσώματα. Θα προβληθεί για πρώτη φορά το ανθρώπινο kinome γιατί κινάσες και τα γονίδια κινάσης που σχετίζονται αποτελούν βασικούς ρυθμιστές των πολύπλοκων κυτταρικών λειτουργιών, όπως η αυτοφαγία. siRNAs μετήχθησαν σε τέσσερις διαφορετικές κυτταρικές σειρές: δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου των ωοθηκών (SKOV3 [

HER2

ενισχύεται?

CDKN2A

,

PIK3CA

, και

TP53

μεταλλάξεις] και OVCAR3 [

PIK3R1

και

TP53

μεταλλάξεις]) και δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού (MDA-MB-231 [

BRAF

,

CDKN2A

,

KRAS

, και

TP53

μεταλλάξεις] και MDA-MB-468 [

EGFR

ενισχύεται?

PTEN

,

RB1 ​​

,

TP53

, και

Smad4

μεταλλάξεις]) με διαφορετικό γενετικό υπόβαθρο. Συνολικά, εντοπίσαμε 67 γονίδια, το 9% του kinome, ότι όταν γκρέμισε μείωσε σημαντικά τη βιωσιμότητα των κυττάρων (z-score κάτω από -2) (Πίνακας S1). Από αυτά τα 67 θετικά χτυπήματα, knockdown 12 γονίδια μείωσε τη βιωσιμότητα των τουλάχιστον δύο από τις κυτταρικές σειρές που δοκιμάστηκαν. Αυτά τα γονίδια ήταν

ΑΚΤ2

,

CHEK1

,

COPB2

,

PRKAR2B, RPS6KA2

και

WEE1

(σε τρεις από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές) και

AVPR1B

,

CNKSR1

,

DGUOK, INSRR

,

JAK2, TAF1L

(σε δύο από τις τέσσερις κυτταρικές σειρές).

Για την αναγνώριση των γονιδίων που εμπλέκονται επίσης στη ρύθμιση της αυτοφαγία στα καρκινικά κύτταρα, πραγματοποιήσαμε μια εικόνα που βασίζεται σε μικρή βιβλιοθήκη RNAi (Accell? Πίνακας S2) οθόνη με autophagosome σχηματισμό ως τελικό σημείο. καρκινικές κυτταρικές γραμμές MDA-MB-231, SKOV3 και U2OS επιμολύνθηκαν σταθερώς με την πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη μικροσωληνίσκων πρωτεΐνη που συνδέεται 1 ελαφριάς αλυσίδας φορέα 3 (GFP-LC3) ρεπόρτερ [18], [19]. Επειδή LC3 αποικοδομείται κατά τα τελικά στάδια της παραγωγικής αυτοφαγία [20], η επίμονη συσσώρευση LC3 σε στικτή κυστίδια χρησιμοποιήθηκε ως δείκτης για διαταραγμένη ή αποτυχημένη αυτοφαγία. Η ραπαμυκίνη, 2-δεοξυ-D-γλυκόζη (2DG), και imatinib ήταν θετικοί έλεγχοι για τον σχηματισμό autophagosome. Μη στόχευση κωδικοποιημένα siRNAs, χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι, δεν οδήγησε σε αυτοφαγία (Εικ. S1 Α-C). Σε όλες τις κυτταρικές γραμμές που εξετάστηκαν, παρατηρήσαμε ότι η εξάντληση της πρωτεΐνης coatomer συγκρότημα υπομονάδα βήτα 1 (COPB1) προκάλεσε συσσώρευση των LC3-θετικών στίγματα τα οποία είναι ενδεικτικά της αυτοφαγία (Σχ S1 Α-C?. Πίνακας S3), υποδεικνύοντας ότι η autophagy μηχανισμός είναι συντηρημένη μεταξύ των διαφόρων καταγωγών όγκου. Εν κατακλείδι, χρησιμοποιώντας τις οθόνες siRNA εντοπίσαμε COPB2 και COPB1 ως ρυθμιστές της αντίστοιχα βιωσιμότητα των κυττάρων και την αυτοφαγία.

Coatomer πρωτεϊνών διαφορετικά τηλέφωνα Βιωσιμότητας

COPB1 και COPB2, συνιστώσες του συγκροτήματος COPI, θεωρήθηκαν ως ελκυστικοί υποψήφιοι για περαιτέρω μελέτη με βάση την σημαντική επίδραση στα καρκινικά κύτταρα και στις δύο κυτταρικές βιωσιμότητα και το σχηματισμό autophagosome (Πίνακας S1 και S3, Σχ. S1). Σε μια δευτερεύουσα οθόνη, εμείς επικυρωθεί και αναλύθηκαν τα αποτελέσματα επί της κυτταρικής ανάπτυξης και του σχηματισμού autophagosome μετά να χτυπήσει κάτω ανεξάρτητα μέλη αυτού του συμπλέγματος σε τρεις καρκινικές κυτταρικές σειρές (MDA-MB-231, ΜϋΑ-ΜΒ-468 και SKOV3). Όπως φαίνεται στο Σχήμα S2, siRNAs μειωμένη έκφραση από διάφορα στοιχεία COPI. Συνεπής με τα ευρήματά μας από την οθόνη του siRNA, εξάντληση των COPA, COPB1, COPB2, COPG1, ΧΑΠ, και COPZ1 μειωμένη ανάπτυξη των κυττάρων (Εικ. 1Α και C). Σε αντίθεση, η βιωσιμότητα των κυττάρων ήταν ανεπηρέαστη σε κύτταρα κατεργασμένα με μη στόχευση siRNA (Σχ. 1Α και Β) ή επηρεάζεται μόνο ελαφρά κατά ΜΟΡ10Α, μια κανονική-σαν κύτταρο μαστού γραμμή, μετά COPB2 knockdown (Εικ. S9B). Η προσθήκη του αναστολέα κασπάσης-τηγάνι zVAD δεν διασώθηκε κυτταρικό θάνατο (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα) υποδεικνύοντας ότι ο κυτταρικός θάνατος ήταν κασπάσης-ανεξάρτητη. Για να επιβεβαιωθεί ότι ο καρκίνος κύτταρα δεσμευθεί μέχρι θανάτου όταν COPI είναι εξασθενημένη, προσδιορίσαμε κλωνογόνων ανάκτηση μετά από 72 ώρες θεραπείας siRNA σε MDA-MB-231 (Εικ. 1 D) και U2OS (Σχ. 1Ε) καρκινικά κύτταρα. Σε αμφότερες τις κυτταρικές γραμμές, βελτίωση της αποτελεσματικότητας επανεπίστρωσης δεν μειώθηκαν μετά την εξάντληση COPG2 σύγκριση με τον έλεγχο, επιβεβαιώνοντας τα αποτελέσματα μας. Αντίθετα, η μείωση έκφρασης COPA ή COPB2 καταργηθούν σχεδόν πλήρως κλωνογόνο ανάκτηση (Εικ. 1 D και Ε), η οποία είναι συνεπής με τα αποτελέσματα της βιωσιμότητας μας (Εικ. 1Α). Αξιοσημείωτα, η αποτελεσματικότητα επανεπίστρωσης δεν μειώθηκε σε κύτταρα U2OS αγωγή με ραπαμυκίνη (Εικ. 1 F), σύμφωνα με την ικανότητα της ραπαμυκίνης να επάγει παραγωγική autophagy ως διαδικασία επιβίωσης. Κυτταρικό θάνατο μετά από COPI νοκ ντάουν ήταν ακόμη ορατά και επιβεβαιώθηκε με τη χρήση αννεξίνης V χρώση (Εικ. S3). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα περισσότερα συστατικά COPI ρυθμίζουν βιωσιμότητα των καρκινικών κυττάρων.

(Α) MDA-MB-231, ΜϋΑ-ΜΒ-468, και SKOV3 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA που στοχεύει ανεξάρτητα μέλη του COPI. Εξόντωση PLK1 χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για κυτταρικό θάνατο. Ο αριθμός των κυττάρων μετά από 72 ώρες μετρήθηκε με χρώση κρυσταλλικού ιώδους. (B, C) Αντιπροσωπευτικά εικόνες φωτεινής μικροσκοπίας των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα κατεργασμένα με RF ή siRNA κατά COPB2. (D) Κλωνογόνος αποδοτικότητα επανεπίστρωσης των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού μετά την μειωμένη έκφραση του COPA, COPB2 ή COPG2 σύγκριση με τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με RISC χωρίς (RF). Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SD από τριπλότυπα δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. Κλωνογόνος αποδοτικότητα επανεπίστρωσης των καρκινικών κυττάρων U2OS μετά από θεραπεία με siRNA κατά COPB2 ή COPG2 (Ε) ή ραπαμυκίνη (F). Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SD από τριπλότυπα δύο ανεξάρτητων πειραμάτων. **, P & lt? 0,01? *** P & lt?. 0.001

Η

Coatomer πρωτεϊνών διαφορετικά Autophagy

Στη συνέχεια, ελέγξαμε εάν η εξάντληση των διαφόρων ανεξάρτητων σύνθετες πρωτεΐνες COPI ξεκίνησε αυτοφαγία, χρησιμοποιώντας τον σχηματισμό στικτή GFP-LC3 ως ανάγνωση. Μειωμένη έκφραση του COPA, COPB1, COPB2, COPG1, COPD, και COPZ1 επήγαγε την στικτή σχηματισμός GFP-LC3 σε MDA-MB-231, κυτταρικές σειρές καρκίνου MDA-MB-468 και SKOV3 (Εικ. 2Α). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν συγκρίσιμα με εκείνα που παρατηρούνται όταν τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με imatinib, ένας θετικός έλεγχος για autophagosome επαγωγής (Σχ. 2Α-C). σχηματισμός Autophagosome εκτιμήθηκε επίσης από την μετατροπή του ενδογενούς LC3-Ι σε LC3-II χρησιμοποιώντας ανοσοστύπωση επειδή η ποσότητα του LC3-ΙΙ συσχετίζεται με την ποσότητα του αυτοφαγικά μεμβρανών επισημασμένου με LC3-II [19]. Σε συμφωνία με τα δεδομένα που ελήφθησαν σε καρκινικά κύτταρα εξωγενώς υπερεκφράζουν GFP-LC3 (Σχ. 2Α-C) και με την εξαίρεση του COPG2, μειώνοντας την έκφραση των υπομονάδων coatomer οδήγησε σε συσσώρευση ενδογενών LC3-ΙΙ σε MDA-MB-231 (Σχ. 2D). Παρόμοια αποτελέσματα βρέθηκαν σε MDA-MB-468 και τα καρκινικά κύτταρα U2OS (Σχ. 2Ε). Εμείς επικυρωθεί περαιτέρω την εμμονή της αύξησης LC3-II μετά την εξάντληση COPI από μια εκτεταμένη ανάλυση πορεία του χρόνου (Σχ. 2F). Μια παρατεταμένη μειωμένη έκφραση της COPI διατηρείται έκφρασης LC3-II χωρίς προφανή υποβάθμιση της LC3-ΙΙ, που υποδηλώνουν εξασθένηση της αυτοφαγία. Electron ανάλυση μικροσκοπία (Εικ. 3Α, C και Ε? Ένθετα σχήμα 3Β, D και F.) Επιβεβαίωσε τον σχηματισμό και την σημαντική αύξηση (Εικόνα 3G). Του αυτοφαγοσώματα μετά την εξάντληση COPB2 (Σχ 3C και D). Και θεραπεία imatinib (Σχ. 3Ε και F) στο υπερδομικό επίπεδο από την παρουσία του διπλού οργανιδίων μεμβράνη που περιέχει άπεπτο κυτταροπλασματική περιεχόμενα [18]. Αντιθέτως, το συγκριτικό siRNA (RF) (Σχ. 3Α και Β) δεν προάγουν τον σχηματισμό autophagosome. Παρά το γεγονός ότι η αύξηση των αυτοφαγοσώματα ήταν παρόμοια μεταξύ MDA ΜΒ-231 κύτταρα επεξεργασμένα με COPB2 siRNA και imatinib, βρήκαμε ότι αυτοφαγοσώματα επάγεται από COPB2 siRNA ήταν σημαντικά μεγαλύτερες σε σύγκριση με αυτοφαγοσώματα επάγεται από imatinib, όπως εκτιμάται από την ποσοτικοποίηση του autophagosomal /περιοχή κυτταρόπλασμα επί ηλεκτρονίων μικροσκοπία εικόνες (Σχ. 3Η). Αυτή η παρατήρηση επιβεβαιώθηκε περαιτέρω με προσδιορισμό του μεγέθους του GFP-LC3 θετική οργανίδια των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα κατεργασμένα με COPB2 siRNA ή ελέγχουν siRNA (Σχ. S4A). Το μέγεθος των αυτοφαγοσώματα που προκαλείται από siCOPB2 είναι επίσης μεγαλύτερη από εκείνη της πείνας που προκαλείται αυτοφαγοσώματα (Εικ. S4B και S4C). Συλλογικά, αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι τα αποτελέσματα εξάντληση COPI τη συσσώρευση της LC3-θετικών στίγματα στα καρκινικά κύτταρα.

(Α) MDA-MB-231, κύτταρα MDA-MB-468, και SKOV3 υπερεκφράζουν σταθερά GFP-LC3 ήταν επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύει ανεξάρτητα μέλη του COPI για 72 ώρες, και ο σχηματισμός autophagosome αναλύθηκε χρησιμοποιώντας τον αναλυτή κυττάρων σε 1000 σύστημα. Imatinib χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για το σχηματισμό autophagosome. Τα αποτελέσματα είναι η μέση τιμή ± SD από τριπλούν. Αντιπροσωπευτικά γράφημα δύο ανεξάρτητα πειράματα δείχνεται. (Β, C) Εκπρόσωπος εικόνες μικροσκόπιο επιφθορισμού (IN Αναλυτής Κυττάρων 1000) της GFP-LC3-θετικά κυστίδια στον έλεγχο κύτταρα MDA-MB-231 ή μετά την εξάντληση COPB2. ανάλυση (Δ) Ανοσοστύπωμα LC3 σε MDA-MB-231 72 ώρες μετά siRNA μεσολαβεί εξάντληση των ανεξάρτητων μελών του COPI. β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Ε) MDA-MB-468 και U2OS κύτταρα κατεργασμένα με RF ή COPB2 siRNA αναλύθηκαν για τα πρωτεϊνικά επίπεδα της LC3. (F) MDA-MB-231 κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA κατά COPB2, COPG2 ή RISC χωρίς (RF) και αναπτύχθηκαν για τους υποδεικνυόμενους χρόνους, λύθηκαν, και ανοσοστυπώθηκαν με αντισώματα προς LC3, COPB2, COPG2 και β-ακτίνης. *, Μη επιλεκτική μπάντα.

Η

(Α-Ρ) μετάδοσης ηλεκτρονίου ανάλυση μικροσκοπία αυτοφαγία σε MDA-MB-231 κύτταρα κατεργασμένα με RF ή siRNA κατά COPB2 για 48 ώρες ή imatinib για 24 ώρες. Τα λευκά βέλη δείχνουν αυτοφαγοσώματα δείχνεται στο πάνελ C και Ε (Β, D, F) Υψηλή μεγέθυνση εικόνων εγκιβωτισμένες περιοχές. Ράβδοι κλίμακας δείχνουν 2 μm (A, C, E) και 500 nm (Β, D, F). (G) Αριθμός αυτοφαγοσώματα ανά κύτταρο υπολογίσθηκε μετρώντας τον αριθμό των διπλών οργανιδίων μεμβράνης σε 20 ή περισσότερα μεμονωμένα κύτταρα. (H) περιοχή Ποσοστό autophagosomal υπολογίστηκε μετρώντας περιοχή που καλύπτεται από διπλό οργανίδια μεμβράνη στο κυτταρόπλασμα των 20 ή περισσοτέρων μεμονωμένων κυττάρων. **, P & lt? 0,01? ****, Σ & lt? 0,0001,

Η

Η διακοπή της COPI Προκαλεί Αποτυχημένη Autophagy

Λόγω εξάντλησης των πολύπλοκων μέλη COPI προκάλεσε θάνατο των κυττάρων και το σχηματισμό autophagosome, στόχος μας ήταν να ελέγξετε αν αποτυχημένο αυτοφαγία ήταν ο μηχανισμός. Να γίνει διάκριση μεταξύ άκαρπη και παραγωγική αυτοφαγία αναλύσαμε ρ62, το οποίο κατά προτίμηση αποικοδομείται κατά τη διάρκεια της αυτοφαγία, αλλά τα επίπεδα παραμένουν σταθερές ή να αυξηθεί με την επαγωγή αποτυχημένη αυτοφαγία [21]. Όπως προσδιορίζεται με ανάλυση ανοσοαποτύπωσης διαφορετικών καρκινικών κυτταρικών γραμμών (Σχ. 4Α) και ανάλυση ανοσοφθορισμού σε MDA-MB-231 κύτταρα (Σχ. 4Β, C), siCOPB2 δεν μειώνουν τα επίπεδα ρ62, όπως θα αναμενόταν από παραγωγικές αυτοφαγία, αλλά αυξήθηκε τα επίπεδα του ρ62 σε σύγκριση με τα επίπεδα ελέγχου. Σε αντίθεση, τα επίπεδα ρ62 μειώθηκαν στα ΜΟΡ10Α (Εικ. S9D), αν και τα επίπεδα πρωτεΐνης COPB2 ήταν σημαντικά μειωμένη (Εικ. S9C). Επιπλέον, χρησιμοποιήσαμε βαφιλομυκίνη Α1 (BafA1), ένα λυσόσωμα-ειδικός αναστολέας της πρωτεϊνικής αποδόμησης και των τελικών σταδίων της διαδικασίας αυτοφαγία να αναστέλλουν αυτοφαγικά ροής [18], [22]. θεραπεία BafA1 έχει αποδειχθεί ότι αυξάνουν τα επίπεδα της LC3-ΙΙ σε κύτταρα που υποβάλλονται σε παραγωγικές autophagy αλλά έχει περιορισμένη επίδραση στα επίπεδα LC3-ΙΙ σε κύτταρα που υποβάλλονται σε άκαρπες autophagy [20]. Σε MDA ΜΒ-231 κυττάρων με knockdown του COPB2, θεραπεία BafA1 δεν αύξησε περαιτέρω τα επίπεδα II LC3-(Εικ. 4D), σε αντίθεση με COPG2 εξαντλημένο ή κύτταρα ελέγχου, υποδεικνύοντας μειωμένη αποικοδόμηση του περιεχομένου autophagosomal από τα λυσοσώματα μετά την εξάντληση COPB2 . Εμείς επιβεβαίωσε αυτή την παρατήρηση στην U2OS καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με είτε BafA1 ή ραπαμυκίνη (Εικ. S5). Μειωμένη υποβάθμιση του εσωτερικού περιεχομένου του αυλού των αυτοφαγοσώματα από λυσοσώματα μπορεί να προκληθεί από: 1) απέτυχε autophagosome σύντηξης /λυσόσωμα? 2) μειωμένη υποβάθμιση? ή 3) ατελής ανακύκλωση των συστατικών autolysosomal [18], [23]. Για να προσδιορίσετε ποια από αυτές τις δυνατότητες ήταν υπεύθυνη για την αύξηση της LC3-II και ρ62 σε κύτταρα με εξάντληση COPI, αναλύσαμε την πρώτη συγχώνευση των αυτοφαγοσώματα (GFP-LC3) και λυσοσώματα (LAMP2) μετά από νοκ ντάουν της COPI στο MDA-MB-231 κύτταρα σταθερά επιμολυσμένα με GFP-LC3 (Εικ. 5Α). Συνεστιακή ανάλυση αποκάλυψε συνεντόπισης της GFP-LC3 και LAMP2 στα καρκινικά κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με siRNA έναντι COPB2 (Εικ. 5Α), γεγονός που υποδηλώνει σύντηξη δεν έχει αποκλειστεί εντελώς από την εξάντληση των COPI. Δοκιμάσαμε περαιτέρω την επίδραση της COPB2 siRNA για την υποβάθμιση autophagosomal χρησιμοποιώντας mRFP-GFP παράλληλα φθορισμού ετικέτα LC3 (tfLC3? [15]). Σε κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με tfLC3, GFP- /RFP-θετικά puncta αντιπροσωπεύουν αυτοφαγοσώματα δεν συγχωνευμένο με λυσοσώματα, ενώ RFP-θετικών /αρνητικών GFP-puncta αντιπροσωπεύουν autolysosomes ως GFP είναι ταχύτερα σβήνεται με χαμηλό pH λυσοσωματική [15]. MDA-MB-231 κύτταρα παροδικά επιμολυσμένα με tfLC3 έδειξε συνεντόπισης του σήματος mRFP και GFP μετά την εξάντληση COPI ή θεραπεία BafA1 (Εικ. 5Β, γραμμή 2 και 3), ενδεικτικά της διαταραγμένης ωρίμανση των αυτοφαγοσώματα. Θεραπεία των κυττάρων MDA-MB-231 κυττάρων με imatinib οδήγησε σε RFP-θετικών /αρνητικών GFP-puncta αντιπροσωπεύει την παρουσία autolysosomes και έτσι αυτοφαγικά ροής (Σχ. 5Β, τελευταία σειρά). Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν σε U2OS καρκινικά κύτταρα (Σχ. S6). Επιπλέον, COPB2 απεμπλουτισμένο κύτταρα έδειξαν μεγάλο LAMP2 θετική οργανίδια (Εικ. S4D).