Αφηρημένο

Ο καρκίνος των ωοθηκών παραμένει ο πιο θανατηφόρος γυναικολογικό καρκίνο και νέες στοχευμένες μοριακές θεραπείες κατά της εν λόγω νόσου άθλιο εξακολουθούν να είναι δύσκολες . Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε τις εκφραστικές μορφές ιντερλευκίνης-6 (IL-6) και του υποδοχέα (IL-6R) έκφραση του σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών, αξιολόγησε την επίδραση αυτών των εκφράσεων στην κλινική έκβαση των ασθενών, και βρήκαν ότι ένα υψηλής επίπεδο έκφρασης IL-6R, αλλά όχι IL-6 έκφραση σε καρκινικά κύτταρα είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας. Στις

in vitro

αναλύσεις που χρησιμοποιούν κυτταρικές σειρές των ωοθηκών, ενώ έξι (RMUG-S, RMG-1, OVISE, Α2780, SKOV3ip1 και OVCAR-3) του επτά υπερεκφρασμένης IL-6R σε σύγκριση με μία πρωτοταγή κανονική επιφάνεια επιθήλιο των ωοθηκών , μόνο δύο (RMG-1, OVISE) των επτά κυτταρικές σειρές υπερεκφράζεται IL-6, υποδηλώνοντας ότι η IL-6 /IL-6R σηματοδότηση ασκεί κατά παρακρινή τρόπο σε ορισμένους τύπους καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών. Ωοθηκών ασκίτη καρκίνος συλλέχθηκαν από ασθενείς, και βρήκαμε ότι η πρωταρχική CD11b

+ CD14

+ κύτταρα, τα οποία ήταν κυρίως M2-πολωμένο μακροφάγα, είναι η κύρια πηγή της IL-6 σε ωοθηκών μικροπεριβάλλον του καρκίνου. Όταν CD11b

+ CD14

+ κύτταρα συνκαλλιεργήθηκαν με καρκινικά κύτταρα, τόσο η εισβολή και ο πολλαπλασιασμός των καρκινικών κυττάρων σθεναρά προωθούνται και αυτές οι προαγωγές σχεδόν αναστέλλεται πλήρως από προκατεργασία με αντι-IL-6R αντισωμάτων (tocilizumab ). Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ προτείνουν ένα σκεπτικό για θεραπεία αντι-IL-6 /IL-6R για να καταστείλει την περιτοναϊκή εξάπλωση του καρκίνου των ωοθηκών, και αντιπροσωπεύουν απόδειξη του θεραπευτικού δυναμικού των αντι-IL-6R θεραπεία για τη θεραπεία του καρκίνου των ωοθηκών.

Παράθεση: Isobe Α, Sawada Κ, Kinose Υ, Ohyagi-Χαρά C, Nakatsuka Ε, Makino H, et al. (2015) ιντερλευκίνης 6 υποδοχέας είναι ένας ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας και ένα πιθανό θεραπευτικό στόχο του καρκίνου των ωοθηκών. PLoS ONE 10 (2): e0118080. doi: 10.1371 /journal.pone.0118080

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Goli Σαμίμι, Garvan Institute of Medical Research, ΑΥΣΤΡΑΛΙΑ

Ελήφθη: 1 Οκτωβρίου, 2014? Αποδεκτές: 5 Ιανουαρίου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 6 Φεβ 2015

Copyright: © 2015 Isobe et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή υποστηρίζεται από μια Grant-in-Aid για την επιστημονική έρευνα από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστήμης, Αθλητισμού και Πολιτισμού της Ιαπωνίας (21791555 και 23592447 για να KS, 22390308 στο Χονγκ Κονγκ και 23659779 έως ΤΚ). Το έργο αυτό ήταν επίσης εν μέρει υποστηρίζεται από το Ίδρυμα Οσάκα Ιατρικής Έρευνας για δυσίατος Νοσημάτων (με KS). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος των ωοθηκών είναι η κύρια αιτία θανάτου από γυναικολογικό κακοήθειες. Πρόσφατα πειστικά δεδομένα υποστηρίζουν την εμπλοκή του φλεγμονώδους στρωματικών μικροπεριβάλλον, που προκαλείται από υπερ-έκφραση κυτοκινών ή χημειοκινών, για την προώθηση των ωοθηκών ογκογένεση, την εξέλιξη του καρκίνου και αντίσταση στην χημειοθεραπείες. [1] Ως εκ τούτου, που στοχεύουν αυτές τις κυτοκίνες από το μικροπεριβάλλον στρωματικών μπορεί να προσφέρει μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για τη βελτίωση της διαχείρισης των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών

Μεταξύ των κυτοκινών έχουν αναφερθεί μέχρι τώρα, ιντερλευκίνη-6 (IL-6) είναι μία από τις πιλοτικές ανοσορυθμιστικών κυτοκινών που υπάρχουν στο μικροπεριβάλλον του καρκίνου των ωοθηκών.? επάγει αρκετές οδούς που οδηγούν σε καρκινικά πολλαπλασιασμό, αγγειογένεση και χημειοαντίσταση. [2] Τα υψηλότερα επίπεδα του ορού και του ασκίτη της IL-6 έχουν βρεθεί σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών από ότι σε ασθενείς με άλλες κακοήθειες, και τα επίπεδα έχει δειχθεί ότι συσχετίζεται με την έκταση της νόσου και η κακή κλινική έκβαση. [3-5] Παρά το γεγονός ότι Rath et al. πρόσφατα έδειξαν ότι η έκφραση IL6-R εκφράζεται έντονα σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών σε σχέση με φυσιολογικούς ιστούς ή καλοήθη νοσήματα, [6] δεν έχει εξετασθεί η κλινική επίδραση της έκφρασης IL6-R σε είδη καρκίνου των ωοθηκών. Ως εκ τούτου, ενθαρρύνθηκαν να διερευνηθούν οι κλινικές τιμές της IL-6 και IL-6R σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών με τη χρήση των μικροσυστοιχίες ιστού (TMAs) κατασκευάσαμε και τα αντίστοιχα κλινικά δεδομένα.

Φαίνεται ότι ανταγωνισμό της IL-6 /IL-6R σηματοδότηση μπορεί να έχει θεραπευτική δραστικότητα σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών μέσω της αναστολής ενός δικτύου κυτοκίνης προαγωγής όγκων. Πράγματι, στοχευμένη IL-6 αντι-θεραπεία με αντισώματα έχει χρησιμοποιηθεί σε κλινικές δοκιμές και διαπιστώθηκε ότι είναι καλά ανεκτές σε ασθενείς διαφόρων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου των ωοθηκών. [7] Tocilizumab (Chugai Pharmaceutical, Shizuoka, Ιαπωνία), είναι ένα εξανθρωπισμένο αντι- ανθρώπινο αντίσωμα IL-6R και συνδέεται με τη θέση της IL-6-πρόσδεσης της ανθρώπινης IL-6R. Είναι γνωστό ότι αναστέλλει συναγωνιστικά IL-6 /σηματοδότηση IL-6R και εξουδετερώνει εντελώς IL-6 δραστηριότητες. [8, 9] Μια σειρά από κλινικές μελέτες έχουν δείξει επιτυχώς ότι η καταστολή της IL-6 /IL-6R σηματοδότηση με tocilizumab είναι θεραπευτικά αποτελεσματική στην ανακούφιση της νόσου του Castleman και η ρευματοειδής αρθρίτιδα. [10, 11] Δεδομένης της επιτυχίας της στη θεραπεία αυτών των ασθενειών, τοκιλιζουμάμπη μπορεί να αποδειχθεί χρήσιμη στη θεραπεία της IL-6 που σχετίζονται με καρκίνους και ήμασταν κίνητρο για να αποσαφηνιστεί το θεραπευτικό δυναμικό της tocilizumab κατά του καρκίνου των ωοθηκών.

αν και δεν είναι μόνο ωοθηκών καρκινικά κύτταρα αλλά μακροφάγα που σχετίζονται με όγκους έχουν αναφερθεί ότι παράγουν IL-6, [12, 13], παραμένει συζητήσιμο το κατά πόσον αυξημένη παραγωγή IL-6 επίπεδα σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών παράγονται από τον όγκο ίδια ή κυρίως από τους ιστούς του ξενιστή. Η πλειονότητα των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών σε προχωρημένο στάδιο παρόν περιτοναϊκή μεταστατικός παθήσεις, που συχνά συνοδεύεται από μαζική ασκίτη. [14] Μαζική ασκίτη των ασθενών να αποτελείται από όχι μόνο τα καρκινικά κύτταρα, αλλά και ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα και κυρίως ανοσοκύτταρα, τα οποία είναι ζωτικής σημασίας για την ανάπτυξη του καρκίνου, εξέλιξη και μετάσταση. οι [15] περιτοναϊκή μακροφάγα πιστεύεται ότι παίζουν κεντρικό ρόλο στο πλαίσιο αυτό, όπως αποδεικνύεται από πολλές μελέτες διαπίστωση ότι η εξάντληση των μακροφάγων στην περιτοναϊκή μοντέλα καρκίνου των ωοθηκών καταστέλλει την πρόοδο και τη συσσώρευση ασκίτη καρκίνου. [16, 17] τα μακροφάγα που διηθούν ιστούς όγκων, τα οποία αναφέρονται ως σχετιζόμενο με τον όγκο μακροφάγων (ΤΑΜ), είναι πολύ γνωστές συνεισφέροντες εξέλιξης του όγκου και σχετίζονται με την κακή πρόγνωση των διαφόρων μορφών καρκίνου. [18, 19] Δεδομένου ότι τα ΤΑΜ γνωστό ότι απελευθερώνουν διάφορες προαγγειογόνος κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες, υποθέσαμε ότι τα μακροφάγα μπορεί να είναι ένας από τους πιθανούς υπεύθυνη πηγές εμπλουτισμένου IL-6 συσσώρευση στο ασκίτη καρκίνο των ωοθηκών.

στο πλαίσιο αυτό, προσπαθήσαμε να αναλύσουμε την εκφραστική μορφή της IL- 6R καθώς και με τον καρκίνο των ωοθηκών TMAs και να αξιολογήσει τον αντίκτυπο αυτών των εκφράσεων σχετικά με τις κλινικές εκβάσεις των ασθενών. Ωοθηκών ασκίτη καρκίνου συλλέχθηκαν από ασθενείς που υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση και βρήκαμε ότι πρωταρχικός CD11b

+ CD14

+ κύτταρα, τα οποία ήταν κυρίως M2-πολωμένο ΤΑΜ, ήταν η κύρια πηγή παραγωγής IL-6 σε ένα μικροπεριβάλλον του όγκου των ωοθηκών και σθεναρά προωθείται ωοθηκών εισβολής και του πολλαπλασιασμού του καρκίνου. Τα δεδομένα που παρουσιάζονται εδώ προτείνουν ένα σκεπτικό για θεραπεία αντι-IL-6 /IL-6R για να καταστείλει την περιτοναϊκή εξάπλωση του καρκίνου των ωοθηκών και παρέχουν απόδειξη της θεραπευτικού δυναμικού της θεραπείας με αντι-IL-6R να θεραπεύσει αυτό το άθλιο ασθένεια.

Υλικά και Μέθοδοι

ηθική Δήλωση

τα δείγματα ασθενών ελήφθησαν με γραπτή συγκατάθεση, σύμφωνα με τις απαιτήσεις της επιτροπής δεοντολογίας από τα ινστιτούτα και τη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Επιτροπή δεοντολογίας (IRB) της Osaka University Graduate School of Medicine ενέκρινε το πρωτόκολλο της μελέτης για την 02.15.2011 (αρ 10064). IRB του Γκιφού Πανεπιστημίου Graduate School of Medicine που εγκρίθηκε στις 02.07.2012 (αρ 26-50).

Υλικά |

Τα αντισώματα κατά της IL-6 (R-49L), IL- 6R (C-20) και το συνολικό STAT3 (C-20) ήταν από την Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Η ανασυνδυασμένη ανθρώπινη IL-6 ελήφθησαν από την Chemicon (Temecula, CA) και ανασυνδυασμένη ανθρώπινη sIL-6R ήταν από R δεν εντοπίστηκε. (F) Western Blot. Η εξωγενής θεραπεία των IL-6 ενεργοποιεί IL-6 /IL-6R σηματοδότηση σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών. κύτταρα SKOV3ip1 διεγέρθηκαν με IL-6 (100 ng /mL) για 30 λεπτά με ή χωρίς προκατεργασία χρησιμοποιώντας Ράντη-IL-6R αντισωμάτων (1-100 μg /ml) μη-άνοση IgG ως μάρτυρα. Τα κυτταρολύματα συλλέχθηκαν και ίση ποσότητα των προϊόντων λύσης κυττάρου (30 μγρ) επιλύθηκε με 10% SDS-PAGE και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-φωσφορυλιωμένο STAT3 αντίσωμα (ρ-STAT3) και αντι-φωσφορυλιωμένες ρ44 /42 ΜΑΡΚ (ρ-ERK1 /2) αντίσωμα. Οι μεμβράνες απομακρύνθηκαν και επαναυβριδοποιήθηκαν με αντισώματα ανίχνευση των συνολικών μορφές της πρωτεΐνης. Οι κηλίδες είναι αντιπροσωπευτικά τριών πειραμάτων.

Η

θεραπεία εξωγενής IL-6 επάγει τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και την παραγωγή VEGF των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών

Δεδομένου ότι η IL-6 /IL-6R σηματοδότηση είναι γνωστές να ενεργεί με διάφορους τρόπους για την αύξηση εξέλιξης του καρκίνου, εξετάσαμε αν η εξωγενής θεραπεία των IL-6 βελτιώνει πολλαπλασιασμό, την εισβολή και VEGF που σχετίζονται με αγγειογένεση σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών. Για το σκοπό αυτό, τα κύτταρα SKOV3ip1 τα οποία δεν εκφράζουν ανιχνεύσιμα επίπεδα πρωτεΐνης IL-6 και RMG-1 κύτταρα που εκφράζουν ένα ορισμένο επίπεδο IL-6 χρησιμοποιήθηκαν. Αμφότερες οι κυτταρικές γραμμές έχουν υψηλά επίπεδα έκφρασης IL-6R όπως επιβεβαιώνεται στο σχ. 2Α. Η εξωγενής θεραπεία των IL-6 σθεναρά επαγόμενη κυτταρική εισβολή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε έναν τρόπο που εξαρτάται από τη δόση (IL-6 100 ng /ml? SKOV3ip1, 4,27 ± 0,53 φορές, RMG-1, 2,99 ± 0,46 φορές), ενώ η επαγωγή ήταν σχεδόν εντελώς αναστέλλεται από την προεπεξεργασία με αντι-IL-6R αντισωμάτων (Σχ. 3Α). Η προσθήκη εξωγενούς sIL-6R δεν προωθούν περαιτέρω την εισβολή των ωοθηκών καρκινικών κυττάρων που επάγεται από την IL-6, υποδηλώνοντας ότι η IL-6RS (IL-6R και sIL-6R) που παράγεται από τα καρκινικά κύτταρα είναι αρκετά για να ενεργοποιήσει IL-6 /IL -6R σηματοδότησης. Η εξωγενής θεραπεία των IL-6 επίσης ενίσχυσε σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των δύο καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε έναν τρόπο που εξαρτάται από τη δόση (IL-6 100 ng /ml? SKOV3ip1, 1,60 ± 0,29 φορές, RMG-1, 1,64 ± 0,39 φορές) και η προεπεξεργασία των αντι -IL-6R αντισώματος σχεδόν κατάργησε τις εν λόγω βελτιώσεις (Σχ. 3Β). Στη συνέχεια, εξετάσαμε την παραγωγή VEGF από τα κύτταρα SKOV3ip1. Η εξωγενής θεραπεία της IL-6 (100 ng /ml, 72h) διεγείρεται σημαντικά την παραγωγή VEGF από τα καρκινικά κύτταρα (έλεγχος? 239,4 ± 16,3 pg /1x 10

5 κύτταρα, η IL-6? 322,4 ± 11,8 pg /1×10

5 κύτταρα) και η προεπεξεργασία των καρκινικών κυττάρων με αντι-IL-6R αντισωμάτων αξιοσημείωτα ανέστειλε την παραγωγή VEGF (Σχ. 3C). Συλλογικά, δεν απαιτήθηκε εξωγενή θεραπεία με IL-6 που προκαλείται από τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και VEGF παραγωγή των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, αν και δεν εκφράζουν IL-6, και συν-θεραπεία με διαλυτό IL-6R. Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι σε ορισμένους τύπους καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών, IL-6 /IL-6R σηματοδότηση μπορεί να αυξήσει την εξέλιξη του καρκίνου σε έναν παρακρινή τρόπο.

(Α) Μία δοκιμασία Matrigel εισβολή έγινε χρησιμοποιώντας ένα τροποποιημένο σύστημα θαλάμου Boyden . 1 x 10

5 SKOV3ip1 (

αριστερά

) ή RMU που-S (

δεξιά

) κύτταρα τοποθετήθηκαν στην κορυφή του θαλάμου σε μέσο ελεύθερο ορού και αφήνονται να εισβάλουν για 72 ώρες . Διάφορες συγκεντρώσεις της IL-6 (1-100 ng /ml) ή 60 ng /ml slL-6R εφαρμόστηκαν στον κάτω θάλαμο ως χημειοελκτικό. 10 μg /ml του αντι-IL-6R αντισωμάτων ή μη-άνοση IgG συν-θεραπεία. Μη εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν χρησιμοποιώντας μια μπατονέτα, και εισβάλλοντα κύτταρα στην κάτω πλευρά του φίλτρου απαριθμήθηκαν. Οι σχετικοί αριθμοί των εισβάλλοντα κύτταρα σε σχέση με τον έλεγχο (χωρίς IL-6 θεραπεία) απεικονίζεται. (Β)

In vitro

δοκιμασία πολλαπλασιασμού των κυττάρων. 1 x 10

4 κύτταρα SKOV3ip1 (

αριστερά

) ή RMG1 (

δεξιά

) κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων σε 10% FBS /DMEM για 24 ώρες και στη συνέχεια επωάστηκαν σε μέσο απαλλαγμένο από ορό, παρουσία ή απουσία διαφόρων συγκεντρώσεων της IL-6 (1-100 ng /ml) με ή χωρίς αντι-IL-6R αντισωμάτων ή μη-άνοση IgG σαν έλεγχος για 72 ώρες. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε με μία τροποποιημένη δοκιμασία MTS. Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκφράζεται ως ο λόγος του αριθμού των βιώσιμων κυττάρων. (Γ) ELISA δοκιμασία του VEGF-A. 1 x 10

5 κύτταρα SKOV3ip1 απλώθηκαν πάνω σε πλάκες 6-φρεατίων και καλλιεργήθηκαν με 2 ml μέσου χωρίς ορό με την παρουσία ή απουσία 100 ng /ml IL-6 επί 72 ώρες. αντίσωμα ή τον έλεγχο αντι-IL-6R IgG συν-θεραπεία. Ρυθμισμένα μέσα συλλέχθηκαν και η συγκέντρωση του ανθρώπινου VEGF-Α μετρήθηκε με ELISA. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές και οι τιμές είναι μέσοι ± SD του τριπλούν. N.s .; ασήμαντο, *; P & lt? 0,05, **? P & lt? 0.01.

Η

CD11b

+ CD14

+ κυττάρων ενισχύεται εισβολή και τον πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών μέσω της IL-6

παραγωγή

Από την IL-6 /IL-6R σηματοδότηση