Αφηρημένο

L-καρνιτίνη (LC) είναι γενικά πιστεύεται ότι μεταφέρει ακυλομάδες μακράς αλυσίδας από λιπαρά οξέα στη μιτοχονδριακή μήτρα για την παραγωγή ΑΤΡ

μέσω

τον κύκλο του κιτρικού οξέος. Με βάση την θεωρία Warburg ότι τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα εξαρτώνται κυρίως από γλυκόλυση για την ΑΤΡ παραγωγή, υποθέτουμε ότι, θεραπεία LC θα οδηγούσε σε διατάραξη του κυτταρικού μεταβολισμού και κυτταροτοξικότητα σε καρκινικά κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, Human ηπάτωμα HepG2, SMMC-7721 κυτταρικές σειρές, χρησιμοποιήθηκαν πρωτεύοντος καλλιεργούμενου θυμοκύτταρα και ποντικών που φέρουν HepG2 όγκου. περιεχόμενο ΑΤΡ ανιχνεύθηκε με δοκιμασία HPLC. κυτταρικού κύκλου, ο κυτταρικός θάνατος και η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκαν με κυτταρομετρία ροής και MTS αντίστοιχα. Gene, η έκφραση mRNA και επίπεδο πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με γονιδιακή μικροσυστοιχιών, Real-time PCR και κηλίδας Western αντίστοιχα. δραστηριότητες HDAC και ακετυλίωση ιστονών ανιχνεύθηκαν τόσο στο δοκιμαστικό σωλήνα και σε καλλιεργημένα κύτταρα. Μια μελέτη μοριακής σύνδεσης διεξήχθη με CDOCKER πρωτόκολλο Ανακάλυψης Studio 2.0 για να προβλεφθεί η μοριακή αλληλεπίδραση μεταξύ L-καρνιτίνης και HDAC. Εδώ βρήκαμε ότι (1) θεραπεία LC επιλεκτικά ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων

in vivo

και

in vitro

? (2) επεξεργασία LC προκαλεί επιλεκτικά την έκφραση του p21

Cip1 γονιδίων, mRNA και πρωτεϊνών στα καρκινικά κύτταρα, αλλά όχι p27

kip1? (4) LC αυξάνει ακετυλίωση των ιστονών και επάγει τη συσσώρευση ακετυλιωμένων ιστονών τόσο υπό κανονικές συνθήκες θυμοκύτταρα και καρκινικά κύτταρα? (5) LC αναστέλλει άμεσα HDAC I /δραστηριότητες II

μέσω

σύνδεσης προς τις ενεργές θέσεις των HDAC και επάγει ακετυλίωση των ιστονών και συσσώρευση λυσίνη-ακετυλίωση

in vitro

? (6) θεραπεία LC προκαλεί συσσώρευση ακετυλιωμένων ιστονών στην χρωματίνη σχετίζεται με την ρ21

Cip1 γονίδιο αλλά όχι p27

kip1 ανιχνεύεται με τη δοκιμασία chip. Αυτά τα δεδομένα υποστηρίζουν ότι LC, εκτός μεταφορά ακυλομάδα, λειτουργεί ως ένας ενδογενής αναστολέας HDAC στο κύτταρο, το οποίο θα ήταν φυσιολογικών και παθολογικών σημασία

Παράθεση:. Huang Η, Liu Ν, Guo Η, Liao S, Λι Χ, Yang C, et al. (2012) L-Καρνιτίνη είναι ένας ενδογενής HDAC αναστολέα επιλεκτικής αναστολής του καρκίνου ανάπτυξη κυττάρων

In Vivo

και

In Vitro

. PLoS ONE 7 (11): e49062. doi: 10.1371 /journal.pone.0049062

Επιμέλεια: Wei-Guo Zhu, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας, Κίνα

Ελήφθη: 21 Δεκεμβρίου, 2011? Αποδεκτές: 9η Οκτωβρίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 5 Νοέμβρη, 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό υψηλής Τεχνολογίας Έρευνας και Ανάπτυξης του Προγράμματος της Κίνας (Έργο 2006AA02Z4B5), Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Projects 81070033, 30770835, 81170608, 81072091)? Έργα (9251018201002, 94510018201003604) της επαρχίας Γκουανγκντόνγκ Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών και έργων από Guangzhou Δημοτική Επιτροπή Παιδείας (10Α 057S, 08A 108) (για JL, HH και CZ). Αυτή η μελέτη είναι εν μέρει υποστηρίζεται από Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας επιχορήγησης R01HL072166 και R01HL085629 (σε XW). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρνιτίνη βιοσυντίθεται από τα αμινοξέα λυσίνη και μεθειονίνη και βιολογικά ενεργό μορφή του είναι η L-καρνιτίνη (LC). Πιστεύεται γενικά ότι η καρνιτίνη μεταφέρει ακυλομάδες μακράς αλυσίδας από λιπαρά οξέα στη μιτοχονδριακή μήτρα, όπου μπορούν να αναλυθούν μέσω β-οξείδωσης σε ακετυλο-CoA για να ληφθεί χρήσιμη ενέργεια

μέσω

ο κύκλος του κιτρικού οξέος [ ,,,0],1] – [3]. Ως εκ τούτου, LC απαιτείται για την παραγωγή της μεταβολικής ενέργειας σε ζωντανά κύτταρα.

Έχει καλά γνωστό ότι τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα παράγουν κυρίως ενέργεια με υψηλό ρυθμό γλυκόλυσης ακολουθούμενη από ζύμωση του γαλακτικού οξέος στο κυτταρόπλασμα, και όχι από ένα συγκριτικά χαμηλό ποσοστό γλυκόλυση που ακολουθείται από οξείδωση του πυροσταφυλικού σε μιτοχόνδρια όπως τα περισσότερα φυσιολογικά κύτταρα. Αυτό είναι γνωστό ως αποτέλεσμα Warburg σε καρκινικά κύτταρα [4], [5]. Ταχέως αναπτυσσόμενες κακοήθη κύτταρα έχουν συνήθως γλυκολυτικά ποσοστά που είναι μέχρι και 200 ​​φορές υψηλότερες από εκείνες των φυσιολογικών ιστών καταγωγής τους. Ακόμα κι αν Warburg αποτέλεσμα έχει αμφισβητηθεί και να αναπτυχθεί περαιτέρω, αυτή η θεωρία παραμένει η πιο συχνά αναφερόμενη ενδείξεις ότι οι όγκοι εμφανίζουν δυσλειτουργικό μεταβολισμό [6].

Με βάση αυτή τη θεωρία ότι ο κύκλος του κιτρικού είναι επιζήμια στα περισσότερα καρκινικά κύτταρα [7 ], [8], υποθέτουμε ότι LC θα οδηγούσε σε διατάραξη του κυτταρικού μεταβολισμού στα καρκινικά κύτταρα αλλά όχι σε φυσιολογικά κύτταρα. Σε αυτή τη μελέτη, ερευνήσαμε την επίδραση του LC στην κυτταροτοξικότητα τόσο σε καρκινικά και φυσιολογικά κύτταρα. Βρήκαμε ότι το LC επιλεκτικά ανέστειλε την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων και

in vitro

και

in vivo

. Ερευνήσαμε περαιτέρω το μηχανισμό της LC-μεσολάβηση κυτταροτοξικότητας και διαπίστωσε ότι φυσιολογικές συγκεντρώσεις LC μπορούσε να αναστείλει άμεσα τις δραστηριότητες HDAC.

Υλικά και Μέθοδοι

Υλικά και μέσα

LC, R -καρνιτίνη, ολιγομυκίνης (Νο 04876), βουτυρικό (βουτ) και τριχοστατίνη Α (TSA) αγοράστηκαν από την Sigma-Aldrich (St. Louis, ΜΟ). HDAC

σύστημα TM I II δοκιμασία /και διαλογής αγοράστηκε από την Promega Corporation (Madison, WI). L-γλυκόζη και D-γλυκόζης ελήφθησαν από την Alfa Aesar (Karlsruhe, Germany). Ο εμβρυϊκός βόειος ορός (FBS) αγοράστηκε από την Invitrogen Οο (Carlsbad, CA). Κουνέλι μονοκλωνικά αντισώματα έναντι ακετυλο-H3 (Lys9) (C5B11), πολύκλωνα αντισώματα κουνελιού έναντι PARP, ακετυλιωμένα-λυσίνη, ακετυλο-H4 (Lys8), και μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού έναντι ρ21

WAF1 /Cip1 (DCS60) ήταν όλοι αγοράζονται από Cell Signaling (Beverly, ΜΑ). Αντισώματα έναντι Rb (G401), Phospho-Rb (S780) αγοράστηκαν από Bioworld Technology, Inc. Mouse ρ27 μονοκλωνικό αντίσωμα (F-8), πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού έναντι GAPDH (FL-335) και υπεροξειδάση κοχλιαρίας (HRP) -επισημασμένο δευτερογενή αντισώματα ήταν από την Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Ενισχυμένη αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας αγοράστηκαν από την Amersham Biosciences (Piscataway, NJ).

Ποντίκια και δίαιτα

Αρσενικά κανονική Balb /c και Balb /c γυμνών ποντικών ηλικίας 5 εβδομάδων (18-22 g) αγοράζονται αντίστοιχα από το Κέντρο ζώων Guangdong και στεγάζονται σε κλουβιά συρμάτινου πλέγματος από ανοξείδωτο χάλυβα σε δωμάτιο ζώο σε σταθερή θερμοκρασία με μια 12-h-φως /-σκοτεινό κύκλο. Τα ποντίκια κατανάλωναν ένα εμπορικό μη-καθαρισμένη δίαιτα και νερό κατά βούληση. Όλα τα πειραματικά πρωτόκολλα ήταν σύμφωνα με το Κέντρο Ζώων Guangdong για την ηθική μεταχείριση των ζώων και έχει εγκριθεί από την πειραματική επιτροπή των ζώων της Guangzhou Medical College (SCXK2008-2002). Αρσενικά φυσιολογικούς ποντικούς Balb /c χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες (η = 8 ποντικοί /ομάδα) και ήταν

ί.ρ

. εγχύθηκαν είτε με φορέα (φυσιολογικός ορός) ή LC στα 400 mg /kg για συνεχόμενες 15 ημέρες. Το σωματικό βάρος και το βάρος των οργάνων εντοπίστηκαν και συνοψίζονται. Αρσενικό Balb /c γυμνά ποντίκια ήταν

υποδορίως

. εμβολιάστηκαν στο αριστερό μασχάλη με κύτταρα HepG2 (1 × 10

6 κύτταρα /ποντίκι). Όταν το μέγεθος του όγκου φθάσει 50-75 mm

3, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε δύο ομάδες (η = 8 ποντικοί /ομάδα) και

ip

ένεση είτε με όχημα (φυσιολογικός ορός) ή LC (400 mg /kg, μία φορά /ημέρα) για 15 ημέρες εκτός ημέρα 8. Το βάρος του σώματος και του όγκου βάρους ανιχνεύθηκαν και συνοψίζονται. Για να φανεί καλύτερα αυτά τα αποτελέσματα, όλα τα πρωτογενή δεδομένα άλλαξαν με το σχετικό επίπεδο (%).

καλλιέργειας κυττάρων

κυτταρικές σειρές ανθρώπινου ηπατώματος HepG2 και SMMC-7721, αγοράστηκε από την American Type Culture Collection (Manassas, VA), αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% FBS, 100 U /mL βενζυλική πενικιλλίνη και 100 U /mL στρεπτομυκίνης, ρΗ 7,4 σε υγροποιημένη ατμόσφαιρα με 5% CO

2 στους 37 ° C. απομόνωση Θυμοκυττάρου και πρωτογενή καλλιέργεια εκτελέστηκε ως ακολούθως: εν συντομία, ο θύμος από ποντίκι Balb /c τυλίχθηκε σε ένα κομμάτι αποστειρωμένης γάζας προς απομάκρυνση συνημμένο λίπος και ο συνδετικός ιστός και ο αδένας τοποθετήθηκε σε ένα τρυβλίο 60 mm τρυβλία που περιέχουν 5 ml ψυχρού μέσα (HBSS σε ρΗ 7.0 που περιέχει 5% ορό εμβρύου μόσχου σε 4 ° C) και ήπια πείραζαν τον θύμο χώρια με βελόνες και σιφώνιο πάνω-κάτω αρκετές φορές για να σπάσει προσεκτικά επάνω οποιεσδήποτε μάζες κυττάρων. Τα μίγματα διήλθαν μέσω ενός πλέγματος από ανοξείδωτο 75 μm για την απομάκρυνση σωρών ιστού, φυγοκεντρήθηκαν τα κυτταρικά αιωρήματα (250 g, 10 min, 4 ° C) και επαναιωρήθηκαν τα σφαιρίδια του κυττάρου με 5 mL RPMI 1640. Ο συνολικός αριθμός των κυττάρων μετρήθηκαν με trypan μπλε σε ένα λευκό μετρητή κυττάρων αίματος.

Ο κυτταρικός θάνατος

δοκιμασία

Αυτή διεξήχθη χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) διπλή χρώση, ακολουθούμενη από κυτταρομετρία ροής όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9]. Εν συντομία, τα καλλιεργημένα κύτταρα HepG2 συλλέχθηκαν και πλύθηκαν με ψυχρό PBS και επαναιωρήθηκαν με το ρυθμιστικό διάλυμα δέσμευσης, που ακολουθείται από Annexin V-FITC επώαση για 15 λεπτά και ΡΙ βαφή για άλλα 15 λεπτά στους 4 ° C σε σκοτάδι. Τα βαμμένα κύτταρα αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής μέσα σε 30 λεπτά.

ΑΤΡ περιεχόμενο προσδιορισμός

ΑΤΡ προσδιορισμός περιεχομένου πραγματοποιήθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10]. Εν συντομία, Ίδιος αριθμός καλλιεργημένων κυττάρων συλλέχθηκε και το κυτταρικό ίζημα καταψύχεται αμέσως και αποθηκεύτηκαν σε υγρό άζωτο για αναλύσεις μετέπειτα ΑΤΡ. Τα προϊόντα λύσης φυγοκεντρήθηκαν στις 12 000 στροφές ανά λεπτό για 10 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο συλλέχθηκε για την ανάλυση του ΑΤΡ με τη χρήση ενός αντίστροφης φάσης C18 HPLC (LC-6AD, Shimadzu, Ιαπωνία) δοκιμασία μετά το ρΗ ρυθμίστηκε 7,4. 180 mM ΚΗ

2 ΡΟ

4 (5% μεθανόλη) χρησιμοποιήθηκε ως κινητή φάση (ρΗ 6.25) που τρέχει σε 0.8 ml /min. Η δοκιμασία ήταν γραμμική από 0,05 σε 200 μ§ /mL για ATP με συντελεστής προσδιορισμού (R

2) & gt? 0.999. συντελεστές επικύρωση της διακύμανσης για ενδο- και δια-ημέρα δοκιμασίες ήταν λιγότερο από 1,5% και 5,1%, αντίστοιχα. Σχετική περιεχόμενο ΑΤΡ υπολογίζεται σύμφωνα με την περιοχή κορυφής

έναντι

το ATP σταθεί καμπύλη.

Η βιωσιμότητα των κυττάρων δοκιμασία

Οι επιδράσεις των φαρμάκων στην βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε από την MTS δοκιμασία (δοκιμασία CellTiter 96® υδατικό One Solution κυτταρικού πολλαπλασιασμού, Promega Corporation, Madison, WI, USA), όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [9]. Εν συντομία, κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 96 φρεατίων και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με ενδεικνυόμενη παράγοντες για 24 ή 48 ώρες. Στη συνέχεια, επεξεργασμένα κύτταρα επωάστηκαν με 20 μι MTS για επιπλέον 3 ώρες. Η απορρόφηση μετρήθηκε στα 490 nm με αυτόματο αναγνώστη μικροπλάκας (Sunrise, Tecan). Η βιωσιμότητα των κυττάρων υπολογίσθηκε από τον ακόλουθο τύπο: βιωσιμότητα κυττάρου (%) = (μέσος όρος απορρόφησης ομάδα που υπέστη αγωγή – μέση απορρόφηση του τυφλού) /(μέση απορρόφηση του μη επεξεργασμένου ομάδα- μέσης απορρόφησης του τυφλού)] χ 100%

ιστόνης και ακετυλίωση πρωτεΐνης

in vitro

και σε καλλιεργημένα κύτταρα

Για

in vitro

πρωτεΐνη ακετυλίωση, κυτταρολύματος είτε από καρκινικά κύτταρα ή θυμοκύτταρα ποντικού επωάστηκαν με διάφορες δόσεις LC και TSA ή βουτ σε ρυθμιστικό δοκιμασίας HDAC στους 37 ° C για 1,5 ώρες, στη συνέχεια ακετυλιωμένης Η3,-h4, και λυσίνη-ακετυλιωμένης πρωτεΐνες ανιχνεύθηκαν με Western Blot. Για ακετυλίωση πρωτεΐνης σε καλλιεργημένα κύτταρα, είτε καρκινικό κύτταρο ή θυμοκυττάρων ποντικού υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις LC ή TSA και βουτ για διάφορα χρονικά σημεία, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και στη συνέχεια ακετυλίωση πρωτεΐνης ανιχνεύθηκε με Western Blot.

Western Blot

κηλίδος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [11], [12]. Εν συντομία, μια ίση ποσότητα της συνολικής πρωτεΐνης που εξάγεται από καλλιεργημένα κύτταρα διαχωρίστηκε με 12% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε διφθοριούχου πολυβινυλιδενίου (PVDF) μεμβράνες. Πρωτογενή αντισώματα και υπεροξειδάση αρμορακίας (HRP) κατάλληλα δευτερεύοντα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για την ανίχνευση των πρωτεϊνών που ορίζονται. Οι οριοθετούνται δευτερογενή αντισώματα επί της μεμβράνης PVDF αντέδρασαν με τα αντιδραστήρια ανίχνευσης ECL και εκτίθεται σε φιλμ ακτίνων Χ (Kodak, Ιαπωνία). Η έκθεση φιλμ ακτίνων Χ σαρώθηκε και ψηφιοποιημένο χρήση ενός σαρωτή υψηλής ανάλυσης. Η πυκνότητα του επιθυμητού ζωνών ποσοτικοποιήθηκε με το λογισμικό Quantity One (BioRad).

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου εκτελέστηκε όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [12]. κύτταρα HepG2 σπάρθηκαν σε 6-cm πιάτα όλη τη νύκτα σε μέσο RPMI 1640 συμπληρωμένο με 10% εμβρυϊκό βόειο ορό, στη συνέχεια κατεργάζεται με LC σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν, πλύθηκαν με PBS, και χρωματίστηκαν με ΡΙ παρουσία ΚΝΑάσης. Τα δεδομένα αναλύθηκαν με βάση την κατανομή των κυτταρικών πληθυσμών σε διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου.

Υπολογιστική μοντελοποίηση

Για να γίνει κατανοητή η μοριακή αλληλεπίδραση μεταξύ L-καρνιτίνη και HDAC, μια μελέτη μοριακό docking ήταν πραγματοποιείται με το πρωτόκολλο CDOCKER του Discovery Studio 2.0 (ΑοοβΙτγδ Software Inc). Η κρυσταλλική δομή της HDAC (ΠΠ ID: 1ZZ0) χρησιμοποιήθηκε ως η πρωτεΐνη σύνδεσης. Πρώτον, μόνο η αλυσίδα Α υπομονάδα διατηρήθηκε μετά από άλλες υπομονάδες αλυσίδα, αναπληρωτής διαμορφώσεις, η αρχική πράξη συνδέτη, μέταλλα κάλιο και τα μόρια του νερού αφαιρέθηκαν. Στη συνέχεια, τα άτομα υδρογόνου και τα τέλη Gasteiger προστέθηκαν στο υπομονάδας. Τέλος, μόνο οι θέσεις υδρογόνου βελτιστοποιηθεί με Dreiding-όπως forcefield χρησιμοποιώντας το μενού Clean Γεωμετρίας. Εν τω μεταξύ, η ένωση L-καρνιτίνη που επιλέγεται ως ο αναστολέας σύνδεσης επίσης βελτιστοποιηθεί με Dreiding-όπως forcefield χρησιμοποιώντας το μενού Clean Γεωμετρία. Η HDAC πρωτεΐνη ήταν άκαμπτο, ενώ το LC πρόσδεμα ήταν ευέλικτο κατά τη διαδικασία σύνδεσης. Η είσοδος του δικτυακού τόπου Σφαίρα ήταν επικεντρωμένη στην αρχική πράξη συνδέτη με ακτίνα 12 α. Κορυφαία χτυπήματα, Τυχαία διαμορφώσεων και κατευθύνσεις για να βελτιώσετε παράμετροι όλα έτοιμα έως το 20. Η διαμόρφωση που αντιστοιχεί στο χαμηλότερο CDOCKER Αλληλεπιδράσεις Ενέργειας επιλέχθηκε ως η πλέον πιθανή διαμόρφωση δέσμευσης. Επιτέλους, το συγκρότημα σύνδεσης περαιτέρω εκτιμάται δεσμευτική ελεύθερη ενέργεια από το πρωτόκολλο Energies Δεσμευτική Υπολογισμός. Όλες οι παράμετροι που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό ήταν προεπιλογή εκτός από την εξήγησε.

προσδιορισμού της δραστικότητας HDAC

in vitro

και σε καλλιεργημένα κύτταρα

δραστηριότητας HDAC

in vitro

και καλλιεργημένα κύτταρα ανιχνεύθηκε με την ανάλυση HDAC-Glo ™ Ι /ΙΙ και του συστήματος Screening (Promega, USA) ακολουθώντας το τυπικό πρωτόκολλο. δοκιμασία HDAC διεξήχθη σε λευκή πλάκα 96 φρεατίων. Για

in vitro

δοκιμασία δραστικότητας HDAC, κυτταρικό λύμα (βέλτιστη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνη: 1 μg) επωάσθηκε με διάφορες ουσίες σε ένα ρυθμιστικό διάλυμα προσδιορισμού HDAC (100 μl) στους 37 ° C για 60 λεπτά και στη συνέχεια 100 μΙ HDAC

TM I /αντιδραστήριο II προστέθηκε, μετά από 30 λεπτά, φωταύγεια μετρήθηκε. Για δοκιμασία HDAC σε καλλιεργημένα κύτταρα, κύτταρα (10.000 κύτταρα /φρεάτιο) υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LC ή θετικός έλεγχος παράγοντες για 6 ώρες ή 12 ώρες, στη συνέχεια τα κινητά μέσο αλλάχθηκε σε μέσο ελεύθερο ορού συν ρυθμιστικό HDAC (50 μl + 50 μΙ). Μετά από 15 λεπτά επώαση, HDAC

TM Ι /ΙΙ αντιδραστήρια (100 μΙ) προστέθηκαν στα κύτταρα, φωταύγεια μετρήθηκε μετά από 30 λεπτά.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου

Ολικά RNAs εκχυλίστηκαν από κύτταρα HepG2 με το αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ. Η αντίστροφη μεταγραφή του RNA καθαρίστηκε διεξήχθη χρησιμοποιώντας εκθέτη III αντίστροφη μεταγραφή, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή (Invitrogen). Ποσοτικοποίηση της όλα τα αντίγραφα του γονιδίου έγινε με ποσοτικά χρησιμοποιώντας το κιτ TaKaRa SYBR Προμίγματα Ex Taq με Applied Biosystems 7500 Fast σύστημα Real-Time PCR. Οι τιμές των Ρ21 και Ρ27 φάνηκαν κατά την αξία του GAPDH το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος. Τα σετ εκκινητών για ενίσχυση που αναφέρονται παρακάτω: p21-F: 5’GTC CAG CGA ΚΔ TCC TCA TCCA3 »? p21-R: 5’CCA TAG ΚΔ CTA CTG CCA CCA TC3 »? p27-F: 5’ACT GAG GCG GAG ACG Α.Ε.Ε. GT3 »? p27-R: 5’CCT GAC AAG CCA CGC AGT AGAT3 »? GAPDH-F: 5’CCA GCA AGA GCA CAA GAG GAA3 »? GAPDH-R:. 5’GGT CTA CAT GGC AAC TGT GAGG3 »

δοκιμασίες ChIP

1 × 10

7 κύτταρα HepG2 ετοιμάστηκαν για τη δοκιμασία ChIP, εκτελούνται όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],13] από KangChen εταιρεία βιοτεχνολογίας (Σαγκάη). Για κάθε δοκιμασία ChIP, το δείγμα ήταν ένα μίγμα από 3 ανεξάρτητα δείγματα κυττάρων. Αντι-H3K9 αντίσωμα που χρησιμοποιήθηκε για την ανοσοκαταβύθιση ιστόνες. Όλα τα δείγματα ChIP έγιναν με πραγματικού χρόνου PCR, χρησιμοποιώντας θερμικό ανακυκλωτή TaKaRa PCR και Rotor-Gene 3000 Realtime PCR. P21 και p27 εκκινητών ήταν ως εξής: p21-F: 5’GCC GAA GTC AGT TCC TTG TG3 »? p21-R: 5’CGG GGT CCC CTG TTG TCT3 »? p27-F: 5’CTC TGA GGA CAC GCA ΤΤΤ GGT3 »? p27-R: 5’TGC ΑΓΓ ΤΕΕ CTT ΚΔ ΤΑΤ TC3 ». Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως φορές εμπλουτισμός υπολογίζεται από κάθε αξία της μάρκας αντίσωμα (IP /εισόδου, το ποσοστό των εισροών) σε σχέση με την αξία της μάρκας έλεγχο IgG.

δοκιμασία μικροσυστοιχιών DNA και ανάλυση

HepG2 κύτταρα υποβλήθηκαν σε θεραπεία διαφορετικές δόσεις του LC επί 24 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν και εκχυλίστηκαν με παράγοντες ΤΚΙζοΙ. ποσότητας και της ποιότητας του RNA μετρήθηκαν με NanoDrop ND-1000. ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε με πρότυπες ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα μετουσίωσης αγαρόζης. Μικροσυστοιχίες DNA έγινε από KangChen εταιρεία βιοτεχνολογίας (Σαγκάη) σε συμμόρφωση με τις οδηγίες MIAME. Η Ανθρώπινη 12 × 135Κ Gene Expression Array κατασκευάστηκε από τη Roche NimbleGen. Εν συντομία, Περίπου 5 μg ολικού RNA από κάθε δείγμα χρησιμοποιήθηκε για την επισήμανση και υβριδισμό συστοιχίας ως τα ακόλουθα βήματα: (1) Η αντίστροφη μεταγραφή με από την Invitrogen Superscript κιτ σύνθεσης ds-cDNA? (2) την επισήμανση ds-cDNA με NimbleGen ένα έγχρωμο κιτ επισήμανσης DNA? (3) υβριδισμό Array χρησιμοποιώντας την υβριδοποίηση System NimbleGen και ακολούθησε πλύση με το NimbleGen πλύνετε κιτ ρυθμιστικό? (4) σάρωση Array χρησιμοποιώντας την Axon GenePix 4000B μικροσυστοιχιών σαρωτή (Molecular Devices Corporation). Σαρωμένες εικόνες (σε μορφή TIFF) στη συνέχεια εισάγονται στην NimbleScan λογισμικού (έκδοση 2.5) για την ευθυγράμμιση του δικτύου και την ανάλυση των δεδομένων της έκφρασης. Διπλώστε αυξήσεις της γονιδιακής έκφρασης υπολογίστηκαν σε σχέση με τον έλεγχο του οχήματος.

Στατιστικές μέθοδοι

Εκτός αν ορίζεται διαφορετικά, Μέση + SD παρουσιάζονται ενδεχομένως

. Αταίριαστα Φοιτητών

t-test

ή ένας τρόπος ANOVA χρησιμοποιείται ενδεχομένως για τον προσδιορισμό των πιθανοτήτων στατιστική.

P

αξία μικρότερη από 0,05 θεωρείται σημαντική.

Αποτελέσματα

θεραπεία LC αναστέλλει επιλεκτικά την ανάπτυξη καρκινικών κυττάρων

in vivo

και

in vitro

Είναι καλά γνωστό ότι τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα εξαρτώνται από την γλυκόλυση για την παραγωγή ΑΤΡ. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω ότι σε συστήματα κυττάρων μας, πολλαπλές καρκινικές κυτταρικές γραμμές χρησιμοποιήθηκαν για να ελεγχθεί εάν ολιγομυκίνη θα μπορούσε να αναστείλει την παραγωγή ΑΤΡ. Το αποτέλεσμα σε αντιπροσωπευτικές καρκινικά κύτταρα δείχθηκε. Διαπιστώθηκε ότι με την παρουσία της L-γλυκόζης στο μέσο καλλιέργειας, ολιγομυκίνης εξαντληθεί γρήγορα την παραγωγή ΑΤΡ, ενώ με την παρουσία του D-γλυκόζης στο ολιγομυκίνη μέσο καλλιέργειας δεν επηρέασε ΑΤΡ γενεά (σχ. 1

α

). Εφόσον L-γλυκόζη δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παραγωγή ΑΤΡ παραγωγή [10], το αποτέλεσμα αυτό υποδηλώνει ότι τα καρκινικά κύτταρα βασίζονται κυρίως σε D-γλυκόζη γλυκόλυση για την παραγωγή ΑΤΡ, συνεπή με προηγούμενες αναφορές [4], [5]. Στην συνέχεια διερευνήσαμε εάν η θεραπεία θα μπορούσε να αυξήσει LC ενδοκυτταρική παραγωγή ΑΤΡ σε καρκινικά κύτταρα. Συνεπής με την πρόβλεψη μας, η θεραπεία LC δεν θα μπορούσε να αυξήσει περαιτέρω την παραγωγή ATP τόσο ηπατική HepG2 και SMMC-7721 καρκινικά κύτταρα (Εικ. 1

β

). Ωστόσο, σε αντίθεση με την επίδραση σε καρκινικά κύτταρα, ολιγομυκίνης, όταν προστίθενται σε θυμοκύτταρα ποντικού καλλιεργήθηκαν με D-γλυκόζη, χρονικά εξαρτώμενο ανέστειλαν παραγωγή ΑΤΡ (Σχ. 1

γ

) ενώ LC αύξησε αποτελεσματικά ενδοκυτταρικό περιεχόμενο ΑΤΡ στο διαφορετικά χρονικά σημεία βάσει της παρούσας κατάστασης (Εικ. 1

δ

). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι το LC είναι σε θέση να παράγουν ΑΤΡ σε κανονική θυμοκύτταρα ποντικού, αλλά όχι στην ηπατική HepG2 και SMMC-7721 καρκινικά κύτταρα.

(α) Τα καρκινικά κύτταρα είναι ανθεκτικά σε ολιγομυκίνη παρουσία D-γλυκόζης ( 2 g /L), αλλά όχι L-γλυκόζη (2 g /L). Ανθρώπινα HepG2 καρκινικά κύτταρα καλλιεργήθηκαν παρουσία ή απουσία είτε D-γλυκόζη ή L-γλυκόζη στο μέσο καλλιέργειας και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διάφορες δόσεις ολιγομυκίνη (0,1, 0,25, 0,5. 1,0 μg /ml) επί 6 ώρες και το περιεχόμενο ΑΤΡ ήταν αξιολογηθεί. Η μέση + SD (η = 3). *

P

& lt? 0,01,

έναντι

ελέγχου. DM: DMSO. (Β) LC δεν αυξάνει ενδοκυτταρική περιεκτικότητα ΑΤΡ σε καρκινικά κύτταρα. Ανθρώπινη ηπατική HepG2 και SMMC-7721 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε κανονικό μέσο καλλιέργειας, αντίστοιχα, και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με διαφορετικές δόσεις του LC επί 6 ώρες, το περιεχόμενο ΑΤΡ ανιχνεύθηκε. LC: L-καρνιτίνη. (Γ) Thymotytes είναι ευαίσθητοι σε ολιγομυκίνη παρουσία D-γλυκόζη (2 g /L). θυμοκύτταρα ποντικού σε επεξεργασία με ολιγομυκίνη (1 mg /ml) για διάφορα χρονικά σημεία (1, 3, 6, 9 ώρες), το συνολικό περιεχόμενο ΑΤΡ ανιχνεύθηκε. (Δ) LC αυξάνει αποτελεσματικά το κυτταρικό περιεχόμενο ΑΤΡ. θυμοκύτταρα ποντικιού έλαβαν θεραπεία με LC (1 mM) για διάφορους χρόνους, κυτταρικό περιεχόμενο ΑΤΡ assassed. Veh:. Οχήματος

Η

Στη συνέχεια συνέκριναν τα αποτελέσματα της LC σε φυσιολογικό ιστό και την ανάπτυξη του καρκίνου του

in vivo

. Φυσιολογικά ποντίκια Balb /c ή Balb /c άτριχα ποντίκια που εμβολιάστηκαν με καρκινικά κύτταρα HepG2 ήταν

ί.ρ

. ένεση με LC (400 mg /kg) για 15 ημέρες εκτός ημέρα 8, που ακολουθείται από τερματισμό του πειράματος. Αυτό το δοσολογικό σχήμα είναι μια ανεκτή δόση για Balb /c γυμνών ποντικών. βάρος οργάνου και το βάρος του όγκου του κάθε ποντικό που νοσηλεύθηκε με LC ή ελέγχου συγκρίθηκαν. Διαπιστώθηκε ότι η θεραπεία LC ανέστειλε περισσότερο από το 70% της αύξησης του καρκίνου, ενώ η ίδια θεραπεία μειώθηκε λιγότερο από το 20% της κανονικής εξέλιξης οργάνων και το σωματικό βάρος (Εικ. 2

α

).

(α) LC αναστέλλει εκλεκτικά την ανάπτυξη του όγκου HepG2 σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς. BALB /c γυμνά ποντίκια ήταν

υποδορίως

. εμβολιάστηκαν στο αριστερό μασχάλη κάθε ποντικού με κύτταρα HepG2 (1 × 10

6 κύτταρα /ποντίκι). Όταν το μέγεθος του όγκου φτάνει 50-75 mm

3, άτριχων ποντικών ήταν

ε.π.

. ένεση με 400 mg /kg για διαδοχικές 15 ημέρες. Φυσιολογικά ποντίκια Balb /c υποβλήθηκαν σε επεξεργασία όπως τα γυμνά ποντίκια. Σώματος και το βάρος του οργάνου εντοπίστηκαν. Β W: βάρος σώματος. Η μέση + SD (η = 8). *

P

& lt? 0,01, **

P

& lt? 0,05,

έναντι

κάθε έλεγχο, αντίστοιχα. % Αναστολή = βάρος σώματος ή βάρος οργάνου στην ομάδα LC-αγωγή /μέσο σωματικό βάρος ή όργανο βάρος στην ομάδα ελέγχου × 100. (Β) LC αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων HepG2 με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόσεις LC (1,25, 2,5, 5, 10 mM) για 24 ώρες ή 48 ώρες, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανιχνεύθηκε με δοκιμασία MTS. Η μέση + SD (η = 3). *

P

& lt? 0,01, **

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Γ) LC προκαλεί διακοπή του κυτταρικού κύκλου στο Go /G1 φάση. Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με διαφορετικές δόσεις του LC επί 24 ώρες, κυτταρικού κύκλου ανιχνεύθηκαν με κυτταρομετρία ροής. Εκπρόσωπος αποτελέσματα φαίνονται. (D, e) LC επάγει ελαφρώς κυτταρικό θάνατο. κύτταρα HepG2 εκτέθηκαν σε διάφορες δόσεις LC για 24 ώρες και κυτταρική απόπτωση ανιχνεύθηκε με κυτταρομετρία ροής. Περίληψη των στοιχείων έγιναν φαίνεται στο (δ) και οι εικόνες αντπροσωπευτικές ροής φαίνονται στον (ε). ** P & lt? 0,05, έναντι του ελέγχου. (Στ) LC δεν επηρεάζει δραματικά θυμοκυττάρων κυτταρική βιωσιμότητα. θυμοκύτταρα ποντικιού υπέστησαν αγωγή με διάφορες δόσεις LC (2,5, 5, 10 mM) για 24 ώρες, η βιωσιμότητα των κυττάρων ανιχνεύθηκε με αριθμό προσδιορισμού και των κυττάρων MTS ήταν καταμέτρηση.

Η

Στη συνέχεια διερευνήθηκαν οι επιδράσεις της LC στον πολλαπλασιασμό των κυττάρων με τη δοκιμασία MTS. Διαπιστώθηκε ότι δοσοεξαρτώμενο LC μειωμένη βιωσιμότητα των κυττάρων HepG2 (εικ. 2

b

), που σχετίζεται με την διακοπή του κυτταρικού κύκλου στην φάση G0 /G1 (Εικ. 2

γ

) και χαμηλά επίπεδα κυτταρικού θανάτου (Εικ. 2,

δ

και

e

). Αυτά τα αποτελέσματα να εννοηθεί ότι κατά κύριο λόγο επάγεται LC αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων αλλά ελαφρώς επάγεται κυτταρικό θάνατο σε καρκινικά κύτταρα. Τέλος, σε κανονική θυμοκύτταρα ποντικού, LC είχε μικρή επίδραση στη βιωσιμότητα των θυμοκυττάρων και μέτρηση των κυττάρων εντός 24 θεραπεία h (Σχ. 2

f

). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώνουν ότι το LC επιλεκτικά προκαλείται από καρκινικό κύτταρο κυτταροτοξικότητα στο

vitro

και

in vivo

.

θεραπεία LC επάγει την έκφραση της p21

Cip1 γονιδίων, mRNA και της πρωτεΐνης στα καρκινικά κύτταρα

Είμαστε δίπλα προσδιορίζεται το μοριακό μηχανισμό για το πώς θα μπορούσε LC επιλεκτικά αναστέλλουν την ανάπτυξη του όγκου. Για να γίνει αυτό, το προφίλ γονιδιακής έκφρασης διερευνήθηκε σε κύτταρα HepG2 μετά από τρεις δόσεις θεραπείας LC (2,5, 5, και 10 mM) για 24 ώρες. Όλα τα up-ρυθμιζόμενη και ρυθμισμένα προς τα κάτω γονίδια (τουλάχιστον 2 φορές αύξηση ή μείωση σε όλα τα τρία δόσεις) μετά από θεραπεία LC συνοψίστηκαν (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Μεταξύ των up-ρυθμιζόμενα γονίδια, ρ21

Cip1 γονίδιο αλλά όχι ρ27

γονίδιο kip1, δύο σημαντικά γονίδια που συνδέονται με την ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, βρέθηκε να είναι εξαιρετικά και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο που εκφράζεται (Σχ. 3

a

). Τα αποτελέσματα της θεραπείας LC σε p21

Cip1 και p27

kip1 επίπεδα mRNA ήταν επόμενο καθορίζεται από PCR πραγματικού χρόνου. Κύτταρα HepG2 καλλιεργήθηκαν με ή χωρίς LC (2,5, 5, 10 mM) είτε για 12 ώρες ή 24 ώρες, RNA παρασκευάστηκαν από τα κύτταρα. Μετά τη θεραπεία με LC, το p21

Cip1 επίπεδο mRNA με δοσοεξαρτώμενο τρόπο αυξάνεται τόσο σε 12 ώρες και 24 ώρες Χρόνος σημεία, και p21

Cip1 επίπεδο mRNA είναι σχετικά υψηλότερη μετά τη θεραπεία 12 ώρες από τη θεραπεία 24 ώρες, ενώ η p27

mRNA kip1 δεν δείχνουν σημαντικές αλλαγές σε αυτά τα δύο χρονικά σημεία (Εικ. 3

β

). Για τον προσδιορισμό των επιπέδων της πρωτεΐνης του p21

Cip1 και p27

kip1, δοκιμασία κηλίδος Western έγινε στα επεξεργασμένα HepG2 κύτταρα. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μετά από θεραπεία με διάφορες δόσεις LC για 48 ώρες, ρ21

kip1 επίπεδα πρωτεΐνης αυξήθηκαν με έναν δοσο-εξαρτώμενο τρόπο σε καρκινικές κυτταρικές σειρές HepG2 (εικ. 3

γ

,

αριστερά

). Περαιτέρω δυναμική μελέτη σε κύτταρα HepG2 έδειξαν ότι μετά από θεραπεία με LC (5mM) για 12, 24, 36, και 48 ώρες, ρ21

Cip1 χρονικά εξαρτώμενο αυξημένη (Σχ. 3

γ

, em

μεσαία

). Σε SMMC7721 κύτταρα θεραπεία LC αύξησε επίσης την έκφραση της πρωτεΐνης ρ21 σε ένα δοσο-εξαρτώμενο τρόπο παρόμοιο με στα κύτταρα HepG2 (εικ. 3

γ

,

δεξιά

). Απροσδόκητα, πρωτεΐνη ρ27 αυξήθηκε τόσο δόση και το χρόνο-εξαρτώμενη ήθη μετά τη θεραπεία LC (Σχ. 3

γ

) παρόλο ρ27

kip1 επίπεδο mRNA είναι σταθερό, γεγονός που υποδηλώνει ότι το LC μπορεί να αναστείλουν την αποικοδόμηση της ρ27 πρωτεΐνη. Να διερευνήσει περαιτέρω την επίδραση της LC στα κατάντη αποτελέσματα της p21

Cip1 και p27

kip1, ανιχνεύθηκαν επίπεδα των μη φωσφορυλιωμένη Rb και φωσφορυλιωμένη Rb (Phos-Rb). Διαπιστώθηκε ότι η θεραπεία με LC μειώθηκε ελαφρώς Rb πρωτεΐνη, αλλά μειώθηκε δραματικά πρωτεΐνη Phos-Rb (Εικ. 3

δ

). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το LC επιλεκτικά προκαλείται από ρ21

Cip1 έκφρασης.

(α) LC προκαλεί ρ21

Cip1 γονιδιακή έκφραση, αλλά όχι p27 και GAPDH. Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με LC (2.5, 5.0, 10 mM) για 24 ώρες? κύτταρα συλλέχθηκαν για ανάλυση γονιδιακής προφίλ έκφρασης. Στο γονιδιακό τσιπ, υπάρχουν 2 ανιχνευτές για p21

Cip1 και 1 ανιχνευτή για p27

kip1. Όλες οι φορές αυξήσεις της p21

Cip1 και p27

kip1 γονιδιακής έκφρασης

σε σχέση με τον έλεγχο

έδειξαν. (Β) με δοσοεξαρτώμενο τρόπο LC επάγει p21

Cip1 έκφραση του mRNA, αλλά όχι p27

kip1 στα κύτταρα HepG2. Κύτταρα HepG2 επωάστηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις LC (2,5, 5, 10 mM) είτε για 12 ώρες ή 24 ώρες? τα κύτταρα συλλέχθηκαν για προσδιορισμό mRNA της p21

Cip1 και p27

kip1 με πραγματικού χρόνου PCR. Πλάσια αύξηση της LC-επεξεργασία

έναντι

ελέγχου εμφανίζεται. Η μέση + SD (η = 3). *

P

& lt? 0,01, **

P

& lt? 0,05, σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Γ) LC δοσοεξαρτώμενο και χρονικά εξαρτώμενο επάγει p21

Cip1 συσσώρευση πρωτεΐνης στα καρκινικά κύτταρα HepG2. HepG2 και SMMC7721 κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με διάφορες δόσεις LC για 48 ώρες ή HepG2 κύτταρα εκτέθηκαν σε 5 mM του LC επί 12, 24, 36, 48 ώρες? πρωτεΐνες ρ21 και ρ27 ανιχνεύθηκαν με στύπωση Western. δοσοεξαρτώμενο (δ) LC μειώνεται φωσφορυλίωσης Rb. Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με LC για 48 ώρες? Rb και Rb φωσφορυλιωμένη είχαν dectected με στύπωση Western. Τυπικά Δυτική εικόνες εμφανίζονται (αριστερά) και η ένταση μπάντα ποσοτικά (δεξιά).

Η

θεραπεία LC αυξημένη ακετυλίωση των ιστονών σε καλλιεργημένα κύτταρα

Με βάση την θεωρία Warburg, υποθέσαμε ότι το συμπλήρωμα του LC σε καρκινικά κύτταρα θα διαταράξει ακετυλίωση πρωτεΐνης. Παλαιότερες μελέτες είχαν δείξει ότι η ακετυλίωση των ιστονών από τους αναστολείς HDAC επιλεκτικά προκαλείται από ρ21

Cip1 έκφραση, αλλά όχι p27

kip1 [14], [15]. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι το LC επιλεκτικά προκαλείται από ρ21

Cip1 έκφραση, αλλά όχι p27

kip1 (Εικ. 2). Ως εκ τούτου, ερευνήσαμε την επίδραση του LC επί ακετυλίωσης ιστόνης και τη συσσώρευση της λυσίνης-ακετυλιωμένης πρωτεϊνών σε καλλιεργημένα κύτταρα. HepG2, SMMC-7721 καρκινικά κύτταρα και θυμοκύτταρα ποντικού υποβλήθηκαν σε θεραπεία με LC. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4,

ένα

και

b

, LC αυξημένη ακετυλίωση της ιστόνης Η3 και Η4 σε μία δόση και το χρόνο εξαρτώμενο τρόπο στα καρκινικά κύτταρα HepG2. LC μπορούσε επίσης να επάγει συσσώρευση της λυσίνης-ακετυλιωμένης πρωτεϊνών σε αμφότερα HepG2 και SMMC-7721 καρκινικά κύτταρα (Σχ. 4

γ

). Σε πρωτογενή καλλιέργεια θυμοκυττάρων, LC δοσοεξαρτώμενο αυξημένη ακετυλίωση ιστονών που είναι παρόμοια με σε καρκινικά κύτταρα (Σχ. 4

δ

). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η θεραπεία με LC αυξημένη πρωτεΐνη (ιστόνης) ακετυλίωση σε καλλιεργημένα κύτταρα.

(α) LC επάγει δοσο-εξαρτώμενο συσσώρευση ακετυλιωμένων ιστονών. κύτταρα HepG2 εκτέθηκαν σε LC (1,25, 2,5, 5,0 mM) για 48 ώρες, ακετυλιωμένων ιστονών Η3 και Η4 ανιχνεύθηκαν με στύπωση Western. GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. (Β) LC επάγει χρονικά εξαρτώμενο συσσώρευση ακετυλιωμένων ιστονών. Κύτταρα HepG2 υποβλήθηκαν σε αγωγή με LC (5mM) για διάφορα χρονικά σημεία (12 ώρες, 24 ώρες, 36 ώρες, 48 ώρες) και ανιχνεύθηκαν ακετυλιωμένων ιστονών. (Γ) κατεργασία LC αυξάνει συσσώρευση πρωτεΐνης λυσίνη ακετυλιωμένη σε ανθρώπινα HepG2 και SMMC-7721 καρκινικά κύτταρα. Ανθρώπινα HepG2 και SMMC-7721 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με LC (10 mM) για 12 ώρες, και στη συνέχεια τα κύτταρα συλλέχθηκαν για στύπωμα Western για την ανίχνευση ακετυλιωμένων πρωτεϊνών με λυσίνη ακετυλιωμένο αντίσωμα. (Δ) LC αυξάνει τη δόση depentently συσσώρευση ακετυλιωμένων ιστονών σε θυμοκύτταρα ποντικού. θυμοκύτταρα ποντικιού έλαβαν θεραπεία με LC για 24 ώρες, ακετυλίωση ιστονών ανιχνεύθηκε με Western Blot. Βουτυλο (1 mM) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας.

Η

LC αναστέλλει άμεσα τις δραστηριότητες HDAC

in vitro

και σε καλλιεργημένα κύτταρα

Από LC προκαλεί ακετυλίωση των ιστονών, Στη συνέχεια διερευνήθηκε κατά πόσον LC θα μπορούσαν να επηρεάσουν άμεσα HDAC δραστηριότητες. Ένα υπολογιστικό μοντέλο σύνδεσης καθιερώθηκε για πρώτη φορά. Η κρυσταλλική δομή ενός HDAC-όπως πρωτεΐνη από το βακτήριο υπερθερμοφιλικά

Aquifex aeolicus

με τον αναστολέα HDAC TSA έχει αναφερθεί [16]. Η δομή δείχνει τη θέση του αιθέριου άτομο ψευδαργύρου που εμπλέκεται στην κατάλυση της κατηγορίας Ι /ΙΙ HDAC. Η χημική δομή του LC και το μοντέλο σύνδεσης του συμπλόκου (L-καρνιτίνη και HDAC) έχουν φαίνεται στο Σχ. 5,

μια

και

β

και CDOCKER Αλληλεπίδραση της Ενέργειας και Βιβλιοδεσία ήταν -29.01 και -85.79 kcal /mol, αντίστοιχα. Σύκο. 5

b

δείχνει ότι ένα άτομο οξυγόνου του καρβοξυλίου ανιόντος και άτομο οξυγόνου των αλληλεπιδράσεων συντονισμού υδροξυλίου μορφή με ιόν ψευδαργύρου, με αποστάσεις 2.696 Å και 2.640 Α, αντίστοιχα. Αυτό το μοντέλο αλληλεπίδρασης είναι διαφορετικό σε σύγκριση με το αρχικό ACT συνδέτη με δύο άτομα οξυγόνου της καρβοξυλικό ανιόν συντονίζονται με Ψευδάργυρο ιόντων. Το καρβοξυλικό ανιόν που σχηματίζεται ένα ασθενές δεσμό υδρογόνου με Gly310, με απόσταση από 2.966 Α, και το υδροξύλιο που σχηματίζεται ένα δεσμό υδρογόνου με Tyr312, με απόσταση από 1.839 Α. Επιπλέον, η (CH

3)

3Ν

+ ομάδα που βρίσκεται σε ένα υδρόφοβο πύλην και αλληλεπιδρά με την υδρόφοβη επιφάνεια που αποτελείται από τις πλευρικές αλυσίδες των Leu21, Ile100, Phe152, Phe208 και Leu275. Επιπλέον, η ομάδα που σχηματίζεται κατιόν-π αλληλεπιδράσεις με τις δακτυλίους βενζολίου της Phe152 και Phe208. Αυτό το μοντέλο προέβλεψε ότι LC έχει τη δυνατότητα να αλληλεπιδρούν με ενεργές θέσεις HDAC.

(α) Η χημική δομή του LC δείχθηκε. Όπως φαίνεται στο Σχ. Όπως φαίνεται στο Σχ.