Αφηρημένο

πλακοσφαιρίνη (PG) είναι μια πρωτεΐνη Armadillo που συνδέεται με τόσο κλασική και δεσμοσωματικής καντερίνες, αλλά επικεντρώνεται κυρίως στις ώριμες δεσμοσώματα σε επιθήλια. Ενώ έχουν μειώσει τα επίπεδα της PG έχουν αναφερθεί σε εντοπισμένη και ορμονοάντοχο όγκους του προστάτη, η λειτουργική σημασία αυτών των αλλαγών είναι άγνωστη. Εδώ αναφέρουμε ότι η έκφραση PG είναι μειωμένη σε δείγματα μιας συστοιχίας ιστού του όγκου του προστάτη και αντιστρόφως ανάλογη με την προχωρημένη δυναμικό του όγκου σε κυτταρικές σειρές 7 PCa. Εκτοπικά εκφραζόμενη PG ενισχυμένη μεσοκυττάρια πρόσφυση, και εξασθένησε την κινητικότητα και την εισβολή των επιθετικών κυτταρικών γραμμών, ενώ φίμωση PG σε λιγότερο ογκογονικά κύτταρα είχε το αντίθετο αποτέλεσμα. PG ρυθμίζεται επίσης κυττάρου-υποστρώματος πρόσφυση και κινητικότητα μέσω εξωκυτταρικής μήτρας (ECM) -εξαρτώμενη αναστολή της Src κινάσης, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι επιδράσεις PG δεν οφείλονταν μόνο σε αυξημένη διακυτταρική προσκόλληση. PG σίγηση οδήγησε σε αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης ECM vitronectin (VN), και εκθέτοντας PG-κύτταρα που εκφράζουν για VN επαγόμενη δραστικότητα Src. Επιπλέον, τα αυξημένα επίπεδα VN και ενεργοποίηση Src συσχετίζεται με μειωμένη έκφραση του PG στους ιστούς των ασθενών. Έτσι, PG μπορεί να αναστείλει την Src κρατώντας VN χαμηλή. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η απώλεια της διακυτταρικής προσφύσεως λόγω της μειωμένης έκφρασης PG μπορεί να επιδεινωθεί από την ενεργοποίηση του Src μέσω μιας PG-εξαρτώμενο μηχανισμό. Περαιτέρω, PG ρύθμιση προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του προστάτη θα μπορούσε να συμβάλει με την γνωστή VN-εξαρτώμενη προώθηση προστάτη εισβολή και μετάσταση, επιδεικνύοντας μια νέα λειτουργική αλληλεπίδραση μεταξύ των δεσμοσωμάτων προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου και προσκόλληση κυττάρου-υποστρώματος άξονες σηματοδότησης στον καρκίνο του προστάτη.

Παράθεση: Franzen CA, Τοντόροβιτς V, Desai BV, Mirzoeva S, Yang XJ, Πράσινη KJ, et al. (2012) Η πρωτεΐνη δεσμοσωματικής Armadillo πλακοσφαιρίνη Ρυθμίζει τον καρκίνο του προστάτη κυτταρικής προσκόλλησης και την κινητικότητα μέσω βιτρονεκτίνη Εξαρτημένων Src σηματοδότησης. PLoS ONE 7 (7): e42132. doi: 10.1371 /journal.pone.0042132

Επιμέλεια: Νατάσα Κυπριανού, Πανεπιστήμιο του Κεντάκι College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 21 Γενάρη του 2012? Αποδεκτές: 3 Ιουλ, 2012? Δημοσιεύθηκε: 30 του Ιούλη του 2012

Copyright: © Franzen et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από το Εθνικό Ίδρυμα Καρκίνου (NCI) SPORE προστάτη Ρ50 επιχορήγηση CA90386, Zell Ιδρύματος, η στήριξη από Rosenberg Seed Grant (σε JCP), R01s CA122151, AR041836 και το κληροδότημα JL Mayberry (σε KJG), Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας (NIH) εκπαίδευση επιχορηγήσεις T32 CA070085 (σε CAF και VT) και F32 AR055444 (για VT) και μια αμερικανική Εταιρεία Καρκίνου (ACS) μεταδιδακτορικός επιχορήγησης PF-10-235-01-CSM (CAF). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

ο καρκίνος του προστάτη (PCA) είναι η δεύτερη κύρια αιτία θνησιμότητας από καρκίνο στις ΗΠΑ [1], οφείλεται κυρίως στη μεταστατική μορφή της νόσου [2]. Τα αρχικά στάδια της μετάστασης των καρκινικών κυττάρων περιλαμβάνουν διαμόρφωση του κυττάρου-κυττάρου και κυττάρου-υποστρώματος συγκολλητικές ιδιότητες για τη διευκόλυνση της κυτταρικής απόσπαση από τον ιστό προέλευσης και εισβολή των τοπικών και άπω ιστούς [3]. Η προς τα κάτω ρύθμιση μορίων προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου είναι ένα από τα σημαντικότερα βήματα στη διαδικασία της τοπικής και άπω εισβολή όγκου προστάτη. Ειδικότερα, οι αλλαγές στην έκφραση και τη λειτουργία των καντερινών και συνδέονται πρωτεΐνες τους έχουν κερδίσει την προσοχή ως κρίσιμη ρυθμιστές της προόδου των όγκων [4], [5]. Απώλεια του μορίου προσφύσεως διασταύρωση, Ρ-cadherin, είναι ένα πρώιμο γεγονός στην περισσότεροι καρκίνοι του προστάτη [6], [7], ενώ μειωμένη έκφραση της Ε-καδερίνης είναι συνδεδεμένη με μια πιο προηγμένη και επιθετική μορφή της νόσου [8]. Ωστόσο, παρά την έκφραση τους σε ιστούς προστάτη [9] – [11], λίγα είναι γνωστά για τον ρόλο των καντερινών δεσμοσωμάτων στην έναρξη και την εξέλιξη του προστάτη

Μεταβολές στην έκφραση της καντερίνης-σχετίζονται πρωτεΐνες in. η Armadillo οικογένεια έχουν επίσης συνδεθεί με την εξέλιξη του όγκου ή /και η καταστολή [12] – [14]. Μία τέτοια πρωτεΐνη είναι στενός συγγενής του β-κατενίνης που ονομάζεται πλακοσφαιρίνης (PG, επίσης γνωστή ως γ-κατενίνη), η οποία μπορεί να συνδέεται προς αμφότερα τα κλασικά και δεσμοσωμάτων καντερίνες, αλλά βρίσκεται κυρίως σε δεσμοσωμάτων και είναι εξαιρετικά σημαντική στην μορφογένεση του δέρματος και η καρδιά [10]. PG έχει αναφερθεί ως καταστολέας της ογκογένεσης σε τραχήλου της μήτρας [15], της ουροδόχου κύστης [16] και του καρκίνου του μαστού [17], και κλινικά δεδομένα υποδεικνύουν ότι το PG ρυθμίζεται προς τα κάτω σε εντοπισμένη και πιο ορμονοάντοχο όγκους σε ασθενείς με καρκίνο του προστάτη [18] . Είναι ενδιαφέρον ότι, σε ορισμένες ορμονοάντοχο όγκων, μια μεταλλαγμένη εκδοχή του PG έχει παρατηρηθεί σε πυρήνες συσχετίζεται με αυξημένη έκφραση Bcl2 και αυξημένη επιβίωση των κυττάρων [18]. Αν αυτές οι αλλαγές που παρατηρήθηκαν στην PG διαδραματίζει αιτιολογικό ρόλο στην εξέλιξη του προστάτη δεν έχει προσδιοριστεί.

Σε προηγούμενη εργασία, δείξαμε ότι η PG αναστέλλει κερατινοκυττάρων κινητικότητα, εν μέρει μέσω της ρύθμισης του κυττάρου-κυττάρου και συστατικό προσκόλλησης κυττάρου-υποστρώματος έκφραση [19], [20]. Μέσω της ανάλυσης των δειγμάτων ιστού ασθενούς ΠΑΠ και μια σειρά in vitro κέρδους και ζημιών των μελετών λειτουργίας, τα δεδομένα μας προτείνουν ένα μοντέλο με το οποίο το PG ρυθμίζει και τις αλληλεπιδράσεις κυττάρου-υποστρώματος και προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου με εξασθένηση της υαλονηκτίνης (Vn) -εξαρτώμενη ενεργοποίηση της Src. Αυτή είναι η πρώτη έκθεση που δεσμοσωμάτων μόρια μπορεί να ρυθμίσει τον καρκίνο του προστάτη αλληλεπιδράσεις με το εξωκυτταρικό μικροπεριβάλλον. Επιπλέον, τα δεδομένα μας εγείρουν την πιθανότητα ότι η PG ρύθμιση προς τα κάτω κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του προστάτη θα μπορούσε να συμβάλει στην γνωστή VN-εξαρτώμενη προώθηση του προστάτη εισβολή και τη μετάσταση στα οστά [21].

Υλικά και Μέθοδοι

Κυτταρικές σειρές και Culture

LNCaP κύτταρα είναι λειτουργικά διαφοροποιημένα, ανδρογόνο-ευαίσθητα κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου προστάτη που προέρχεται από ένα μετάσταση λεμφαδένα [22]. C4-2B κύτταρα είναι ένας ανεξάρτητος από ανδρογόνο, μεταστατική οστική παράγωγο των κυττάρων LNCaP [23]. Τα κύτταρα DU145 μετρίως διαφοροποιημένα, κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου προστάτη ανδρογόνου inedpendent που προέρχεται από ένα μετάσταση εγκεφάλου [24]. PC-3 κύτταρα είναι ελάχιστα διαφοροποιημένα, κύτταρα αδενοκαρκινώματος ανθρώπινου προστάτη ανεξάρτητο από ανδρογόνο που προέρχεται από ένα σπονδυλικό μετάσταση [25]. PC3-M είναι μια ιδιαίτερα μεταστατική παραλλαγή της κυτταρικής γραμμής PC-3 [26]. κύτταρα ARCaP είναι ανδρογόνο καταστέλλεται κύτταρα τα οποία εκφράζουν λειτουργικό υποδοχέα ανδρογόνων [27]. ARCaP

E κύτταρα είναι ένα επιθηλιακό παραλλαγή των γονικών κυττάρων ARCaP με χαμηλή ογκογονικότητα και ARCaP

Μ κυττάρων είναι μια ιδιαίτερα μεταστατική παραλλαγή μεσεγχυματικά των γονικών κυττάρων ARCaP [28]. κύτταρα PC3-Μ, τα κύτταρα LNCaP, PC-3 κύτταρα (όλα τα δώρα από τον Δρ Raymond C. Bergan, το Πανεπιστήμιο Northwestern, Chicago, IL), κύτταρα DU145 (δώρο από τον Δρ Λέστερ F. Lau, University of Illinois, Chicago, IL) και C4-2B κύτταρα (ένα δώρο από τον Dr. RS Taichman, Πανεπιστήμιο του Μίσιγκαν, Ann Arbor, ΜΙ) καλλιεργήθηκαν σε μέσο RPMI 1640 (Mediatech) που περιέχει 10% ορό εμβρύου θερμο-απενεργοποιημένο βοοειδών (FBS) (Invitrogen, Carlsbad , CA), 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Mediatech). ARCaP

Ε και ARCaP

Μ κυττάρων (Novicure) καλλιεργήθηκαν σε ΜΟΑΡ μέσο (Novicure) που περιέχει 5% θερμο-απενεργοποιημένο FBS, 100 μονάδες /ml πενικιλίνη, και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (Mediatech).

Αντιδραστήρια και αντισώματα

pSrc (Y416) πολυκλωνικά αντισώματα και μονοκλωνικά αντισώματα Src (για δυτικές μελέτες κηλίδωση και ανοσοφθορισμού σε κυτταρικές σειρές) ήταν από τη Cell Signaling Technologies (Danvers, ΜΑ). pSrc πολυκλωνικά αντισώματα (για χρώση ΤΜΑ), κολλαγόνο Ι πολυκλωνικά αντισώματα ήταν από Abcam (Cambridge, ΜΑ). PG πολυκλωνικά κοτόπουλο αντισώματα ήταν από την Άβες Labs (Eugene, OR). GAPDH μονοκλωνικό αντίσωμα ήταν από την Millipore (Temecula, CA). δευτερογενή αντισώματα αντι-κουνελιού συζευγμένο με HRP κατσίκας αντι-ποντικού και αίγας ήταν από την Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). HRP-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας αντι-κοτόπουλου δευτερεύον αντίσωμα ήταν από Kirkegaard &? Perry Laboratories (Gaithersburg, MD). Vitronectin (VN) μονοκλωνικό αντίσωμα, ινονεκτίνη πολύκλωνα αντισώματα, λαμινίνη μονοκλωνικά ασκιτικό υγρό, και VN από ανθρώπινο πλάσμα ήταν από τη Sigma. ΡΡ2 εκλεκτικός αναστολέας Src ήταν από την Calbiochem (San Diego, CA). ένζυμο Δισπάση II ελήφθη από τη Roche (Βασιλεία, Ελβετία). πισίνα και siRNA ελέγχου # ακολουθία 2 μη στόχευση PG siRNA ελήφθησαν από Dharmacon (Lafayette, CO). caSrc αδενοϊό ήταν ένα γενναιόδωρο δώρο από τον Δρ Paul L. Stein (Πανεπιστήμιο Northwestern). Diff-Quik σύνολο Stain ήταν από την Dade Behring.

αδενοϊικές κατασκευές και Μεταγωγή

Το σύστημα συσκευασίας αδενοϊό pAdEasy, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Warren G. Tourtellote (Northwestern University Feinberg School of Medicine) ήταν χρησιμοποιείται για να παράγει προηγουμένως χαρακτηριζόμενη myc-tagged πλήρους μήκους ανθρώπινο PG [29], σύμφωνα με δημοσιευμένα πρωτόκολλα [30]. τα ποσοστά μόλυνσης κυττάρων παρακολουθήθηκαν με τη χρήση της έκφρασης GFP σε συνδυασμό με PG? τουλάχιστον το 30% του νέου επιστρώθηκαν κύτταρα εξακολουθούν να διατηρούνται έκφραση GFP.

siRNA Επιμολύνσεις

ARCaP

E, κύτταρα LNCaP, και C4-2B αναπτύχθηκαν σε 30% συρροή και κατόπιν επιμολύνθηκαν με ατομικό ή μια δεξαμενή 4 μικρά παρεμβαλλόμενα ON-TARGETplus RNA (siRNA) για ανθρώπινη PG ή με αλληλουχία # 2 ελέγχου μη-στόχευσης (Dharmacon, Lafayette, CO) σε τελική συγκέντρωση 20 ηΜ χρησιμοποιώντας Dharmafect αντιδραστήριο 1 διαμόλυνσης (Dharmacon) σύμφωνα με τις συστάσεις του κατασκευαστή. PG siRNA αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν ήταν ως εξής: 5′-AGACAUACACCUACGACUC-3 ‘? 5’-UGAGUGUGGAUGACGUCAA-3 ‘? 5′-CCACCAACCUGCAGCGACU? 5’-UGUACUCGUCGGUGGAGAA-3 ‘.

Ξυστό πληγή Δοκιμασία

PC3-Μ και ARCaP

Μ κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε τρυβλία 24 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν και την εξάπλωση. Τα κύτταρα μετάγονται με GFP- ή PG που περιέχουν αδενοϊό. Στις 24 ώρες μετά την μεταγωγή, ένα τραύμα το μηδέν έγινε με το ξύσιμο του συρρέουσα μονοστιβάδα με ένα ρύγχος πιπέτας 20 μΙ. Για τις μελέτες αναστολής Src, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο που περιέχει τον αναστολέα ΡΡ2 Src ή έλεγχος διαλύτη DMSO για 24 ώρες πριν από την πληγή μηδέν που γίνονται. Τα κύτταρα απεικονίστηκαν αμέσως μετά τον τραυματισμό και 24 ώρες μετά τον τραυματισμό. Στις 24 ώρες μετά τον τραυματισμό, τα κύτταρα λύθηκαν με ουρία Sample Buffer (USB) και τα προϊόντα λύσης χρησιμοποιήθηκαν για τη δοκιμή για την έκφραση του PG. ARCaP

Ε και κύτταρα C4-2B απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν και εξάπλωση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με έλεγχο ή PG siRNA. Μια πληγή γρατσουνιά έγινε 96 ώρες μετά την επιμόλυνση. Για τις μελέτες ενεργοποίησης Src, ARCaP

E κύτταρα υπέστησαν μεταγωγή με GFP-αδενοϊό ή ιδιοσυστατικά ενεργό Src (caSrc) -adenovirus για 24 ώρες πριν από την πληγή μηδέν που γίνεται. Τα κύτταρα απεικονίζεται αμέσως μετά τον τραυματισμό και 18 ώρες (κύτταρα C4-2B) ή 24 ώρες (ARCaP

Ε κύτταρα) μετά από τραυματισμό. Στις 24 ώρες μετά τον τραυματισμό, τα κύτταρα λύθηκαν με USB και προϊόντα λύσης αναλύθηκαν με κηλίδωση Western για τη δοκιμή για την έκφραση του PG. Το ποσοστό του κλεισίματος του τραύματος προσδιορίσθηκε με τη χρήση του λογισμικού ImageJ.

εισβολής σε Matrigel Δοκιμασία

Η δοκιμασία εισβολή Matrigel διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [31] με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Η εσωτερική καλά ενθεμάτων transwell (0.8 μm? BD Biosciences) επικαλύφθηκαν με 100 μΙ Matrigel Υπόγειο Membrane Matrix (Βϋ Biosciences) και αφέθηκε να διαπερατά σε θερμοκρασία δωματίου για 1 ώρα. Το απομένον υγρό απομακρύνθηκε, και τα φίλτρα πλύθηκαν με μέσο άνευ ορού και αφήνονται να στεγνώσουν στον αέρα. κύτταρα του προστάτη αποσπάστηκαν σύμφωνα με την κυτταρική σειρά ειδικά πρωτόκολλα (ARCaP

Ε, ARCaP

M, C4-2B, DU145, και PC-3 κύτταρα αποκολλήθηκαν χρησιμοποιώντας θρυψίνη, ενώ τα κύτταρα LNCaP και PC3-Μ αποσπάστηκαν με τη χρήση του ασβεστίου παγίδευση) και πλύθηκε με απαλλαγμένο από ορό μέσο, ​​και 5 × 10

5 κύτταρα προστέθηκαν στον εσωτερικό θάλαμο εισβολή. Τα κύτταρα αφέθηκαν να εισβάλουν για 24 ώρες? μη εισβάλλοντα κύτταρα απομακρύνθηκαν από το εσωτερικό φρεάτια χρησιμοποιώντας μια μπατονέτα, και εισβάλλοντα κύτταρα προσκολλημένα στον πυθμένα της μεμβράνης μονιμοποιήθηκαν και χρωματίστηκαν χρησιμοποιώντας το κιτ χρώσης Diff-Quik (DADE AG). Οι εισβάλλοντας κύτταρα καταμετρήθηκαν με όρθια στερεοφωνικό μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας ένα 10x στόχος (Nikon).

Ανοσοαποτύπωσης

ARCaP

M, C4-2B και PC3-Μ κύτταρα τοποθετήθηκαν σε 6- φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν και την εξάπλωση. Τα κύτταρα σε μεταγωγή με GFP που περιέχει αδενοϊό ή PG που περιέχουν αδενοϊό, συλλέχθηκαν 24 ώρες αργότερα με USB και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE. Μετά τη μεταφορά σε μία μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, ανάλυση ανοσοκηλίδος διεξήχθη με αντισώματα έναντι PG, pSrc, Src, LN, FN, VN, και GAPDH. ARCaP

Ε και κύτταρα C4-2B απλώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν και εξάπλωση. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με PG siRNA ή αλληλουχία ελέγχου # 2 siRNA. Μετά από 96 ώρες, τα κύτταρα λύθηκαν με USB και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE, μεταφέρθηκαν σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, και στη συνέχεια υποβάλλεται σε Ανάλυση ανοσοκηλιδώσεως με αντισώματα έναντι PG, VN, FN, Col IV, και GAPDH. Ποσοτικοποιήσεις των εντάσεων ζώνης διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Αναλύστε εργαλείο Gels του λογισμικού ImageJ.

μηχανική ισχύ (Dispase) Δοκιμασία

LNCaP, κύτταρα C4-2B, και PC3-M απλώθηκαν σε 6- φρεατίων, και αφέθηκαν να προσκολληθούν και την εξάπλωση. Οι καλλιέργειες μεταγωγή με GFP που περιέχει αδενοϊό ή PG που περιέχουν αδενοϊό, και μετά από 24 ώρες εκτελέστηκε η δοκιμασία δισπάση. Για τις μελέτες αναστολής Src, κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο που περιέχει ΡΡ2 (10 μΜ) ή DMSO (έλεγχος διαλύτη) για 24 ώρες πριν από την εκτέλεση του προσδιορισμού δισπάση όπως περιγράφεται [32]. Εν συντομία, καλλιέργειες κυττάρων σε συρροή πλύθηκαν με PBS και επωάστηκαν με 2,4 U /ml δισπάσης για 30 λεπτά στους 37 ° C. Κυκλοφόρησε μονοστιβάδες υποβλήθηκαν σε ήπια μηχανική καταπόνηση, και στη συνέχεια σταθεροποιήθηκαν με φορμαλίνη. Θραύσματα μετρήθηκαν με ένα τεμαχίζοντας πεδίο (Leica, MZ6) όπως περιγράφεται [32] ή απεικονίστηκαν με Hamamatsu Orca ψηφιακή φωτογραφική μηχανή (μοντέλο C4742-95) και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό απεικόνισης MetaVue (Molecular Devices). Τα δεδομένα εκφράζονται ως μέσος αριθμός θραυσμάτων ± SEM. Η στατιστική ανάλυση έγινε με τη χρήση

t

test του Student.

Κρεμαστά Drop Aggregation Δοκιμασία

Ο προσδιορισμός κρεμαστή πτώση διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [32], με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Οι καλλιέργειες κυτταρικών σειρών προστάτη αποκολλήθηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω, φυγοκεντρούνται και εναιωρούνται εκ νέου στο κατάλληλο μέσο καλλιέργειας. Σταγόνες (20-μΙ) κυτταρικών αιωρημάτων σπάρθηκαν πάνω στην εσωτερική επιφάνεια ενός καπακιού καλλιέργειας πιάτο 35 mm και καλλιεργήθηκαν για 20 ώρες. Για να περιοριστεί η εξάτμιση, 2 ml PBS προστέθηκε στο κάτω μέρος των δίσκων καλλιέργειας. Για να συγκρίνετε παρόμοιες πυκνότητες κυττάρων αιωρούνται στο σταγόνα, 4 × 10

3 κύτταρα εξετάστηκαν. Για να εξεταστεί η ικανότητα των κυττάρων να σχηματίζουν συσσωματώματα μετά από 24 ώρες, τα καπάκια πιάτο καλλιέργειας αναστρέφεται, και τα κρεμαστά σταγόνες ισοπεδώθηκαν με καλυπτρίδα γυάλινη για την απεικόνιση. Για να εξεταστεί η κολλητική ισχύς των κυτταρικών συσσωματωμάτων, παράλληλες καλλιέργειες κονιοποιήθηκαν 10 φορές μέσω 20-μΙ ρύγχος πιπέτας (προ-ξεπλύθηκε με 0,1% Triton Χ-100 /PBS) στη συνέχεια ξεπλύθηκαν 3 φορές σε PBS πριν από την απεικόνιση. Πέντε τυχαία πεδία των εικόνων αντίθεσης φάσης από κάθε ανάρτηση πτώση αποκτήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Zeiss Axiovert 200 ανεστραμμένο μικροσκόπιο με μια φωτογραφική μηχανή Zeiss AxioCam και λογισμικού Zeiss Axiovision. Ο συνολικός αριθμός των κυττάρων συστάδες μετρήθηκε από κρέμεται τριπλούν σταγόνες.

ανοσοφθορισμού

ARCaP

Ε, ARCaP

M, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3, και PC3-M κύτταρα αναπτύχθηκαν σε γυάλινες καλυπτρίδες, εκπλύθηκαν σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και σταθεροποιήθηκαν σε άνυδρη μεθανόλη για 2 λεπτά στους -20 ° C. Αυτά στη συνέχεια επωάστηκαν με κοτόπουλο αντι-ΡΟ (1407) (1:1000) και ποντικού αντι-Ε-καδερίνης (HECD-1) αντισώματα (1:100) όλη τη νύκτα στους 4 ° C. Πρωτογενή αντισώματα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας Alexa Fluor 350-, 488- και 568-συζευγμένο αντίσωμα κατσίκας δευτερογενή αντισώματα έναντι ποντικού, κουνελιού και IgG κοτόπουλου (1:400), αντίστοιχα. Καλυπτρίδες εξετάσθηκαν με μια Leica όρθια μικροσκόπιο μοντέλο DMR (Deerfield, IL), και οι εικόνες συλλήφθηκαν χρησιμοποιώντας ένα Hamamatsu Orca ψηφιακή φωτογραφική μηχανή μοντέλο C4742-95 (Bridgewater, NJ) και Metamorph 7.6 (Molecular Devices) λογισμικό απεικόνισης.

ιστός μικροσυστοιχιών χρώσης, απεικόνισης και έντασης φθορισμού Ανάλυση

Η μικροσυστοιχιών προστατικό ιστό παραφίνη-ενσωματωμένες (BC19021) που περιέχει 72 πυρήνες από τις 20 περιπτώσεις που αγοράστηκε από ΗΠΑ Biomax (Rockville, MD), και υποβλήθηκε σε επεξεργασία για ανοσοϊστοχημική χρώση όπως περιγράφεται [33]. Το αντιγόνο ανάκτηση διεξήχθη με θέρμανση του γυάλινο πλακίδιο στους 95 ° C σε 0,01 Μ ρυθμιστικό διάλυμα κιτρικού. Η μικροσυστοιχία μπλοκαρίστηκε σε 2% κανονικό ορό κατσίκας (Jackson ImmunoResearch Laboratories) και 1% BSA για 60 λεπτά στους 37 ° C, μετά επωάζονται με πρωτεύοντα αντισώματα ενάντια PG, VN και pSrc όλη τη νύκτα στους 4 ° C σε υγροποιημένο θάλαμο. Η μικροσυστοιχία επωάστηκε σε AlexaFluor-συζευγμένο δευτερεύον αντι-κοτόπουλου (633), ποντικού (488) και κουνελιού (568) αντισώματα για 60 λεπτά στους 37 ° C, και το επικάλυμμα τοποθετήθηκε σε πολυβινυλική αλκοόλη. PG, VN, και pSrc απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας συνεστιακή μικροσκοπία (Cell Imaging Διευκόλυνσης, το Northwestern University), εντός 3 ημερών από την επεξεργασία. Ρυθμίσεις απόκτηση Πανομοιότυπες χρησιμοποιήθηκαν για όλες τις εικόνες που να εξασφαλίζει την ένταση των πίξελ της εικόνας μπορεί να συγκριθεί. Εικόνες ελήφθησαν σε 40Χ μεγέθυνση, με τουλάχιστον 4 εικόνων ανά πυρήνα ιστό που λαμβάνεται. Σχετικές εντάσεις φθορισμού προσδιορίστηκαν με χρήση MetaMorph 7,6 λογισμικού (Molecular Devices) όπως περιγράφεται προηγουμένως [34] με τις ακόλουθες τροποποιήσεις. Κάθε ωμά, ακόρεστα εικόνα ορίστηκε σε 16 σειρά bit (κλίμακα από το 0 για χαμηλή και 255 για την υψηλή) και σφαιρικότητα κατώφλι. Η λειτουργία Μέτρο Grid χρησιμοποιήθηκε για να επιλέξει τις περιοχές του όγκου που πρόκειται να αναλυθεί. Κάθε δίκτυο ήταν 40 × 40 τετράγωνα (30,86 μm

2 /τετραγωνικό). Η μέση ένταση των κατώφλι περιοχές ήταν υπολογίζονται αυτόματα από MetaMorph για κάθε δίκτυο. πλατείες Πλέγμα με ένταση 0 αποκλείστηκαν από τη μέση ένταση υπολογισμού για το σύνολο του δικτύου. Όγκου στάσης έχει χαρακτηριστεί από U.S. Biomax, σύμφωνα με την κλίμακα που χρησιμοποιείται από ΤΝΜ UICC [35]. Πρωτογενής όγκου (Τ) τα κριτήρια σταδιοποίησης του καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιήθηκε ως εξής: Τ1, Κλινικά αφανή όγκων? Τ2, Tumor περιορίζεται εντός του προστάτη? Τ3, Tumor εκτείνεται διαμέσου της κάψουλας του προστάτη? Τ4, όγκου εισβάλλει γειτονικών κατασκευών, πλην των σπερματοδόχων κύστεων. Λεπτομερής περιγραφή των ιστών που χρησιμοποιούνται για την μικροσυστοιχιών μπορούν να βρεθούν στην ιστοσελίδα της εταιρείας https://www.biomax.us/tissue-arrays/Prostate/BC19021. Επιπλέον, το αδενοκαρκίνωμα του προστάτη βαθμολογήθηκε από έναν εμπειρογνώμονα ουροποιογεννητικού παθολόγο (Ximing J. Yang), χρησιμοποιώντας το σύστημα ταξινόμησης Gleason, η οποία βασίζεται αποκλειστικά στις αρχιτεκτονικά χαρακτηριστικά των καρκινικών κυττάρων.

Στατιστικές Μέθοδοι

πειράματα καλλιέργειας κυττάρων διεξήχθησαν με 3 ή περισσότερα αντίγραφα. Οι τιμές δίνονται ως μέση με ράβδους σφάλματος που υποδεικνύει SEM. Οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση GraphPad Prism έκδοση λογισμικού 5.02 για Windows (San Diego, USA). Όλες οι στατιστικές δοκιμασίες ήταν 2 όψεων. t-test του Student για συγκρίσεις ραβδόγραμμα διεξήχθη. Γραμμικής παλινδρόμησης έγινε για τα γραφήματα γραμμής σύγκριση της έκφρασης του VN και PG ή pSrc και PG, με το R τετράγωνο τιμή που αντιπροσωπεύει την καλοσύνη της προσαρμογής της γραμμής. p & lt? 0,1 θεωρήθηκε στατιστικά σημαντική

Αποτελέσματα

PG είναι εντοπίζεται λανθασμένα και η έκφρασή της είναι μειωμένη σε δείγματα ιστών καρκίνου του προστάτη και κυτταρικές γραμμές

Αρκετές αναφορές στη βιβλιογραφία έχουν προταθεί. ότι η έκφραση PG είναι μειωμένη σε κλινικά δείγματα προστάτη σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό [18], [36], [37]. Ωστόσο, αν είναι υπεύθυνη διαμόρφωση της έκφρασης PG για οποιαδήποτε από τις φυσιολογικές και μοριακών γεγονότων σε PCa ογκογένεση δεν έχει ακόμη μελετηθεί μηχανιστικά. Για την αντιμετώπιση αυτού του προβλήματος και να αποκτήσουν μια καλύτερη κατανόηση της σχέσης μεταξύ της έκφρασης ΡΟ και την έκταση των πρωτογενών προστάτη προσβολή όγκου, μια μικροσυστοιχία ιστός προστάτη με 72 πυρήνες από 20 ασθενείς με καρκίνο του προστάτη αναλύθηκαν για έκφραση PG. Παρατηρήσαμε μια μείωση στην συνολική έκφραση PG σε όλες τις κακοήθεις δείγματα σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό, καθώς και μια εξαφάνιση των PG από τις κυττάρου-κυττάρου σύνορα όπου κανονικά εντοπισμένο (Εικ. 1Α). Ανάλυση της έντασης φθορισμού PG αποκάλυψε, κατά μέσο όρο, περίπου 50% λιγότερο PG σε δείγματα πρωτογενούς όγκου όλων των τάξεων Gleason και ανέβασε Τ1 μέσω Τ3, σε σύγκριση με φυσιολογικό ιστό (Σχ. 1Β-C). Επιπλέον, σε επεμβατικές όγκους Τ4 υπήρχε ένα επιπλέον -30% μείωση σε ΡΟ (Εικ. 1 C). Αυτά τα ευρήματα έδειξαν ότι η έκφραση ΡΟ μειώθηκε και εντοπίζεται λανθασμένα σε ιστό καρκίνου του προστάτη πρωτογενή σύγκριση με το φυσιολογικό ιστό προστάτη. Επιπλέον, η περαιτέρω απώλεια της PG στην επεμβατική δείγματα (Τ4) όγκου αυξάνει την πιθανότητα που PG παίζει ρόλο στην καταστολή του προστάτη εισβολή.

Α-C. Μια μικροσυστοιχία προστατικό ιστό βάφτηκε με ένα αντίσωμα έναντι PG. Α, Αντιπροσωπευτικές ανοσοφθορισμού εικόνα που δείχνει έκφραση PG στον φυσιολογικό ιστό του προστάτη (επάνω) και του ιστού Τ3 (κάτω) του προστάτη. Ράβδος αντιπροσωπεύει 50 μm. B. Η ποσοτικοποίηση της έκφρασης PG στον φυσιολογικό ιστό του προστάτη σε σύγκριση με ιστό από όγκους του προστάτη με Gleason Βαθμού μικρότερη ή ίση με 6 (6 όγκοι), 7 (5), ή μεγαλύτερη από ή ίση με 8 (33). έκφραση PG έχει υψηλή περιεκτικότητα σε κανονικό ιστό (μαύρο) και μειώνεται με ~ 50% στον ιστό του όγκου όλων των βαθμών Gleason. Gleason ταξινόμηση έγινε με χειρουργική παθολόγο Ximing Γιανγκ. C. Ποσοτικός προσδιορισμός της έκφρασης PG στον φυσιολογικό ιστό του προστάτη σε σύγκριση με ιστό όγκου του προστάτη σταδίου Τ. PG εκφράζεται υψηλά σε φυσιολογικό ιστό (μαύρο) και η έκφραση μειώνεται από -40% σε στάδιο Τ1-Τ3 ιστό όγκου του προστάτη και κατά 70% περίπου σε Τ4 ιστό όγκου του προστάτη. Όγκου στάσης έχει χαρακτηρισθεί σύμφωνα με την κλίμακα ΤΝΜ χρησιμοποιείται από UICC [35]. Πρωτογενής όγκου (Τ) τα κριτήρια σταδιοποίησης του καρκίνου του προστάτη χρησιμοποιήθηκε ως εξής: Τ1, Κλινικά αφανή όγκων (3 όγκους)? Τ2, Tumor περιορίζεται εντός του προστάτη (33)? Τ3, Tumor εκτείνεται διαμέσου της κάψουλας του προστάτη (9)? Τ4, Tumor εισβάλλει γειτονικών κατασκευών, εκτός από σπερματοδόχους κύστεις (3). Επιπλέον, υπήρξαν 8 δείγματα φυσιολογικού ιστού προστάτη στη συστοιχία. Γραφήματα αντιπροσωπεύουν μέσους όρους +/- SEM. * P & lt? 0,05? ** P & lt? 0,002? *** P & lt? 0,0005? **** P & lt?. 0,0001, από paired t test

Η

Στη συνέχεια, τα επίπεδα έκφρασης PG και διανομή αξιολογήθηκαν σε μια επιτροπή επτά κυτταρικές σειρές προστάτη ποικίλλουν σε ογκογόνο τους ιδιότητες. Σε γενικές γραμμές, οι κυτταρικές σειρές που περιγράφονται στη βιβλιογραφία ως έχοντα περισσότερο μεταστατικού δυναμικού (ARCaP

Μ, C4-2B, και PC3-Μ) παρουσίασαν αρκετές φορές χαμηλότερη έκφραση PG από ό, τι λιγότερο επιθετικές γραμμές (LNCaP και ARCaP

ΜΙ). Ενώ μετρίως διαφοροποιημένα κύτταρα DU145 εκφράζεται περισσότερο PG από τις άλλες κυτταρικές σειρές, PG εμφάνισε μια πιο διάχυτη κυτταροπλασματική και πυρηνική εντόπιση αντί να συγκεντρώνεται στο κύτταρο-κύτταρο διεπαφές (Σχ. 2Α, Β). Ομοίως, οι επιθετικές γραμμές ARCaP

M και C4-2B εκτίθενται αμυδρό και διάχυτη χρώση για PG. Τέλος, η μεταστατική παραλλαγή της κυτταρικής σειράς PC-3, τα κύτταρα PC3-M, που εκφράζεται λιγότερο PG από τα PC-3 κύτταρα (Σχ. 2Α, Β). Είναι ενδιαφέρον, αν και παρουσίασαν συνολικά χαμηλότερα επίπεδα PG από τα κύτταρα PC3-M, τα κύτταρα C42B εξακολουθούν να δείχνουν κάποια πυρηνική χρώση (Εικ. 2Β). Συνολικά αυτά τα δεδομένα δείχνουν μια τάση μειωμένης έκφρασης PG και απώλεια των κυττάρων-κυττάρων σύνορα εντοπισμό των PG στις επιθετικές γραμμές κυττάρων του προστάτη.

Α. καρκινικές κυτταρικές γραμμές του προστάτη λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE, ακολουθούμενη από ανοσοκηλίδωση με αντισώματα έναντι PG και GAPDH. επίπεδα PG προσδιορίστηκαν με ομαλοποίηση σε επίπεδα GAPDH για κάθε κυτταρική σειρά χρησιμοποιώντας Image J. ανοσοστυπώματος δείχνει ότι η έκφραση του PG σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου του προστάτη συσχετίζεται αντιστρόφως με το βαθμό της επιθετικότητας της κυτταρικής γραμμής. καρκινικές κυτταρικές γραμμές Β προστάτη απλώθηκαν σε καλυπτρίδες και αφέθηκαν να προσκολληθούν και εξάπλωση. Ανοσοφθορισμού διεξήχθη χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι PG για να αποδειχθεί ο εντοπισμός του PG σε ARCaP

E, ARCaP

Μ, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3, και PC3-M κυτταρικές σειρές. Η ανοσοφθορισμού δείχνει ασθενέστερη χρώση και απώλεια κυττάρου-κυττάρου σύνορα εντοπισμό των PG στις πιο επιθετικές κυτταρικές γραμμές (ARCaP

Μ, C4-2B, και PC3-Μ). Οι εκπρόσωποι των τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων ανοσοστυπώματα δείχνεται, με τους αριθμούς που αντιπροσωπεύουν GAPDH κανονικοποιημένα επίπεδα πρωτεΐνης PG για την κηλίδα που φαίνεται. Όλα τα επίπεδα της πρωτεΐνης PG ομαλοποιήθηκαν να ARCaP

επίπεδα E μέσα σε κάθε κηλίδα. Το μέσο επίπεδο και την τυπική απόκλιση των επιπέδων της πρωτεΐνης PG στον πίνακα Α, έχει ως εξής: ARCaP

E 1.0, ARCaP

M 0.3 +/- 0.2, LNCaP 1.5 +/- 0.5, 0.5 C4-2B +/- 0,2 , DU145 3.4 +/- 1.2, PC-3 1.0 +/- 0.4, PC3-M 0,5 +/- 0,2.

Η

PG Προωθεί κυττάρου-κυττάρου προσκόλληση του προστάτη κύτταρα

εν όψει του γεγονότος ότι ένα χαρακτηριστικό γνώρισμα του διηθητικού καρκίνου είναι η ικανότητα των κακοήθων κυττάρων να συντονίσει την αποδυνάμωση του κυττάρου-κυττάρου συμφύσεων τους με μεταβολές στις λειτουργικές αλληλεπιδράσεις με το υποκείμενο υπόστρωμα [3], μπορούμε επόμενη διερευνήσαμε εάν πειραματικός χειρισμός των επιπέδων PG (Εικ. S1 και S2) που επηρεάζονται προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε κύτταρα PCa. PC3 κύτταρα-M, τα κύτταρα C4-2B, και τα κύτταρα LNCaP υπέστησαν μεταγωγή με PG-εκφράζουν αδενοϊό και μία δοκιμασία δισπάση διεξήχθη για να μετρηθεί μεσοκυττάριο δύναμη προσκόλλησης (Εικ. 3Α). προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου ήταν σημαντικά αυξημένη σε όλα τα κύτταρα μετάγονται με PG-εκφράζουν αδενοϊό (PG ΟΕ) σε σύγκριση με κύτταρα που έχουν υποστεί μεταγωγή με τον έλεγχο (GFP) αδενοϊό (Σχ. 3Α-Β).

A. Αντιπροσωπευτική εικόνα μιας δοκιμασίας δισπάση σε κύτταρα PC3-M μετά από μεταγωγή με PG Ο.Ε. αδενοϊό ή τον έλεγχο της GFP με αδενοϊό. B. ποσοτικοποιήσεις του δισπάση δοκιμασίες πραγματοποιήθηκαν εις τριπλούν? LNCaP, C4-2B, ή PC3-M κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 6 φρεατίων, και αφέθηκαν να προσκολληθούν και εξάπλωση. Οι καλλιέργειες μεταγωγή με GFP που περιέχει αδενοϊό (GFP) ή PG που περιέχουν αδενοϊό (PG ΟΕ), και μετά από 24 ώρες εκτελέστηκε η δοκιμασία δισπάση. Η υπερέκφραση του PG σε όλες τις 3 κυτταρικές σειρές ενισχύει προσκόλληση κυττάρου-κυττάρου. κύτταρα C. LNCaP απλώθηκαν σε πλάκες 6-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν και εξάπλωση. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου ή πισίνα PG siRNA. Η δοκιμασία dispase διεξήχθη 96 ώρες μετά την επιμόλυνση. Η καταστολή της PG αποτελέσματα έκφρασης σε αποδυνάμωση της προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε κύτταρα LNCaP. Δ Εκπρόσωπος εικόνα μιας δοκιμασίας κρέμεται πτώση στα κύτταρα DU145 μετά την επιμόλυνση με τον έλεγχο ή την πισίνα PG siRNA. E-F. Η ποσοτικοποίηση του κρέμονται δοκιμασίες πτώση εκτελούνται εις τριπλούν? C4-2B και PC3-M κύτταρα μετάγονται με GFP- ή PG που περιέχουν αδενοϊούς (Ε), ARCaP Ε, LNCaP, DU145 και τα κύτταρα PC3 διαμολύνθηκαν με έλεγχο siRNA ή πισίνα PG siRNA (F). δοκιμασίες Aggregation έγιναν 24 h (Ε), ή 96 ώρες (F) μετά την επεξεργασία. Γραφήματα αντιπροσωπεύουν μέσους όρους +/- SEM. * P & lt? 0,06? ** P & lt? 0.005? *** P & lt?. 0.0007, από ζεύγη Student t test

Η

Είναι ενδιαφέρον ότι, η υπερέκφραση του PG στα κύτταρα LNCaP, τα οποία εκφράζουν ήδη σημαντικά επίπεδα PG, οδήγησε σε περαιτέρω αύξηση των μεσοκυττάρια δύναμη πρόσφυσης και κυττάρων β-κυττάρων χρώση διασταύρωση της Ε-καδερίνης (Εικ. 3Β και σχ. S3), γεγονός που υποδηλώνει ότι η παρουσία πρόσθετων PG μπορεί να σταθεροποιηθεί περαιτέρω ενώσεις προσφύσεως σε PCa. Επιπλέον, σε ARCaP

Μ κύτταρα, η υπερέκφραση του PG οδήγησε σε ανοδική ρύθμιση του δεσμοπλακίνη συστατικού δεσμοσωμάτων (Εικ. S3), υποδεικνύοντας μια πιθανή σταθεροποιητική επίδραση του PG επί διασταυρώσεις των δεσμοσωμάτων στην PCa, καθώς και. Από την άλλη πλευρά, να χτυπήσει κάτω έκφραση PG σε κύτταρα LNCaP οδήγησε σε σημαντική εξασθένιση της κυττάρου-κυττάρου συμφύσεις (Σχ. 3C). Επιπλέον, προς τα κάτω ρύθμιση των PG οδήγησε σε μείωση τόσο της Ε-καδερίνης και δεσμοσωμάτων καντερίνης δεσμογλείνης 2 σε ARCaP

E κύτταρα (Σχ. S3), υπογραμμίζοντας και πάλι τη σημασία της PG για τη σταθερότητα της προσφύσεως και διασταυρώσεις των δεσμοσωμάτων στην PCa . Αυτά τα αποτελέσματα συλλογικά στηρίζουν την ιδέα ότι η έκφραση ΡΟ ενισχύει προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε κύτταρα PCa.

Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω η επίδραση του PG επί προστάτη προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου, εκτελέσαμε συσσωμάτωση (κρέμασμα σταγόνα) δοκιμασίες των κυττάρων σε εναιώρημα (Σχ. 3D). Αυτή η δοκιμασία είχε χρησιμοποιηθεί στο παρελθόν για την ποσοτικοποίηση της δύναμη προσκόλλησης μιας ποικιλίας επιθηλιακών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των Α431, MDCK και SCC68 [38] – [40]. Για να δοκιμαστεί δύναμη προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου που υποβάλλεται σε διάτμηση συσσωματώματα δύναμη. Ο αριθμός των θραυσμάτων που παράγονται με διάτμηση συσσωματωμάτων μειώθηκε σημαντικά στις κυτταρικές σειρές που υπερεκφράζουν PG σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 3Ε). Επιπλέον, χτυπώντας τα κάτω PG οδήγησε σε σημαντική αύξηση του αριθμού των τεμαχίων, γεγονός που υποδηλώνει την εξασθένιση της αντοχής προσκόλλησης κυττάρου-κυττάρου σε διάτμηση δύναμη (Εικ. 3D, F).

PG Αναστέλλει Η κινητικότητα και εισβολή PCa κυτταρικές Γραμμές

Ως αποδυνάμωση του κυττάρου-κυττάρου συμφύσεων έχει αναφερθεί ότι αυξάνουν την κυτταρική κινητικότητα [41], από την επόμενη κατάσταση διερευνηθεί εάν PG σε κύτταρα συσχετίζεται με σχετική κινητικότητα τους. Προς το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε μια δοκιμασία μηδέν πληγή για να συγκρίνουν την κινητικότητα των PC3-Μ, ARCaP

M, ARCaP

Ε, και C4-2B κύτταρα. Η δοκιμασία έδειξε ότι PC3-M και ARCaP

M κύτταρα ήταν ιδιαίτερα κινητικά (με πάνω από 50% του τραύματος έκλεισε το 24 h), ενώ ArCaP

Ε και C4-2B κύτταρα ήταν λιγότερο κινητικά (περίπου 20% έκλεισε σε 24 ώρες) (Σχ. 4Α, Β). Στη συνέχεια υπερεκφράζεται PG σε PC3-M και ARCaP

κύτταρα Μ, η οποία μειώθηκε κινητικότητα τους κατά 2-φορές σε σύγκριση με τον μάρτυρα (Σχ. 4Α). Ταυτόχρονα, knockdown του PG σε ARCaP

Ε και C4-2B κύτταρα είχε ως αποτέλεσμα μια περίπου 50% και πάνω από 2 φορές αύξηση στην κινητικότητα τους, αντίστοιχα (Σχ. 4Β). Τα ευρήματα αυτά υποστηρίζουν συλλογικά την έννοια ότι εκτοπικά εκφράζοντας PG αναστέλλει την κινητικότητα των κυττάρων του προστάτη, ενώ φίμωση PG αυξάνει την κινητικότητα τους.

Α. PC3-M και ARCaP

M απλώθηκαν σε πλάκες 24 φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν και εξάπλωση. Τα κύτταρα στη συνέχεια μεταγωγή με GFP που περιέχει αδενοϊό ή PG που περιέχουν αδενοϊό, και μετά από 24 ώρες το τραύμα γρατσουνιά έγινε. Εικόνες ελήφθησαν στις 0 και 24 ώρες και το κλείσιμο% τραύμα υπολογίστηκε με σύγκριση του μεγέθους της πληγής στις 24 ώρες στο χρονικό σημείο 0 ώρα κάθε κατάσταση. Η υπερέκφραση του PG καταστέλλει κινητικότητα σε αυτές τις δύο κυτταρικές σειρές. B. ARCaP

Ε και C4-2B κύτταρα τοποθετήθηκαν σε πλάκες 24-φρεατίων και αφέθηκαν να προσκολληθούν και εξάπλωση. Τα κύτταρα στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου ή πισίνα PG siRNA, και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα τραύματα έγιναν μηδέν. Καταστολή της PG οδηγεί σε αύξηση της κινητικότητας σε ARCaP

Ε και κύτταρα C4-2B. δοκιμασία Scratch πληγή γίνεται εις τριπλούν σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του προστάτη μετά από υπερέκφραση ή knockdown του PG. Γ ARCaP

Μ, C4-2B, DU145 και PC3-M κύτταρα μετάγονται με GFP που περιέχει αδενοϊό ή PG που περιέχουν αδενοϊό, και μετά από 24 ώρες απλώθηκαν σε Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνες μεταξύ φρεατίων για μία δοκιμασία εισβολής. Η υπερέκφραση της PG καταστέλλει την εισβολή σε αυτές τις τέσσερις κυτταρικές σειρές. D. ARCaPE, LNCaP, C4-2B, DU145, PC-3 και PC3-M κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA ελέγχου ή πισίνα PG siRNA, και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, επιστρώθηκαν επί Matrigel επικαλυμμένα μεμβράνες μεταξύ φρεατίων για μία δοκιμασία εισβολής. Καταστολή της PG οδηγεί σε αύξηση της εισβολής σ ‘αυτές τις έξι κυτταρικές σειρές. δοκιμασίες Εισβολή έγιναν εις τριπλούν.