Αφηρημένο

Η νικοτίνη ασκεί ογκογόνο επιδράσεις τους μέσω της σύνδεσης προς νικοτινικούς υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChRs; ) και η ενεργοποίηση των καθοδικών πορειών που μπλοκάρουν την απόπτωση και την προώθηση της νεο-αγγειογένεσης. Οι nAChRs του υποτύπου α7 είναι παρόντες σε μια ευρεία ποικιλία καρκινικών κυττάρων και η αναστολή τους από νευροτοξίνες δηλητηρίου κόμπρας έχει προταθεί σε διάφορα άρθρα και σχόλια ως δυνητική καινοτόμο θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα. Ωστόσο, δεδομένου ότι μέρος των δημοσιευμένων αποτελεσμάτων πρόσφατα ανασυρθεί, πιστεύουμε ότι η αντικαρκινική δράση του δηλητηρίου κόμπρας νευροτοξίνες πρέπει να ανεξάρτητα επαναξιολογηθεί.

Έχουμε καθορίσει τη δραστηριότητα του ενζύμου α-νευροτοξίνες από

Naja ATRA

(μικρής αλυσίδας νευροτοξίνης, α-cobrotoxin) και

Naja kaouthia

(μακράς αλύσου νευροτοξίνης, α-cobratoxin)

in vitro

με μετρήσεις κυτταροτοξικότητα σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του πνεύμονα 5, με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας με α7nAChRs εκφράζουν και μη κυτταρικές σειρές που εκφράζουν και

in vivo

αξιολογώντας την ανάπτυξη του όγκου σε ένα ορθοτοπικό μη παχύσαρκοι διαβητικοί /σοβαρή συνδυασμένη ανοσοανεπάρκεια (

NOD SCID

/) μοντέλο ποντικού σύστημα που χρησιμοποιεί διαφορετικά σχήματα αγωγής και οι δοσολογίες.

Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση στην ανάπτυξη του όγκου παρατηρήθηκε στα σκέλη θεραπείας σε σύγκριση με τον έλεγχο και για τις δύο τοξίνες. Παραδόξως α-cobrotoxin από

Naja ATRA

έδειξε την τάση να ενισχύσει την ανάπτυξη του όγκου, αν και, ακόμη και σε αυτή την περίπτωση, η στατιστική σημαντικότητα δεν επιτεύχθηκε.

Εν κατακλείδι τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι, σε αντίθεση με άλλες εκθέσεις, η nAChR αναστολείς της α-cobratoxin από

Ν. kaouthia

και α-cobrotoxin από

Ν. ATRA

ούτε κατέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ούτε παρέτεινε την επιβίωση των ζώων που δέχθηκαν

Παράθεση:. Alama Α, Bruzzo C, Cavalieri Ζ, Φορλάνι Α, Utkin Υ, Casciano I, et al. (2011) Αναστολή της νικοτινικό ακετυλοχολίνη υποδοχείς από Cobra Venom α-νευροτοξίνες: είναι μια προοπτική σε πνεύμονα θεραπεία του καρκίνου υπάρχουν; PLoS ONE 6 (6): e20695. doi: 10.1371 /journal.pone.0020695

Συντάκτης: William C. S. Cho, Queen Elizabeth Hospital, το Χονγκ Κονγκ

Ελήφθη: 10 Δεκεμβρίου του 2010? Δεκτές: 7 Μαΐου του 2011? Δημοσιεύθηκε: 13 Ιουνίου 2011

Copyright: © 2011 Alama et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Χρηματοδότηση ήταν που παρέχεται από το ιταλικό Υπουργείο Υγείας (www.salute.gov.it/) και Fondazione Compagnia di San Paolo, Torino (www.compagniadisanpaolo.it/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι πειραματικές αποδείξεις που υποδηλώνει ότι διεγερτική ή ανασταλτική νευροδιαβίβαση εμπλέκεται στην ανάπτυξη του καρκίνου, την εξέλιξη και την ανταπόκριση στη θεραπεία έχουν σταθερά συσσωρεύσει [1]. Πράγματι, τα συστατικά του καπνού ρυθμίζει κυτταρικές λειτουργίες που σχετίζονται με τον μετασχηματισμό των κυττάρων και εμπλέκονται με τον εθισμό του καπνίσματος και προδιάθεση καρκίνου του πνεύμονα και την ανάπτυξη με την άμεση αλληλεπίδραση με νευρωνικούς και μη νευρωνικούς νικοτινικούς υποδοχείς ακετυλοχολίνης (nAChRs) [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11]. η ίδια η νικοτίνη έχει περιορίσει τον καρκίνο του πνεύμονα την έναρξη της δυνατότητες, αλλά μπορούν να στηρίξουν την ανάπτυξη του όγκου και την προώθηση μεταστατική εξάπλωση μέσω αντιαποπτωτικού και neoangiogenic ιδιότητες [2], [7], [12].

Η έκφραση των nAChRs σε μη-νευρικά κύτταρα του πνεύμονα, και ιδιαίτερα στο επιθήλιο των αεραγωγών, αντανακλά τις πολλαπλές ουσιώδεις λειτουργίες που ασκείται από το χολινεργικό σύστημα στην κανονική ανάπτυξη των πνευμόνων και τη λειτουργία [13], [14]. Από την άποψη αυτή, έχει προταθεί ότι ο ρόλος των nAChRs στον καρκίνο του πνεύμονα θα μπορούσε να είναι παρόμοια με εκείνη των υποδοχέων οιστρογόνου στον καρκίνο του μαστού επειδή και στις δύο περιπτώσεις, η ακατάλληλη διέγερση των υποδοχέων συμβάλλει στην ανάπτυξη του καρκίνου [15]. Λόγω του υψηλού επιπέδου έκφρασης ορισμένων υποτύπων nAChRs στον καρκίνο του πνεύμονα κυττάρων σε σύγκριση με τον περιβάλλοντα ανεπηρέαστο ιστό [16], [17] και της υποστήριξης πειραματικές αποδείξεις [18], [19], [20], [21] , υποτέθηκε ότι οι ανταγωνιστές του nAChRs, και ιδίως κόμπρα α-νευροτοξίνες, θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν ως πιθανοί θεραπευτικοί παράγοντες [22], [23], [24]. Ωστόσο, η περιορισμένη γνώση της λειτουργικότητας και των μακροπρόθεσμων αποτελεσμάτων της διέγερσης αυτών των υποδοχέων στα καρκινικά κύτταρα [2], [25], [26] και, το σημαντικότερο, η πρόσφατη ανάκληση μιας έκθεσης που υποστηρίζουν τα αντικαρκινικά αποτελέσματα της κόμπρα α-νευροτοξίνες

in vitro

και

in vivo

[27] καθιστά αμφίβολη τη στόχευση των nAChRs με αυτές τις τοξίνες για τη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα.

δηλητηρίου κόμπρας αποτελείται από πολλά πολυπεπτίδια με πολλαπλές τοξικές δραστηριότητες. Μεταξύ αυτών, οι τρεις δακτύλων τοξίνες (TFTs) είναι τα κύρια συστατικά και αντιπροσωπεύονται από α-νευροτοξίνες και κυτταροτοξίνες. Οι α-νευροτοξίνες προσδένονται σε nAChR με διαφορετική εξειδίκευση και συγγένεια: τοξίνες μικρής αλυσίδας (υπολείμματα 60-62 αμινοξέων, 4 δισουλφιδικές γέφυρες) μπλοκ μυϊκού τύπου nAChRs ενώ τοξίνες μακράς αλυσίδας (υπολείμματα 66-75 αμινοξέων, 5 δισουλφιδικοί δεσμοί , η πέμπτη δεσμός που υπάρχει στο κεντρικό βρόχο πολυπεπτίδιο) εκτός από nAChRs μυϊκού τύπου μπλοκάρουν επίσης τους νευρωνικούς υποδοχείς [28], [29]. Ως παράδειγμα των τοξινών βραχείας αλύσου, α-νευροτοξίνη που ονομάζεται α-COBr * o * τοξίνης από

μπορούν να αναφερθούν Naja ATRA

δηλητηρίου κόμπρας. Η κύρια α-νευροτοξίνη από

Naja kaouthia

δηλητηρίου κόμπρας ονομάζεται α-COBr * a * τοξίνη είναι ένα παράδειγμα των τοξινών μακράς αλυσίδας. Οι τοξίνες μικρής αλυσίδας είναι δομικά σχετικές με τις κυτταροτοξίνες ότι η μη-επιλεκτικά σκοτώνουν τα κύτταρα [30].

Κατά την επανεξέταση της βιβλιογραφίας σχετικά με τα αποτελέσματα κατά των όγκων α-cobratoxin [18], [19], [20], [21], [22], [27] διαπιστώσαμε ότι οι διάφορες εκθέσεις που παρουσιάζονται σημαντικές διαφορές σχετικά με την δοσολογία της τοξίνης που χρησιμοποιούνται για τις

in vivo πειράματα

, σχετικά με τον αριθμό των κυττάρων και εγχέονται σε ποντίκια επιβίωση. Επίσης, η παρουσία του α7 nAChR στην κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιείται για την in vivo μελέτες ήταν αβέβαια επειδή αντικρουόμενα αποτελέσματα υπάρχουν στην βιβλιογραφία [22], [31]. Επιπλέον, δεδομένου ότι μέρος των στοιχείων που είχαν ανασυρθεί χωρίς ιδιαίτερο κίνητρο [27], θεωρήσαμε απαραίτητο να επαναξιολογήσει τις αντικαρκινικές ιδιότητες της νευροτοξίνες κόμπρα

in vitro

και

in vivo

στην μια κλινικά σχετική ζωικό μοντέλο καρκίνου του πνεύμονα [18], για να διευκρινίσει εάν αυτές οι τοξίνες θα μπορούσαν να θεωρηθούν το πρωτότυπο μιας νέας κατηγορίας φυσικών προϊόντων με ιδιότητες κατά των όγκων όπως προτείνεται [15], [22], [24].

Αποτελέσματα και Συζήτηση

Η έκφραση της α7 nAChR σε Α549 και Α549-Luc κύτταρα

Η αλληλεπίδραση μεταξύ των α-cobratoxin και την α7 νικοτινικού υποδοχέα [32] ήταν μια από τις πειραματικές αποδείξεις πίσω από το σκεπτικό αξιοποίησης τοξίνες δηλητηρίου κόμπρας ως αντικαρκινικών παραγόντων [22]. Αν και αυτός ο υποδοχέας εκφράζεται σε ένα ευρύ φάσμα από ιστούς και κυτταρικές σειρές, μια πρόσφατη έρευνα της βιβλιογραφίας [22], [31] ανέφεραν αντικρουόμενα δεδομένα σχετικά με την έκφραση αυτού του υποδοχέα σε Α549, η κυτταρική γραμμή που χρησιμοποιείται για την

σε vivo

και οι περισσότεροι από το

in vitro

αντικαρκινική δοκιμασίες για α-cobratoxin. Ως εκ τούτου, ως πρώτο βήμα για την επαλήθευση της δραστικότητας του α-cobratoxin σε NSCLC, πραγματοποιήσαμε μια ημιποσοτική έρευνα RT-PCR και qPCR για να αποδειχθεί η έκφραση του α7 nAChR σε καρκινικές κυτταρικές γραμμές 5 πνεύμονα. Τρεις από τις κυτταρικές σειρές που χρησιμοποιούνται στην παρούσα μελέτη (Α549, H1650 και 1 SK-MES) ήταν τα ίδια από την αρχική ομάδα πειραμάτων [18], [19], [20], [27]. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 1, Panel Α, το α7 νικοτινικού υποδοχέα ήταν εύκολα ανιχνεύσιμη στο Α549, H1650 και SK-MES 1 αλλά όχι σε H1975 και ανάλυση CALU 1. Η qPCR επιβεβαίωσε την παρουσία διαφορετικής ποσότητας του nAChR α7 mRNA σε Α549, H1650 και SK-MES 1 (Σχήμα 1, Πίνακας Β). Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα RT-PCR, με H1975 και CALU 1 η α7 nAChR μεταγραφή, χρησιμοποιώντας την ίδια ποσότητα του cDNA που χρησιμοποιείται για όλες τις κυτταρικές σειρές, εμφανίστηκε μετά τον κύκλο 40, ένα αποτέλεσμα που μπορεί να αποδοθεί είτε σε ένα εξαιρετικά χαμηλό επίπεδο έκφραση ή στο θόρυβο του περιβάλλοντος

Α) ημι-ποσοτική ανάλυση α7 RT-PCR για τα Ανθρώπινα NSCLC αδενοκαρκίνωμα e κυττάρων πλακώδους καρκινώματος γραμμές. έκφραση GAPDH χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος για την ακεραιότητα του mRNA και cDNA ποσοτικοποίηση. NCI-H1975 και Calu1 είναι αρνητικά. Γ: Δεν υπάρχει έλεγχος πρότυπο. Β) qPCR άλφα 7 έκφραση στις ίδιες κυτταρικές σειρές. Σε y-άξονα φυσικό logaritm (ln) της φορές αλλαγή. NCI-H1650 χρησιμοποιήθηκε ως βαθμονομητή, GAPDH ως γονίδιο αναφοράς. Ένα UGR από συνολικό RNA retrotrascibed και η ίδια ποσότητα cDNA ανά δείγμα (2 μΙ) χρησιμοποιήθηκε (Ct GAPDH περιλαμβάνεται μεταξύ 15.65 και 17.65). NCI-H1975 και Calu1 είχε ως αποτέλεσμα αρνητική ή με εξαιρετικά χαμηλή έκφραση λόγω Ct & gt? 40. Γ) ανάλυση κηλίδας Western για άλφα 7. PC12 φορτώθηκε ως θετικός έλεγχος. έκφραση ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως εσωτερικός έλεγχος.

Η

Η έκφραση του α7 nAChR στο επίπεδο πρωτεΐνης επιβεβαιώθηκε με ανάλυση Western blot σε Α549 και Α549-Ιυο κύτταρα (Σχήμα 1, Πάνελ C).

έχει αναφερθεί ότι η διέγερση του α7 nAChR σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα πνεύμονα ως αποτέλεσμα την ρύθμιση προς τα επάνω του υποδοχέα αυτού [33]. Έχουμε δοκιμάσει την επίδραση των α-νευροτοξίνες από

Ν. ATRA

και

N.kaouthia

στο επίπεδο της α7 nAChR εστιάζοντας σε Α549 και Α549-Luc.

Η ανάλυση qPCR έδειξε ότι η θεραπεία με είτε α-cobrotoxin ή α-cobratoxin σε συγκέντρωση 0.003 μΜ, η αναφερόμενη IC

50 για α-cobratoxin σε Α549 [20], μαζί με τις συγκεντρώσεις τρεις φορές χαμηλότερο (0,001 μΜ) και τρεις φορές υψηλότερα (0.009 μΜ), δεν άλλαξε ουσιαστικά το επίπεδο του έκφραση του υποδοχέα σε αυτές τις κυτταρικές σειρές (λιγότερο από δύο φορές την αλλαγή, το σχήμα S1).

In vitro αποτελέσματα των βραχυπρόθεσμων και μακράς αλυσίδας α-νευροτοξίνες σε κυτταρικές σειρές NSCLC

Early

in vitro πειράματα

πρότεινε ότι η επίδραση του α-cobratoxin είναι δοσοεξαρτώμενη και ότι η υψηλή εκλεκτικότητα και ειδικότητα αυτού του μορίου εξαρτάται από την πυκνότητα του α7 nAChR [20], [21]. Από την άποψη αυτή μη καρκινικών πνευμονικών κυττάρων, καθώς και άλλα πρωτογενή ανεπηρέαστες κύτταρα που εκφράζουν χαμηλά επίπεδα υποδοχέων α7 ήταν αξιοσημείωτα ανθεκτική σε α-cobratoxin αγωγή [20].

Για να αξιολογηθεί η κυτταροτοξική δράση του α-cobratoxin, ότι αποτελεσματικά δεσμεύεται στο α7 nAChR (βλέπε Υλικά και Μέθοδοι) και η ειδικότητα και η επιλεκτικότητα της δράσης της, πραγματοποιήσαμε προσδιορισμούς ΜΤΤ με τις βραχυπρόθεσμες και μακράς αλυσίδας α-νευροτοξίνες για πιθανώς ευαίσθητοι α7 nAChR-θετικών και πιθανώς ανθεκτικά α7 nAChR αρνητικών κυτταρικές γραμμές. Οι καμπύλες δόσης-απόκρισης που να εκτιμηθεί η συγκέντρωση του φαρμάκου μειώνοντας την επιβίωση. Τα αρχικά πειράματα κυτταροτοξικότητας διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας τοξίνες συγκεντρώσεις που σε άλλες δημοσιεύσεις έχουν αναφερθεί ότι είναι αποτελεσματική σε α7 nAChR-θετικών NSCLC κυτταρικές γραμμές αλλά όχι τοξική σε κανονικά κύτταρα (IC50: 0.003 μΜ για Α549, 0.04 μΜ για SK-MES 1 και 1 μΜ για H1650) [18], [20], [21], [22]. Ωστόσο, με αυτές τις συγκεντρώσεις δεν μπορέσαμε να ανιχνεύσει αξιόλογη κυτταροτοξική δράση και η IC50 δεν θα μπορούσε να επιτευχθεί με οποιαδήποτε από τις δύο τοξίνες (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Σε υψηλότερες συγκεντρώσεις (μέχρι 30 μΜ) της α-cobrotoxin εμφάνισαν περιορισμένη μη εξαρτώμενη από τη δόση τοξικότητα που παρέμεινε ουσιαστικά σταθερή σε μία ευρεία περιοχή συγκεντρώσεων και στα 5 κυτταρικές σειρές (Σχήμα 2, πάνελ Α).

Ο NSCLC κυτταρικές γραμμές Α549, ΝΟΙ-H1975, H1650, CALU 1 και SK-MES 1 επωάστηκαν για 72 ώρες με α-cobrotoxin (0,6 έως 30 μΜ), άνω πάνελ, ή α-cobratoxin (0,75 έως 50 μΜ), κάτω πάνελ, και η τοξικότητα μετρήθηκε με τη δοκιμή ΜΤΤ χρωματομετρική. Η IC50 επιτεύχθηκε μόνο με α-cobratoxin.

Η

Σε υψηλές συγκεντρώσεις η α-cobratoxin έδειξε μια σαφή τοξικότητα εξαρτάται από τη δόση (Σχήμα 2, Πίνακας Β). Ωστόσο, η συγκέντρωση IC50 που παρατηρήθηκε στη μελέτη μας για Α549 και SK-MES 1 ήταν 2.466 και 105 φορές υψηλότερη από εκείνη που αναφέρεται σε προηγούμενη δημοσίευση [20]. Η διαφορά ήταν πολύ χαμηλότερη για H1650 (2,9 φορές) αποτέλεσμα συμβατή με την χρησιμοποίηση ενός διαφορετικού παρασκευάσματος τοξίνη.

Η περιορισμένη τοξική επίδραση του βραχείας αλύσου α-cobrotoxin θα μπορούσε να εξηγηθεί από την ανικανότητά της να συνδεθεί με την α7 υποδοχέα. Παραδόξως όμως, η α-cobratoxin ήταν αποτελεσματικό και σε α7 nAChR-αρνητικά κύτταρα υποδηλώνοντας ότι η τοξική δράση δεν διαμεσολαβείται από την πρόσδεση της τοξίνης με τον υποδοχέα α7.

Για να επιβεβαιωθεί και να επεκταθεί αυτή η παρατήρηση έχουμε διεξάγει μια δοκιμασία σχηματισμού αποικίας με το α7 nAChR + Α549 και με τις κυτταρικές γραμμές nAChR-NCI-H1975 α7. Δεδομένου ότι η IC50 δεν επιτεύχθηκε με α-cobrotoxin, χρησιμοποιήσαμε τις δύο υψηλότερες συγκεντρώσεις που δοκιμάστηκαν με ΜΤΤ (15 και 30 μΜ). Για α-cobratoxin χρησιμοποιήσαμε τις συγκεντρώσεις που αντιστοιχούν στο IC50 για Α549 και ΝΟΙ-H1975 (7. 5 και 3 μΜ, αντίστοιχα) και οι συγκεντρώσεις που αντιστοιχούν στο μισό και το διπλάσιο της IC50. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 3, η κλωνογονική δραστηριότητας των δύο κυτταρικών σειρών δεν επηρεάστηκε από τη θεραπεία και από την παρουσία του υποδοχέα α7 nach.

Οι κυτταρικές γραμμές Α549 (α7 AChR +) και ΝΟΙ-H1975 ( α7 AChR -) απλώθηκαν σε δίσκους Petri 35 χιλ ή σε πλάκες 24 φρεατίων σε πυκνότητες 150 (Α549) και 300 (NCI-H1975) κύτταρα /δίσκο και εκτέθηκαν είτε μακράς αλυσίδας α-νευροτοξίνη από

Naja Kaouthia

, σε συγκεντρώσεις 15 μΜ, 7.5 μΜ, 3.8 μΜ (Α549) και 6 μΜ, 3 μΜ, 1,5 μΜ (NCI-H1975), ή βραχείας αλυσίδας από το

Naja Atra

, σε συγκεντρώσεις 30 μΜ και 15 μΜ (και οι δύο κυτταρικές σειρές). Τα επεξεργασμένα κύτταρα μετά επωάστηκαν για 7-10 ημέρες, μέχρις ότου σχηματίστηκε ορατές αποικίες.

Η

Η ενεργοποίηση του αποπτωτικού καταρράκτη θεωρήθηκε η βασική επίδραση της πρόσδεσης της α-cobratoxin στο α7 nAChR [18 ], [20], [21], [22]. Λόγω των μεγάλων διαφορών μεταξύ των αποτελεσμάτων μας και αυτές οι οποίες έχουν δημοσιευθεί σχετικά με τη δοσολογία με την οποία θα μπορούσε να επιτευχθεί η IC50 και την απουσία εκλεκτική δράση των α-cobratoxin για α7 κύτταρα nAChR-θετικά, προσπαθήσαμε να καταλάβουμε εάν η ενεργοποίηση της απόπτωσης συμβαίνει πράγματι κατά την αγωγή με α-cobratoxin με Annexin V-ΡΙ χρώση κυτταρομετρίας ροής. Έχει αναφερθεί ότι η μέγιστη επαγωγή της απόπτωσης σε κύτταρα Α549 μπορεί να ληφθεί με κατεργασία με 1 μΜ τοξίνη για 24 ώρες [18]. Έχουμε επαναλήφθηκε το ίδιο πείραμα χρησιμοποιώντας την ίδια μεθοδολογία αλλά με συγκεντρώσεις τοξίνης (1, 10 και 50 μΜ) που επάγεται inibition ανάπτυξη κυμαίνονται από 5 έως 87% σε προσδιορισμούς ΜΤΤ.

Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4, ακόμα και σε η υψηλότερη συγκέντρωση πολύ λίγα κύτταρα (1-3%) παρουσίασαν αποδείξεις της απόπτωσης με νεκρωτικών κυττάρων είναι διαδεδομένη.

τα κύτταρα επωάστηκαν για 24 ώρες με 1, 10 και 50 μΜ α-cobratoxin και απόπτωση εκτιμήθηκε με Annexin χρώση V-ΡΙ και διαχωρισμό FACS. Απόπτωση σε μη επεξεργασμένα κύτταρα ήταν 0,63% και σε επεξεργασμένα κύτταρα ήταν στο εύρος 0,98 έως 2,32%.

Η

Συνολικά αυτά τα αποτελέσματα προτείνουν ότι ο θάνατος των κυττάρων που παρατηρείται in vitro είναι πιθανόν το αποτέλεσμα νέκρωση και όχι η ενεργοποίηση του αποπτωτικού μονοπατιού μετά την ειδική σύνδεση του α-cobratoxin να συνδέτη της.

In vivo

τοξικότητα του α-νευροτοξινών

Η οξεία τοξικότητα της αυξανόμενες δόσεις των τοξινών μετά iv χορήγηση (όπως στο Μ &? Μ) αξιολογήθηκε σε ποντίκια CD1 βάσει των κλινικών και συμπεριφορικών συμπτωμάτων. Οξέα συμπτώματα αναπτύσσονται μέσα σε 15 λεπτά μετά την ένεση και ως επί το πλείστον χαρακτηρίζεται από γενική δυσφορία και αναπνευστική δυσχέρεια που αποκαταστάθηκε με τις κανονικές συνθήκες εντός 60-180 λεπτά. Με βάση τον αριθμό των νεκρών ποντικών CD1, μετά από χορήγηση είτε α-cobrotoxin ή α-cobratoxin και πάνω από μια περίοδο παρατήρησης 14 ημερών, οι τιμές LD προσδιορίστηκαν και η MTD προσδιορίζονται ως 0.1 mg /kg για α-cobrotoxin και 0,2 mg /kg για α-cobratoxin όπως φαίνεται στον πίνακα 1.

η

Είναι σημαντικό ότι η LD50 για α-cobrotoxin προσδιορίζεται στη μελέτη μας (0,128 mg /kg) ήταν σε πολύ καλή συμφωνία με τα δεδομένα της βιβλιογραφίας (0,1 mg /kg: https://www.uniprot.org/uniprot/P60770). Η παρατηρούμενη LD50 για α-cobratoxin ήταν 0,35 mg /kg, μια τιμή της ίδιας τάξης μεγέθους των δεδομένων της βιβλιογραφίας (0,1 mg /kg? https://www.uniprot.org/uniprot/P01391).

Οι εκθέσεις σχετικά με την in vivo τοξικότητα των α-cobratoxin προκαλούν σύγχυση και στην πρόσφατη βιβλιογραφία έχουμε παρατηρήσει ότι η συγκέντρωση LD50 αναφερθεί σε τρεις διαφορετικές εκδόσεις από την ίδια ομάδα διαφέρει από 1000 φορές (0,15 mg /kg ή 0,15 μg /kg ) [18], [21], [22]. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται στην παρούσα μελέτη είναι ουσιαστικά σε συμφωνία με εκείνες των δύο εκ των προηγούμενων εκθέσεων [18], [21] και, το σημαντικότερο, καταδεικνύουν την βιολογική δραστικότητα

in vivo

παρασκευασμάτων τοξίνης μας.

το ήμισυ του MTD για κάθε τοξίνη (0.05 και 0.1 mg /kg, αντίστοιχα) στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν σε μία από τις δύο πρωτόκολλα θεραπείας έχουν σχεδιαστεί για την αξιολόγηση της δραστικότητας κατά του όγκου in vivo από αυτές τις τοξίνες.

η αντικαρκινική δραστηριότητα του α-νευροτοξινών

Για να αξιολογηθεί η δραστικότητα κατά του όγκου και των δύο τοξινών,

NOD /SCID ποντικοί

μεταμοσχεύεται ορθοτοπικά με 0.5 × 10

6 ανθρώπινα Α549-luc κύτταρα /σε όγκο 10 μΙ PBS στο δεξιό πνεύμονα. Ως υποκατάστατος δείκτης της ανάπτυξης του όγκου μετρήσαμε την εκπομπή φωτός του λουσιφεράσης-tagged Α549 κύτταρα? Το σύστημα αυτό μας επέτρεψε να ακολουθήσει κατά μήκος κάθε ζώο και για την παρακολούθηση της επίδρασης της θεραπείας.

Μετά την αξιολόγηση των εμφυτευμάτων του όγκου, με ανίχνευση IVIS, τα ποντίκια χωρίστηκαν τυχαία σε μία από τις ομάδες μελέτης και θεραπεία ξεκίνησε 7 ημέρες μετά την ορθοτοπική μεταμόσχευση σύμφωνα με τις δύο διαφορετικά πρωτόκολλα που περιγράφονται στο Σχήμα 5.

τα ποντίκια ενέθηκαν με 0.5 × 10

6 ανθρώπινα Α549-Luc κύτταρα. Την ημέρα 7, μετά τον προσδιορισμό IVIS, τα ζώα τυχαιοποιήθηκαν και υποβλήθηκαν σε θεραπεία. Για το πρόγραμμα 1, τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε αγωγή με 1/1000 της LD10, όπως αναφέρεται στο [20] τρεις φορές /εβδομάδα για τρεις εβδομάδες. Για το πρόγραμμά 2 τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε θεραπεία μία φορά την εβδομάδα με μια δόση που αντιστοιχεί σε ½ MTD (που καθορίζεται στην παρούσα μελέτη)

Η

Πρωτόκολλο 1:. 8 ζώα για να λάβουν ενδοφλεβίως 0,12 μg /kg τοξίνης (1/1000 της LD

10 αναφέρεται στο [20]), τρεις φορές την εβδομάδα για τρεις εβδομάδες σύμφωνα με ένα χρονοδιάγραμμα που έχουν αναφερθεί προηγουμένως [20] και 8 ζώα έλαβαν μόνον όχημα.

Το πρωτόκολλο 2: 8 ζώα υποβλήθηκαν σε θεραπεία iv μια φορά την εβδομάδα για τρεις εβδομάδες με 0,05 mg /kg α-cobrotoxin ή 0,1 mg /kg α-cobratoxin (που αντιστοιχεί στο μισό MTD). Για α-cobratoxin την ημίσεια MTD αντιστοιχεί σε 12,8 μΜ, μία συγκέντρωση που

in vitro

πρέπει να σκοτώσει μεταξύ 50 και 63% των κυττάρων Α549. Οκτώ ζώα ελέγχου έλαβαν μόνο όχημα.

Σε μια άλλη δημοσίευση [18], όπου χρησιμοποιήθηκε το χρονοδιάγραμμα του πρωτοκόλλου 1, η αναφερόμενη α-cobratoxin δόση ήταν 0,12 mg /kg. Βάσει των

in vivo

αποφασιστικότητά μας τοξικότητας που θεωρήσαμε Αυτή η δόση είναι πολύ υψηλή για να χορηγείται για τρεις συνεχόμενες μέρες σε ποντίκια με μειωμένη αναπνευστική λειτουργία.

Μετά από μια αρχική αξιολόγηση της ανάπτυξης του όγκου κατά την ημέρα 7, η αντικαρκινική δράση που προκαλείται από τοξίνες αξιολογήθηκε σε θεραπεία και χωρίς θεραπεία ποντικούς, τις ημέρες 14, 21 και 28 μετά τη χορήγηση και στις δύο πρωτόκολλα. Έχουμε παρατηρήσει ότι στα αρχικά στάδια της ανάπτυξης, η bioluminiscence των ζώων που αντιπροσωπεύεται από κοντά την έκταση της ανάπτυξης του όγκου. Αντίστροφα, σε μεταγενέστερα στάδια, νέκρωσης όγκου και μειωμένη αιμάτωση, πιθανόν μείωσε την εκπομπή φωτός σε ποντίκια ακόμη και όταν ο όγκος είχε εισβάλει εντελώς την θωρακική κοιλότητα και, στις περισσότερες περιπτώσεις, είχε επεκταθεί έξω από το θώρακα.

προ- επεξεργασία IVIS αξιολόγηση των 56 ποντίκια που περιλαμβάνονται στη μελέτη κατά την ημέρα 7 έδειξαν επιτυχή ανάπτυξη του όγκου σε όλα τα ζώα παρά ένα 300-πλάσια μεταβλητότητα (μέσος όρος εκπομπής φωτονίων: 5.5 × 10

7 /ποντίκι, εύρος 6,68 × 10

5 – 2,06 × 10

8). Ως εκ τούτου, για την ανάλυση των δεδομένων, θεωρήσαμε την πολλαπλή μεταβολή του εκπομπής μεταξύ ζώων υπό θεραπεία και χωρίς θεραπεία σε κάθε χρονικό σημείο θεραπείας (14, 21 και 28 ημέρες) και όχι στις απόλυτες τιμές εκπομπής φωτονίων [18].

στο Σχήμα 6, αναφέρουμε τις πρώτες αποφασιστικότητα IVIS σε κάθε ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με α-cobrotoxin σύμφωνα με το χρονοδιάγραμμα 1 και στην αντίστοιχη ομάδα ελέγχου. Όπως φαίνεται, αυτή η θεραπεία δεν φαίνεται να έχει σημαντική επίδραση στην ανάπτυξη του όγκου σε αυτό το ζωικό μοντέλο του συστήματος. Η μόνη εμφανής διαφορά εντυπωσιακό ήταν ο αριθμός των νεκρών ζώων κατά το τέλος της περιόδου παρατήρησης (4 στην ομάδα ελέγχου και 2 στην ομάδα θεραπείας). Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι αυτή τη στιγμή όλα τα ζώα έπρεπε να θυσιαστεί για ηθικούς λόγους και ότι η αυτοψία αποκάλυψε ότι ο όγκος είχε επεκταθεί εκτός της θωρακικής κοιλότητας σε όλα τα επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα ποντίκια. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 7 επίσης στις υψηλότερες δόσεις που χρησιμοποιούνται στο σχέδιο θεραπείας χρονοδιάγραμμα 2, η επίδραση των α-cobrotoxin ως αντικαρκινικά παράγων ήταν αμελητέα, αν υπάρχουν. Όσο για το σχέδιο θεραπείας χρονοδιάγραμμα 1, και αυτά τα ζώα θανατώθηκαν την ημέρα 28 λόγω συμπτωμάτων που σχετίζονται με την ανάπτυξη του όγκου. Πράγματι, κατά την αυτοψία σε όλα τα ζώα παρουσίασε μια εντελώς εισέβαλε θωρακική κοιλότητα με όγκους που εκτείνονται έξω από το στήθος, ανεξαρτήτως του συστήματος επεξεργασίας.

Χ σημαίνει τα νεκρά ζώα.

Η

Χ σημαίνει τα νεκρά ζώα.

η

στο σχήμα 8 αναφέρεται η μέση πολλαπλή μεταβολή των εκπομπών στα σκέλη θεραπείας και ελέγχου για το πρόγραμμα 1 (Πίνακας Α) και το πρόγραμμα 2 (Πίνακας Β). Αν και η διαφορά, αξιολογήθηκε από τη δοκιμασία Mann-Withney, δεν έφθασε στατιστική σημασία (εκτός από το πρόγραμμα 1, ημέρα 14, ρ = 0,04), παρατηρήσαμε μια εντυπωσιακή υψηλότερη εκπομπή στην ομάδα θεραπείας τοξίνη σε σχέση με τον βραχίονα ελέγχου. Αυτή η επίδραση ήταν εμφανής δραματικά στο πρόγραμμα 2 την ημέρα 28, αν και η διαφορά στην εκπομπή φωτονίων δεν ήταν στατιστικά σημαντική, πιθανόν λόγω του περιορισμένου αριθμού των ζώων,

Πίνακας Α: ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με α- cobrotoxin σύμφωνα με το χρονοδιάγραμμα 1. Πίνακας Β: ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με α-cobrotoxin σύμφωνα με το πρόγραμμα 2. Πίνακας C: ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με α-cobratoxin σύμφωνα με τα προγράμματα 1 και 2.

Η

Η ίδια προγράμματα θεραπείας ήταν χρησιμοποιείται επίσης με το α-cobratoxin. Τα αποτελέσματα αυτής της σειράς πειραμάτων έδειξαν ότι αυτή η τοξίνη δεν έχει εμφανές αντικαρκινική δραστηριότητα, καθώς και. Στο Σχήμα 9, αναφέρουμε την πρώτη προσδιορισμό IVIS για κάθε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με α-cobratoxin σύμφωνα με τα προγράμματα 1 και 2, ενώ στο Σχήμα 8, πάνελ C, δείχνουμε τη μέση πολλαπλή μεταβολή εκπομπής στον έλεγχο και αγωγή ποντικούς. Όπως μπορεί να φανεί, η θεραπεία δεν επηρεάζουν αισθητά την ανάπτυξη του όγκου ως εκπομπές φωτονίων σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή ήταν συγκρίσιμη με εκείνη των μαρτύρων σε κάθε χρονικό σημείο. Ο αριθμός των ζώων που έπρεπε να θυσιαστεί για ανθρωπιστικούς λόγους πριν από τη λήξη της περιόδου παρατήρησης ήταν υψηλότερη σε έλεγχο σε σύγκριση με ποντίκια που έλαβαν θεραπεία. Ωστόσο, πρέπει να επισημανθεί ότι και σε αυτή την περίπτωση όλα τα ζώα, την ημέρα 28, παρουσίασε τεράστια αύξηση του όγκου που εκτείνεται έξω από την θωρακική κοιλότητα ανεξάρτητα από το σχέδιο θεραπείας.

Χ σημαίνει τα νεκρά ζώα.

Οι

in vivo

πειράματα διεξήχθησαν μόνο με την Α549-Luc κυτταρική γραμμή από την αξιοποίηση των μη-Luc σεσημασμένων κυττάρων θα απαιτούσε ένα μεγάλο αριθμό ποντικών για την αξιολόγηση της αντικαρκινικής δραστηριότητας της τοξίνες. Κατά την άποψη των αποτελεσμάτων που επιτυγχάνονται

in vitro

στις 5 κυτταρικές σειρές και

in vivo

με Α549-Luc θεωρούσαμε ανήθικο να προηγείται με πρόσθετες μελέτες σε ζώα

Η μοριακή βάση της καρκίνο του πνεύμονα έχουν μελετηθεί εκτενώς και η αλληλεπίδραση μεταξύ της νικοτίνης και nAChRs έχει αναγνωριστεί ως ένα από τα βασικά γεγονότα που οδηγούν στην ανάπτυξη αυτού του όγκου [2], [4], [5], [6], [7], [ ,,,0],8], [9], [10], [11], [16], [26]. Επομένως, δεν είναι εκπληκτικό ότι nAChRs θεωρήθηκαν ως καλός υποψήφιος στόχοι για καινοτόμο «βιολογική» θεραπείες [15], [22], [23], [24]. Σε αυτό το πλαίσιο, η ύπαρξη ισχυρών τοξινών αναστολή των υποδοχέων nach μπορεί να ανοίξει τη δυνατότητα προσαρμογής «μαγική σφαίρα» έννοια του Paul Ehrlich στη θεραπεία του καρκίνου του πνεύμονα [34].

Το δηλητήριο κόμπρας φίδι είναι μια πηγή των διαφόρων τοξινών διαθέτουν κυτταρολυτική και nAChR αναστολή δραστηριοτήτων [32], [35]. Λόγω αυτής της τελευταίας δραστηριότητας, το α-cobratoxin από

N. kaouthia

έχει προταθεί ως ένα καινοτόμο φυσικό θεραπευτικό παράγοντα για τον καρκίνο του πνεύμονα [18], [19], [20], [22], [24] σε θέση να αναστέλλουν την ανάπτυξη των πνευμόνων δραματικά καρκινικά κύτταρα και να βελτιώσει σημαντικά την επιβίωση των πνεύμονα που φέρουν όγκους ποντικούς. Έχουμε επανεκτιμηθεί τα αντικαρκινικά δραστηριότητες των δύο διαφορετικών νευροτοξίνες κόμπρα

in vitro

και

in vivo

χρησιμοποιώντας δύο πίνακες της διοίκησης και τις ίδιες πειραματικές συνθήκες των προηγούμενων εκθέσεων. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων μας δείχνουν σαφώς ότι αυτοί οι δύο βιολογικώς δραστικές τοξίνες έχουν ουσιαστικά καμία επίδραση επί της ανάπτυξης των κυττάρων του όγκου σε

in vitro δοκιμασίες

σε συγκέντρωση που αναφέρθηκαν σε άλλες δημοσιεύσεις. Μία σημαντική αναστολή της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων ελήφθη σε συγκέντρωση α-cobratoxin πολύ υψηλή για να χρησιμοποιηθούν

in vivo

. Σημαντικά α-νευροτοξίνες, σε συγκεντρώσεις που μπορούν να χρησιμοποιηθούν

in vivo

, δεν ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου ούτε ήταν ικανά να παρατείνουν σημαντικά την επιβίωση σε ποντικούς που φέρουν ένα ορθοτοπικά εμφυτευμένες NSCLC. Πράγματι, η

in vivo πειράματα

έπρεπε να διακοπεί κατά την ημέρα 28, ή και νωρίτερα, σε επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα πειραματόζωα για ηθικούς λόγους δεδομένου ότι σε όλες τις περιπτώσεις η μπολιασμένα όγκος είχε επεκταθεί έξω από το θώρακα. Αυτά τα αποτελέσματα είναι σε πλήρη αντίθεση με αυτά των άλλων μελετών που ανέφεραν αυξημένη διάρκεια ζωής του 93% σε α-cobratoxin αγωγή έναντι ποντικών χωρίς θεραπεία [20] και υποδηλώνουν ότι κόμπρα α-νευροτοξίνες έχουν καμία πιθανή θεραπευτική επίδραση στον καρκίνο του πνεύμονα.

Απομένει να εξηγήσει γιατί σε μια έκθεση που δημοσιεύθηκε από την ίδια ομάδα, όλα τα ζώα έπρεπε να θανατωθούν για ανθρωπιστικούς λόγους κατά την ημέρα 29 [18], ενώ σε μια άλλη μελέτη, τα ζώα, παρόμοια επεξεργασία, θα μπορούσε να ακολουθηθεί μέχρι την ημέρα 170 [20 ], (που επισκοπείται στο [22]).

Απροσδόκητα έχουμε παρατηρήσει ότι η

in vivo

ανάπτυξη του όγκου στα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με α-cobrotoxin ήταν υψηλότερη από εκείνη των ομάδων ελέγχου. Το απροσδόκητο αυτό εύρημα θα μπορούσε να υποδηλώνει ότι παρόλο που αυτή η τοξίνη δεν δεσμεύεται με τον υποδοχέα α7, η αναφερόμενη κυρίαρχο υποτύπου παρόντες σε κύτταρα Α549, θα μπορούσε να ενεργοποιήσει την νικοτίνη που εξαρτάται από ογκογόνο οδό μέσω σύνδεσης της σε διαφορετικές nAChR (πιθανότατα στον υποδοχέα μυϊκού τύπου) . Έτσι, αυτή η τοξίνη μπορεί να είναι ένα εξαιρετικό εργαλείο για την τέλεια ανατομία τις βιολογικές οδούς όπου εμπλέκονται οι nAChRs

Υλικά και Μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Όλες οι λεπτομέρειες σχετικά με:. Δικαιώματα , οι κανονισμοί και την καλή διαβίωση των ζώων που αναφέρονται στην ενότητα «Ζώα» υπο-ενότητα του παρόντος τμήματος Μέθοδοι

όγκου κυτταρικές σειρές και παρασκευάσματα α-νευροτοξίνη

Ο αρουραίος PC12 φαιοχρωμοκύττωμα κυτταρική σειρά, που χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας για α7 nAChR έκφραση, οι ανθρώπινο αδενοκαρκίνωμα κυτταρικές σειρές NSCLC H1650 και H1975 ελήφθησαν από την ATCC? η NSCLC αδενοκαρκινώματος Α549 και οι πλακωδών κυττάρων καρκινώματος γραμμές SK-MES 1 και CALU 1, ελήφθησαν από Θεσμικών κυττάρων μας Repository (ICLC, www.iclc.it). Η κυτταρική σειρά Α549-Ιυο, τροποποιημένα ώστε να εκφράζουν σταθερά λουσιφεράση, και χρησιμοποιούνται για

in vivo μελέτες

ευγενώς από το Δρ J.W. Shay (H. Simmons Comprehensive Cancer Center του Πανεπιστημίου του Τέξας, Ντάλας). Το Α549, Α549-Ιυο, SK-MES 1 και H1650 χρησιμοποιηθούν στην παρούσα μελέτη είχαν την ίδια προέλευση εκείνων που χρησιμοποιούνται σε άλλες δημοσιευμένες εργασίες [18], [19], [20], [27]. Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε RPMI 1640 με 10% βόειο ορό. (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Ιταλία).

Η μικρής αλυσίδας α-cobrotoxin από

Ν. ATRA

(ΜΒ 6949 kDa) ελήφθη από την Sigma (Μιλάνο, Ιταλία). Η LD50 στα ποντίκια της παρτίδας που χρησιμοποιείται σε αυτό το έργο, που καθορίζεται από την Εταιρεία, ήταν 0,09 mg /kg.

Η μακράς αλυσίδας α-cobratoxin (MW 7821 kDa) καθαρίστηκε από το

Ν. kaouthia

δηλητήριο όπως περιγράφεται [36]. Η διαδικασία αυτή περιλαμβάνει: διήθηση πηκτής, υψηλής απόδοσης ανταλλαγής ιόντων και χρωματογραφία αντίστροφης φάσης και χρησιμοποιείται για την παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων της τοξίνης για τις μελέτες του υποδοχέα [37]. Η α-cobratoxin παρασκευάζονται με τη μέθοδο αυτή είναι πλήρως ενεργός και ανέστειλε ακετυλοχολίνη επαγόμενα ρεύματα σε

Xenopus ωοκύτταρα

εκφράζουν ανθρώπινο α7 νικοτινικού υποδοχέα της ακετυλοχολίνης με IC

50 από 4,1 ηΜ [38]. Η βιολογική δραστικότητα της παρτίδας της τοξίνης που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη δοκιμάστηκε για ικανότητα να αναστέλλουν ραδιενεργό σύνδεση με ανθρώπινο α7 νικοτινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης εκφράζεται ετερόλογα σε κύτταρα GH4C1 α-μπουγκαροτοξίνη. Στα 20 ηΜ α-cobratoxin ανέστειλε α-βουγγαροτοξίνης κατά περισσότερο από 50%.

Τα λυοφιλοποιημένα τοξίνες διαλύθηκαν σε συγκέντρωση αποθέματος 10

-3 Μ σε αλατόνερο ρυθμισμένο με φωσφορικό (PBS) και διατηρήθηκε στους -20 ° C.

Western ανάλυση κηλίδος

εναιωρήματα κυττάρων ελήφθησαν μετά από θρυψινοποίηση της Α549 ή Α549-Luc και πολιτισμούς PC12 (που χρησιμοποιείται ως θετικός μάρτυρας). Τα κύτταρα διαλύθηκαν σε ρυθμιστικό διάλυμα λύσης και υποβάλλονται σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [39]. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης των κυτταρολυμάτων προσδιορίστηκε με την Protein Bio-Rad Δοκιμασία (Bio-Rad Laboratories, Segrate, Ιταλία) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Πενήντα μα συνολικών πρωτεϊνών διαχωρίστηκαν σε NuPAGE 4-12% δις-Τρις γέλης (Invitrogen, San Giuliano Milanese, Ιταλία) και στη συνέχεια μεταφέρθηκε σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης με iBlot ™ gel Μεταφορά στοίβες (Invitrogen).

τα στυπώματα ανιχνεύθηκαν με το αντίσωμα αντι α7 AChR πολυκλωνικό αντίσωμα (Santa Cruz, Χαϊδελβέργη, Γερμανία) και στη συνέχεια με αντι-ßActin μονοκλωνικό αντίσωμα (Sigma, Μιλάνο, Ιταλία) για να διαπιστωθεί ότι μια ίση ποσότητα πρωτεΐνης φορτώθηκε σε κάθε λωρίδα.

Ανοσοσήμανση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση της ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (ECL) κιτ (GE Healthcare, Μιλάνο, Ιταλία) ακολουθώντας τις διαδικασίες που συνιστά ο προμηθευτής.

RT και qPCR ανάλυση

το συνολικό RNA από Α549-Luc (ακατέργαστο και κατεργασμένο με 1, 3 και 9 ηΜ α- cobratoxin ή α-cobrotoxin για 72 ώρες), Α549 (μη επεξεργασμένων και επεξεργασμένων με 1, 3 και 9 ηΜ α-cobratoxin), H1650, H1975, SK-MES 1, CALU 1 και κυτταρικές PC12 γραμμές απομονώθηκε χρησιμοποιώντας το RNAeasy Mini Kit (Qiagen) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με RNAse DNAse απαλλαγμένη κατά τον καθαρισμό στη στήλη. ακεραιότητα του RNA εκτιμήθηκε με ηλεκτροφόρηση πηκτής: αναλογία των 28S για 18S ήταν περίπου 2:01. RNA ποσοτικοποιήθηκε με φασματοφωτομετρία. Η αναλογία των μετρήσεων στα 260 nm και 280 nm περιλαμβάνεται μεταξύ 1,9 και 2,1.

Ένα μg ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για την παρασκευή cDNA με τη SuperScript ™ II RNase Η- Reverse μεταγραφάσης (Invitrogen) σύμφωνα με την τις οδηγίες του κατασκευαστή.

για να προσδιοριστεί η παρουσία α7 nAChR σε κυτταρικές σειρές, cDNA χρησιμοποιήθηκαν σε μία ημιποσοτική αντίδρασης όπως περιγράφεται αλλού [40], [41], [42].

συνθήκες PCR ήταν:. 95 ° C για 10 λεπτά, 45 κύκλους 95 ° C για 15 sec, 55 ° C για 15 δευτερόλεπτα και 72 ° C για 30 sec)

qPCR αντιδράσεις διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας Maxima SYBR Green qPCR Master Mix .