Αφηρημένο

εισβολή και την επακόλουθη μετάσταση είναι η κύρια αιτία θανάτου από τις περισσότερες μορφές καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του προστάτη. Εδώ έχουμε υποβάλει έκθεση σχετικά με τις πιθανές ιδιότητες καταστολής όγκου των Rab7, μια ΘΤΡάση που ρυθμίζει την εμπορία των λυσοσώματα. Η κίνηση των λυσοσωμάτων στην κυτταρική επιφάνεια σε απόκριση σε περιβαλλοντικές νύξεις αυξάνει την έκκριση πρωτεϊνασών και κυτταρικής εισβολής. Έχουμε προσδιορίσει ότι τρογλιταζόνη και άλλα μέλη της οικογένειας θειαζολιδινοδιόνης αναστέλλουν κυτταρική επιφάνεια διακίνησης κατευθυνόμενη λυσόσωμα και έκκριση καθεψίνης Β μέσω ενός Rab7-εξαρτώμενο μηχανισμό. Επιπλέον, Rab7 shRNA κύτταρα που εκφράζουν βρέθηκαν να είναι πιο επεμβατικές

in vitro

και

in vivo

. Αυξημένη διεισδυτικότητα συνοδεύτηκε από αυξημένη έκφραση του υποδοχέα c-Met και παρατεταμένη κατάντη σηματοδότησης, στηρίζοντας έτσι έναν ρόλο για Rab7 ως μεσολαβητής της σηματοδότησης ρύθμισης προς τα κάτω. Στο σύνολό τους, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι Rab7 δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της ανάπτυξης του όγκου του προστάτη και την εισβολή, παρέχοντας περαιτέρω ενδείξεις για τις δυνατότητές της ως καταστολέας των όγκων

Παράθεση:. Steffan JJ, αναχώματα SS, Coleman DT, Adams LK , Rogers D, Carroll JL, et al. (2014) Στήριξη Ένας ρόλος για την ΘΤΡάση Rab7 στον καρκίνο του προστάτη Εξέλιξη. PLoS ONE 9 (2): e87882. doi: 10.1371 /journal.pone.0087882

Συντάκτης: Μινγκ Tat Λινγκ, Queensland University of Technology, Αυστραλία

Ελήφθη: 18 Αυγούστου, 2013? Αποδεκτές: 5, Ιανουαρίου 2014? Δημοσιεύθηκε: 5 Φεβρουαρίου, 2014

Copyright: © 2014 Steffan et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα χρηματοδοτήθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας χορηγούν ΝΙΗ R01 CA104242. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν τις ακόλουθες συγκρούσεις: BJW σήμερα απασχολούνται από Astellas Pharma ΗΠΑ, Inc α. η εταιρεία με συμφέροντα στη θεραπευτική ογκολογία? Ωστόσο, αυτή η απασχόληση συνέβη μετά την ολοκλήρωση του χειρογράφου και την περιοχή της εταιρείας του ενδιαφέροντος δεν αποτελεί άμεση ανταγωνιστική συμφέρον. Όλοι οι άλλοι συντάκτες έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις πολιτικές PLoS ONE σχετικά με την κοινοχρησία δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

Σχηματισμός των μεταστατικών εστιών από μια επεμβατική πρωτοπαθούς όγκου είναι το κεντρικό γεγονός στην κορυφαία διαδικασία να σχετίζονται με τον καρκίνο θανάτους. Τα ποσοστά θνησιμότητας για τον καρκίνο του προστάτη τελικού σταδίου (μεταστατική νόσος) δεν έχουν βελτιωθεί σημαντικά κατά την τελευταία δεκαετία? Ως εκ τούτου, μια κατανόηση των μηχανισμών που διέπουν εισβολή και μετάσταση όγκου, και την ανάπτυξη θεραπειών για την πρόληψη της εξέλιξης του όγκου χρειάζονται επειγόντως. Ο αυξητικός παράγοντας ηπατοκυττάρων (HGF) -Met άξονα σηματοδότησης είναι ένας σημαντικός ρυθμιστής της εισβολής καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση [1]. Που επάγεται με συνδέτη c-Met σηματοδότηση είναι γνωστό ότι επάγει επιθηλιακή-μεσεγχυματικά μετάβαση (ΕΜΤ), στην οποία τα επιθηλιακά κύτταρα χάνουν συμφύσεων μεταξύ κυττάρων και να αναλάβει ένα πιο κινητικό, μεσεγχυματικά φαινότυπο [2]. Η επαγωγή της EMT θεωρείται για να ενισχύσει τη μετανάστευση καρκινικών κυττάρων και εισβολή μέσω των βασικών μεμβρανών. Εκτός από την Met σηματοδότηση, άλλοι παράγοντες εντός μικροπεριβάλλον του όγκου όπως η υποξία, η αερόβια γλυκόλυση, όξινη και εξωκυτταρικό ρΗ (Phe) μπορούν να αυξήσουν την εισβολή των καρκινικών κυττάρων [3], [4].

Tumor εισβολή συχνά απαιτεί η έκκριση πρωτεολυτικών ενζύμων, αν και ορισμένες μορφές κυτταρικών μετανάστευση /την εισβολή είναι πρωτεάση ΑΝΕΞΑΡΤΗΤΩΝ [5], [6]. Αν και η έκκριση πρωτεϊνάση μπορεί να συμβεί μέσω της ιδιοσυστατικά ενεργού οδού έκκρισης, έχουν σημαντικούς ρόλους για λυσόσωμα-εντοπισμένη πρωτεάσες καταδειχθεί σε κύτταρο όγκου εισβολή [7], [8]. Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι όξινα Phe και HGF επάγει την διακίνηση των λυσοσωμάτων στην κυτταρική επιφάνεια, οδηγώντας σε αυξημένη έκκριση καθεψίνη Β [9], [10]. Αυτό είναι σημαντικό καθώς μεταβάλλεται καθεψίνης Β και D εντοπισμός ανιχνεύεται σε μοντέλα του μαστού και μελάνωμα σε απόκριση προς μετασχηματισμό Ras ή αλλαγές στις pHe [11], [12]. Σε προηγούμενες δημοσιεύσεις, έχουμε καταδείξει ότι η χωρική θέση των λυσοσωμάτων σε καρκινικά κύτταρα είναι σημαντική για την κυτταρική εισβολή [10], [13]. Όταν τα λυσοσώματα τοποθετούνται πιο κοντά στην επιφάνεια των κυττάρων, την αύξηση των εκκρινομένων πρωτεασών και των κυττάρων εισβολής ανιχνεύεται? λαμβάνοντας υπόψη ότι, όταν τα λυσοσώματα που βρίσκεται πιο κοντά στον πυρήνα του κυττάρου. (μακριά από την κυτταρική επιφάνεια? δηλαδή αντιπαρατίθεται στον πυρήνα του κυττάρου) καρκινικά κύτταρα εκκρίνουν λιγότερα πρωτεϊνάσες και είναι σημαντικά λιγότερο επεμβατικές

Τα λυσοσώματα διακινούνται σε όλη κύτταρα μαζί μικροσωληνίσκους και /ή νημάτια ακτίνης χρησιμοποιώντας μοριακές πρωτεΐνες μοτέρ όπως δυνεΐνες, κινεσίνες, και /ή μέλη της οικογένειας μυοσίνης [14]. Επιπλέον, αρκετές GTPases όπως RhoA, Rab7, Rab27 και ΑΠΦ μέλη της οικογένειας ρυθμίζουν τη δραστηριότητα της πρωτεΐνης κινητήρα ή την πρόσληψη, ρυθμίζοντας έτσι την κατανομή των λυσοσώματα και άλλα ενδοκυτταρικά κυστίδια [15], [16].

Rab7 είναι ένας ρυθμιστής της ενδοκυτταρικής ενδοκυτταρικής διακίνησης /μεμβράνης και εμπλέκεται σε πολλές παθολογικές καταστάσεις συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου και αρκετών μολυσματικών ασθενειών (που επισκοπείται στο [17]). Rab7, με έναν από τους δράστες της, RILP (Rab7-αλληλεπιδρούν λυσοσωμικής πρωτεΐνης), προσλαμβάνει το συγκρότημα κινητήρα δυνεΐνης-dynactin σε λυσοσώματα διευκόλυνση της διακίνησης λυσοσώματα κατά μήκος των μικροσωληνίσκων προς τον πυρήνα του κυττάρου [18]. Επιπλέον, εκτός από αναγνωρισμένο ρόλο του στη διακίνηση κυστιδίων, Rab7 έχει συγκεντρώσει προσφάτως την προσοχή ως ρυθμιστής της απόπτωσης σε απόκριση προς απόσυρση αυξητικού παράγοντα [19] και έχει προταθεί για να λειτουργήσει ως μια πρωτεΐνη καταστολής όγκου [20].

οι αναστολείς των εναλλακτών νατρίου-πρωτονίου (ΝΗΕ) έχουν δειχθεί ότι είναι πολύ αποτελεσματικό στην πρόληψη της κυτταρικής επιφάνειας διακίνησης κατευθυνόμενη λυσόσωμα, μειώνοντας έτσι την έκκριση πρωτεάσης και κυτταρική διείσδυση [9], [10], [13]. EIPA (5 – (

Ν

-αιθυλ-

Ν

-ισοπροπυλό) -amiloride) έχει αποδειχθεί για την πρόληψη όξινο Phe και HGF που προκαλείται κυτταρική επιφάνεια-σκηνοθεσία λυσόσωμα εμπορίας? ότι, τα μέλη της θειαζολιδινοδιόνης οικογένεια των ενώσεων έχουν δειχθεί να αποφευχθεί όξινο Phe-επαγόμενη κυτταρική επιφάνεια κατευθυνόμενη λυσόσωμα διακίνησης. προηγούμενη εργασία μας καθορίζεται το ενώσεων τρογλιταζόνης και EIPA δύο χρησιμοποιούν ένα Rab7-εξαρτώμενο μηχανισμό για να προκαλέσει juxtanuclear λυσόσωμα συνάθροιση (JLA) [13]. Τρογλιταζόνη είναι ένα από διάφορα μέλη της οικογένειας θειαζολιδινοδιόνης (ΤΖϋ) από συνθετικές συνδέτες υψηλής συγγένειας για τη μεταγραφή παράγοντας ενεργοποιείται από πολλαπλασιαστή περοξυσώματος υποδοχέα γ (ΡΡΑΚ-γ γ). Ωστόσο, αυτές οι ενώσεις, συμπεριλαμβανομένων σιγλιταζόνη (Cig), ροσιγλιταζόνη (Rosi? Avandia) και πιογλιταζόνη (Pio? Actos), εμφανίζουν ΡΡΑΚ-γ γ ανεξάρτητες επιδράσεις, και εργαστήριο μας κατέδειξε την ισχυρή επίδραση της τρογλιταζόνης σε όξινα Phe-επαγόμενη διανομή λυσόσωμα να είναι ανεξάρτητη από ΡΡΑΚ γ, αλλά απαιτούν Rab7 (ΤΖϋδ αναθεωρούνται στο [21]). Στην πραγματικότητα, αποδείχθηκε πρόσφατα ότι λυσοσώματα κίνηση στην επιφάνεια του κυττάρου σε κύτταρα που εκφράζουν Rab7 shRNA (ανεξάρτητη από εξωτερικό ερέθισμα) υποδηλώνοντας ότι Rab7 είναι ένας αρνητικός ρυθμιστής της κυτταρικής επιφανείας κατευθυνόμενης λυσόσωμα διακίνηση [10]. Επιπλέον, Rab7 shRNA κύτταρα που εκφράζουν παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα εκκρίνονται πρωτεάσες και ήταν πιο επεμβατική

in vitro

[10], [13].

Εδώ, σας παρουσιάζουμε μερικές γραμμές στοιχεία που να αποδεικνύουν ότι Rab7 μπορεί να παίζει ένα κατασταλτικό ρόλο στην ανάπτυξη και εξέλιξη του όγκου, γεγονός που υποδηλώνει την πρώτη εν λόγω Rab7 είναι μια υποθετική ογκοκατασταλτικό

in vivo

. Τρογλιταζόνη απαιτείται Rab7 να αποτρέψει τον επαγόμενο από HGF έκκριση πρωτεάσης και εισβολής καρκινικών κυττάρων

in vitro.

Επιπλέον, Rab7 shRNA κύτταρα που εκφράζουν σχηματίζεται μεγαλύτερους όγκους

in vivo

, που επέδειξε αυξημένο πολλαπλασιασμό, μειωμένη απόπτωση, και την αύξηση της εισβολής ικανότητα σε περιβάλλοντες ιστούς. Τέλος, shRNA μεσολάβηση μείωση του Rab7 οδήγησε σε αύξηση των c-Met

in vitro

και

in vivo κατασκευαστής παρέχουν ένα πιθανό μηχανισμό που αντισταθμίζει τις αλλαγές αυτές.

Υλικά και μέθοδοι

Δήλωση Ηθικής

Δεν ανθρώπινων ιστών χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη. Όλα τα ζώα που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη έλαβαν ανθρώπινη φροντίδα με βάση τις κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζονται από την αμερικανική Κτηνιατρική Ιατρική Ένωση (AVMA), καθώς και σύμφωνα με τον Οδηγό για τη Φροντίδα και Χρήση των Ζώων Εργαστηρίου (Ινστιτούτο Ερευνητικό Εργαστήριο Ζώων, Washington, DC ). Όλα τα πρωτόκολλα που αφορούν τα ζώντα ζώα ελέγχονται και εγκρίνονται από την Επιτροπή Θεσμικών Ζωικά Φροντίδα και Χρήση των LSU Κέντρο Επιστημών Υγείας-Shreveport. Αυτό το σύνολο των πειραμάτων που διεξάγονται στο πλαίσιο του εγκεκριμένου πρωτοκόλλου P-07-059. Όλα έγιναν προσπάθειες για την ελαχιστοποίηση της ταλαιπωρίας των ζώων, να μειωθεί ο αριθμός των ζώων που χρησιμοποιούνται, και να χρησιμοποιούν εναλλακτικές λύσεις για την in vivo τεχνικές, εάν είναι διαθέσιμη.

Cell Culture

Ο καρκίνος του προστάτη ανθρώπινη κυτταρική σειρά DU -145 αγοράστηκε από το ATCC και διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 (Mediatech), με 10% FBS (Gemini Bio-Products) και 1% Πενικιλλίνη-Στρεπτομυκίνη (Mediatech). Τα κύτταρα διατηρήθηκαν σε έναν επωαστή 37 ° C με 5% CO

2 και υπο-καλλιεργήθηκαν κατά την επίτευξη & gt?. 75% συρροή

Αντιδραστήρια και αντισώματα

φαλλοειδίνη, 1:100 αγοράστηκε από την Molecular Probes. α-τουμπουλίνης αντίσωμα, 1:1000, αγοράστηκε από Lab Vision. LAMP-1 αντίσωμα (H4A3), 1:50, αγοράστηκε από την Αναπτυξιακών Μελετών Hybridoma Bank στο Πανεπιστήμιο της Αϊόβα, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής. Τα ακόλουθα αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν για τη Δυτική bloting: pMet, pAkt, pErk1 /2, (1:1000), που διασπάται-κασπάσης-3 (1-200) (Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ, USA), Rab7 (1:1000 ) (Sigma, St Louis, ΜΟ, USA), c-Met (δείγματα ιστού 1:500) (Abcam, Cambridge, MA, USA), c-Met (1:1000) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), Ki67 (1:50) (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με φθορισμοφόρο (1:100) αγοράστηκαν από Jackson Immunoresearch Laboratories (Westrgrove, ΡΑ, USA). IHC δευτερογενή αντισώματα (1:200) αγοράστηκαν από την Vector Labs (Burlingame, CA, USA). HGF (Calbiochem, San Diego, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε σε 33 ng /ml.

Εκχύλιση πρωτεΐνης από κατεψυγμένα δείγματα όγκου

Τα κατεψυγμένα δείγματα όγκου αραιώθηκαν πρώτα σε παγωμένο ρυθμιστικό διάλυμα ΚΙΡΑ που περιέχει Roche κοκτέιλ αναστολέων πρωτεάσης (Indianapolis, ΙΝ, USA), NaF, και NaVO4 σε 1:05 αναλογία, μάζα προς όγκο. Τα δείγματα με το χέρι ομογενοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας ένα γουδί και γουδοχέρι ακολουθούμενη από σύντομη κατεργασία με υπερήχους, και τοποθετήθηκε σε πάγο για 20 λεπτά με περιοδική ανάδευση. Τα δείγματα στην συνέχεια φυγοκεντρήθηκαν στα 12.000 g για 10 λεπτά για να απομακρυνθούν τα αδιάλυτα υπολείμματα. Οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης προσδιορίσθηκαν με δοκιμασία BCA και ίση ποσότητα πρωτεΐνης αραιώθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα Laemmli και έβρασαν για 10 λεπτά.

Καθεψίνη Δοκιμασία Β Έκκριση

Δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9], [10] . HGF προστέθηκε στις καλλιέργειες για 18 ώρες σε 33 ng /ml.

ανοσοφθορισμού (Ι.Ρ.) Χρώση και Μικροσκοπία

ενδιάμεση συχνότητα. μικροσκοπία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [9], [10]. Εν συντομία, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν με παγωμένο 4% PFA για 20 λεπτά. Τα κύτταρα μετά πλύθηκαν σε PBS, στη συνέχεια επωάστηκαν με αντι-LAMP-1 (H4A3-s Iowa State University Hybridoma Bank) σε αραίωση 1:100 σε BSP για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και επωάστηκαν με 594 Dylight αντι ποντικού (Jackson IR) σε αραίωση 1:100 σε BSP για μία ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Φαλλοειδίνη στη συνέχεια χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση του κυτταροσκελετού της ακτίνης (φαλλοειδίνη 488, Molecular Probes) και επωάστηκε για 20 λεπτά στους 1:200 σε BSP σε θερμοκρασία δωματίου. Διαφάνειες τοποθετήθηκαν με DAPI περιέχει SlowFade χρυσό αντιδραστήριο (Invitrogen S36938). Τα κύτταρα απεικονίστηκαν χρησιμοποιώντας ένα Olympus ΒΧ-50 μικροσκόπιο χρησιμοποιώντας το λογισμικό MetaMorph. Εικόνες συγχωνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ImageJ.

Διανομή λυσοσώματα Ανάλυση

διανομή

λυσοσώματα από τον πυρήνα μετρήθηκε με τη χρήση του λογισμικού LysoTracker, μια γενναιόδωρη δωρεά από Meiyappan Solaiyappan (Johns Hopkins). Ένα σύνολο 25 κυττάρων που εκτείνονται από τρία ανεξάρτητα πειράματα αναλύθηκαν για κάθε σύνολο δεδομένων.

Ανάλυση Western Blot

ανάλυση κηλίδος Western έγινε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [9].

λεντοϊού Παράδοση Short-φουρκέτα RNA

Σύντομη RNAs φουρκέτα (shRNA) κατευθύνεται προς Rab7 (CCGGGCCACAATAGGAGCTGACTTTCTCGAGAAAGTCAGCTCCTATTGTGGCTTTTT) παραδόθηκαν σε καρκίνο του προστάτη DU145 κυττάρων (δημιουργία σταθερών Rab7 shRNA κυττάρων που εκφράζουν) χρησιμοποιώντας αποστολή λεντοϊού Μεταγωγή Σωματίδια (Sigma) σύμφωνα με την το πρωτόκολλο του κατασκευαστή και όπως περιγράφεται προηγουμένως [9]. Μη Target shRNA εκφράζοντα κύτταρα παρήχθησαν χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο με ένα φορέα ελέγχου στόχευσης κανένα γνωστά γονίδια θηλαστικών (Sigma shc202V).

Εισβολή Δοκιμασία

δοκιμασίες εισβολή διεξήχθησαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [10], [13]. HGF προστέθηκε σε άνευ ορού μέσο τόσο στα άνω και κάτω θαλάμους με συγκέντρωση 33 ng /ml. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο αριθμό των εισέβαλε κύτταρα σε τέσσερις τομείς της προβολής ανά κατάσταση από τρία ανεξάρτητα πειράματα.

In vivo

Πειράματα

Έξι έως 8 εβδομάδων αρσενικούς SCID /bg ποντίκια ενέθηκαν με 2 χ 10

6 DU145 κύτταρα όγκου του προστάτη που εκφράζουν σταθερά είτε ως κωδικοποιημένο (μη-στόχος? ΝΤ) shRNA ή shRNA κατευθύνεται σε Rab7 σε 100 μΙ PBS υποδορίως (n = 6 NT shRNA? n = 7 Rab7 shRNA) . Οι όγκοι έγιναν μετρήσιμοι την ημέρα 41 μετά την εμφύτευση και μετρήθηκαν με ψηφιακά παχύμετρα δύο φορές την εβδομάδα. Οι όγκοι των όγκων υπολογίστηκαν από την εξίσωση: Όγκος = π /6 * Μήκος * Πλάτος

2. Τα ποντίκια υποβλήθηκαν σε ευθανασία σε 104 ημέρες μετά την εμφύτευση και οι όγκοι αφαιρέθηκαν χειρουργικά και μονιμοποιήθηκαν σε 10 τοις εκατό φορμαλδεΰδη ή κατεψυγμένα. Όλα τα πειράματα διεξήχθησαν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές που καθορίζονται από την επιτροπή LSUHSC-S Θεσμικών Animal Care και Χρήση.

Η ανοσοϊστοχημεία

Η ανοσοϊστοχημεία έγινε χρησιμοποιώντας πρότυπες τεχνικές DAB. Εν συντομία, τα σταθεροποιημένα με φορμαλίνη όγκοι υποβλήθηκαν σε επεξεργασία και ενσωματωμένα σε παραφίνη. Αυτά τα μπλοκ κατόπιν τεμαχίστηκαν, αποπαραφινοποιήθηκαν, και επανυδατώθηκαν σε ξυλόλιο και βαθμολογούνται πλύσεις αιθανόλης. Τα αντιγόνα είχαν εκδηλωθεί με ρυθμιστικό ανάκτηση προθερμασμένο αντιγόνου για 15 λεπτά και στη συνέχεια ψύχεται. 0,3% Η

2O

2 σε μεθανόλη δόθηκε στις πλάκες για 30 λεπτά για να εμποδίσει την ενδογενή υπεροξείδια, που ακολουθείται από μια πρωτεΐνη (ορός) μπλοκ για 10 λεπτά. Primary αντίσωμα προστέθηκε στη συνέχεια για 1 ώρα στην υποδεικνυόμενη αραίωση. Βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα (1:200) προστέθηκε στη συνέχεια για 30 λεπτά. Βιοτίνη πρόσδεσης αυξήθηκε με τη χρήση της μεθόδου ABC Elite (Vector Labs) για 30 λεπτά και λεκέδες απεικονίστηκαν με DAB (Vector Labs) για 7 λεπτά. Διαφάνειες Ακολούθησε χρώση με αιματοξυλίνη για 2 λεπτά.

Στατιστική Ανάλυση

GraphPad Software, Prism 3.0 χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει όλες τις στατιστικές. Ένα ή δίπλευρη Mann-Whitney Τ-τεστ εκτελέστηκαν για να υποδείξει στατιστική σημαντικότητα. Όλα τα γραφήματα δείχνουν το τυπικό σφάλμα της μέσης τιμής (SEM).

Αποτελέσματα

τρογλιταζόνη Αποτρέπει HGF που προκαλείται κυτταρική επιφάνεια κατευθύνεται λυσοσώματα Εμπορίας, Καθεψίνη Β Έκκριση και κυττάρων εισβολή

Έχουμε αποδείξει προηγουμένως ότι ο HGF μπορεί να επάγει την επιφάνεια κατευθυνόμενη κυτταρική διακίνηση λυσοσώματα [10]. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει ότι τρογλιταζόνη εμπόδισε όξινο κυτταρικής επιφάνειας pHe επαγόμενη κατευθυνόμενη λυσόσωμα διακίνηση [13]. Προκειμένου να προσδιοριστεί εάν τρογλιταζόνη μπορεί επίσης να αποτρέψει τον επαγόμενο από HGF στην κυτταρική επιφάνεια κατευθυνόμενη λυσόσωμα διακίνησης, τα καρκινικά κύτταρα του προστάτη DU145 συν-επεξεργασία με 10 μΜ τρογλιταζόνη και 33 ng /μl HGF για 16 ώρες, μετά τις οποίες λυσοσώματα έγιναν ορατές με Ι.Ρ. μικροσκοπία χρησιμοποιώντας LAMP1 (λυσόσωμα σχετιζόμενη μεμβράνη πρωτεΐνη-1) ως ένα προηγουμένως καθοριστεί λυσόσωμα δείκτης [9]. Εκπρόσωπος Ι.Ρ. εικόνες φαίνεται στο Σχήμα 1Α καταδεικνύουν ότι ο HGF προκάλεσε την διακίνηση των λυσοσωμάτων στην κυτταρική επιφάνεια όπως προηγουμένως δημοσιευθεί και ότι τρογλιταζόνη εμπόδισε όχι μόνο τον επαγόμενο από HGF επιφάνεια κατευθυνόμενη κυτταρική διακίνηση, αλλά επίσης προκάλεσε την ανάδρομη διακίνηση και συνένωση των λυσοσωμάτων παρακείμενα πυρήνες κυττάρων. Τα λυσοσώματα συγχωνεύτηκαν κατά την μικροσωληνίσκων οργανώνοντας το κέντρο (MTOC) σε τρογλιταζόνη κατεργασμένα κύτταρα (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα? [13]). Ποσοτικοποίηση της τοποθεσίας λυσοσώματος καθώς η απόσταση από τον πυρήνα των κυττάρων (με τη χρήση που περιγράφηκε προηγουμένως λογισμικού [9], [22]? Σχήμα 1Β) απέδειξαν ότι HGF προκάλεσε την αναδιανομή των λυσοσωμάτων προς την επιφάνεια του κυττάρου (μακριά από τον πυρήνα του κυττάρου) και τρογλιταζόνη εμπόδισε HGF επαγόμενη κυτταρική επιφάνεια κατευθυνόμενη λυσόσωμα διακίνησης.

Α) κύτταρα όγκου του προστάτη DU145 υποβλήθηκαν σε θεραπεία με 10 μΜ τρογλιταζόνη και /ή HGF τη διάρκεια της νύχτας, ακολουθούμενη από IF μικροσκόπιο για να απεικονίσει λυσοσώματα (κόκκινο), ακτίνη (πράσινο), και πυρήνες (μπλε). Τρογλιταζόνη προκαλεί επίσης λυσοσώματα να συγκεντρώνονται juxtanuclear στους κυτταρικούς πυρήνες. Β) Ποσοτικοποίηση της χωρικής κατανομής των λυσοσωμάτων παρουσιάζεται ως μέση απόσταση από μεμονωμένους πυρήνες κυττάρων για κάθε κατάσταση θεραπείας. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την s.e.m των 30 κυττάρων από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. C) κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 16 ώρες με τρογλιταζόνη και /ή HGF και το ποσό της Καθεψίνης Β εκκρίνονται στο μέσο καλλιέργειας ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία δραστικότητας καθεψίνης Β (βλέπε μεθόδους και υλικά). D) κύτταρα DU145 σπάρθηκαν πάνω σε επικαλυμμένα με Matrigel ένθετα transwell και αφέθηκε να εισβάλουν για 24 ώρες. Προστέθηκαν Θεραπείες όπου υποδεικνύεται τόσο στο πάνω και κάτω μέρος του ενθέτου. * Η στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0.001) έναντι του ελέγχου? ** Η στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0,01) έναντι του ελέγχου. Ράβδοι κλίμακας: 10 μm

Η

Για να αποδειχθεί μια λειτουργική συνέπεια του λυσοσώματος εμπορίας, η δράση της καθεψίνης Β εκκρίνεται στο μέσο καλλιέργειας μετρήθηκε.. Η αύξηση της δραστηριότητας της καθεψίνης Β είναι ευθέως ανάλογη με την ποσότητα της καθεψίνης Β που εκκρίνεται από τα κύτταρα όγκου [9]. Το σχήμα 1C δείχνει ότι τρογλιταζόνη εμπόδισε σημαντικά την έκκριση επαγόμενο από HGF καθεψίνης Β. Τέλος, Matrigel ένθετα επικαλυμμένα Transwell χρησιμοποιήθηκαν για να εκτελέσει

in vitro δοκιμασίες

εισβολή. Τρογλιταζόνη εμπόδισε σημαντικά την εισβολή του HGF επεξεργασμένα κύτταρα (Σχήμα 1 D). Η μείωση στην εισβολή δεν οφειλόταν σε κυτταρικό θάνατο (δεν παρουσιάζονται τα δεδομένα? [10])

Μέλη της Οικογένειας θειαζολιδινοδιόνη (ΤΖϋ) των ενώσεων διαφορικά Αναστέλλουν επαγόμενο από HGF στην κυτταρική επιφάνεια κατευθυνόμενη εμπορία λυσοσώματα και κυτταρική διείσδυση.

τρογλιταζόνης είναι μέλος της θειαζολιδινοδιόνης οικογένεια των ενώσεων. Ως εκ τούτου, ελέγξαμε την ικανότητα άλλων TZDs να αναστέλλουν επαγόμενο από HGF στην κυτταρική επιφάνεια κατευθυνόμενη διακίνησης λυσόσωμα και κυτταρική διείσδυση. Όπως φαίνεται στο Σχήμα S1A και ποσοτικοποιείται στο Σχήμα S1B, Η ciglitazone και Rosiglitazone εμπόδισε επίσης κυτταρική επιφάνεια κατευθύνεται διακίνησης λυσοσωμικής? εκτιμώντας ότι, η πιογλιταζόνη δεν είχε καμία επίδραση. Οι διαφορικές επιδράσεις των τριών TZDs επί λυσόσωμα ομαδοποίηση κατατάχθηκαν: τρογλιταζόνη & gt? Η ciglitazone = ροσιγλιταζόνη. Από πιογλιταζόνη δεν είχε καμία επίδραση στην λυσόσωμα εμπορίας, συγκρίναμε τα αποτελέσματα της τρογλιταζόνη και πιογλιταζόνη στην κυτταρική εισβολή. Εικόνα S1c αποδεικνύει ότι τρογλιταζόνη ανέστειλε σημαντικά την εισβολή των κυττάρων μέσω της Matrigel επικαλυμμένα φίλτρα? ότι, πιογλιταζόνη είχε καμία επίδραση στην κυτταρική εισβολή, γεγονός που υποδηλώνει ότι η χωρική θέση των λυσοσωμάτων είναι μια εγγενώς σημαντική πτυχή των καρκινικών κυττάρων εισβολής.

Η Rab7 ΟΤΡάσης είναι απαραίτητη για την πρόληψη της επαγόμενης από HGF στην κυτταρική επιφάνεια κατευθυνόμενη λυσοσώματα διακίνησης, καθεψίνη Β έκκριση και κυττάρων εισβολή

Αν και έχουμε εμπλακεί πρόσφατα Rab7 ως αρνητικός ρυθμιστής του λυσοσώματος εμπορίας ανθρώπων, της έκκρισης καθεψίνης Β, και την κυτταρική εισβολή [10], [13], δεν έχουμε καταδείξει το ρόλο του Rab7 στο πλαίσιο της τρογλιταζόνης και HGF. Ως εκ τούτου, τα κύτταρα DU145 εκφράζουν Rab7 shRNA (Rab7 knockdown ήταν 95% σε σύγκριση με ένα μη-στόχο (ΝΤ) shRNA κυτταρική γραμμή που εκφράζει (Σχήμα 2C ένθετο) [10]), υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με HGF ή τρογλιταζόνη επί 16 ώρες. ΑΝ. μικροσκοπία (Σχήμα 2Α) έδειξαν ότι Rab7 ήταν απαραίτητη για να αποτραπεί τρογλιταζόνη επαγόμενο από HGF στην κυτταρική επιφάνεια κατευθυνόμενη λυσόσωμα διακίνησης. Επιπλέον, λυσοσώματα σε Rab7 shRNA που εκφράζουν κύτταρα βρέθηκαν πιο κοντά στην κυτταρική επιφάνεια ακόμη και εν απουσία του HGF. Η ποσοτικοποίηση του πυρήνα-λυσοσώματος απόσταση (σχήμα 2Β) δείχνει ότι λυσοσώματα είναι σημαντικά μακρύτερα από τις κυτταρικές πυρήνες και ότι τρογλιταζόνη ήταν αναποτελεσματική στην επαγωγή juxtanuclear συσσωμάτωση λυσόσωμα στα κύτταρα που εκφράζουν Rab7 shRNA.

Α) Ι.Ρ. μικροσκοπία διεξήχθη επί κυττάρων όγκου προστάτη DU145 που εκφράζουν είτε ένα μη στόχους (κωδικοποιημένο) shRNA ή ένα Rab7 κατευθυνόμενη shRNA να απεικονίσει λυσοσώματα (κόκκινο), ακτίνη (πράσινο), και οι πυρήνες (μπλε). έκφραση Rab7 shRNA αποτρέπει τρογλιταζόνη που προκαλείται juxtanuclear λυσόσωμα ομαδοποίηση και προκαλεί λυσοσώματα στην κυκλοφορία στην επιφάνεια του κυττάρου ανεξάρτητα από HGF. Β) Ποσοτικοποίηση της χωρικής κατανομής των λυσοσωμάτων παρουσιάζεται ως μέση απόσταση από μεμονωμένους πυρήνες κυττάρων για κάθε κατάσταση θεραπείας. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν την s.e.m των 30 κυττάρων από τουλάχιστον τρία ανεξάρτητα πειράματα. Γ) NT και Rab7 shRNA εκφράζοντα κύτταρα DU145 υποβλήθηκαν σε αγωγή για 24 ώρες με τρογλιταζόνη και /ή HGF και το ποσό της Καθεψίνης Β εκκρίνονται στο μέσο καλλιέργειας ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας μία δοκιμασία δραστικότητας καθεψίνης Β (βλέπε μεθόδους και υλικά). έκκριση Καθεψίνη Β αυξάνεται και τρογλιταζόνη δεν εμποδίζει πλέον την έκκριση στα κύτταρα Rab7 knockdown. Ένθετο δεικνύει έκφραση LAMP-1 και Rab7 στο nontarget (ΝΤ) ή Rab7 shRNA (KD) σταθερές κυτταρικές σειρές με κηλίδα Western. Δ) NT και Rab7 shRNA κύτταρα που εκφράζουν DU145 σπάρθηκαν πάνω σε επικαλυμμένα με Matrigel ένθετα transwell και αφέθηκε να εισβάλουν για 24 ώρες. Θεραπείες υποδεικνύεται προστέθηκαν τόσο στο πάνω και κάτω μέρος του ενθέτου. * Η στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0.001) έναντι του ελέγχου NT? ** Η στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0,01) έναντι του ελέγχου NT. Ράβδοι κλίμακας: 10 μm

Η

Παρόμοια με τη διανομή των λυσοσώματα, Rab7 shRNA κύτταρα που εκφράζουν έδειξαν αυξημένη έκκριση καθεψίνης Β απουσία HGF (Σχήμα 2C).. Επιπλέον, τρογλιταζόνη δεν ήταν σε θέση να εμποδίσει την έκκριση επαγόμενο από HGF καθεψίνης Β σε κύτταρα που εκφράζουν Rab7 shRNA. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν για την κυτταρική εισβολή. Τρογλιταζόνη εμπόδισε την επαγόμενο από HGF αύξηση των καρκινικών κυττάρων εισβολής στα κύτταρα ελέγχου NT shRNA, αλλά όχι στα κύτταρα Rab7 knockdown (Σχήμα 2D). Επιπλέον, Rab7 shRNA κύτταρα που εκφράζουν ήταν σημαντικά πιο επεμβατικές σε σύγκριση με κύτταρα NT shRNA απουσία οποιουδήποτε ερεθίσματος. Λαμβανόμενα μαζί αυτά τα δεδομένα προτείνουν ότι i.) Έκφραση Rab7 απαιτείται για τρογλιταζόνη να αποτρέψει τον επαγόμενο από HGF λυσόσωμα διακίνησης και ii.) Rab7 δρα ως αρνητικός ρυθμιστής της κυτταρικής επιφανείας κατευθυνόμενης λυσόσωμα διακίνησης, έκκριση καθεψίνης Β, και εισβολής καρκινικών κυττάρων.

Rab7 shRNA εκφράζοντας όγκοι μεγαλώνουν οφείλεται σε αυξημένο πολλαπλασιασμό και μειωμένη αποπτωτικά Τιμές

Από Rab7 shRNA κύτταρα που εκφράζουν DU145 ήταν πιο επεμβατικές

in vitro

, αυτά τα κύτταρα εγχέονται υποδόρια στο οπίσθιο πλευρό των SCID ποντίκια και των όγκων του όγκου μετρήθηκε την πάροδο του χρόνου για να καθορίσει ποια, ενδεχομένως, Rab7 κάτω ρύθμιση επίδραση είχε

in vivo

. Οι όγκοι που προέρχονται από Rab7 shRNA εκφράζοντα κύτταρα αναπτύχθηκαν μεγαλύτερες από εκείνες από NT shRNA που εκφράζουν κύτταρα (Σχήμα 3Α). Η διαφορά έγινε σημαντική (ρ & lt? 0,05) κατά την ημέρα 79 μετά την ένεση και ιδιαίτερα σημαντική παρελθόν 79 ημέρες (ρ & lt? 0.001). Είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι αυξημένο πολλαπλασιασμό δεν ανιχνεύθηκε στο Rab7 shRNA που εκφράζει κύτταρο

in vitro

(Εικόνα S2). Αφού το μεγαλύτερο του όγκου έφθασε 1,4 cm

3, όλα τα ποντίκια θυσιάστηκαν και οι όγκοι αφαιρέθηκαν χειρουργικά. Οι περιβάλλοντες ιστούς ποντικού δίπλα στους όγκους ήταν επίσης συγκομίζονται αυτή τη στιγμή. Οι όγκοι στη συνέχεια χωρίζεται στη μέση και είτε σταθερό σε δέκα τοις εκατό φορμαλίνη ή flash-κατεψυγμένα.

Α) SCID /Bg ποντικοί ενέθηκαν με 2 χ 10

6 NT shRNA (n = 6) ή Rab7 shRNA (n = 7) κυττάρων που εκφράζουν DU145 sc Οι όγκοι έγινε μετρήσιμη από την ημέρα 41 και μετρήθηκαν μέσω της ψηφιακής δαγκάνες δύο φορές την εβδομάδα. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν κάποτε η μεγαλύτερη του όγκου έφθασε 1,4 εκατοστά

2. Τα δεδομένα εκφράζονται ως κυβικό όγκο χιλιοστά. Οι μπάρες σφάλματος αντιπροσωπεύουν S.E.M. 6 και 7 όγκους αντίστοιχα. * Η στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0,05) έναντι όγκων NT shRNA? ** Η στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0,001) έναντι όγκων NT shRNA. Β) Η ανοσοϊστοχημεία πραγματοποιήθηκε σε φορμαλδεΰδη σταθερό ιστό του όγκου (βλέπε μεθόδους και υλικά). Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας Ki-67 ως δείκτη και αποπτωτικά κύτταρα οπτικοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας διασπασμένη κασπάση-3 ως δείκτη. Γ) IHC ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση Ki-67 ή διασπασμένη κασπάση-3 θετικά κύτταρα. Τρία τυχαία πεδία ανά όγκου με το χέρι μετρήθηκαν. Ο αριθμός των θετικώς χρώση κυττάρων απεικονίστηκαν γραφικά. * Η στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0,01) έναντι όγκων NT shRNA? ** Η στατιστική σημαντικότητα (ρ & lt? 0,05) έναντι όγκων NT shRNA. Ράβδοι κλίμακας: 100 μm

Η

φορμόλη σταθερό όγκοι συνέχεια τομές και ενσωματωμένες σε παραφίνη για ανοσοϊστοχημική ανάλυση (IHC).. Δεδομένου ότι μια διαφορά στο ρυθμό ανάπτυξης του όγκου ανιχνεύθηκε, τομές όγκων βάφτηκαν με Ki-67 (δείκτης πολλαπλασιασμού) και διασπασμένης κασπάσης-3 (ένα αποπτωτικό δείκτη) και με αιματοξυλίνη. Αντιπροσωπευτικά χρώση δείχνεται στο Σχήμα 3Β. χρώση IHC ποσοτικοποιήθηκε με μέτρηση με το χέρι Ki-67 ή διασπασμένη κασπάση 3 χρώση κυττάρων. Ποσοτικοποίηση φαίνεται στο Σχήμα 3C δείχνει μια σημαντική (ρ & lt? 0,01) αύξηση στο Ki-67 θετική χρώση και σημαντική (ρ & lt? 0,05) μείωση διασπασμένη κασπάση 3 θετική χρώση, υποδηλώνοντας ότι η αύξηση του όγκου του όγκου οφείλεται τόσο αυξημένο πολλαπλασιασμό και μειώθηκε αποπτωτικών τιμές.

Rab7 shRNA Εκφράζοντας όγκοι παρουσιάζουν αυξημένη εισβολή και ιστών αναδιαμόρφωση

παραφίνη ενσωματωμένα τμήματα των όγκων βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και ηωσίνη και οπτικοποιούνται σε δύο διαφορετικές μεγεθύνσεις. Όπως προαναφέρθηκε, κατά τη διάρκεια χειρουργική αφαίρεση των όγκων, οι γειτονικούς ιστούς και το δέρμα ποντικών είχαν μείνει ανέπαφα. Εκπρόσωπος διατομές της H & amp? Τα E λεκέ φαίνεται στο Σχήμα 4. Έλεγχος (ΝΤ shRNA εκφράζοντας) όγκοι παρουσιάζουν συνολική ακεραιότητα του ιστού με ένα λεπτό στρώμα του δέρματος που επικαλύπτει μια πολύ στρώμα στοχαστής του οργανωμένου, άθικτο ιστό (γραμμωτών κυττάρων? Υποδεικνύεται από το βέλη). Λίγοι καρκινικά κύτταρα μπορεί να ανιχνευθεί εισβάλλουν σε αυτό το στρώμα ιστού σε όγκους ελέγχου. Σε αντίθεση, οι όγκοι που εκφράζουν Rab7 shRNA εμφανίζεται μια πολύ πιο επιθετική φαινότυπο. Η ακεραιότητα του περιβάλλοντος ιστού ποντικού σοβαρά σε κίνδυνο και πολυάριθμα κύτταρα όγκου βρέθηκαν διάσπαρτες εντός του μυϊκού ιστού ή στις περισσότερες περιπτώσεις, η γραμμωτών αρχιτεκτονική του περιβάλλοντος ιστού εξ ολοκλήρου σε κίνδυνο. Ως εκ τούτου, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι όχι μόνο ήταν η Rab7 shRNA εκφράζοντας όγκους μεγαλύτερα, είχαν αυξημένη ικανότητα να ανακαινίσει και να εισβάλλουν στον περιβάλλοντα ιστό

H & amp?. Ε βάφονται υποδορίως όγκου διατομές με τον περιβάλλοντα ιστό και το δέρμα ποντικών που φαίνεται δίπλα στον όγκο. Rab7 όγκοι knockdown εμφανίζουν αυξημένη διείσδυση στο στρώμα ιστού υποκείμενη του δέρματος σε σύγκριση με τον έλεγχο των όγκων. Επιπλέον, οι οθόνες των ιστών αυξημένη διαταραχή και απώλεια της ακεραιότητας που περιβάλλουν τους όγκους Rab7 knockdown. μπαρ κλίμακα:. 100 μm

Η

Rab7 mRNA ρυθμίζεται προς τα κάτω στον καρκίνο του προστάτη Τα επιθηλιακά βιοψίες κυττάρων, αλλά όχι στη γύρω στρωματικά κύτταρα, ούτε στην ΚΥΠ

Από Rab7 κάτω ρύθμιση αυξημένη ανάπτυξη όγκου

in vivo

και αυξημένη επεμβατική ικανότητα

in vitro

, η

ONCOMINE

βάση δεδομένων αναζητήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων διαφορική mRNA της Rab7 στον ανθρώπινο καρκίνο του προστάτη. Η ανάλυση της διαφορικής ρύθμισης των Rab7 στον καρκίνο του προστάτη αποκάλυψε έξι σύνολα δεδομένων που εκτείνονται σε εννέα διαφορετικά υποσύνολα προστατικό ιστό. Όπως φαίνεται στον Πίνακα 1, αρκετές μελέτες έδειξαν μια σημαντική μείωση φορές στην έκφραση του mRNA Rab7 κυμαίνονται από -2,501 να -1,128? Ωστόσο, δύο μελέτες ήταν διφορούμενα με έναν ανιχνευτή που ανιχνεύει την αύξηση και ένα δεύτερο ανιχνευτή που ανιχνεύει μια μείωση του Rab7 mRNA σε δείγματα όγκων του προστάτη, και μία μελέτη δεν ανίχνευσε καμία αλλαγή στην έκφραση Rab7 mRNA. Επιπλέον, η ανάλυση των βλαβών PIN έδειξε επίσης μια σημαντική -1.939 φορές μείωση στην Rab7, ενώ δύο ξεχωριστές αναλύσεις της καλοήθους υπερπλασίας του προστάτη (ΚΥΠ) απέτυχε να δείξει μείωση των Rab7. Στο σύνολό τους, μια τάση εμφανίζεται σύμφωνα με την οποία Rab7 ρυθμίζεται προς τα κάτω νωρίς στην ανάπτυξη του όγκου του προστάτη (ΡΙΝ αλλοιώσεις) και παραμένει κάτω ρυθμισμένα κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου, αλλά δεν είναι κάτω-ρυθμίζονται σε καλοήθεις καταστάσεις, όπως η ΒΡΗ.

Η

Rab7 Νοκ ντάουν προκαλεί αύξηση του c-Met επίπεδα

για να αρχίσει να καθορίσει τους μηχανισμούς που ρυθμίζουν την αύξηση του πολλαπλασιασμού των όγκων και την εισβολή σε κύτταρα που περιέχουν μειωμένη Rab7, εξετάσαμε τα επίπεδα και την ενεργοποίηση του c-Met σε φορέα ελέγχου και Rab7 shRNA κυττάρων που εκφράζουν. Η προσθήκη HGF με κύτταρα ελέγχου οδήγησε σε αυξημένη φωσφορυλίωση και ενεργοποίηση των οδών κατάντη σηματοδότησης που ακολουθείται από μια σταδιακή μείωση κατά τις επόμενες ώρες c-Met. Σε αντίθεση, η προσθήκη του HGF να Rab7 knockdown κυττάρων είχε ως αποτέλεσμα μια πιο ισχυρή αύξηση στη φωσφορυλίωση c-Met και μια πιο αργή απώλεια των ενεργοποιημένων εταίρων Met και κατάντη σηματοδότησης πάροδο του χρόνου (Σχήμα 5Α). Σε συμφωνία με αυτά τα δεδομένα, η ανάλυση της συνολικής πρωτεΐνης c-Met σε έλεγχο και Rab7 knockdown κυττάρων έδειξε ότι τα επίπεδα c-Met ήταν υψηλότερα σε κύτταρα με λιγότερο Rab7 και ότι ο HGF μεσολάβηση απώλεια της c-Met επίσης εξασθενημένος (Σχήμα 5Β).

Α) nontarget (ΝΤ) έλεγχος φορέα ή Rab7 shRNA κύτταρα που εκφράζουν DU145 εκτέθηκαν σε HGF για τους υποδεικνυόμενους χρόνους. Λύματα ολόκληρων κυττάρων συλλέχθηκαν και c-met, Akt, και φωσφορυλίωση Erk ανιχνεύθηκε με κηλίδωση Western. Β) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε αγωγή με HGF για τις indictated χρονικές περιόδους και τα επίπεδα της συνολικής πρωτεΐνης c-Met προσδιορίστηκαν με ανάλυση κηλίδας Western. Πυκνότητας από τρία ανεξάρτητα πειράματα χρησιμοποιήθηκε για γραφική αναπαράσταση της απώλειας c-Met πάροδο του χρόνου. C) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τις υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις HGF για 30 λεπτά που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western των υποδεικνυόμενων πρωτεϊνών. λύματα D) Protein του ξενομοσχεύματος όγκοι συλλέχθηκαν και τα επίπεδα της ολικής c-met και Rab7 πρωτεΐνης ανιχνεύθηκαν με στύπωμα Western. Το γράφημα ράβδος αντιπροσωπεύει το μέσο όρο c-met και Rab7 έκφραση επτά όγκων ανά ομάδα θεραπείας, όπως προσδιορίζεται με πυκνομετρία Western blot. * = P & lt? 0,0007 σε σύγκριση με ΝΤ shRNA Rab7. ** = Ρ & lt? 0,03 σε σύγκριση με ΝΤ shRNA c-met. μπαρ σφάλματος αντιπροσωπεύουν SEM.

Η

Επειδή τα επίπεδα c-Met ήταν υψηλότερα σε Rab7 νοκ ντάουν κύτταρα, είχαμε προβλέψει ότι αυτά τα καρκινικά κύτταρα θα ανταποκρίνονται περισσότερο στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις του HGF. Όπως υποδεικνύεται στο Σχήμα 5C, κύτταρα knockdown Rab7 ανταποκρίθηκε σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις του HGF, όπως μετράται με την ενεργοποίηση του c-Met, Akt και ERK.

Τέλος, για να προσδιοριστεί εάν τα επίπεδα c-Met μειώθηκαν σε Rab7 knockdown ξενομοσχεύματα ποντίκι , πρωτεΐνη από ιστό όγκου ξενομοσχεύματος κατεψυγμένο συλλέχθηκε και παρασκευάσθηκε για ανάλυση στυπώματος Western. Εικόνα 5D δείχνει ότι οι όγκοι σχηματίζονται από κύτταρα DU145 έλεγχο των φορέων κατά μέσο όρο περιείχε περισσότερα Rab7 και λιγότερο c-Met από τους όγκους που σχηματίζονται από τα κύτταρα Rab7 νοκ ντάουν.