Αφηρημένο

Ιστορικό

Το γονίδιο (COL11A1) collagen11A1 υπερεκφράζεται στον καρκίνο του παγκρέατος. Η έκφραση της πρωτεΐνης COL11A1 θα μπορούσαν να συμμετέχουν σε δεσμοπλαστικού γεγονότα στον καρκίνο του παγκρέατος, αλλά ένα αντίσωμα που χρωματίζει συγκεκριμένα την πρωτεΐνη COL11A1 δεν είναι προς το παρόν διαθέσιμο.

Μέθοδοι και ευρήματα

Ένα σύνολο των 54 παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκινώματα (PDAC), 23 χρόνια παγκρεατίτιδα (CP) δείγματα, και καλλιεργημένα περιογκική στρωματικά κύτταρα του PDAC (αποσπάσματα 3-6) μελετήθηκαν. Δείγματα φυσιολογικού ιστού ανθρώπινου παγκρέατος ελήφθησαν μέσω ενός πτωματικό πρόγραμμα δωρεάς οργάνων.

1) Επικύρωση των COL11A1 υπερέκφραση της γονιδιακής από την Q-RT-PCR. Ευρήματα:. Η έκφραση του γονιδίου COL11A1 αυξάνεται σημαντικά στα δείγματα PDAC εναντίον φυσιολογικά και CP δείγματα

2) Ανάλυση COL11A1 με ανοσοϊστοχημεία χρησιμοποιώντας εξαιρετικά ειδικά αντισώματα αντι-proCOL11A1. Ευρήματα:. Αντι-proCOL11A1 λεκέδες στρωματικά κύτταρα /καρκινο-συναφές ινοβλάστες (CAFS) του PDAC αλλά δεν λεκιάζει χρόνιας καλοήθης κατάσταση (χρόνια παγκρεατίτιδα) στρωματικά κύτταρα, επιθηλιακά κύτταρα, ή φυσιολογικές ινοβλάστες

3) Αξιολόγηση της η ικανότητα διάκρισης του αντισώματος. Ευρήματα:. Αντι-proCOL11A1 ανοσοχρώση με ακρίβεια διακρίσεις μεταξύ PDAC και CP (AUC 0,936, 95% CI 0,851, 0,981)

4) Η φαινοτυπική χαρακτηρισμό proCOL11A1 + στρωματικά κύτταρα συν-χρώση με δείκτες μεσεγχυματικά, επιθηλιακών κυττάρων και αστεροειδή σε δείγματα παγκρεατικός ιστός και καλλιεργήθηκαν περιογκική παγκρεατικών κυττάρων του καρκίνου του στρώματος. Ευρήματα: ProCOL11A1 + κύτταρα που υπάρχουν συν-χρώση με μεσεγχυματικά, αστεροειδών και επιθηλιακών δεικτών (φαινότυπος EMT) σε διαφορετικές αναλογίες

Συμπεράσματα /Σημασία

Ανίχνευση proCOL11A1 μέσω ανοσοχρώση με αυτό το πρόσφατα ανεπτυγμένο αντισώματος επιτρέπει. για μια εξαιρετικά ακριβή διάκριση μεταξύ PDAC και CP. Σε αντίθεση με άλλα διαθέσιμα αντισώματα που χρησιμοποιούνται συνήθως για την ανίχνευση CAFS, αντι-proCOL11A1 είναι αρνητική σε στρωματικά κύτταρα των φυσιολογικών παγκρέατος και σχεδόν απούσα σε καλοήθεις φλεγμονή. Αυτά τα αποτελέσματα υποδεικνύουν έντονα ότι proCOL11A1 είναι ένας ειδικός δείκτης για την CAFS, και ως εκ τούτου, αντι-proCOL11A1 είναι ένα ισχυρό νέο εργαλείο για την έρευνα για τον καρκίνο και την κλινική διάγνωση

Παράθεση:. García-Pravia C, Galván JA, Gutiérrez-Corral Ν, Solar-García L, García Pérez-E, García-Ocaña M, et al. (2013) Η υπερέκφραση του COL11A1 με Καρκίνο-Associated ινοβλάστες: κλινική σημασία μιας στρωματικά Marker σε καρκίνο του παγκρέατος. PLoS ONE 8 (10): e78327. doi: 10.1371 /journal.pone.0078327

Επιμέλεια: Francisco X. Real, Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO), Ισπανία

Ελήφθη: 28 Απρ, 2013? Αποδεκτές: 11 του Σεπτέμβρη του 2013? Δημοσιεύθηκε: 23 του Οκτώβρη, 2013

Copyright: © 2013 García-Pravia et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα έχει συγχρηματοδοτηθεί από ταμεία ΕΤΠΑ από το ΕΥΡ ΠΑΪΚΗΣ ΕΝ? από INNPACTO-ONCOPAN IPT-010000-2010-31 έργου? από FISS-09- PS09 /01911 Έργων, Υπουργείο Επιστημών και Καινοτομίας της Ισπανίας? Η ομάδα FC-11-PC10-23 έργου, FICYT, Axe 1 του 2007-2013 ΕΤΠΑ Επιχειρησιακού Προγράμματος Πλαισίου του Πριγκιπάτου της Αστούριας, Ισπανία? και από Progenika Biopharma, S.A. και Oncomatrix, S.L. Derio, Ισπανία. Η proCOL11A1 mAb έχει κατοχυρωθεί με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας από Oncomatrix, S.L. (PCT /ES2012 /070.616? WO 2013/021088 Α2). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Το αντίσωμα που περιγράφονται στην παρούσα μελέτη είναι στο πλαίσιο ενός διπλώματος ευρεσιτεχνίας που κατατίθεται από τους Δρ. Luis Barneo, Carmen García-Pravia, Juan R. de los Toyos, Marcos García-Ocaña, jokin Del Amo-Iribarren, Laureano Simón-Buela και άλλοι με τίτλο: μέθοδοι και τα προϊόντα διάγνωσης in vitro, IN VITRO πρόγνωση και την ανάπτυξη φαρμάκων ΚΑΤΑ διηθητικά καρκινώματα (PCT /ES2012 /070.616? WO 2013/021088 Α2). Jokin Del Amo-Iribarren λειτουργεί για Progenika Biopharma, S.A. και Laureano Simón-Buela λειτουργεί για Oncomatrix, S.L. Η μελέτη αυτή χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από Progenika Biopharma, S.A. και Oncomatrix, S.L. Δεν υπάρχουν άλλα διπλώματα ευρεσιτεχνίας, προϊόντα για την ανάπτυξη ή την εμπορία προϊόντων που να δηλώνουν. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών.

Εισαγωγή

παγκρεατικού πόρου αδενοκαρκίνωμα (PDAC) αποτελεί την τέταρτη κυριότερη αιτία θανάτου από καρκίνο στους άνδρες και τις γυναίκες. Το ποσοστό επιβίωσης 5-ετών είναι λιγότερο από 5% και ο μέσος χρόνος επιβίωσης είναι 6 μήνες μετά την αρχική διάγνωση. Ακόμη και σε ασθενείς που υποβάλλονται σε εκτομή, τα ποσοστά μακροπρόθεσμης επιβίωσης παραμένουν εξαιρετικά φτωχή [1]. Προς το παρόν, δεν υπάρχουν μέθοδοι έγκαιρης διάγνωσης ή αποτελεσματικές θεραπείες για χρήση έναντι αυτού του τύπου όγκου. Παρά την πρόοδο που έχει σημειωθεί στη διάγνωση και τη θεραπεία της, ο καρκίνος του παγκρέατος συνεχίζει να έχει τη χειρότερη πρόγνωση όλων των στερεών κακοήθων όγκων. Ο καρκίνος του παγκρέατος είναι το παράδειγμα των προηγμένων νεοπλασματικής νόσου: ανεξάρτητα από το στάδιο ΤΝΜ, η πλειοψηφία των ασθενών παρουσιάζει με την ασθένεια στα πρώτα στάδια [2]. Επιπλέον, ο καρκίνος του παγκρέατος είναι ανθεκτικό σε χημειοθεραπεία και η ακτινοθεραπεία [3].

παγκρεατικό καρκίνωμα χαρακτηρίζεται από μία αντίδραση που περιλαμβάνει δεσμοπλαστικού κυτταρικά και μη κυτταρικά συστατικά, όπως είναι οι ινοβλάστες (ενεργοποιημένη ή ανάπαυση), μυοϊνοβλάστες, περικύτταρα, παγκρεατικό αστεροειδή κύτταρα, κύτταρα του ανοσοποιητικού συστήματος, τα αιμοφόρα αγγεία, η εξωκυτταρική μήτρα, και διαλυτές πρωτεΐνες όπως κυτοκίνες και αυξητικούς παράγοντες [4,5]. Αυτή η ετερογενής στρώμα επηρεάζει πολλαπλές πτυχές της PDAC και φαίνεται να προάγουν την ανάπτυξη του όγκου, εισβολή, και την αντίσταση στη χημειοθεραπεία [6-9].

Η χρόνια παγκρεατίτιδα είναι μια φλεγμονώδης νόσος που χαρακτηρίζεται από μη αναστρέψιμη και προοδευτική καταστροφή του οργάνου, με αποτέλεσμα εξωκρινή και ενδοκρινή ανεπάρκεια. Το χαμένο παρέγχυμα αντικαθίσταται από πυκνό ινώδη ιστό με διείσδυση λευκοκυττάρων και των σωληνίσκων υπερπλασία. Η χρόνια παγκρεατίτιδα αυξάνει σημαντικά τον κίνδυνο ανάπτυξης καρκίνου του παγκρέατος [10-12], γεγονός που υποδηλώνει ότι η χρόνια φλεγμονή μέσα στο πάγκρεας μπορεί να είναι ένας προδιαθεσικός παράγοντας για την ανάπτυξη του καρκίνου. Ο σύνδεσμος αιτιολογικός μεταξύ χρόνιας φλεγμονής και καρκίνου περιγράφονται δύο αιώνες πριν από Marjolin [13], αλλά οι φλεγμονώδεις μεσολαβητές που οδηγούν στην ανάπτυξη του καρκίνου παραμένουν απροσδιόριστες.

Μεταξύ των κολλαγόνων μήτρας που σχετίζονται με όγκους, κολλαγόνα ινιδώδη είναι το πιο εμφανές. Τα κολλαγόνα συντίθενται ως προκολλαγόνα από τους ινοβλάστες. Αυτά τα προκολλαγόνα έχουν ένα κύριο κεντρικό τριπλής έλικας, που ορίζονται ως α1, α2, α3 και, και κωδικοποιούνται από ειδικές γονιδιακές αλληλουχίες. Μόλις εκκρίνεται στο εξωκυτταρικό περιβάλλον, αυτά τα προκολλαγόνα διασπώνται, και στη συνέχεια τα ώριμα μόρια κολλαγόνου συναρμολόγηση εξωκυτταρικά σε ινίδια. Σε φυσιολογικούς ιστούς, οι τύποι κολλαγόνου Ι, II και III είναι οι κύριες μεγάλες κολλαγόνα ινιδώδη, ενώ κολλαγόνα V και XI είναι λιγότερο άφθονα ελάσσονα κολλαγόνα ινιδώδη [14]. Κολλαγόνα V και XI μοιράζονται μια ομολογία 75% στο επίπεδο αλληλουχίας αμινοξέων τους. Προκολλαγόνων α1 των τύπων V και XI κωδικοποιούνται από COL5A1 και COL11A1 γονίδια, αντίστοιχα.

Μελέτες των ινοβλαστών στην περιοχή του όγκου, των λεγόμενων καρκινο-συναφές ινοβλάστες (CAF), έχουν καταδείξει το ρόλο τους στην τόνωση της προόδου των όγκων [15-20]. Τα χαρακτηριστικά των CAFS έχουν διερευνηθεί σε βάθος, που δείχνουν ότι το γονοτυπικό έκφραση, πρότυπο ανάπτυξης, μεταναστευτικής συμπεριφοράς και έκκριση παραγόντων ανάπτυξης τους διαφέρουν από εκείνες των φυσιολογικών ινοβλαστών [15,21]. Ωστόσο, οι ερευνητές δεν έχουν συγκεκριμένα εργαλεία για να διαφοροποιήσει CAFS από φλεγμονώδη ινοβλάστες. Βιμεντίνης (VIM) και α-λείου μυός ακτίνη (αSMA) συχνά χρησιμοποιούνται για την αναγνώριση CAFS, αλλά αυτά τα βιο-δείκτες δεν είναι συγκεκριμένες, διότι λεκέ φλεγμονώδεις ινοβλάστες και άλλα κύτταρα, καθώς και. Έχουμε εντοπίσει προηγουμένως 116 γονίδια που υπερεκφράζεται σε PDAC χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχίες DNA [22] (βλέπε S2 αρχείου). Βρήκαμε γονίδια της εξωκυττάριας μήτρας του οποίου η έκφραση αυξήθηκε σε σύγκριση με το κανονικό και χρόνια παγκρεατίτιδα (CP) ιστούς. Ένα από τα πιο σημαντικά και με συνέπεια υπερέκφραση γονιδίων ήταν COL11A1 (Πίνακας S1 σε File S1). Λόγω της έλλειψης ενός αξιόπιστου εμπορικού αντισώματος, δημιουργήσαμε ένα πολυκλωνικό αντιορό κουνελιού σε ένα πολύ συγκεκριμένο τέντωμα αμινοξέων της ανθρώπινης proCOL11A1 προκειμένου να αξιολογηθεί το επίπεδο της πρωτεΐνης που εκφράζεται σε καρκίνο του παγκρέατος [23]. Στη συνέχεια, έχουμε αναπτύξει ένα μονοκλωνικό αντίσωμα [24], εξαιρετικά ειδικό για ανθρώπινη proCOL11A1, η οποία σηματοδοτεί με σαφήνεια αυτές τις περινεοπλασματικής στρωματικά κύτταρα.

Στην παρούσα μελέτη προσπαθήσαμε να επιβεβαιώσει την υπερέκφραση του γονιδίου COL11A1 σε PDAC. Επιπλέον, αξιολογήσαμε την κλινική χρησιμότητα της ανοσοανίχνευση proCOL11A1 σε PDAC και CP ιστούς. Τέλος, θα διερευνηθούν τα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά των COL11A1-κυττάρων που εκφράζουν εντός του παγκρέατος στρώμα.

Υλικά και Μέθοδοι

Τα χαρακτηριστικά των ασθενών και δειγματοληψία ιστού

Οι μελέτες ανοσοϊστοχημείας με αντι-proCOL11A1 pAb πραγματοποιήθηκαν σε 54 PDAC και 23 CP (20 αλκοολικός, 2 αυτοάνοση, 1 χοληφόρων) ιστορικά δείγματα παραφίνη-ενσωματωμένες λαμβάνεται από χειρουργικά δείγματα από ασθενείς οι οποίοι υποβλήθηκαν σε χειρουργική επέμβαση στο Νοσοκομείο Universitario Κεντρική de Asturias, Oviedo, Ισπανία. Η μέση ηλικία των ασθενών με PDAC ήταν 65 ± 9 έτη (46 – 81 ετών) και 56 ± 12 έτη (25-73 ετών) από τους ασθενείς με ΠΣ. Η αναλογία των δύο φύλων (M /F) ήταν 37/17 για τις PDAC ασθενείς, ενώ στους άνδρες ήταν ακόμη υψηλότερη στους ασθενείς σε CP (22/1). (.. AJCC Καρκίνος Σταδιοποίηση Εγχειρίδιο 7η έκδ 2010) Η κατανομή του σταδίου του όγκου PDAC σύμφωνα με την ταξινόμηση ΤΝΜ ήταν: ΙΑ, 13%? ΙΒ, 17%? ΙΙΑ, 19%? ΙΙΒ, 37%? III, 6%? IV, 9%. Η νεοπλασματική βαθμολόγηση ήταν: G1, 20%? G2, 66%? G3, 12%? G4, 2%. Το αντι-proCOL11A1 mAb εφαρμόστηκε σε 69 (51 και 18 PDAC CP) από τις προηγούμενες περιπτώσεις. Φρέσκο ​​αφαιρεθεί PDAC, CP και τα δείγματα φυσιολογικό πάγκρεας ιστού αμέσως συμπληρωματικό καταψύχθηκαν σε υγρό άζωτο στο χειρουργείο και αποθηκεύτηκαν στους -80 ° C μέχρι την επεξεργασία. Η κανονική ανθρώπινο πάγκρεας δείγματα ιστού που λαμβάνονται μέσω ενός πτωματικό πρόγραμμα δωρεάς οργάνων (6 περιπτώσεις, όλα τα παλιά αρσενικά 41 – 76 χρόνια) και χρησιμοποιήθηκαν για το Q-RT-PCR. Φρέσκα δείγματα χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση και καλλιέργεια των ινοβλαστών. μελέτες Q-RT-PCR εφαρμόστηκαν σε κατεψυγμένα δείγματα PDAC και CP. Η μελέτη αυτή είναι σύμφωνη με τη Διακήρυξη του Ελσίνκι και εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας Νοσοκομείο Universitario Κεντρική de Asturias (n Έργου ° 42/12). Όλοι οι ασθενείς που υπογράφηκε έντυπα συγκατάθεσης που δείχνει την προθυμία τους να συμμετάσχουν και την κατανόησή τους για τη διαδικασία και το γενικό στόχο της μελέτης.

Ποσοτική RT-PCR του COL11A1

Το συνολικό RNA απομονώθηκε από βιοψίες πάγκρεας χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ αντιδραστήριο (Life Technologies), και cDNA συνετέθη με ανάστροφη μεταγραφάση ένζυμο Superscript II RNAse (Life Technologies). Όλες οι PCR αντιδράσεις διεξήχθησαν εις διπλούν σε ένα LightCycler 2.0 (Roche) χρησιμοποιώντας το κύριο FastStart DNA SYBR Green Ι kit (Roche). Primer αλληλουχίες ήταν ως εξής: COL11A1 (γονίδιο-στόχος): προς τα εμπρός 5 ‘TGGTGAT CAGAATCAGAAGTTCG 3’, αντίστροφος 5 ‘AGGAGAGTTGAGAATTGGGAATC 3’? Ριβοσωμική πρωτεΐνη L10 (γονίδιο αναφοράς): προς τα εμπρός 5 ‘TGCGATGGCTGCACACA 3’, αντίστροφη 5 ‘TCCCTTAGAGCAACCCATACAAC 3’. Η αποδοτικότητα των αντιδράσεων PCR υπολογίστηκε χρησιμοποιώντας καμπύλες αναφοράς με διαδοχικές αραιώσεις του cDNA. Οι αναλογίες κανονικοποιημένες τιμές γονιδιακής έκφρασης προσδιορίστηκαν χρησιμοποιώντας τη σχετική εξίσωση ποσοτικοποίησης που διορθώνει τις διαφορές στην αποδοτικότητα της PCR [25]. Τέλος, τα δεδομένα έκφρασης γονιδίου συγκρίθηκαν μεταξύ των δειγμάτων όγκου και ελέγχου χρησιμοποιώντας το Mann-Whitney U.

κουνελιού πολυκλωνικό αντιορό προς την μεταβλητή περιοχή του ανθρώπινου προκολλαγόνου 11A1 (αντι-proCOL11A1 pAb)

έχουν περιγράψει προηγουμένως τη δημιουργία αυτού του αντιορού [23]. Εν συντομία, μετά η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη σύντηξης COL11A1-TGSt κατασκευάστηκε, εκφράστηκε και καθαρίστηκε, ένα λευκό κουνέλι Νέας Ζηλανδίας ενέθηκε ενδομυϊκά σε διαστήματα 2 εβδομάδων με 2 ml ανοσογόνου γαλακτώματος της πρωτεΐνης καθαρισμένου COL11A1-T-GST σύντηξης (βλέπε File S2). Ο αντιορός που λαμβάνεται με καρδιακή παρακέντηση εξαντλήθηκε της αντιδραστικότητας anti_GST. Το κλάσμα IgG καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας Protein ASepharose.

μονοκλωνικού αντισώματος ποντικού ανθρώπινου προκολλαγόνου 11A1 (αντι-proCOL11A1 mAb)

Η μεθοδολογία για τη δημιουργία του proCOL11A1 μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-ανθρώπινου και για τον χαρακτηρισμό αυτών έχει δημοσιευτεί [24]. Συνοπτικά, η καθαρισμένη πρωτεΐνη σύντηξης COL11A1-T-GST χρησιμοποιήθηκε για υπερανοσοποίηση ποντικών BALB /c. Χρησιμοποιώντας Sp2 /0 κύτταρα μυελώματος ως εταίρος σύντηξης, Β-κυττάρου υβριδώματα παρήχθησαν με πρότυπες μεθόδους. Το αντίσωμα, DMTX1, δόθηκε από Oncomatrix, SL, Δέρειο, η Ισπανία (Ref # P0002, πολλά # 200212).

Δημιουργία κυτταρικών καλλιεργειών

Τα δείγματα ελήφθησαν από την περιοχή του όγκου, περιογκική περιοχής και κανονικής περιοχής, χρησιμοποιώντας διαφορετικές χειρουργικές λεπίδες για να αποφευχθεί η μόλυνση. Εκπρόσωπος δείγματα ιστολογικά εξετάστηκαν. Τα δείγματα μεταφέρθηκαν σε RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen) συμπληρωμένου με αμικακίνη και βανκομυκίνη (νορμον Laboratories, Μαδρίτη, Ισπανία, τόσο σε 40 μg /ml) στο εργαστήριο καλλιέργειας όπου είχαν κοπεί σε μικρότερα τεμάχια χρησιμοποιώντας χειρουργικό ψαλίδι. Τα θραύσματα που λήφθηκαν ενζυματικώς πέψη με κολλαγενάση (τύπου Ι 2 mg /ml, Sigma) για 1-2 ώρες. Μετά την πέψη, το διάλυμα κολλαγενάσης φυγοκεντρήθηκε στα 400 g για 10 λεπτά. Το ίζημα επαναιωρήθηκε σε ένα μέσο ινοβλαστών καλλιέργειας (τροποποιημένο μέσο Eagle του Dulbecco (Gibco, Invitrogen) συμπληρωμένου με 10% ορό εμβρύου μόσχου (FCS, Gibco, Invitrogen), αμικακίνη και βανκομυκίνη (αμφότερα στα 40 μg /ml). Τα θραύσματα ιστού που δεν είχε υποστεί πέψη με κολλαγενάση υποβλήθηκαν σε δεύτερη χώνευση με 0.05% θρυψίνη και 0.02% EDTA (T /E, Gibco, Invitrogen, Βαρκελώνη, Ισπανία) για 30-60 λεπτά. Το απομακρύνθηκε T /E αδρανοποιήθηκε με μέσο καλλιέργειας που περιέχει ορό (DMEM + 10% FCS) και φυγοκεντρήθηκε στα 400 g για 10 λεπτά. Το σφαιρίδιο επαναιωρήθηκε σε μέσο ινοβλαστών καλλιέργειας. Τα κύτταρα που λαμβάνονται από πέψη κολλαγενάσης και θρυψίνη πέψη σπάρθηκαν σε πλάκες έξι φρεατίων χρησιμοποιώντας μέσο ινοβλαστών καλλιέργειας και διατηρήθηκε στους 37 ° C σε έναν επωαστήρα 5% CO2. το μέσο αλλάχθηκε κάθε 3 ημέρες. Όταν η κύρια καλλιέργεια συμβολή, τα κύτταρα πλύθηκαν δύο φορές με PBS και υφίσταται κατεργασία με Τ /Ε έως ότου αποκολληθεί. στη συνέχεια, το T /E εξουδετερώθηκε με καλλιέργεια μεσαίες και φυγοκέντρηση σε 400 g για 10 λεπτά για να ανακτηθούν τα κύτταρα. Όλα τα στρωματικά κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν σε πρώτα περάσματα (διελεύσεις 3-6). Η καθαρότητα των κυττάρων στρωματικών κυττάρων εκτιμήθηκε με μορφολογία και με ανοσοχρώση για βιμεντίνη.

Ανοσοϊστοχημεία και διπλό ανοσοχρώση σε παγκρεατικό ιστό εκτομή

Ο ιστός που λαμβάνεται από τα δείγματα πάγκρεας ορίστηκε σε φορμαλδεΰδη 10% διάλυμα, ενσωματωμένα σε παραφίνη, κόβονται 3 μm πάχους και χρωματίστηκαν με Η &? Ε για ιστολογική εξέταση. Το αντιγόνο ανάκτηση πραγματοποιήθηκε με θέρμανση των δειγμάτων σε

PTLink

(DakoCytomation, Δανία) σε ρυθμιστικό διάλυμα σε υψηλό ρΗ για 20 λεπτά. Η ενδογενής δραστικότητα υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με

υπεροξειδάσης Blocking Reagent

(DakoCytomation, Δανία) για 5 λεπτά. Τα δείγματα επωάστηκαν στους 37 ° C με τα πρωτογενή αντισώματα που περιγράφονται στον Πίνακα 1, επωάστηκαν με το EnVision HRP Flexsystem (DakoCytomation, Δανία) επί 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, και χρωματίστηκαν με DAB (3-3′-Διαμινοβενζιδίνη) (DakoCytomation, Δανία) για 10 λεπτά. Τέλος, ήταν αντίθετη χρώση για 10 λεπτά με αιματοξυλίνη (DakoCytomation, αφυδατωμένο και τοποθετούνται σε Entellan® (Merck, Germany) AntiproCOl11A1 pAb προσδιορίστηκε σε 1:.. 2000 σε ρυθμιστικό S2022 (Dako)

πρωτογενή αντισώματα (είδη)

Clone

Εμπορική αναφορά

Αραίωση

χρόνος επώασης (min)

ProCOL11A1 (mAb) 1E8.33 (DMTX1) Oncomatrix1: 40030ProCOL11A1 (pAB) Oncomatrix1.200030Alpha-ακτίνη των λείων μυών (mAb) 1A4Dako, DenmarkR-t-U20Desmin (mAb) D33Dako, DenmarkR-t-U20GFAP (mAb) GA-5Biogenex, Η Netherlands1: 20020Citokeratin 7 (mAb) OV-TL 12 /30Dako, DenmarkR-t-U20Vimentin (pAB) C-20Santa Cruz Biotech , Γερμανία1:. 60010Table 1. Τα αντισώματα που χρησιμοποιούνται στην ανοσοϊστοχημική ανάλυση

(pAB) Πολυκλωνικά Κουνέλι, (mAb) μονοκλωνικά ποντίκι, RTU έτοιμο προς χρήση CSV Λήψη CSV

για να εκτιμηθεί η συν-έκφραση της Pro-Col11A1 με μεσεγχυματικά (αSMA και VIM), επιθηλιακά (CK7), και παγκρεατικών κυττάρων αστεροειδής (δεσμίνη, γλοιακή ινιδική όξινη πρωτεΐνη δείκτες-GFAP-), διπλή ανοσοχρώση πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας το ultra άποψη κιτ ανίχνευσης καθολική αλκαλική φωσφατάση Red (Ventana Medical Systems, Tucson, ΑΖ) ως ερυθρό χρωμογόνου και DAB ως καφέ χρωμογόνου. Προηγουμένως, τα δείγματα είχαν επωάζονται στους 37 ° C με τα πρωτογενή αντισώματα που περιγράφονται στον Πίνακα 1.

Immunocytofluorescence καλλιεργημένων στρωματικών κυττάρων και Ομοεστιακή Μικροσκοπία

κύτταρα μονιμοποιήθηκαν σε ακετόνη (-20 ° C ) για 10 λεπτά στο slide θάλαμο. Τα κύτταρα ξηραίνονται σε θερμοκρασία δωματίου και στη συνέχεια εισήχθησαν στο ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης (Dako) επί 30 λεπτά. Τα δείγματα επωάστηκαν με το αντι-proCOl11A1 mAb, (DMTX1, Oncomatrix) με Cytokeratin 7 (CK7) αντίσωμα και αντίσωμα VIM, σε θερμοκρασία δωματίου, κάτω από τις συνθήκες που καθορίζονται στον Πίνακα 1. Τα δευτερεύοντα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν πράσινο αντι-κουνελιού Alexa- 488 (1: 500, Invitrogen) και κόκκινο αντι-κουνελιού Alexa-546 (1: 500, Invitrogen), για 1 ώρα σε θερμοκρασία δωματίου. Τέλος, οι τομές τοποθετήθηκαν με μέσο στερέωσης περιέχει DAPI (Vector Labs).

Η colocalization (proCOL11A1 εναντίον VIM, proCOL11A1 εναντίον CK7, proCOL11A1 εναντίον αSMA και VIM εναντίον CK7) οπτικοποιήθηκε και φωτογραφήθηκε χρησιμοποιώντας μια Leica TCS SP2 συνεστιακό μικροσκόπιο με 63X και 100Χ στόχους εμβάπτιση λάδι, χρησιμοποιώντας το ακόλουθες πηγές φωτισμού για κάθε φθοριόχρωμα διέγερση:. Αργό /κρυπτό laser (488 nm), Ήλιο /Neon laser (546 nm) και το μπλε-ιώδες διόδων (405 nm)

PDAC εναντίον αξιολόγηση CP ανοσοϊστοχημεία

η αξιολόγηση πραγματοποιήθηκε σε τέσσερις περιοχές που επιλέγονται ως οι καλύτερες εκπροσώπους του δεσμοπλαστικού αντίδρασης. Περιπτώσεις που παρουσιάζονται 4 θετικά πεδία, μέσω του στόχου 10Χ είχαν ανατεθεί η μέγιστη βαθμολογία των 4, ενώ οι αρνητικές πεδία ανέθεσε την ελάχιστη βαθμολογία 0. Για την αξιολόγηση χρώση, ένα πεδίο 20Χ στη μεγαλύτερη περιοχή με την πιο έντονη χρώση ( «hot spot «) επιλέχθηκε. Περιπτώσεις με λιγότερο από 1% θετικά κύτταρα σε σχέση με την επιφάνεια στρωματικά είχαν ανατεθεί ένα σκορ 0, περιπτώσεις με μεταξύ 1 και 10% είχαν ανατεθεί ένα σκορ 1, περιπτώσεις μεταξύ 10% και 50% είχαν ανατεθεί ένα σκορ 2, και περιπτώσεις με περισσότερο από 50% θετικά κύτταρα αποδίδεται μια βαθμολογία 3. συνολικός διακύμανση χρώση ορίστηκε πολλαπλασιάζοντας τον αριθμό των θετικών πεδίων (0-4) με την ένταση χρώσης του πεδίου (0-3), δίδοντας ένα συνολικό σκορ 0-12. Η ανοσοχρώση ήταν διπλή-τυφλή σκόραρε από δύο παθολόγους (CGP και JGG). Μια σειρά από 24 PDAC και 16 CP ανοσοχρωματίστηκε πλάκες και ποσοτικά μέσω του προγράμματος ανάλυσης εικόνας QWin (Leica), προκειμένου να τα συγκρίνει με τα αποτελέσματα των παθολόγων ». Εικόνες από την μεγαλύτερη περιοχή με την πιο έντονη χρώση ελήφθησαν μέσω του στόχου 20Χ του ένα μικροσκόπιο Olympus BX61 και καταγράφονται σε μια φωτογραφική μηχανή της Olympus DP70.

Η στατιστική ανάλυση των δεδομένων

Υποθέτοντας άνισες διακυμάνσεις, εφαρμόσαμε η δοκιμή Welch να προσδιοριστεί η σημασία των διαφορών στα δεδομένα εικόνας μεταξύ PDAC και δείγματα χρόνιας παγκρεατίτιδας. Το τεστ ANOVA εφαρμόστηκε επίσης. Η συσχέτιση μεταξύ των διαφόρων παραμέτρων απεικόνισης εκτιμήθηκε χρησιμοποιώντας την δοκιμή συσχετισμού Spearman Rank. Η ευαισθησία και η ειδικότητα της proCOL11A1 απεικονιζόταν ως ανάλυση λειτουργίας δέκτη χαρακτηριστικό (ROC). Η ακρίβεια (δηλαδή ταξινομείται ορθώς περιπτώσεις) υπολογίστηκε. Η θέση του cut-off στην καμπύλη θα καθορίσει τον αριθμό των πραγματικά θετικά, αλήθεια αρνητικά, ψευδώς θετικά και ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα. Η αξία κριτήριο είναι το cut-off που αντιστοιχεί στην υψηλότερη ακρίβεια (ελάχιστη ψευδώς αρνητικά και ψευδώς θετικά αποτελέσματα). Το μέγεθος του δείγματος που χρησιμοποιείται στην ανοσοϊστοχημική μελέτη μας (n = 77) μας επέτρεψε να επιτύχουμε στατιστική σημασία (άλφα = 0.05) για την AUC = 0.9 κάτω από την μηδενική υπόθεση ενός AUC = 0.5, με στατιστική δύναμη του 90%. Όλες οι αναλύσεις εκτελέστηκαν χρησιμοποιώντας το στατιστικό πακέτο για τις Κοινωνικές Επιστήμες (SPSS 13) ή MedCalc v9.4.1.0.

Αποτελέσματα

Q-RT-PCR των COL11A1 και ανοσοϊστοχημεία των παγκρεατικών ιστών με αντι-proCOL11A1

παγκρεατικά καρκινικά κύτταρα εκφράζουν υψηλά επίπεδα mRNA COL11A1, όπως φαίνεται με ποσοτική RT-PCR (Εικόνα 1). Τα αποτελέσματα επιβεβαίωσαν μια σημαντικά αυξημένη έκφραση του γονιδίου COL11A1 σε δείγματα PDAC εναντίον κανονική και CP δείγματα (πάσο αλλαγή: 174? SLR: 7)

Η

Όλα τα δείγματα PDAC δοκιμάστηκε με αντι-proCOL11A1 mAb και. με antiproCOL11A1 pAb έδειξε ισχυρή ενδοκυτταροπλασματική επισήμανση των όγκων-γύρω δεσμοπλαστικού CAFS στρωματικά (Σχήμα 2Ε? Σχήμα S1D στο αρχείο S1). Η χρώση δεν ήταν ευρέως διαδεδομένη, αλλά μάλλον εντοπίζεται σε περιορισμένες περινεοπλαστικό περιοχές, ακόμη και όταν τα καρκινικά κύτταρα δεν παρατηρήθηκαν. Τα μορφολογικά χαρακτηριστικά αυτών των ινοβλαστών ομοιάζουν με στρωματικά κύτταρα ήταν συμβατά με αυτά της μυοϊνοβλαστών (Σχήμα SLE, F στο S1 File). Εξωκυτταρική χρώση δεν παρατηρήθηκε ποτέ. Σε αντίθεση, η έκφραση του proCOL11A1 σε δείγματα χρόνιας παγκρεατίτιδας ήταν είτε απών (Εικόνα 2Α? Σχήμα S1B στον Ι1 File) ή πολύ χαμηλή και περιορίζεται σε λίγες στρωματικά κύτταρα. CP στρώμα έδειξε ινωτικές και φλεγμονώδεις αλλαγές χωρίς αξιόλογη μυοϊνοβλαστικά πληθυσμού. Κανονική πάγκρεας και επιθηλιακά κύτταρα του όγκου, από την άλλη πλευρά, δεν έδειξε καμία χρώση καθόλου με αντι-proCol11A1 (Σχήμα S2 σε File S1). Κανονική παγκρέατος έδειξαν χρώση με VIM και αSMA, αλλά δεν βάφουν με GFAP. Η πλειοψηφία των CP (Εικόνες 2C, D) και PDAC (Σχήματα 2G, Η) στρωματικά κύτταρα έδειξαν ισχυρή ενδοκυττάρια χρώση με VIM και αSMA. Η χρώση με δεσμίνης ήταν έντονη σε PDAC (Σχήμα 2F) δείγματα, αλλά ανύπαρκτη στην CP (Σχήμα 2Β) δείγματα. Εικόνα S3 στο αρχείο S1 δείχνει θετική χρώση με αντι-proCOL11A1 mAb (βαθμολογία 4) και δεσμίνης σε περίπτωση αυτοάνοσης παγκρεατίτιδας? Επιπλέον, παρατηρείται έντονη θετικότητα με VIM και αSMA, και την αρνητικότητα με GFAP.

στρωματικά κύτταρα σε CP ήταν αρνητικά για αντι-proCOL11A1 mAb (Α) και δεσμίνης (Β), ενώ ένα σημαντικό αριθμό στρωματικά κύτταρα του PDAC εκφράζεται αντι-proCOL11A1 mAb (Ε) και δεσμίνης (F). Σε CP και PDAC ο λεκές από στρωματικά κύτταρα για αSMA (C και G, αντιστοίχως) και VIM (Δ και Η, αντίστοιχα) ήταν διάχυτη και μη-επιλεκτική. Anti-proCOL11A1 mAb (Α και Ε), δεσμίνης (Β και F), αSMA (C και G) και VIM (D και H) (όλες οι μικροφωτογραφίες σε × 400, bar Κλίμακα 50 μm).

Η

Χαρακτηρισμός του παγκρέατος CAFS

για να χαρακτηρίζουν την CAFS, τμήματα παγκρεατικός ιστός ήταν διπλή χρώση για proCOL11A1 /δεσμίνη, proCOL11A1 /αSMA, proCOL11A1 /VIM, proCOL11A1 /GFAP, proCOL11A1 /CK7 και CK7 /VIM (Σχήμα 3 ). Ένας πολύ μεγάλος αριθμός των μεσεγχυματικών κυττάρων έντονα επισημανθεί προς VIM και αSMA. Ανοσοχρώση με GFAP ήταν αρνητική. Ως αναλογία ένας μικρός αριθμός των κυττάρων ήταν proCOL11A1 + και δεσμίνη +. Συν-χρώση VIM ή CK7 με proCOL11A1 εντοπιστεί ένα υποσύνολο του CAFS με το φαινότυπο μεσεγχυματικά (proCOL11A1 + /VIM +) και πολύ λίγα κύτταρα με την επιθηλιακή φαινότυπο (proCOL11A1 + /CK7 +) (Σχήματα 3 και Ε, αντίστοιχα). Μερικά δεσμίνης ή αSMA κύτταρα συν-χρώση με proCOL11A1 (Σχήμα 3 Α και Β, αντίστοιχα). Ωστόσο, τα δείγματα CP στρώματος δεν έδειξαν χρώση με proCOL11A1, δεσμίνης ή GFAP, και δεν υπήρχε συν-χρώση (Σχήμα 4).

Α, αντι-proCOL11A1 (καφέ)

vs

. δεσμίνης (ματζέντα)? Β, αντι-proCOL11A1 (καφέ)

vs

. αSMA (ματζέντα)? C, αντι-proCOL11A1 (καφέ)

vs

. VIM (ματζέντα)? D, αντι-proCOL11A1 (καφέ)

vs

. GFAP (δεν χρώση)? Ε, αντι-proCOL11A1 (καφέ) έναντι CK7 (ματζέντα)? F, CK7 (επιθηλιακών κυττάρων του όγκου:

καφέ

) εναντίον VIM (ματζέντα) (όλες οι μικροφωτογραφίες σε × 200, Κλίμακα bar 200 μm? Ένθετο X1000).

Η

Α, αντι-proCOL11A1 (καφέ)

vs

. δεσμίνης (ματζέντα)? Β, Anti-proCOL11A1 (καφέ)

vs

. αSMA (ματζέντα)? C, αντι-proCOL11A1 (καφέ)

vs

. VIM (ματζέντα)? D, αντι-proCOL11A1 (καφέ)

vs

. GFAP (δεν χρώση)? Ε, αντι-proCOL11A1 (καφέ) έναντι CK7 (ματζέντα)? F, CK7 (επιθηλιακών κυττάρων του όγκου:

καφέ

) εναντίον VIM (ματζέντα) (όλες οι μικροφωτογραφίες σε × 200, Κλίμακα bar 200 μm).. .

Η

Η κατανομή των κυττάρων των καλλιεργημένων CAFS αναλύθηκε με colocalization με immunocytofluorescence. Τα προκύπτοντα δεδομένα που απεικονίζονται στον πίνακα 2 (Σχήμα 5). Η ερμηνεία του πίνακα έχει ως εξής: όταν ένας διπλός χρώση εφαρμόστηκε στα καλλιεργημένα παγκρεατικά CAFS, για παράδειγμα proCOL11A1 και CK7, συνολικά 188 κύτταρα χρωματίστηκαν? Από αυτά, 82 κύτταρα σημάνθηκαν με αντι-proCOL11A1, 60 κύτταρα ήταν θετικά CK7, και 46 κύτταρα βάφτηκαν με τα δύο αντισώματα. Η ίδια λογική ισχύει και για τα υπόλοιπα χρώσεις. Σύμφωνα με τα δεδομένα που φαίνονται στον Πίνακα 2, μεταξύ proCOL11A1 κύτταρα, το 36% είναι CK7 +, 49% είναι VIM + και το 48% είναι αSMA +? μεταξύ των κυττάρων με τον φαινότυπο VIM, το 21% είναι proCOL11A1 + και μόνο το 8% είναι CK7 +? 33% των κυττάρων αSMA μοιράζονται το φαινότυπο proCOL11A1? και, τέλος, το 45% των κυττάρων CK7 έχουν την VIM + φαινότυπο και το 43% έχουν το φαινότυπο proCOL11A1. Η κατανομή των proCOL11A1, CK7 και δεσμίνη φαινοτύπων σε δείγματα ιστού παρουσιάζεται στον Πίνακα S2 σε S1 αρχείου. Δεν ήταν δυνατόν να αναλυθούν τα εν λόγω πεδία στα οποία κύτταρα είναι VIM + και αSMA +, λόγω του μεγάλου αριθμού των βαμμένων κυττάρων, γεγονός που καθιστά περίπλοκο να εξατομικεύσει και να μετρήσει τους. Σύμφωνα με τα δεδομένα που φαίνονται στον Πίνακα S2 σε File S1, 18% των κυττάρων proCOl11A1 είναι CK7 +, και 21% είναι δεσμίνης +? 45% αυτών των κυττάρων με χρώση δεσμίνης έχουν το φαινότυπο proCOL11A1, και το 50% των κυττάρων CK7 είναι proCOL11A1.

ProCOL11A1 /CK7 (DI)

proCOL11A1 /VIM (DI)

proCOL11A1 /αSMA (DI)

VIM /CK7 (DI)

proCOL11A1 + μόνο 82 (43%) proCOL11A1 + μόνο 106 (18%) proCOL11A1 + μόνο 73 (23%) VIM + μόνο 364 (85%) CK7 + μόνο 60 (32%) VIM + μόνο 370 ( 64%) αSMA + μόνο 138 (50%) CK7 + μόνο 36 (8%) proCOL11A1 + /CK7 + 46 (25%) proCOL11A1 + /VIM + 101 (18%) proCOL11A1 + /αSMA + 67 (24%) VIM + /CK7 + 30 (7%) Σύνολο 188 (100%) Σύνολο 577 (100%) Σύνολο 278 (100%) Σύνολο 430 (100%) Πίνακας 2. Ποσοτική ανάλυση της κατανομής των κυττάρων σε καλλιεργημένα περινεοπλασματικής παγκρεατικό καρκίνο ινοβλαστών (δίοδος 3)

*.

* ένα δείγμα του ασθενούς, την αποτίμηση σε πέντε πεδία για κάθε πείραμα της διπλής ανοσοχρώση (DI). Τα κύτταρα χρωματίστηκαν με αμφότερα Ab με έντονους χαρακτήρες. CSV Λήψη CSV

Διπλή χρώση φθορισμού δείχνει την παρουσία των κυττάρων proCOL11A1 + /CK7 +, proCOL11A1 + /αSMA + και proCOL11A1 + /VIM +.

Κόκκινο

: proCOL11A1?

πράσινο

: CK7, αSMA και VIM, αντίστοιχα?

μπλε

: πυρήνες. Ένθετα: λαμβάνεται τυχαία πεδία υψηλής ισχύος του πολιτισμού. Κλίμακα bar 100 μm (X200) και 20 μm (X630).

Η

PDAC εναντίον CP

Τα χαρακτηριστικά του κάθε ασθενή και η βαθμολογία ανοσοχρώση proCOL11A1 παθολόγο του /της φαίνονται στον Πίνακα S3 στο S1 αρχείου. Υπήρχε μια στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ PDAC και χρόνιας παγκρεατίτιδας στο σκορ mAb (μέση ± SD: 7,33 ± 4,04 έναντι 0,61 ± 1,33? Ρ & lt? 0,0001). Τα δεδομένα παρουσιάζονται στο Σχήμα 6. Η AUC του ROC καμπύλες PDAC εναντίον CP ήταν 0.936 (0.851 να 0.981), Ρ & lt? 0,0001 (Σχήμα 7). Η ανοσοχρώση έδειξε ευαισθησία 92% και ειδικότητα 83% σε διακρίσεις PDAC από CP, με ακρίβεια 90%. Η χρήση pAb έδειξε παρόμοια αποτελέσματα διακρίσεις PDAC από CP (Πίνακας S4 στο αρχείο S1). Παρατήρησης συμφωνία μεταξύ των παθολόγων ήταν & gt? 90%. Η βαθμολογία χρώση δεν σχετίζεται με την ηλικία, το φύλο, το στάδιο του όγκου ή ποιότητας των ασθενών. Η σύνδεση με τον ασθενή συνολική επιβίωση δεν ερευνήθηκε επειδή ο αριθμός των ασθενών PDAC με χαμηλό σκορ ήταν πολύ χαμηλή (4/51 περιπτώσεις)

Bars:.. ± 1 SD

Η

μ υποδεικνύει το σημείο αποκοπής με τον καλύτερο διαχωρισμό (ελάχιστη ψευδώς αρνητικά και ψευδώς θετικά αποτελέσματα) μεταξύ των δύο ομάδων.

η

ανοσοβαφή αξιολογήθηκε επίσης χρησιμοποιώντας το λογισμικό ανάλυσης εικόνας QWin. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα S5 στο S1 αρχείου. Υπάρχει μια στατιστική διαφορά μεταξύ PDAC και CP του αριθμού των θετικών κυττάρων στην λεκιασμένη επιφάνεια και στην περιοχή αναφοράς. Εντός της ίδιας σειράς, υπήρχε υψηλή αντιστοιχία μεταξύ της βαθμολογίας παθολόγος και τα δεδομένα QWin όπως το εμβαδόν της επιφάνειας των βαμμένων κυττάρων και του αριθμού των θετικών κυττάρων (συντελεστής Spearman του βαθμού συσχέτισης = 0,825 και 0,825, αντίστοιχα). καμπύλη ROC AUC δεδομένα ελήφθησαν για τις έξι παραμέτρους ανάλυσης εικόνας (Πίνακας S6 στο S1 αρχείου). Όλες οι παράμετροι επιτρέπουν διακρίσεις μεταξύ PDAC και χρόνιας παγκρεατίτιδας. Οι πιο σημαντικές παράμετροι ήταν ο αριθμός των θετικών κυττάρων και η επιφάνεια των χρωματισμένων κυττάρων.

Συζήτηση

Οι μικροσυστοιχίες DNA επιτρέπουν την ταυτόχρονη ανάλυση του επιπέδου έκφρασης χιλιάδων γονιδίων και θα μπορούσαν να αποσαφηνιστούν οι μηχανισμοί του παγκρέατος καρκινογένεση [26-31]. Η πρώτη μελέτη για την εφαρμογή αυτή η τεχνική για τον καρκίνο του παγκρέατος που προσδιορίζονται με επιτυχία ένα σύνολο των γονιδίων που εκφράζεται διαφορικά σε καρκίνο του παγκρέατος [32]. Άλλες μελέτες οδήγησαν στην αναγνώριση και των δύο προηγουμένως περιγράφονται και νέες υποψήφια γονίδια [33-39,50]. Τα περισσότερα από τα γονίδια που δεν κατέστη δυνατόν να επικυρωθεί από άλλες πιο ακριβείς τεχνικές είτε στο mRNA ή του επιπέδου της πρωτεΐνης. Έχουμε επικεντρωθεί μελέτες μας σε αυτά τα γονίδια με πιθανό ενδιαφέρον ως δείκτες ή /και θεραπευτικούς στόχους [23], ένα εκ των οποίων είναι COL11A1.

Στην έκθεση αυτή επαληθεύει την ανοσοϊστοχημική έκφραση της COL11A1 σε PDAC. Προηγούμενες παρατηρήσεις σχετικά με την έκφραση των COL11A1 σε άλλους καρκίνους [40-44] περιορίστηκαν σε διαφορική γονιδιακή έκφραση αναλύσεις επικυρώνονται με ποσοτική RT-PCR, κηλίδες Northern ή /και σε υβριδοποίηση mRNA situ. Πρόσφατα, η έκφραση του κολλαγόνου XI και σε φυσιολογικά και κακοήθη ιστό κόλου του ανθρώπου έχει αξιολογηθεί με ανοσοϊστοχημεία [45].

Μια υπολογιστική ανάλυση της γονιδιακής έκφρασης σε πολλαπλά καρκίνους [46] αποκαλύπτει ότι υπερέκφραση του COL11A1 και άλλων γονιδίων είναι ένας βιολογικός δείκτης υψηλής εξειδίκευσης για την εισβολή του καρκίνου και προβλέπει την απάντηση στην εισαγωγική θεραπεία. Η ρύθμιση προς τα κάτω του COL11A1 σε in vitro συν-καλλιέργειες καρκίνου του παγκρέατος και στρωματικά κύτταρα [47] έχει αναφερθεί. Αυτές οι in vitro παρατηρήσεις δεν υποστηρίζονται από ex vivo δεδομένων? η τεχνητή in vitro συνθήκες δεν πληρούσε όλες τις προϋποθέσεις, ούτε την πολυτέλεια όλους τους τοπικούς παράγοντες που συμβάλλουν στην υψηλή έκφραση COL11A1.

Για τις γνώσεις μας, δεν υπάρχει ειδική σήμανση για CAFS έχει αναφερθεί. Συμβατική χρώση δεν έδειξε διαφορές μεταξύ CAFS και φυσιολογικών ινοβλαστών. Α: CP (H & amp? Ε). Β: CP αρνητική αντι-proCOL11A1 λεκέ. C: PDAC (H & amp? Ε). H & amp? Α, αντι-proCOL11A1 mAb, θετικός έλεγχος (ένθετο): κυτταρική σειρά Α204? Β, δεσμίνη, θετικός έλεγχος (ένθετο): προσάρτημα? C, άλφα-ακτίνη των λείων μυών, θετικός έλεγχος (ένθετο): προσάρτημα? D, βιμεντίνη, θετικός έλεγχος (ένθετο): προσάρτημα)? Ε, GFAP, θετικός έλεγχος (ένθετο): αστροκύτωμα). Σειριακές τομές (όλες οι μικροφωτογραφίες σε × 200, Κλίμακα bar 200 μm). Α, αντι-proCOL11A1 mAb, θετικός έλεγχος (ένθετο): κυτταρική σειρά Α204)? Β, δεσμίνη, θετικός έλεγχος (ένθετο): προσάρτημα)? C, άλφα-ακτίνη των λείων μυών, θετικός έλεγχος (ένθετο): προσάρτημα)? D, βιμεντίνη, θετικός έλεγχος (ένθετο): προσάρτημα)? Ε, GFAP, θετικός έλεγχος (ένθετο): αστροκύτωμα). Σειριακές τομές (όλες οι μικροφωτογραφίες σε × 200, Κλίμακα bar 200 μm).