Αφηρημένο

Ιστορικό

Για να βελτιωθεί η έκβαση των ασθενών που πάσχουν από καρκίνο του στομάχου, ένα καλύτερη κατανόηση των υποκείμενων γενετικών και επιγενετικών γεγονότα σε αυτή την κακοήθεια απαιτείται. Αν και CpG νησί methylator φαινότυπο (CIMP) και αστάθεια μικροδορυφόρου (MSI) έχουν δειχθεί να παίζει καθοριστικό ρόλο στην παθογένεση γαστρικό καρκίνο, η κλινική σημασία αυτών των γεγονότων σχετικά με τα αποτελέσματα της επιβίωσης σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου παραμένει άγνωστη.

Μέθοδοι

Αυτή η μελέτη περιλάμβανε έναν ασθενή ομάδα με παθολογικά επιβεβαίωσε γαστρικό καρκίνο οι οποίοι είχαν χειρουργική εκτομές. Μια ομάδα από 68 γαστρικών καρκίνων αναλύθηκε. CIMP και MSI καταστάσεις προσδιορίστηκαν με την ανάλυση υποστηρικτής CpG νησιωτικός μεθυλίωσης των 28 γονιδίων /τόπους, και της γονιδιωματικής αστάθειας σε 10 δείκτες μικροδορυφορικού, αντίστοιχα. ανάλογο μοντέλο κινδύνους ενός Cox, έγινε για πολυπαραγοντική ανάλυση όπως η ηλικία, το στάδιο, η διαφοροποίηση του όγκου,

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης, και σε συνδυασμό CIMP /

MLH1

κατάσταση μεθυλίωσης σε σχέση με τη συνολική επιβίωση (OS).

Αποτελέσματα

με την πολυπαραγοντική ανάλυση, πλέον OS συσχετίστηκε σημαντικά με χαμηλότερο παθολογικό στάδιο (

P

= 0,0088), καλύτερη διαφοροποίηση του όγκου (

P

= 0.0267) και CIMP-υψηλής και

μετουσιωμένο κατάσταση MLH1 3 ‘

(

P

= 0,0312). Διαστρωμάτωση της κατάστασης CIMP σε σχέση με

MLH1

κατάσταση μεθυλίωσης περαιτέρω να ενεργοποιήσετε την πρόβλεψη του γαστρικού πρόγνωση του καρκίνου.

Συμπεράσματα

CIMP και /ή

MLH1

κατάσταση μεθυλίωσης μπορεί να έχει μια δυνατότητα να είναι προγνωστικοί βιοδείκτες για τους ασθενείς με καρκίνο του στομάχου

Παράθεση:. Shigeyasu K, Nagasaka Τ, Mori Υ, Yokomichi Ν, Kawai Τ, Fuji T, et al. (2015) Κλινική σημασία του MLH1 μεθυλίωση και CpG νησί Methylator φαινότυπου ως προγνωστικοί δείκτες σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. PLoS ONE 10 (6): e0130409. doi: 10.1371 /journal.pone.0130409

Επιμέλεια: Hassan Ashktorab, Πανεπιστήμιο Howard, Ηνωμένες Πολιτείες |

Ελήφθη: 18 του Φλεβάρη, 2015? Αποδεκτές: 20η Μαΐου του 2015? Δημοσιεύθηκε: 29, Ιουνίου, 2015

Copyright: © 2015 Shigeyasu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του Υποστηρίζοντας αρχεία πληροφοριών του χαρτιού και

Χρηματοδότηση:. η εργασία αυτή χρηματοδοτήθηκε από KAKENHI επιχορηγήσεις 19390351 και 20590572 για να TN, και με επιχορηγήσεις R01 CA72851 και 181.572 από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας, και κονδύλια από το Baylor Research Institute στο AG

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

καρκίνο του στομάχου είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου. -σχετικών θανάτων, με περίπου 700.000 επιβεβαίωσε θνησιμότητας κάθε χρόνο σε όλο τον κόσμο, αν και η συχνότητα έχει μειωθεί σταδιακά [1-3]. γαστρικό καρκίνο γενικά διαγιγνώσκεται σε προχωρημένο στάδιο, που είναι η κύρια αιτία της κακής πρόγνωσης του [4]. Για να βελτιωθεί η έκβαση του γαστρικού καρκίνου, απαιτείται ταυτοποίηση γενετικών ή επιγενετικών γεγονότα στην εξέλιξη του καρκίνου του στομάχου. Το πιο σημαντικό γεγονός επιγενετικό στην εξέλιξη του καρκίνου είναι η μεθυλίωση του υποκινητή περιοχών CpG βασικών ογκοκατασταλτικών γονιδίων. CpG νησίδες είναι σχεδόν 1-kb μακρές ακολουθίες DNA με υψηλή περιεκτικότητα σε γουανίνη-κυτοσίνη σε περιοχές προαγωγού των γονιδίων [5]. Σε αντίθεση με τα κανονικά κύτταρα, CpG νησίδων εντός όγκου γονίδια καταστολής στα καρκινικά κύτταρα συχνά υπερμεθυλιωμένο, οδηγώντας σε μια CpG φαινότυπο νησί methylator (CIMP) [6,7]. Επιγενετική αποσιώπηση γονιδίων όγκων που σχετίζονται λόγω CpG νησί μεθυλίωση έχει πρόσφατα αναφερθεί σε γαστρικό καρκίνο. Η ανώμαλη CpG νησί μεθυλίωση & gt? 100 ανάπτυξης ρυθμιστικών γονιδίων σε γαστρικό καρκίνο έχει μέχρι σήμερα αναφερθεί [8-24], ωστόσο, η κλινική σημασία της CIMP σε γαστρικό καρκίνο παραμένει ανεξερεύνητη και ελάχιστα κατανοητό

Σε αντίθεση. , επισκευή αναντιστοιχία (MMR) ανεπάρκεια σε γαστρικό καρκίνο είναι επίσης ένα σημαντικό γενετικό συμβάν. Γενωμική αστάθεια στο εσωτερικό του αριθμού των επαναλήψεων μικροδορυφόρων (ή μικροδορυφόρων) ονομάζεται μικροδορυφορικού αστάθεια (MSI). MSI είναι ένα χαρακτηριστικό που προκαλείται από ένα ελαττωματικό σύστημα DNA MMR. Λειτουργική απενεργοποίηση των γονιδίων MMR, όπως

MLH1

ή

MSH2

, με μεθυλίωση προαγωγού είναι υπεύθυνη για το φαινότυπο MSI-υψηλή (MSI-H) σε γαστρικό καρκίνο. Σε προηγούμενη μελέτη, γαστρικό καρκίνο με MSI-H έδειξε υψηλότερη συχνότητα άντρου τοποθεσία, εντερική υπότυπο, μικρότερη συχνότητα εμφάνισης μετάστασης λεμφαδένα, και βελτιωμένη επιβίωση σε σύγκριση με μικροδορυφόρων σταθερές (MSS) ή MSI-L γαστρικών καρκίνων [17,25 -30]. Ωστόσο, η κλινική σημασία της ανεπάρκειας MMR στον καρκίνο του στομάχου παραμένει άγνωστη.

Εν όψει αυτού του κενού στη γνώση, στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε τη σημασία της CIMP και MMR ανεπάρκεια σε καρκίνο του στομάχου και προσδιορίζεται η συμβολή τους ως προγνωστικός δεικτών σε ασθενείς με καρκίνο του στομάχου.

Υλικά και Μέθοδοι

δείγματα ιστών

Αυτή η μελέτη περιελάμβανε μια σειρά ασθενών με παθολογικά επιβεβαίωσε γαστρικό καρκίνο οι οποίοι είχαν υποβληθεί σε χειρουργική εκτομή στο Πανεπιστήμιο Okayama νοσοκομείο (Οκαγιάμα, Ιαπωνία) 1998 – 2004. Ένα σύνολο 68 γαστρικού καρκινικούς ιστούς και συμφωνημένα φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο τους αναλύθηκαν. Όλες οι συνήθεις γαστρικού βλεννογόνου ιστοί ελήφθησαν από θέσεις πλησίον, αλλά τουλάχιστον 5 cm μακριά από, τον αρχικό όγκο. Όλοι οι ασθενείς παρέχεται γραπτή συγκατάθεση και η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Okayama. Όλοι οι ασθενείς παρέχεται γραπτή συγκατάθεση για τη χρήση των προσωπικών τους δεδομένων για μελλοντικές αναλύσεις. Όλα γαστρικούς καρκίνους και φυσιολογικό γαστρικό βλεννογόνο ήταν δείγματα φρέσκο ​​κατεψυγμένο ιστό, από τον οποίο το DNA εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας ένα QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN).

MSI ανάλυση

ανάλυση

MSI διεξήχθη με εξέταση του 2 επαναλήψεις μονονουκλεοτιδίου (BAT25 και BAT26), επαναλήψεις 12 δινουκλεοτίδιο (D17S250, D18S35, D18S58, D18S69, D2S123, D4S1559, D4S2381, D4S470, D5S107, D5S346, και D8S87, ΤΡ53), και μία επαναλήψεις τετρανουκλεοτιδικές, MYCL, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],31]. Οι όγκοι που δείχνει αλληλομόρφων βάρδιες σε ≥5 15 δείκτες ταξινομήθηκαν ως MSI-H (που αναφέρεται εδώ και στο εξής ως «MSI»), και τα υπόλοιπα κατατάσσονται ως μικροδορυφορικού σταθερό (MSS).

όξινο θειώδες νάτριο τροποποίηση και αναλύει CIMP

Λόγω συχνών υπερμεθυλίωση πολλών γονιδίων είναι ένα από τα χαρακτηριστικά των όγκων με CIMP, διερευνήθηκε η κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή 28 CpG νησί που σχετίζονται με τόπους (

APC

,

CACNA1G

,

CHFR

,

COX2

,

DAPK

,

DCC

,

HPP1

,

MGMT-Στ περιοχή

,

MGMT-Eh περιοχή

,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

,

MLH1 5 ‘

,

MLH1 3 ‘

,

p14

,

p16

,

RASSF1A

,

RASSF2A-region1

,

RASSF2A-περιοχή 2

,

RASSF3

,

RASSF5

,

RASSF6

,

RUNX3

,

SFRP2-region1

,

SFRP2- περιοχή 2

,

UNC5C

,

3OST2

,

FOXL2

), και οι αντίστοιχες αλληλουχίες εκκινητών παρατίθενται στον πίνακα S1. Γονιδιακού DNA ήταν όξινο θειώδες τροποποιηθεί για να μετατρέψει όλες τις μη μεθυλιωμένες κατάλοιπα κυτοσίνης σε ουρακίλες. Εν συντομία, 0,5-2,0 μα DNA μετουσιώθηκαν σε ΝαΟΗ, υποβάλλεται σε επεξεργασία με όξινο θειώδες νάτριο, και καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας το DNA Clean-up System Οδηγό (Promega). Η κατάσταση μεθυλίωσης του κάθε CIMP σχετίζονται locus αξιολογήθηκε με συνδυασμένη διθειώδες ανάλυση περιορισμού (COBRA). Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) για COBRA διεξήχθη σε διθειώδες τροποποιημένου μήτρα DNA σε ένα μίγμα PCR 25-μί που περιείχε 12,5 μL του κιτ HotStarTaq Master Mix (Qiagen), 0,5 μmol /L για κάθε εκκινητή PCR, και περίπου 25 ng όξινο θειώδες-τροποποιημένου DNA. Τα προϊόντα PCR υποβλήθηκαν σε πέψη με την προσθήκη ενζύμου περιορισμού σε 37 ° C για 12 ώρες. Το χωνεμένο DNA διαχωρίστηκε σε πηκτές αγαρόζης 3% σε 1 ρυθμιστικό × τρις-οξικό-ΕϋΤΑ και χρωματίστηκαν με βρωμιούχο αιθίδιο. Ανθρώπινη φυσιολογική κολονική DNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με μεθυλάση SSSI (New England Biolabs) χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για μεθυλιωμένα αλλήλια, και το DNA από τα φυσιολογικά λεμφοκύτταρα χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος για μη μεθυλιωμένα αλλήλια. Το νερό χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος PCR για την παρακολούθηση της μόλυνσης PCR. CIMP-υψηλής ορίστηκε ως όχι λιγότερο από 10 της μεθυλίωσης αυτών των τόπων.

KRAS

μετάλλαξη αναλύει

Άμεση αλληλούχιση διεξήχθη για να προσδιορίσει

KRAS

εξόνιο 2 (κωδικόνιο 12/13) μεταλλάξεις. PCR για

KRAS

γονίδιο διεξήχθη σε ένα μίγμα PCR 25-μί που περιέχει 12,5 μι HotStarTaq Master Mix kit με εκκινητές. Το κιτ καθαρισμού QIAquick PCR χρησιμοποιήθηκε για να καθαρίσει τα προϊόντα της PCR, και αναλύθηκαν κατά την αλληλουχία απευθείας σε έναν αλληλουχητή ϋΝΑ ΑΒΙ 310 [32].

Στατιστικές αναλύσεις

λογισμικό JMP (ver 10.0, SAS Institute Inc .) χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει στατιστική ανάλυση. t-test του Student χρησιμοποιήθηκε για να συγκρίνει τις συνεχείς μεταβλητές, και ακριβές τεστ του Fisher χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση κατηγορικές μεταβλητές. Η συνολική επιβίωση (OS) μετρήθηκε από την ημερομηνία λειτουργίας μέχρι την ημερομηνία του θανάτου. Τα στατιστικά στοιχεία μέθοδο Kaplan-Meier και log-rank για τις διαφορές μεταξύ των διαφόρων προγνωστικούς παράγοντες που χρησιμοποιούνται για την εκτίμηση διανομές OS. Cox αναλογικά μοντέλα κινδύνου χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό της αναλογίας κινδύνου (HR) με αντίστοιχο 95% διάστημα εμπιστοσύνης (CI). Μονοπαραγοντική ή πολυπαραγοντική ανάλυση λογιστικής παλινδρόμησης διεξήχθη για να προσδιοριστούν οι διαφορές στο HR ανάμεσα σε κάθε ομάδα. Όλες οι αναφερόμενες

P

τιμές είναι διπλής όψης, και

P

& lt? 0,05 θεωρήθηκε ότι υποδηλώνουν στατιστική σημαντικότητα.

Αποτελέσματα

πληθυσμός Μελέτη

Στην παρούσα μελέτη, ερευνήσαμε 68 ασθενείς με καρκίνο του στομάχου. Στα CpGs προαγωγέα του

MLH1

γονίδιο, εξάπλωση του CpG μεθυλίωσης εντός ‘περιοχή του 3 προσδιορίστηκε ότι είναι ένα κρίσιμο για την έκφραση MLH1 [33]. Μια περιγραφή της κοόρτης ασθενών και διάφορα κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά που βασίζονται στο φύλο, την ηλικία, το στάδιο, η διαφοροποίηση του όγκου, την κατάσταση MSI,

KRAS

μετάλλαξη, και

μεθυλίωση MLH1 3 ‘

παρουσιάζεται στον Πίνακα 1. Αυτές οι καταστάσεις συγκρίθηκαν μεταξύ των CIMP-υψηλής και CIMP-χαμηλή ομάδες. Από αυτές τις παραμέτρους, την κατάσταση MSI και

MLH1 3 ‘

κατάσταση μεθυλίωσης έδειξε αξιοσημείωτες διαφορές μεταξύ των 2 ομάδων (Πίνακας 1).

Η

κατάσταση μεθυλίωσης

28 CpG τόποι συμπεριλαμβανομένων των

APC

,

CACNA1G

,

CHFR

,

COX2

,

DAPK

,

DCC

,

HPP1

,

MGMT-Mp περιοχή

,

MGMT-Eh περιοχή

,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

,

MLH1 5 ‘

,

MLH1 3′

,

p14

,

p16

,

RASSF1A

,

RASSF2A-region1

,

RASSF2A-περιοχή 2

,

RASSF3

,

RASSF5

,

RASSF6

,

RUNX3

,

SFRP2-region1

,

SFRP2-περιοχή 2

,

UNC5C

,

3OST2

και

FOXL2

αναλύθηκαν για τον προσδιορισμό της κατάστασης CIMP της κάθε γαστρικό καρκίνο. Η μεθυλίωση του φάσματος αυτών τόπων φαίνεται στο πλακίδιο χάρτη (Σχήμα 1α). Σε αυτές τις θέσεις,

CACNA1G

,

CHFR

,

DCC

,

HPP1

,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

,

MLH1 5 ‘

,

MLH1 3′

,

p16

,

RASSF2A-region1

,

RASSF2A-περιοχή 2

,

RUNX3

,

SFRP2-περιοχή 2

,

UNC5C

,

3OST2

, και

FOXL2

ήταν σημαντικά μεθυλιώνονται στο CIMP-υψηλή ομάδα (Πίνακας 2).

α) Πλακάκια χάρτης που δείχνει μοτίβο μεθυλίωσης. Είκοσι οκτώ τόποι (

APC

,

CACNA1G

,

CHFR

,

COX2

,

DAPK

,

DCC

,

HPP1

,

MGMT-Mp περιοχή

,

MGMT-Eh περιοχή

,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

,

MLH1 5 ‘

,

MLH1 3′

,

p14

,

p16

,

RASSF1A

,

RASSF2A-region1

,

RASSF2A-περιοχή 2

,

RASSF3

,

RASSF5

,

RASSF6

,

RUNX3

,

SFRP2-region1

,

SFRP2-περιοχή 2

,

UNC5C

,

3OST2

,

FOXL2

) αναλύθηκαν για να προσδιοριστεί κατάσταση CIMP. Τριάντα ασθενείς με όχι λιγότερο από δέκα μετουσιωμένο loci ταυτοποιήθηκαν ως CIMP-υψηλή ομάδας. β) Venn διάγραμμα που δείχνει την επικάλυψη των

MLH1

3 ‘μεθυλίωση και την κατάσταση CIMP. Η αλληλοεπικάλυψη σχέση μεταξύ

μεθυλίωση MLH1 3 ‘

και το καθεστώς CIMP αναλύθηκε. 10 ασθενείς ήταν η συνδυασμένη στον CIMP-υψηλής /

MLH1 3 ‘

μεθυλιωμένη (Α), 1 ασθενείς ήταν στην CIMP-χαμηλό /

MLH1 3′

μεθυλιωμένη (Β), 20 ασθενείς ήταν στην CIMP υψηλή /

MLH1 3 ‘

μη-μεθυλιωμένου (C), και 37 ασθενείς ήταν στην CIMP-χαμηλό /

MLH1 3′

μη μεθυλιωμένα ομάδες (D). γ) κατά Kaplan-Meier εκτίμηση της OS σε ασθενείς με

MLH1

3 ‘μεθυλιωμένα ή μη μεθυλιωμένα γαστρικών καρκίνων. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν σύμφωνα με το

κατάσταση μεθυλίωσης MLH1 3 ‘. Τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών αναλύθηκαν για τις

μετουσιωμένο και μη-μετουσιωμένο ομάδες MLH1 3 ‘

. Το ποσοστό επιβίωσης ήταν σημαντικά υψηλότερο στο

μετουσιωμένο ομάδα MLH1 3 ‘

σε σχέση με το μη-μεθυλιωμένο ομάδα (log-rank

P

= 0.0257). δ) κατά Kaplan-Meier εκτίμηση της OS σε ασθενείς με CIMP-υψηλή ή CIMP χαμηλής γαστρικών καρκίνων. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν σύμφωνα με την κατάσταση CIMP. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών αναλύθηκε για την CIMP-υψηλή ομάδας και CIMP-χαμηλής ομάδας. Το ποσοστό επιβίωσης ήταν ελαφρώς υψηλότερη στην CIMP-υψηλής ομάδα από ό, τι στην CIMP-χαμηλής ομάδας, αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική (log-rank

P

= 0,0688). ε) Συμβολή της CIMP και επισκευή ασυμφωνία κατάσταση ανεπάρκειας σε ποσοστό επιβίωσης. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν σύμφωνα με CIMP και

MLH1

κατάσταση μεθυλίωσης. Οι ασθενείς ταξινομήθηκαν με βάση την συνδυασμένη κατάσταση CIMP και

MLH1

κατάσταση μεθυλίωσης στο CIMP-υψηλής /

MLH1 3 ‘

μεθυλιωμένη (Α), CIMP χαμηλής /

MLH1 3 «

μεθυλιωμένο (Β), CIMP υψηλή /

MLH1 3 ‘

μη μεθυλιωμένη (C), και CIMP-χαμηλό /

MLH1 3′

μη-μετουσιωμένο ομάδες (D). Τα συνολικά ποσοστά επιβίωσης ήταν υψηλότερη στη συνδυασμένη CIMP-υψηλής /

MLH1 3 ‘

μεθυλιωμένη ομάδα, σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες, όπου οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (log-rank

P

= 0,0706) .

Η

εκβάσεις επιβίωσης σε ασθενείς με βάση την

MLH1 3 ‘

μεθυλίωση και την κατάσταση CIMP σε γαστρικών καρκίνων

Η αλληλοεπικάλυψη σχέση μεταξύ CIMP και

κατάσταση μεθυλίωσης MLH1 3 ‘αναλύθηκε. 10 ασθενείς ήταν στην CIMP-υψηλής /

MLH1 3 ‘

μετουσιωμένο, 1 ασθενής ήταν στο CIMP-χαμηλό /

MLH1 3′

μετουσιωμένο, 20 ασθενείς ήταν στην υψηλή CIMP /

MLH1 3 ‘

μη-μετουσιωμένο και 37 ασθενείς ήταν στην CIMP-χαμηλό /

MLH1 3′

μη-μετουσιωμένο ομάδες (Σχήμα 1β). Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν σύμφωνα με το

κατάσταση μεθυλίωσης MLH1 3 ‘. Τα ποσοστά OS 5 ετών προσδιορίστηκαν για τις

μετουσιωμένο και μη-μετουσιωμένο ομάδες MLH1 3 ‘

. Τα ποσοστά OS 5 ετών ήταν σημαντικά υψηλότερη στην

MLH1 3 ‘

μετουσιωμένο ομάδα σε σύγκριση με το μη-μεθυλιωμένο ομάδα. (Log-rank

P

= 0,0257? Σχήμα 1γ)

Επίσης, τα ποσοστά OS 5 ετών αναλύθηκαν για τις CIMP-υψηλής και CIMP-χαμηλή ομάδες, και ο ρυθμός ήταν ελαφρώς υψηλότερη στην CIMP-υψηλής ομάδα από ό, τι στην CIMP χαμηλής ομάδα, αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική ( log-rank

P

= 0,0688? Σχ. 1δ)

Συμβολή της αναντιστοιχίας ανεπάρκειας επισκευή και την κατάσταση CIMP σε ποσοστό επιβίωσης

Τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν μεταξύ αυτών των ομάδων? CIMP-υψηλής /

MLH1 3 ‘

μετουσιωμένο, CIMP χαμηλής /

MLH1 3′

μετουσιωμένο, CIMP υψηλή /

MLH1 3 ‘

μη-μετουσιωμένο και CIMP-χαμηλό /

μη-μετουσιωμένο ομάδες MLH1 3 ‘

. Εμείς σημειωθεί ότι τα συνολικά ποσοστά επιβίωσης ήταν υψηλότερη στη συνδυασμένη CIMP-υψηλής /

MLH1 3 ‘

μεθυλιωμένη ομάδα, σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες, όπου οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (log-rank

P

= 0,0706? Εικ. 1ε)

σχέση μεταξύ των

MLH1

μεθυλίωση και MSI

Η αλληλοεπικάλυψη σχέση μεταξύ

MLH1 5 ‘

μεθυλίωση και

3 ‘

κατάσταση μεθυλίωσης αναλύθηκε. 10 ασθενείς ταξινομήθηκαν ως

MLH1 5 ‘

μεθυλιωμένο /

3′

μετουσιωμένο, 8 ασθενείς ως

MLH1 5 ‘

μεθυλιωμένο /

3′

μη μετουσιωμένο, 1 ασθενής ως

MLH1 5 ‘

μη-μεθυλιωμένου /

3′

μετουσιωμένο, και 49 ασθενείς ως

5 ‘

μη-μεθυλιωμένου /

3′

μη-μεθυλιωμένου (Σχήμα 2α). Στο

μετουσιωμένο ομάδα MLH1 3 ‘

, περισσότερο από το 80% των ασθενών εμφάνισαν MSI. Σε αντίθεση, στο

μη-μεθυλιωμένου ομάδα MLH1 3 ‘

, σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις έδειξαν MSS (Σχήμα 2Β). Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν σύμφωνα με το

κατάσταση μεθυλίωσης MLH1 5 ‘. Τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών αναλύθηκαν για τις

MLH1 5 ‘

μετουσιωμένο και μη-μετουσιωμένο ομάδες, και ο ρυθμός ήταν ελαφρώς υψηλότερο στο

MLH1 5′

μετουσιωμένο ομάδα σε σχέση με το μη μεθυλιωμένη ομάδα, αλλά οι διαφορές δεν ήταν σημαντικές (log-rank

P

= 0,1009? Σχήμα 2γ). Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν σύμφωνα με την κατάσταση MSI. Τα ποσοστά επιβίωσης 5 ετών αναλύθηκαν για τις ομάδες MSI και MSS, και ο ρυθμός ήταν ελαφρώς υψηλότερη στην ομάδα MSI σχέση με την ομάδα MSS, αλλά οι διαφορές δεν ήταν σημαντικές (log-rank

P

= 0,1316? Σχήμα 2δ).

α) διάγραμμα Venn δείχνει την επικάλυψη των MLH1 5 ‘μεθυλίωση και 3’ κατάσταση μεθυλίωσης. Η αλληλοεπικάλυψη σχέση μεταξύ

MLH1 5 ‘

-και

3′

κατάσταση μεθυλίωσης αναλύθηκε. 10 ασθενείς ήταν στο

MLH1 5 ‘

μεθυλιωμένο /

3′

μεθυλιωμένη (Α), 8 ασθενείς ήταν στο

MLH1 5 ‘

μεθυλιωμένο /

3′

μη μεθυλιωμένη (Β), 1 ασθενής ήταν στο

MLH1 5 ‘

μη-μεθυλιωμένου /

3′

μεθυλιωμένη (C), και 49 ασθενείς ήταν στο

5 ‘

μη-μεθυλιωμένου /

3′

μη μεθυλιωμένα ομάδες (D). β) Η σχέση μεταξύ του

MLH1

μεθυλίωση και MSI. Στο

MLH1 3 ‘

μεθυλιωμένη ομάδα, & gt? 80% των περιπτώσεων έδειξε MSI. Σε αντίθεση, στο

μη μεθυλιωμένη ομάδα MLH1 3 ‘

, σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις έδειξαν MSS. γ) κατά Kaplan-Meier εκτίμηση της OS σε ασθενείς με

MLH1

5 ‘μεθυλιωμένα ή μη μεθυλιωμένα γαστρικό καρκίνο. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν σύμφωνα με το

κατάσταση μεθυλίωσης MLH1 5 ‘. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών αναλύθηκε για το

MLH1 5 ‘

Ομάδα και μη-μετουσιωμένο ομάδες. Το ποσοστό επιβίωσης ήταν ελαφρώς υψηλότερο στο

μετουσιωμένο ομάδα MLH1 5 ‘

σε σχέση με το μη-μεθυλιωμένο ομάδα, αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική (log-rank

P

= 0,1009). δ) κατά Kaplan-Meier εκτίμηση της OS σε ασθενείς με MSI ή MSS γαστρικό καρκίνο. Οι καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν σύμφωνα με την κατάσταση MSI. Το ποσοστό επιβίωσης 5 ετών αναλύθηκε για την ομάδα MSI και την ομάδα MSS. Το ποσοστό επιβίωσης ήταν ελαφρώς υψηλότερη στην ομάδα MSI σε σχέση με το μη μετουσιωμένο ομάδα, αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική (log-rank

P

= 0,1316).

Η

Η πολυπαραγοντική ανάλυση για προγνωστικοί αποτέλεσμα την επιβίωση

Ένα Cox μοντέλο αναλογικού κινδύνου, όπως η ηλικία, το στάδιο, διαφοροποίηση,

KRAS

κατάσταση μετάλλαξης, και CIMP /

MLH1 3 ‘

κατάσταση μεθυλίωσης σε σχέση με το λειτουργικό σύστημα χρησιμοποιήθηκε για να εκτελέσει πολυμεταβλητή ανάλυση (Πίνακας 3). Μόνο το στάδιο (

P

= 0,0088), διαφοροποίηση (

P

= 0,0267), και CIMP /

MLH1

κατάσταση μεθυλίωσης (

P

= 0,0312) ήταν στατιστικά σημαντικοί προγνωστικοί του OS. αναλογία κινδύνου ήταν σημαντικά χαμηλότερη στην CIMP-υψηλής /

MLH1 3 ‘

μετουσιωμένο ομάδα.

Η

Συζήτηση

μεθυλίωσης του DNA των καρκινικών κυττάρων έχει γίνει ένα θέμα έντονης έρευνα. Η αδρανοποίηση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων με CpG μεθυλίωση των περιοχών προαγωγού επιταχύνει την καρκινογένεση λόγω της παρεκκλίνουσας ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου και τον πολλαπλασιασμό [15]. Μερικά υποψήφια έκτροπα έχουν μεθυλιωμένα γονίδια σε καρκίνο του στομάχου έχουν αναφερθεί.

RASSF1A

,

p14ARF

, και

MGMT

[34-38]?

CHRNA3

,

DOK1

, και

GNMT

[39]?

p16

,

hMLH1

,

MINT1

,

MINT2

,

MINT12

,

MINT25

, και

MINT31

[40]?

APC

,

Cdh1

,

MHL1

,

CDKN2A

,

CDKN2B

, και

RUNX3

[17 ]?

Cdh1

[41]?

DKK3

[42]?

PTEN

[43]?

MGMT

[44]?

TFPI2

[22]?

CACNA2D3

[45]?

PCDH10

[46]?

SOX2

[47]?

MAL

[48]? και

COX2

[49] είχαν προηγουμένως αναφερθεί ότι υπερμεθυλίωση σε γαστρικό καρκίνο. Η μεθυλίωση του

ρ16

προαγωγού CpG νησίδων είναι ένας δείκτης για κακόηθες δυναμικό της δυσπλασίας στο στομάχι [50]. Η μεθυλίωση του

MGMT

σχετίζεται με προχωρημένο στάδιο και φτωχή πρόγνωση [44]. Η παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA σε αυτά τα γονίδια μπορεί να προωθήσει την ανάπτυξη του καρκίνου του στομάχου. Ωστόσο, οι ακριβείς στόχοι γονίδιο της υπερμεθυλίωσης για καρκινογένεση παραμένει άγνωστη [51,52].

Η ταυτόχρονη μεθυλίωση CpG σε πολλαπλά γονίδια έχει οριστεί ως CIMP στον καρκίνο του παχέος εντέρου (CRC) και του γαστρικού καρκίνου [15,40,53- 57], και έχει αποδειχθεί ότι συσχετίζεται με υπερμεθυλίωση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Ωστόσο, τα στοιχεία για CIMP σε γαστρικό καρκίνο δεν είναι τόσο πειστική όπως είναι η περίπτωση για CRC [58,59]. Στον καρκίνο του στομάχου, του CIMP-high έχει περιγραφεί στο 41% ​​[40] και 31% [54] όγκους. Ασθενείς με CIMP-υψηλής γαστρικού καρκίνου έχουν σημαντικά μικρότερη επιβίωση από αυτούς με CIMP-χαμηλό καρκίνο του στομάχου [54,60]. Μια άλλη έκθεση έδειξε ότι CIMP συσχετίστηκε με καλύτερη επιβίωση στον καρκίνο του στομάχου [54]. Η πρόσφατη μετα-ανάλυση επικεντρώθηκε στην ισχυρή σχέση CIMP με H. pylori, EBV, και MSI, αλλά CIMP δεν θα μπορούσε να δείξει ένα προγνωστικό δυναμικό για καρκίνο του στομάχου [61].

Αντίθετα, η αστάθεια κατά τη μικροδορυφόρων επαναλήψεις εντός διαφόρων γονιδίων ανάπτυξης ρυθμιστικών ορίζεται ως MSI. Ένα πρότυπο πάνελ, όπως το πάνελ NCI, συνιστάται, συμπεριλαμβανομένων μονονουκλεοτίδιο (BAT26 και BAT25) και δινουκλεοτίδιο (D2S123, D5S346, και D17S250) επαναλαμβάνει [62]. μπορούν να προσδιοριστούν τρία επίπεδα MSI: υψηλού επιπέδου MSI (MSI-H), χαμηλού επιπέδου MSI (MSI-L), και MSS. Ο φαινότυπος MSI-H σε γαστρικό καρκίνο αναφέρθηκε να αντιπροσωπεύουν το 5% -50% MSI θετικά νεοπλάσματα [17]. MSI είναι ένα χαρακτηριστικό που προκαλείται από ένα ελαττωματικό σύστημα DNA MMR. Λειτουργική απενεργοποίηση των γονιδίων MMR, όπως

MLH1

ή

MSH2

, με μεταλλακτική αδρανοποίηση και υποστηρικτής μεθυλίωσης είναι υπεύθυνη για το φαινότυπο MSI-H σε γαστρικό καρκίνο. Ειδικότερα, παρόμοια με CRC, μεθυλίωση του

MLH1

σχετίζεται με τον φαινότυπο MSI-H [15,40,63,64], επειδή

MLH1

μεθυλίωση προηγείται της απώλειας έκφρασης πρωτεΐνης. Leite M et al. αναφερθεί ότι

MLH1

υπερμεθυλίωση προαγωγού παρατηρήθηκε στο 78,7% (70/89) των ανέλυσε περιπτώσεις MSI [65]. Η μεθυλίωση της περιοχής 3 ‘του

MLH1

υποκινητή, που είναι κοντά στην έναρξη της μεταγραφής ιστοσελίδα της (TSS), απαιτείται για γονιδιακή αποσιώπηση. Το 5 ‘άκρο του προαγωγού είναι επίσης επιρρεπείς σε μεθυλίωση, αλλά αυτό δεν είναι λειτουργικά σημαντική εκτός αν η μεθυλίωση εκτείνεται στην κρίσιμη περιοχή 3’ [66,67]. κατάσταση MSI είναι υπεύθυνη για την μετάλλαξη των γονιδίων που ρυθμίζουν τον κυτταρικό κύκλο και αποπτωτική σηματοδότηση, συμπεριλαμβανομένων των

ΤΟΡβΚΙΙ

,

IGFIIR

,

TCF4

,

RIZ

,

ΒΑΧ

,

CASPASE5

,

FAS

,

BCL10

, και

APAF1

[17,25] και τα γονίδια τη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας , συμπεριλαμβανομένων των

MSH6

,

MSH3

,

MED1

,

RAD50

,

BLM

,

ATR

, και

MRE11

[17,68]. Γαστρικούς καρκίνους με MSI-H παρουσιάζουν υψηλότερη συχνότητα του άντρου τοποθεσία, εντερική υπότυπο, μικρότερη συχνότητα εμφάνισης μετάστασης λεμφαδένα, και βελτιωμένη επιβίωση σε σχέση με εκείνες του γαστρικού καρκίνου με MSS ή MSI-L [17,25-30].

Όπως περιγράφεται παραπάνω, CIMP και την κατάσταση MMR-ανεπάρκειας είναι τα βασικά χαρακτηριστικά του καρκίνου του στομάχου και μπορεί να αντανακλούν διαφορές επιβίωσης σε ασθενείς που πάσχουν από αυτή την κακοήθεια. Σημαντική συσχέτιση μεταξύ CIMP και MSI έχει αναφερθεί σε GC [61]. Ωστόσο, τα στοιχεία σχετικά με τις συνεργιστικές επιδράσεις αυτών των παραμέτρων είναι σπάνιες, και απαιτείται πολυπαραγοντική ανάλυση αυτών των γενετικών και επιγενετικών παραμέτρων. Στη μελέτη μας,

CACNA1G

,

CHFR

,

DCC

,

HPP1

,

MINT1

,

MINT2

,

MINT31

,

MLH1 5 ‘

,

MLH1 3′

,

p16

,

RASSF2A-region1

,

RASSF2A-περιοχή 2

,

RUNX3

,

SFRP2-περιοχή 2

,

UNC5C

,

3OST2

, και

FOXL2

ήταν σημαντικά μεθυλιώνονται στο CIMP-υψηλή ομάδας. Ειδικότερα, αναφέρθηκε μεθυλίωση προαγωγού του

FOXL2

σε γαστρικό καρκίνο.

FOXL2

είναι ένα γονίδιο που κωδικοποιεί ένα παράγοντα μεταγραφής forkhead και είναι απαραίτητη για τη λειτουργία των ωοθηκών [69].

FOXL2

ρυθμίζει τον κυτταρικό κύκλο μέσω επαγωγής G1 σύλληψη και προστατεύει τα κύτταρα από οξειδωτική βλάβη, με την προώθηση οξειδωμένη επιδιόρθωση του DNA και με αύξηση της ποσότητας της γλουταθειόνης παράγοντα αντιοξειδωτικό [69].

FOXL2

καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, την εισβολή και προάγει την απόπτωση των κυττάρων καρκίνου του τραχήλου [70]. Η μεθυλίωση υποστηρικτής του

FOXL2

μπορεί να έχει ένα σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση σε καρκίνο του στομάχου. Σε αντίθεση,

MLH1 3 ‘

μεθυλίωση ήταν απαραίτητη για την ανεπάρκεια MMR και έδειξε MSI. Η

MLH1 3 ‘

μεθυλίωση ομάδα είχε μια τάση προς μια καλή πρόγνωση στην εκτίμηση επιβίωσης Kaplan-Meier.

Ωστόσο, CIMP και ανεπάρκεια MMR εξαρτώνται η μία από την άλλη. MSI που σχετίζονται με σποραδικές CRCs προκύπτουν μέσα από μια διαδικασία που περιλαμβάνει CIMP [66,71]? Ως εκ τούτου, θα πρέπει να γίνεται ολοκληρωμένη στατιστική ανάλυση των CIMP και MMR ανεπάρκεια. Για παράδειγμα, το δωδεκαδακτυλικό αδενοκαρκινώματα, CIMP /

MLH1

κατάσταση μεθυλίωσης παρουσίασαν σημαντική προγνωστική αξία τόσο OS και time-to-υποτροπή (ΤΤΡ) σε πολυπαραγοντική ανάλυση [72]. Ασθενείς με CIMP-υψηλή /

MLH1

-unmethylated όγκοι είχαν το χειρότερο λειτουργικό σύστημα και TTR [72]. Στην πολυπαραγοντική ανάλυση μας των ασθενών με καρκίνο του στομάχου, μόνο το CIMP-υψηλής /

μετουσιωμένο ομάδα MLH1 3 ‘

είχε μια καλή πρόγνωση. Ο λόγος για την καλή πρόγνωση του CIMP-υψηλής /

μετουσιωμένο ομάδα MLH1 3 ‘

παραμένει άγνωστη. Αυτό το φαινόμενο μπορεί να οφείλεται σε συνεργιστική αδρανοποίηση των ζωτικών γονιδίων λόγω μετάλλαξης και μεθυλίωση προαγωγού. Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω τα ευρήματά μας, πραγματοποιήσαμε μια ανεξάρτητη επικύρωση των αποτελεσμάτων μας από το στοιχεία των ασθενών που υποβάλλονται στη βάση δεδομένων Cancer Genome Atlas (TCGA). [73-75] CIMP-υψηλής /

MLH1

υπερ-μεθυλιωμένη ομάδα έδειξε πιο συχνές λεμφαδένες μετάσταση στους λεμφαδένες (p = 0,0009), το στάδιο προχωρημένη νόσο (p = 0.0078? S1 File), και Νόσος ελαφρώς καλύτερη επιβίωση χωρίς (S2 File). Από την άλλη πλευρά, η κατάσταση CIMP /MSI δεν μπορεί να δείξει τη σημαντική αξία ως προγνωστικός δείκτης (Πίνακας S2). Το αποτέλεσμα αυτό δείχνει ότι

MLH1

έχει τον πιο σημαντικό ρόλο μεταξύ MMR γονίδια στην καρκινογένεση του GC. Περαιτέρω έρευνα απαιτείται για να διευκρινιστεί η σχέση μεταξύ της κατάστασης CIMP και ανεπάρκεια MMR. Η προσέγγιση αυτή θα οδηγήσει σε μια νέα στρατηγική για τη θεραπεία του καρκίνου του στομάχου.

Συμπερασματικά, τα δεδομένα μας δείχνουν ότι η στρωματοποίηση των ασθενών με CIMP βασίζεται σε

MLH1

κατάσταση μεθυλίωσης μπορεί να επιτρέψει την πρόβλεψη του καρκίνου του στομάχου πρόγνωση. Η CIMP-υψηλής /

μετουσιωμένο ομάδα MLH1 3 ‘

είχε καλή πρόγνωση, αλλά και άλλες ομάδες μπορεί να απαιτούν εντατική θεραπεία για τη βελτίωση της επιβίωσης, η οποία πρέπει να επικυρωθεί σε μελλοντικές μελέτες.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 αρχείου. Σχέση μεταξύ CIMP και

MLH1

μεθυλίωσης σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο στη βάση δεδομένων TCGA.

Ερευνήσαμε την κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή 17 CpG νησί που σχετίζονται με τόπους (

APC

,

CACNA1G

,

CHFR

,

DAPK

,

DCC

,

MGMT

,

ΜΕΝΤΑ

,

MLH1

,

p16

,

RASSF1

,

RASSF2

,

RASSF3

,

RASSF5

,

RASSF6

,

RUNX3

,

SFRP2

,

και UNC5C

) στη βάση δεδομένων TCGA (TCGA προσωρινό). Άνω του 25% του κάθε τόπου προσδιορίστηκε ως υπερ-μεθυλιωμένη. CIMP-υψηλής ορίστηκε ως όχι λιγότερο από 5 της υπερ-μεθυλίωση αυτών των τόπων (Σχήμα Α). Η αλληλοεπικάλυψη σχέση μεταξύ CIMP και

MLH1

κατάσταση μεθυλίωσης αναλύθηκε. 55 ασθενείς ήταν στην CIMP-υψηλής /

MLH1

μετουσιωμένο, 29 ασθενείς ήταν στην CIMP-χαμηλό /

MLH1

μετουσιωμένο, 77 ασθενείς ήταν στην υψηλή CIMP /

MLH1

μη-μετουσιωμένο και 177 ασθενείς ήταν στην CIMP-χαμηλό /

MLH1

μη-μετουσιωμένο ομάδες (Σχήμα Β). Συσχέτιση μεταξύ βάθος όγκων, λεμφαδένες μετάσταση στους λεμφαδένες, μακρινή μετάσταση, Σταδίου και CIMP /

MLH1

κατάσταση μεθυλίωσης αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το ακριβές τεστ του Fisher. Θετική λεμφαδένα μετάσταση (p = 0,0009) και υψηλότερο στάδιο (p = 0.0078) σχετίστηκαν θετικά με CIMP-υψηλή /

MLH1

μεθυλιωμένη ομάδα (Σχήμα Γ)

doi:. 10.1371 /journal.pone. 0130409.s001

(DOCX)

S2 αρχείου. Επιβίωσης χωρίς νόσο σε ασθενείς με γαστρικό καρκίνο στη βάση δεδομένων TCGA.

Καμπύλες επιβίωσης Kaplan-Meier δημιουργήθηκαν σύμφωνα με το

MLH1

κατάσταση μεθυλίωσης. Τα ποσοστά επιβίωσης χωρίς νόσο προσδιορίστηκαν για το

MLH1

μετουσιωμένο και μη-μετουσιωμένο ομάδες. Ελεύθερο νόσου ποσοστό επιβίωσης ήταν ελαφρώς υψηλότερο στο

MLH1

μετουσιωμένο ομάδα σε σύγκριση με το μη μετουσιωμένο ομάδα, αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική (log-rank

P

= 0.1173) (Σχήμα Α). Ελεύθερο νόσου ποσοστό επιβίωσης αναλύθηκαν για τις CIMP-υψηλής και CIMP-χαμηλή ομάδες, και ο ρυθμός ήταν ελαφρώς υψηλότερη στην CIMP-υψηλής ομάδα από ό, τι στην CIMP χαμηλής ομάδα, αλλά η διαφορά δεν ήταν σημαντική (log-rank

P

= 0.1847) (Σχήμα Β). Ελεύθερο νόσου ποσοστό επιβίωσης αναλύθηκαν και συγκρίθηκαν μεταξύ CIMP-υψηλής /

MLH1

μετουσιωμένο και άλλες ομάδες. Σημειώσαμε ότι η ελεύθερη νόσου επιβίωση ήταν ελαφρώς υψηλότερο στο συνδυασμό CIMP-υψηλής /

MLH1

μεθυλιωμένη ομάδα, σε σύγκριση με τις άλλες ομάδες, όπου οι διαφορές δεν ήταν στατιστικά σημαντικές (log-rank p = 0.1073) (Σχήμα . C)

doi: 10.1371 /journal.pone.0130409.s002

(DOCX)

S1 πίνακα. Primer ακολουθίες

doi:. 10.1371 /journal.pone.0130409.s003

(DOCX)

S2 πίνακα. Πολυπαραγοντική ανάλυση των προγνωστικών αποτελεσμάτων με βάση την κατάσταση CIMP /MSI

doi:. 10.1371 /journal.pone.0130409.s004

(DOCX)

Ευχαριστίες

Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστώ τον κ Toru Nakai, κα Tae Yamanishi, και ο κ Akihiro Nyuya για τεχνική βοήθεια.