Αφηρημένο

Τα microRNAs (miRNAs) είναι απελευθερωμένη σε έναν αριθμό καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων καρκίνου του παχέος εντέρου. MiR-30c ανήκει miR-30 οικογένεια, και εμπλέκεται σε μία ποικιλία κακοήθων νόσων. Σε αυτή τη μελέτη, ανιχνεύσαμε την έκφραση του miR-30c σε κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου και κλινικά δείγματα καρκίνου του παχέος εντέρου. MiR-30c δείχθηκε να είναι δραματικά ρυθμίζεται προς τα κάτω και σε κυτταρικές σειρές και καρκινικούς ιστούς. Επιπλέον, miR-30c θα μπορούσε να αναστείλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, η μετανάστευση και εισβολή in vitro. Σταθερά, σταθερή υπερέκφραση του miR-30c ανέστειλε την ανάπτυξη και την πνευμονική μετάσταση ξενομοσχεύματα καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων in vivo. Επιπλέον, η βιοπληροφορική αλγόριθμο και δοκιμασία ανταποκριτή λουσιφεράσης έδειξε ADAM19 ως άμεσο στόχο του miR-30c. Ενδιαφέρον, περαιτέρω πειράματα απέδειξαν ότι η αναστολή της ADAM19 με miR-30c μεσολαβεί μερικώς το αποτέλεσμα κατά του όγκου miR-30c. Συνολικά, η μελέτη μας παρέχει η νέα αντίληψη ότι το miR-30c ανέστειλε καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα μέσω στόχευσης ADAM19. Έτσι, miR-30c θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μια πολλά υποσχόμενη θεραπευτική στρατηγική για την θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Zhang Q, Yu L, Qin D, Huang Ε, Jiang Χ, Ζου C, et al. (2015) Ο ρόλος των microRNA-30c Στόχευση ADAM19 στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 10 (3): e0120698. doi: 10.1371 /journal.pone.0120698

Ακαδημαϊκό Επιμέλεια: Klaus Roemer, του Πανεπιστημίου του Saarland Ιατρική Σχολή, Γερμανία

Ελήφθη: 11, Νοεμβρίου, 2014? Αποδεκτές: 26 Γενάρη 2015? Δημοσιεύθηκε: 23 Μαρτίου, 2015

Copyright: © 2015 Zhang et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα: Όλα τα σχετικά δεδομένα είναι εντός του χαρτιού

χρηματοδότηση:.. Οι συγγραφείς δεν έχουν καμία υποστήριξη ή χρηματοδότηση για να αναφέρετε

Αντικρουόμενα συμφέροντα:. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) είναι πολύ συντηρημένες, 22 νουκλεοτίδια μη-κωδικοποίησης RNA. MiRNA θα μπορούσε να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση μετα-μεταγραφικά από την αλληλεπίδραση με συμπληρωματικές αλληλουχίες (συνήθως βρίσκεται στην 3′-αμετάφραστη περιοχή (3′-UTR) του νουκλεοτιδίου) του αγγελιαφόρου RNA στόχων (mRNA). Αυτές οι αλληλεπιδράσεις μπορούν να οδηγήσουν στην υποβάθμιση αναστολή μετάφρασης πρωτεΐνης ή στόχου mRNAs ανάλογα με το αν miRNAs και οι στόχοι τους είναι απόλυτα συμπληρωματικά [1]. Τα miRNAs απορρυθμισμένη σε μία ποικιλία καρκίνων και miRNAs διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην ογκογένεση [2,3,4,5]. Ένας αριθμός miRNAs έχουν βρεθεί να δρουν ως καταστολείς όγκων [2,6,7,8]. Τα τελευταία χρόνια, έχουν miRNAs αναγνωριστεί ως κρίσιμο ρυθμιστικές αρχές στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου (CRC) [9,10,11,12].

CRC είναι η τρίτη πιο κοινή μορφή καρκίνου σε άνδρες και γυναίκες , με κατ ‘εκτίμηση 142.820 νέες περιπτώσεις και 50.830 θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες το 2013 [13]. Παρά το γεγονός ότι σημαντική πρόοδος έχει σημειωθεί τις τελευταίες δεκαετίες, συμπεριλαμβανομένης της χειρουργικής θεραπείας, ακτινοθεραπείας και χημειοθεραπείας, το ποσοστό επιβίωσης των ασθενών με CRC έχει αλλάξει ελάχιστα. Είναι ζωτικής σημασίας να ψάξετε μέθοδος έγκαιρης ανίχνευσης λόγω της αυξημένης μετάσταση και η θνησιμότητα των προηγμένων υψηλής ποιότητας CRC.

MiR-30c είναι ένα μέλος της οικογένειας miR-30. Οι πέντε διακριτές ώριμες αλληλουχίες miRNA που περιλαμβάνονται σε αυτή την οικογένεια: miR-30a /miR-30c-2, miR-30D /miR-30b και miR-30e /miR-30c-1 [14]. Συσσωρευμένα αποδείξεις δείχνουν ότι η απορρύθμιση του miR-30c συμβάλλει σε διάφορες κακοήθεις όγκους, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του μαστού, καρκίνου του ενδομητρίου, τον καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο του ήπατος [8,15,16,17]. MiR-30 καταστέλλει τις οιδηματώδης διαδικασίες σε αυτές τις παραπάνω καρκίνων με άμεση αλληλεπίδραση με τους αντίστοιχους στόχους. Παρ ‘όλα αυτά, υπάρχουν σχετικά λίγες διαθέσιμες μελέτες αναφέρουν την εμπλοκή του miR-30c στην εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Στη μελέτη μας, έχουμε καθορίσει την πιθανή επίπτωση του miR-30c για την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα δεδομένα μας έδειξαν ότι miR-30c έχει χαμηλότερο επίπεδο έκφρασης σε δείγματα ανθρώπινου καρκίνου του παχέος εντέρου. Τι περισσότερο, ερευνήσαμε τους μηχανισμούς που διέπουν το ρόλο του miR-30c στην ανάπτυξη του καρκίνου του παχέος εντέρου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-30c διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο σε μια πληθώρα βιολογικών διεργασιών μέσω ρύθμισης ADAM19 στον ανθρώπινο καρκίνο του παχέος εντέρου. Ως εκ τούτου, η εκ νέου έκφραση του miR-30c ή /και να παρεμβαίνει με τη λειτουργία ADAM19 μπορούσε να είναι μια πολλά υποσχόμενη καρκίνου του παχέος εντέρου θεραπευτική στρατηγική.

Υλικά και Μέθοδοι

Κλινικά δείγματα

καρκίνος του παχέος εντέρου Εξήντα δείγματα και των παρακείμενων φυσιολογικών ιστών τους συλλέχθηκαν από ασθενείς με καρκίνο του παχέος εντέρου στο Δεύτερο Συνδεδεμένες Νοσοκομείο Harbin Ιατρικό Πανεπιστήμιο (Harbin, Κίνα) κατά τη διάρκεια της χειρουργικής επέμβασης και αποθηκεύεται αμέσως σε υγρό άζωτο μέχρι τη χρήση. Κανένας ασθενής δεν είχε υποβληθεί σε θεραπεία με ραδιοθεραπεία ή χημειοθεραπεία πριν την επέμβαση. Η μελέτη εγκρίθηκε από την επιτροπή δεοντολογίας του 2

ου Ενταγμένο Νοσοκομείο Ha’erbin Ιατρικό Πανεπιστήμιο. Όλα κλινική έρευνα διεξήχθη σύμφωνα με τις αρχές που διατυπώνονται στη Διακήρυξη του Ελσίνκι. Η γραπτή συγκατάθεση λήφθηκε από κάθε ασθενή και εγκρίθηκε από την τοπική επιτροπή δεοντολογίας.

καλλιέργειας κυττάρων

HCT116 και κυτταρικές σειρές καρκίνου του ανθρώπινου παχέος εντέρου SW620 ήταν δώρα από την Pro. LQ [18] και αναπτύχθηκαν σε RPMI1640 ή μέσου L15 (GIBCO Laboratories, Grand Island, ΝΥ, USA) και τα κύτταρα ΗΕΚ293Τ αναπτύχθηκαν σε μέσο DMEM. Όλα μέσο συμπληρώθηκαν με 10% ορό εμβρύου μόσχου, 100 U /ml πενικιλλίνη G και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη (GIBCO Laboratories, Grand Island, ΝΥ, USA). Όλα τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν στους 37 ° C σε υγροποιημένο επωαστή που περιέχει 5% CO2.

φορέων Η κατασκευή, σύνθεση ολιγονουκλεοτιδίων και την επιμόλυνση

Η HSA-miR-30c μιμούνται, αναστολέας miR-30c, μιμητικό αρνητικό έλεγχο (NC μιμούνται), αναστολέα αρνητικού ελέγχου (αναστολέας NC) ακολουθίες και τα ανθρώπινα ADAM19 siRNA ήταν από το γονίδιο Pharma Company (Σαγκάη, Κίνα). Αντιδραστήριο Lipofectamine 2000 Transfection (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) χρησιμοποιήθηκε για την επιμόλυνση κυττάρων. ADAM19 cDNA χωρίς 3′-UTR του (2757 bp) εισήχθησαν εντός pcDNA3.1 (+) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) για την κατασκευή του πλασμιδίου pcDNA3.1 (+) – ADAM19. Μια 513-bp τμήμα που περιέχει προ-miR-30c συνδέθηκε προς το φορέα pcDNA3.1 (+) για να κατασκευάσει σταθερά κύτταρα υπερέκφραση miR-30c. Πίνακα 1 παρατίθενται όλες σχετικών αλληλουχιών DNA.

Η

Σταθερή διαμόλυνση miR-30c

2 × 10

5 κύτταρα HCT116 αναπτύχθηκαν σε μια πλάκα 60-mm έως ότου το συρροή επιτεύχθηκε 60-70% σε μέσα RPMI1640. Η pcDNA3.1 (+) – πλασμίδιο προ-miR-30c στη συνέχεια επιμολύνονται σε κύτταρα με Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Σταθερές κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε διαλογή με 1 mg /ml G418 (Sigma, Σαγκάη, Κίνα), και θετικοί κλώνοι πιστοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας qRT-PCR.

Ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου (qRT-PCR)

Ποσοτική πραγματικού χρόνου RT-PCR διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Ολικό RNA απομονώθηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ αντιδραστήρια (Invitrogen, Carlsbad, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Στη συνέχεια, το RNA μεταγράφηκε αντίστροφα, στη συνέχεια ο qRT-PCR πραγματοποιήθηκε με χρήση 7500 Real Time PCR System (Applied Biosystems, Mannheim, Germany) ως ακολούθως: 94 ° C για 3 λεπτά και στη συνέχεια 40 κύκλους των 94 ° C για 30s, 60 ° C για 30s, 72 ° C για 30s και ένα βήμα από 82 ° C για 5s. Ο φθορισμός ανιχνεύθηκε στο τέλος κάθε κύκλου.

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων και του σχηματισμού αποικιών δοκιμασία

Το 3- (4, 5-διμεθυλθειαζολ-2-υλ) -2, βρωμιούχο 5-διφαινυλτετραζόλιο ( ΜΤΤ δοκιμασία), εκδόθηκε για την αξιολόγηση της βιωσιμότητας των κυττάρων όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Για να αξιολογηθεί η ικανότητα σχηματισμού αποικίας, HCT116 ή SW620 κύτταρα σπάρθηκαν σε 3.5-cm τρυβλία (1000 κύτταρα /τρυβλίο). Οι αποικίες σταθεροποιήθηκαν σε μεθανόλη, χρωματίστηκαν με 0.1% κρυσταλλικό ιώδες (Sigma, St Louis, MO, USA) και μετρήθηκαν μετά από 2 εβδομάδες.

Μετανάστευση και την εισβολή δοκιμασία

Για να προσδιοριστεί η ικανότητα μετανάστευσης των κυττάρων in vitro, ο προσδιορισμός Transwell εγκρίθηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως [18]. Για την ανίχνευση της ικανότητα εισβολής των κυττάρων, η μεμβράνη της μονάδας Transwell επικαλύφθηκε με 40 μΙ Matrigel (BD Biosciences, Sanjosé, CA, USA) στους 37 ° C για 4 ώρες για την ανάπτυξη ενός ανακατασκευασμένη βασικής μεμβράνης. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με τον ίδιο τρόπο όπως δοκιμασία μετανάστευσης. Επούλωση δοκιμασία επούλωσης εγκρίθηκε επίσης να διερευνηθεί η ικανότητα κυτταρικής μετανάστευσης. Τα κύτταρα σπάρθηκαν σε πλάκες 3,5-cm σε πυκνότητα 70-80%. Στη συνέχεια, τα κύτταρα γδαρμένο από 200 μλ ρύγχη πιπέτας να κατασκευάσει μια τεχνητή πληγή. Η απόσταση μεταναστευτική μετρήθηκε μετά 24-72h

Western ανάλυση κηλίδος

Σύνολο κύτταρο ή ιστό εκχυλίσματα εκχυλίστηκαν σε ρυθμιστικό κυτταρικής λύσης ακολουθείται από ανοσοκηλίδωση με αντι-ADAM19 (1:. 1000, Abcam, Cambridge, MA, USA), και αντι-β-ακτίνη (1:. 2000, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]

λουσιφεράσης δημοσιογράφος δοκιμασία

Για να κατασκευάσει το pMIR-ADAM19-3’UTR πλασμίδιο που περιείχε τις θέσεις του ADAM19 3′-UTR δέσμευσης καθοδικά του γονιδίου λουσιφεράσης πυγολαμπίδας δυναμικό, μια αλληλουχία 282 bp ενισχύθηκε και εισήχθη εντός των θέσεων SpeI και HindIII του Luciferase pMIR-REPORT φορέα (Ambion, Austin, TX, USA). Το πλασμίδιο με την θέση-στόχο miR-30c διαγράφονται από το ADAM19 3′-UTR κατασκευάστηκε επίσης. ΗΕΚ293 και HCT116 κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για να μετρηθεί η δραστικότητα λουσιφεράσης. Όταν αυξήθηκε σε 60-70% συρροή, τα κύτταρα συν-επιμολύνθηκαν με 100 ng πλασμιδίου λουσιφεράσης και 50 ng Renilla πλασμίδιο (Ambion, Austin, ΤΧ, USA) μαζί με 650 ng miR-30c μιμούνται ή NC όπως περιγράφηκε παραπάνω. Μετά από επώαση για 48 ώρες στους 37 ° C, η δραστικότητα της λουσιφεράσης ανιχνεύθηκε με τη Reporter 1000 σύστημα διπλών Luciferase Assay (Promega, Madison, WI, USA).

In vivo δοκιμασίες ανάπτυξης όγκων

Γυναίκα αθυμικοί BALB /c nu /nu ποντίκια (ηλικίας 4 εβδομάδων) αγοράστηκαν από τη Σαγκάη Εργαστήριο Κέντρο ζώων (Σαγκάη, Κίνα). Όλες οι διαδικασίες των ζώων ήταν σύμφωνα με τις κατευθυντήριες γραμμές Χαρμπίν Ιατρικό Πανεπιστήμιο φροντίδας ζώων και την Επιτροπή Χρήσης. Το 2ο Συνδεδεμένες Νοσοκομείο Χαρμπίν Ιατρικό Πανεπιστήμιο Φροντίδα Ζώων και Επιτροπής Χρησιμοποιήστε ενέκρινε την εν λόγω έρευνα. Τα ζώα στεγάστηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [12]. 5 × 10

6 κύτταρα HCT116 που διαμολύνθηκαν σταθερά με miR-30c εγχύθηκαν υποδορίως στα δεξιά πλευρά γυμνών ποντικών. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε με παχύμετρο κάθε 4 ημέρες. Τόσο μέγιστο (L) και ελάχιστο (W) μήκος του όγκου μετρήθηκαν και το μέγεθος του όγκου υπολογίστηκε ως ½LW

2. Μετά από 30 ημέρες, τα ποντίκια θυσιάστηκαν και φωτογραφήθηκαν. Οι όγκοι συλλέχθηκαν και ζυγίστηκαν. Επιπλέον, 2 × 10

6 κύτταρα εγχύθηκαν στις φλέβες της ουράς γυμνών ποντικών. Μετά από 18 ημέρες, οι πνεύμονες αφαιρέθηκαν και ξεπλύθηκαν, και οι πνευμονικές μεταστατικές αποικίες μετρήθηκαν με οπτική επιθεώρηση. Όλες οι χειρουργικές επεμβάσεις πραγματοποιήθηκε υπό αναισθησία πεντοβαρβιτάλης νατρίου, και όλες οι προσπάθειες έγιναν για να ελαχιστοποιήσουν την ταλαιπωρία. Τρία ζώα συμπεριελήφθησαν σε κάθε ομάδα.

Η στατιστική ανάλυση

Το λογισμικό SPSS V20.0 χρησιμοποιήθηκε για τη στατιστική ανάλυση. Όλες οι τιμές εκφράζονται ως μέση τιμή ± SEM και όλα τα δεδομένα έχει επαναληφθεί τουλάχιστον τρεις φορές. t-tests του Student χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί η στατιστική σημασία των διαφορών μεταξύ των ομάδων. συσχέτιση Spearman ήταν εφαρμόζονται για τον προσδιορισμό της αντιστοιχίας μεταξύ της έκφρασης του miR-30c και έκφραση ADAM19. Οι διαφορές με το

σ

*

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt? 0,01. (Ε) Επίδραση του miR-30c επί του πολλαπλασιασμού των κυττάρων HCT116 εξετάστηκαν με δοκιμασία σχηματισμού αποικίας. (Στ) Ο αριθμός των κλώνων αναλύθηκε ποσοτικά. *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt?. 0.01

Η

MiR-30c ανέστειλε τη μετανάστευση των κυττάρων και την ικανότητα εισβολής των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου

Για να κατανοήσουμε την επίδραση του miR-30c για κυτταρική μετανάστευση και εισβολή, τη μετανάστευση και εισβολή Transwell και επούλωσης πληγών δοκιμασίες διεξήχθησαν. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η υπερέκφραση του miR-30c προφανώς ανέστειλε ενώ ρύθμιση προς τα κάτω του miR-30c προωθείται μετανάστευση και εισβολή ικανότητες του καρκίνου του παχέος εντέρου κύτταρα (Σχ. 3Α-3D). Επιπλέον, επούλωσης τραύματος δοκιμασία εφαρμόσθηκε για να μελετηθεί η επίδραση του miR-30c για τη μετανάστευση των κυττάρων SW620 (Εικ. 3Ε, 3F). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι miR-30c θα μπορούσε να αναστείλει ρυθμό μετανάστευσης των κυττάρων καρκίνου του κόλου. Στο σύνολό τους, miR-30c ήταν πιθανό να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην κυτταρική μετανάστευση και την εισβολή.

(Α-Β) Επιπτώσεις του miR-30c για τη μετανάστευση αναλύθηκαν με τη δοκιμασία μετανάστευσης Transwell. Α, εκπρόσωπος φωτογραφίες? Β, ποσοτική ανάλυση. (C-D) Επιδράσεις των miR-30c για εισβολή αναλύθηκαν με τη δοκιμασία εισβολή Transwell. C, εκπρόσωπος φωτογραφίες? D, ποσοτική ανάλυση. (Ε-ΣΤ) F, τραύματος δοκιμασία επούλωσης εγκρίθηκε για να αξιολογηθεί η επίδραση του miR-30c για τη μετανάστευση. Το τεχνητό χάσμα ήταν μέσω του κεντρικού άξονα όταν τα κύτταρα έφθασαν σε πυκνότητα 80%. Φωτογραφίες από τα κύτταρα ελήφθησαν στις 0 και 24 ώρες. Ε, εκπρόσωπος φωτογραφίες? F, ποσοτική ανάλυση. *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt?. 0.01

Η

ADAM19 ήταν άμεσο στόχο του miR-30c

στρατηγικές

Βιοπληροφορική χρησιμοποιήθηκαν για την αναζήτηση των πιθανών στόχων του miR-30c ανάπτυξη και μετάσταση αναστολή της εν λόγω μεσολάβηση miR-30c του. Όλες οι τέσσερις αλγορίθμους βιοπληροφορικής, miRBase, TargetScan, PicTar και Miranda χρησιμοποιήθηκαν και στη συνέχεια εφαρμόστηκε miR-Οντολογία βάση δεδομένων. Τέλος, ADAM19 αναγνωρίστηκε ως ένα γονίδιο που σχετίζεται με καρκίνο. ADAM19 3′-UTR κατείχε μια τέλεια συμπληρωματική περιοχή σε 3539-3546nt θέση για miR-30c. Επιπλέον, TargetScan έδειξε ότι οι θέσεις δέσμευσης των miR-30c είναι εξελικτικά συντηρημένες σε διάφορα σπονδυλικά είδη (Εικ. 4Α). Επιπλέον, τόσο western blot και qRT-PCR πρότεινε μια ρύθμιση προς τα κάτω των ADAM19 σε κύτταρα HCT116 μετά από επιμόλυνση με miR-30c μιμούνται (Σχ. 4Β, 4C). Περαιτέρω πειράματα έδειξαν ότι τα επίπεδα έκφρασης του miR-30c και ADAM19 συσχετίζονταν αντίστροφα σε αρκετές κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου και κλινικά δείγματα όγκων προσδιορίζεται με qRT-PCR (Σχ. 4D, 4Ε). Consitently, ADAM19 ρυθμίζεται αυξητικά σε ιστούς όγκων ανιχνεύεται με κηλίδα western (Σχ. 4G). Τα δεδομένα αυτά απέδειξαν ότι ADAM19 ήταν πιθανό να αποτελούν στόχο miR-30c τόσο μεταγραφικά και μετα-μεταγραφικά. Για να εξηγήσει τη λεπτομερή μηχανισμό, προσδιορισμός λουσιφεράσης εκτελέστηκε. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Ε, παροδική συν-επιμόλυνση των miR-30c μιμούνται και το pmiRGLO-wt φορέα 3′-UTR (το οποίο περιείχε το σημείο στόχο miR-30c) σε κύτταρα ΗΕΚ293Τ με οδήγησε σε σημαντική μείωση της δραστηριότητας ανταποκριτή. Ωστόσο, η μείωση καταργήθηκε όταν miR-30c μιμούνται και ένα κατασκεύασμα στο οποίο η θέση στόχος διαγράφηκε από το ADAM19 3′-UTR-ρεπόρτερ διαμολύνθηκαν σε ΗΕΚ293Τ κύτταρα (Σχ. 4F). Στο σύνολό τους, τα ευρήματα αυτά αποκάλυψαν ότι το miR-30c ανέστειλε την έκφραση ADAM19 με απευθείας στόχευση του ADAM19 3′-UTR

(Α) Η προβλεπόμενη θέση στόχευση με miR-30c του ADAM19 3′-UTR.? MiR-30c ακολουθίες στόχευσης των ADAM19 3′-UTR είναι εξελικτικά συντηρημένες μέσω οκτώ είδη (HSA: ανθρώπινη? Ptr: χιμπατζή? MML: rhesus? Oga: bushbabay? TBE: treeshrew? MMU: ποντίκι? RNO: αρουραίος? Και Ocu: κουνέλι .). Οι περιοχές που στοχεύουν επισημαίνονται με κόκκινο χρώμα. (Β-Ο) qRT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western εφαρμόστηκε για την ανίχνευση της έκφρασης του mRNA και της πρωτεΐνης του ADAM19 σε κύτταρα HCT116 μετά από επιμόλυνση του miR-30c μιμούνται ή NC μιμητικό. (D) ADAM19 mRNA και επίπεδο έκφρασης miR-30c προσδιορίστηκε σε πέντε κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου κατά qRT-PCR. (Ε) ADAM19 mRNA και επίπεδα miR-30c συσχετίζονταν αντίστροφα σε ιστούς καρκίνου του κόλου όπως προσδιορίζεται με qRT-PCR. β-ακτίνης και U6 χρησιμοποιήθηκαν ως ενδογενής έλεγχος, αντίστοιχα. (F) κύτταρα ΗΕΚ293Τ συν-επιμολυσμένα με άγριου τύπου ή μεταλλαγμένο δημοσιογράφους και τον μιμούνται miR-30c ή αρνητικό έλεγχο (NC μιμούνται). Μετά από 48 ώρες, μετρήθηκε δραστικότητα λουσιφεράσης /Renilla. (G) ADAM19 ρυθμίζεται αυξητικά σε ιστούς καρκίνου του κόλου σε σύγκριση με φυσιολογικούς ιστούς, όπως υποδεικνύεται από κηλίδωση Western.

Η

ADAM19 μεσολαβητικό νεόπλασμα κατασταλτική επίδραση του miR-30c

Με βάση αυτά τα παραπάνω αποδείξεις , κάναμε την υπόθεση ότι ADAM19 αποδοθεί στην αντι-νεοπλασματική δράση του miR-30c. Για να αποδειχθεί αυτή η μη δοκιμασμένη υπόθεση, κατασκευάσαμε ένα φορέα χρησιμοποιώντας ένα cDNA που δεν περιείχε το 3′-UTR του ADAM19, μετά τον φορέα και miR-30c μιμητικό /NC μιμούνται συν-επιμολύνθηκαν σε κύτταρα HCT116. MiR-30c και έκφραση ADAM19 εξετάστηκαν με qRT-PCR και Western Blot, αντίστοιχα (Εικ. 5Α, 5Β). Φρεατίων μετανάστευση και την εισβολή αναλύσεις έδειξαν ότι η αποκατάσταση της ADAM19 ήταν σε θέση να καταργήσει miR-30c που προκαλείται από τη μετανάστευση και την αναστολή της εισβολής (Εικ. 5C, 5D). Ενδιαφέρον, δοκιμασίες Transwell έδειξαν ότι εξόντωση ADAM19 με siRNA θα μπορούσε να καταστείλει τη μετανάστευση και την εισβολή των κυττάρων, η οποία ήταν παρόμοια με την επίδραση της miR-30c υπερέκφραση (Σχ. 5Ε, 5G και 5Η). Επιπλέον, προσδιορίσαμε την επίδραση του miR-30c και ADAM19 στη διαδικασία EMT. Τα αποτελέσματα qRT-PCR demonstrateed ότι Ε-καδερίνης ρυθμίζεται αυξητικά ενώ Ν-καντερίνης και βιμεντίνης ανεστάλησαν από υπερέκφραση του miR-30c ή αποσιώπηση του ADAM19 (Εικ. 5F), ως εκ τούτου miR-30c και ADAM19 μπορεί να εμπλέκεται στη ρύθμιση της ΕΜΤ διαδικασία. Συνολικά, ADAM19 μπορεί να είναι ένα λειτουργικό στόχο miR-30c.

(ΑΒ) Η έκφραση του miR-30c και ADAM19 εξετάστηκαν με qRT-PCR (Α) και ανάλυση κηλίδος western (Β), αντίστοιχα σε HCT116 κύτταρα τα οποία διαμολύνθηκαν ταυτόχρονα με miR-30c μιμούνται (ή NC μιμητικό) και ADAM19 (ή pcDNA3.1 (+)). β-ακτίνη χρησιμοποιήθηκε ως ενδογενής έλεγχος. (C-D) Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες Transwell. C, εκπρόσωπος φωτογραφίες Transwell? D, ποσοτική ανάλυση. (Ε) κύτταρα HCT116 διαμολύνθηκαν με ADAM19 siADAM19 ή siRNA αρνητικού μάρτυρα (sinc). Μετά από 48 ώρες, η έκφραση ADAM19 ανιχνεύθηκε με western blot. (F) E-cadherin, N-cadherin και βιμεντίνης ανιχνεύθηκαν από qRT-PCR μετά από επιμολυσμένα με siADAM19 /sinc και miR-30c μιμούνται /NC μιμούνται. Οι στήλες αντιπροσώπευαν τη σχετική έκφραση για να sinc και NC μιμούνται ομάδες αντίστοιχα. (G-Η) Μετά επιμολυσμένα με siRNA ή SINC, κύτταρα HCT116 υποβλήθηκαν σε μετανάστευση και εισβολή δοκιμασίες Transwell. G, εκπρόσωπο φωτογραφίες Transwell? Η ποσοτική ανάλυση. *

σ

& lt? 0,05? **

σ

& lt?. 0.01

Η

MiR-30c ανέστειλε την ανάπτυξη του όγκου και των μεταστάσεων in vivo

Για να αναλυθεί η λειτουργία των miR-30c in vivo, η χρησιμοποιήθηκε γυμνό μοντέλο ποντικών ξενομοσχεύματος. Κατασκευάσαμε το πρώτο miR-30c που υπερεκφράζουν σταθερά κύτταρα χρησιμοποιώντας HCT116 κυτταρική σειρά (Σχ. 6Α). Όπως είχε την υψηλότερη έκφραση miR-30c, το # 4 κλώνος επελέγη στα ακόλουθα πειράματα. Τα κύτταρα εγχύθηκαν υποδορίως σε πλευρό γυμνών ποντικών και τα μεγέθη των όγκων παρακολουθήθηκαν κάθε τέσσερις ημέρες. Τα ποντίκια θυσιάστηκαν και υποδόριων όγκων ζυγίστηκαν μετά από τέσσερις εβδομάδες. Τα αποτελέσματα αποκάλυψαν ότι miR-30c οδήγησε σε σημαντικά μειώνεται το μέγεθος και το βάρος του όγκου σε σύγκριση με την ψευδο ομάδα (Εικ. 6Β-6D). Όπως φαίνεται στο Σχ. 6Ε, miR-30c μείωσε το ρυθμό ανάπτυξης όγκων in vivo. Επιπλέον, η έκφραση του miR-30c στην ομάδα αγωγή miRNA ήταν υψηλότερη από ότι σε ψευδο ομάδα (Σχ. 6F). Επιπλέον, δοκιμασία in vivo μετάσταση όγκου έδειξε ότι miR-30c θα μπορούσε να αναστείλει την μετάσταση του πνεύμονα (σχ. 6G, 6Η). Συνολικά δεδομένα πρότειναν την αντικαρκινική δράση του miR-30c in vivo.

(Α) Η σταθερή υπερέκφραση του miR-30c σε κλώνους κυττάρων HCT116 προσδιορίστηκε με qRT-PCR. (Β) 5 × 10

6 κύτταρα HCT116 που διαμολύνθηκαν σταθερά με miR-30C ή κενό φορέα (ψεύτικο) εγχύθηκαν υποδορίως σε γυμνούς ποντικούς (η = 3). Οι ποντικοί θυσιάστηκαν 28 ημέρες μετά την ένεση. (Γ) Οι όγκοι συλλέχθηκαν και αντιπροσωπευτικές όγκοι φαίνονται. (Δ) Οι όγκοι ζυγίστηκαν και η ομάδα υπερέκφραση του miR-30C είχαν μικρότερο βάρος σε σχέση με την πλαστή ομάδα. (Ε) MiR-30c υπερέκφραση οδήγησε σε αναστολή του ρυθμού ανάπτυξης. (F) Η έκφραση του miR-30c ανιχνεύθηκε με qRT-PCR σε όγκους. (G-Η) αιματοξυλίνης και ηωσίνη χρώση τομών του πνεύμονα και στατιστικών αποτελεσμάτων των κόμβων μετάστασης. **

σ

& lt?. 0.01

Η

Συζήτηση

Τα miRNAs απελευθερωθεί σε διάφορους τύπους καρκίνων και έτσι λειτουργούν σαν όγκο-καταστολείς ή ογκογονίδιο από την αλληλεπίδραση με τους αντίστοιχους στόχους. Ωστόσο, σχετικά περιορισμένες πληροφορίες στις οποίες βασίζεται η λεπτομερής μηχανισμός της συμμετοχής miRNA σε καρκίνους που είναι γνωστό. MiR-30c έχει διερευνηθεί σε έναν αριθμό καρκίνων. Είναι ρυθμίζεται προς τα κάτω τα περισσότερα από αναφερθεί έρευνες όπως σε μη μικροκυτταρικό καρκίνο του πνεύμονα, καρκίνο του προστάτη, λευχαιμία, καρκίνο του ενδομητρίου, τον καρκίνο του μαστού και του παχέος εντέρου [8,19,20,21,22]. Ωστόσο, αρκετές μελέτες έχουν αναφέρει την αυξητική ρύθμιση του miR-30c στον καρκίνο του μαστού, το καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων [23,24]. MiR-30c ασκεί τη λειτουργία του με τη συμμετοχή στην εξέλιξη του όγκου, την πρόβλεψη πρόγνωση ή την αποτελεσματικότητα της χημειοθεραπείας σε αυτούς τους καρκίνους. Του ενδιαφέροντος, υπάρχουν ορισμένες αμφιλεγόμενες αποδείξεις όσον αφορά την λειτουργία του miR-30c. Αυτό διαφωτίζει το περίπλοκο ρόλο του miR-30c στην ογκογένεση και την εξέλιξη, παρά τις αντι-όγκου ή ογκογόνο χαρακτήρα. Στη μελέτη μας, σας παρουσιάζουμε ότι miR-30c μπορεί να ρυθμίζει αντιστρόφως την εξέλιξη του καρκίνου του παχέος εντέρου με την καταστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή. Επιπλέον, miR-30c είναι μειωμένη τόσο σε κλινικά δείγματα και κυτταρικές σειρές μαζί με up-ρύθμιση των επιπέδων της ADAM19. ADAM19 είναι ένα άμεσα λειτουργικό στόχος του miR-30c προσδιορίζονται με προσδιορισμούς λουσιφεράσης και in vitro πειράματα. Όλα τα δεδομένα μας δείχνουν ότι το miR-30c παίζει σημαντικό ρόλο στον καρκίνο του παχέος εντέρου.

Για να προσδιοριστούν οι πιθανοί στόχοι του miR-30c, εφαρμόστηκαν τέσσερις βιοπληροφορική αλγορίθμων. Μετά από μια πρώτη διαλογή, ADAM19 ταυτίζεται με το στόχο του miR-30c, διότι είναι στενά συνδεδεμένο με νεοπλασματική διαδικασία. ADAM είναι μια μήτρα μεταλλοπρωτεϊνάσης που σχετίζονται με την οικογένεια πρωτεϊνών που ανήκει στην υπεροικογένεια πρωτεάση ψευδαργύρου. Η οικογένεια ADAM θα ​​μπορούσε να συνδέεται με τον υποδοχέα ιντεγκρίνης και να ενεργούν ως μεταλλοπρωτεάση. Επίσης, παρουσιάζονται με μια κυτταροπλασματική περιοχή [25]. Η (μεταλλοπρωτεάσες αποσυνθετίνη) οικογένεια ADAMs εμπλέκονται σε μια πληθώρα δραστηριοτήτων, συμπεριλαμβανομένων της σύντηξης μεμβράνης, παράγοντα κυτοκίνη την ανάπτυξη και την απόπτωση, μετανάστευση κυττάρων, μαζί με την ανάπτυξη των μυών, λίπανση, και την αποφασιστικότητα της κυτταρικής τύχης [26]. ADAMs θα μπορούσε να υποβαθμίσει μόρια ECM και την προώθηση της μετάστασης του καρκίνου λόγω της πρωτεϊνάσης δραστηριότητα τους, η οποία είναι παρόμοια με ΜΜΡ. Υπάρχουν περισσότερα από είκοσι μέλη της οικογένειας ADAM. ADAM19 είναι ένα σημαντικό μέλος της οικογένειας ADAM. Διάφορες μελέτες έχουν δείξει ότι ADAM19 εμπλέκεται σε πολλούς τύπους ασθενειών. Έχει αναφερθεί ότι πιθανότητα ότι μεταλλάξεις στο ADAM19 μπορεί να συνεισφέρει στην ανθρώπινη συγγενή καρδιακή βαλβίδα και διαφραγματικών ανωμαλιών [27]. Ορισμένες έρευνες από την Κίνα έδειξαν ότι ADAM19 θα μπορούσαν να έχουν επιπτώσεις στην ανάπτυξη των όρχεων και της χρόνιας αποφρακτικής πνευμονοπάθειας. συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου. Τι περισσότερο, κάποια δεδομένα υποδηλώνουν ότι ADAM19 μπορούν να συμμετέχουν στις βασικές διαδικασίες της έκκριση αδένων, τροφοβλάστη εισβολής και της υποβάθμισης της εξωκυττάριας μήτρας κατά τη διάρκεια της πρόωρης εγκυμοσύνης [28]. Επιπλέον, ADAM19 βρέθηκε να είναι ρυθμισμένα προς τα πάνω σε καρκίνωμα νεφρικών κυττάρων και πρωτογενών όγκων του εγκεφάλου και προώθησε την διεισδυτικότητα των όγκων [29,30]. Υπάρχουν σχετικά λίγες μελέτες σχετικά με miRNA στοχεύει ADAMs παρά ότι μια πρόσφατη μελέτη διαπίστωσε μετασχηματισμού ανάπτυξης σηματοδότηση παράγοντα-β ρυθμίζει την έκφραση ADAM στην πειραματική νεφρική ίνωση μέσω του miR-29 [31]. Η λειτουργία της ADAM19 παραμένει ασαφής. Στη μελέτη μας, διαπιστώσαμε ότι ADAM19 θα μπορούσε να προωθήσει την εισβολής των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου, για πρώτη φορά

MiR-30c ανήκει στην οικογένεια miR-30 το οποίο αποτελείται από πέντε μέλη:. MiR-30a, b, c , δ και ε. Είναι ενδιαφέρον ότι, αυτά τα πέντε μέλη έχουν διαφορετικές λειτουργίες. MiR-30c έχει δειχθεί να λειτουργεί είτε ως ογκογονιδίου ή ογκοκατασταλτικών σε διαφορετικούς τύπους καρκίνου. Σταθερά, miR-30a δρα ως καταστολέας όγκων σε σημαντικές τύπους κακοήθων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, καρκίνο μαστού, γαστρικό καρκίνο, καρκίνο του θυρεοειδούς, λευχαιμία και [6,32,33,34,35]. MiR-30b θα μπορούσαν να απαγορεύουν την απόπτωση των κυττάρων γλοιώματος και καρκινικά κύτταρα πνεύμονα [36]. Ότι, miR-30b είναι ικανό να μειώνει την ανάπτυξη των κυττάρων του καρκίνου του μαστού και την πρόληψη EMT σε καρκίνο του ήπατος με αλληλεπίδραση με κυκλίνη Ε2 (CCNE2) και Snail1, αντίστοιχα [32,37]. Ωστόσο, miR-30d είναι πιθανό να λειτουργεί ως ογκογονίδιο στην πλειοψηφία των ερευνών [38,39,40,41]. Ομοίως με miR-30a, miR-30e μπορεί να αναστέλλει τον πολλαπλασιασμό των κρουσμάτων καρκίνου [16] και είναι επίσης αναγνωριστεί ως προγνωστικός πρόγνωση σε καρκίνωμα του ρινοφάρυγγα [42]. Το φαινόμενο αυτό είναι λογικό όπως miRNA εκτελέσει σε στόχους-εξαρτώμενη και ιστο-ειδικό τρόπο. Το μερίδιο οικογένεια miRNA-30 η ίδια αλληλουχία σπόρων, ωστόσο, δεν δραματικές πρόσθετα αποτελέσματα παρήχθη μετά την αναγκαστική έκφραση αυτών των πέντε μέλη ταυτόχρονα (τα δεδομένα δεν φαίνονται) που υποδηλώνει δεν υπάρχει συνεργική επίδραση τους. Η επίδραση της αναστολής του miR-30c για ADAM19 είναι πιο προφανής μεταξύ όλων των πέντε μελών του miR-30 οικογένεια που υποδεικνύεται από qRT-PCR και προσδιορισμού λουσιφεράσης. Ως εκ τούτου, έχουμε επικεντρωθεί σε miR-30c στη μελέτη μας.

Είναι γνωστό ότι ένα ενιαίο miRNA θα μπορούσε να ρυθμίσει πολλαπλούς στόχους και κάθε mRNA θα μπορούσε επίσης να ελέγχεται από διάφορες miRNAs. Στη μελέτη μας, βρήκαμε ότι το miR-30c προκάλεσε μια μείωση κατά 20% της έκφρασης ADAM19, όμως, ο ρυθμός μετανάστευσης και εισβολής αυξήθηκε περισσότερο από 20% (Σχ. 5Β VS 5D). Επισήμανε ότι κάποιοι άλλοι στόχοι γονίδιο που εμπλέκεται σε μεταβολές που προκαλούνται από miR-30c.

Στο σύνολό τους, η παρούσα μελέτη δείχνει για πρώτη φορά ότι το miR-30c καταστέλλει την ανάπτυξη των καρκινικών κυττάρων, τη μετανάστευση και την εισβολή απευθείας στόχευση ADAM19 η οποία θα μπορούσε να προωθήσει την κακοήθεια του καρκίνου του παχέος εντέρου κυττάρων. Τα πρόσφατα εντοπίστηκαν άξονα miR-30c /ADAM19 ρίξει νέο φως για το ρυθμιστικό μηχανισμό miRNA-based. Λαμβάνοντας υπόψη τον κρίσιμο ρόλο του miR-30c στον καρκίνο του παχέος εντέρου, χειραγώγηση του miR-30c μπορεί να αντιπροσωπεύει ένα δυνητικό νέο θεραπευτικό στόχο για τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Ευχαριστίες

Σας ευχαριστούμε κ Zhao για ποντίκια διατήρηση .