Αφηρημένο

Ιστορικό

Η διαχείριση των ασθενών που έχουν διαγνωστεί με καρκίνο του προστάτη (PCA) είναι πολύ αποτελεσματικό? Ωστόσο, η επανεμφάνιση του όγκου με ευνουχισμού Resistant καρκίνου του προστάτη (CRPC) και μετέπειτα μετάσταση οδηγεί σε κακή έκβαση επιβίωση, υποδεικνύοντας ότι υπάρχει απόλυτη ανάγκη για νέα μηχανιστική κατανόηση επανεμφάνισης του όγκου, η οποία θα είναι κρίσιμης σημασίας για το σχεδιασμό νέων θεραπειών. Η επανεμφάνιση και η μετάσταση του προστάτη είναι στενά συνδεδεμένη με τη βιολογία των βλαστικών κυττάρων του καρκίνου του προστάτη ή καρκινικά κύτταρα κίνηση που θυμίζει την απόκτηση Τα επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά Μετάβασης (EMT) φαινότυπο. Αύξηση στοιχεία δείχνουν ότι τα κύτταρα EMT-τύπου έχουν πολλά κοινά βιολογικά χαρακτηριστικά με καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν.

Μεθοδολογία /Κύρια Ευρήματα

Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι τα κύτταρα του προστάτη με EMT φαινότυπο εμφανίζεται STEM- όπως χαρακτηριστικά των κυττάρων που χαρακτηρίζεται από αυξημένη έκφραση του Sox2, Nanog, Oct4, Lin28B ή /και Notch1, σύμφωνα με ενισχυμένη κλωνογονικού και σφαίρα (prostasphere) -forming ικανότητα και tumorigenecity σε ποντίκια, η οποία σχετίζεται με μειωμένη έκφραση του miR-200 και /ή ας-7 οικογένεια. Αναστροφή της ΕΜΤ με εκ νέου έκφραση του miR-200 ανέστειλε prostasphere σχηματισμού ικανότητα των κυττάρων ΕΜΤ-τύπου και μείωσε την έκφραση της Notch 1 και Lin28B. Κάτω ρύθμιση των Lin28B αυξημένη αφήστε 7-έκφρασης, η οποία ήταν σύμφωνη με καταπιεσμένη ικανότητα αυτο-ανανέωσης.

Συμπεράσματα /Σημασία

Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-200 διαδραμάτισε καίριο ρόλο στη διασύνδεση της χαρακτηριστικά του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με EMT-όπως υπογραφές κυττάρων στην ΣΕΣΣ. Επιλεκτική εξάλειψη του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν με την αντιστροφή του φαινοτύπου EMT να μεσεγχυματικά-Επιθηλιακά Μετάβασης (ΚΟΑ) φαινότυπο, χρησιμοποιώντας νέους παράγοντες θα ήταν χρήσιμοι για την πρόληψη της υποτροπής του όγκου ειδικά με την εξάλειψη αυτών των κυττάρων που αποτελούν το «Root Αιτία» ανάπτυξη όγκου και υποτροπή

Παράθεση:. Κονγκ D, Banerjee S, Ahmad A, Li Υ, Wang Ζ, Sethi S, et al. (2010) Τα επιθηλιακά σε μεσεγχυματικά μετάβαση μηχανιστική Συνδέεται με υπογραφές Βλαστικών Κυττάρων σε κύτταρα καρκίνου του προστάτη. PLoS ONE 5 (8): e12445. doi: 10.1371 /journal.pone.0012445

Συντάκτης: Τσαντ Creighton, Baylor College of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 28 Ιούνη 2010? Αποδεκτές: 6 Αυγούστου, 2010? Δημοσιεύθηκε: 27 Αυγούστου του 2010

Copyright: © 2010 Κονγκ et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο χρηματοδοτήθηκε από μια επιχορήγηση από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, Εθνικό Ινστιτούτο Υγείας (NIH) (5R01CA083695-08 να FHS) (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Οι αναδυόμενες στοιχεία δείχνουν ότι μπορεί να προκύψουν πιο συμπαγείς όγκους, συμπεριλαμβανομένων του καρκίνου του προστάτη (PCA) από καρκινικά βλαστικά κύτταρα [1]. Τα καρκινικά βλαστικά κύτταρα είναι κύτταρα εντός ενός όγκου που διαθέτουν την ικανότητα της αυτο-ανανέωσης και ικανότητα ογκογενή, και διαφοροποιούνται προς τα ετερογενή καταγωγές των καρκινικών κυττάρων που περιλαμβάνουν σε μία μάζα όγκου. Αυτά τα ογκογενή κύτταρα θα μπορούσε να παρέχει μια δεξαμενή για κύτταρα που προκαλούν υποτροπή του όγκου μετά από θεραπεία. Wang et al. έχουν δείξει ότι η προέλευση των κυττάρων του προστάτη είναι από τις διαφοροποιημένες αυλού επιθηλιακά βλαστικά κύτταρα [2]. Ωστόσο, υπάρχει ένας μεγαλύτερος βαθμός φαινοτυπική ετερογένεια των κυττάρων σε προστάτη, ιδιαίτερα εντός μεταστατικές θέσεις. Μεταστάσεις συχνά περιλαμβάνουν σπάνια κύτταρα που είναι φαινοτυπικά αδιαφοροποίητα [3], υποδεικνύοντας ότι τα κύτταρα των μεταστάσεων-κίνηση μπορεί να μην είναι τα μόνα κύτταρα που προέρχονται από ανδρογόνων αυλού κύτταρα υποδοχέα θετική. Αν και προέλευση των κυττάρων προστάτη πρέπει να διευκρινιστεί πλήρως, ένας αριθμός αυξανόμενες αποδείξεις υποδεικνύουν ότι ογκογενή κύτταρα ή αρχέγονα κύτταρα του καρκίνου παίζουν έναν κρίσιμο ρόλο στην εξέλιξη και την επανάληψη της PCA, ώστε να ευνουχίσει ανθεκτικά καρκίνου του προστάτη (CRPC) και μετέπειτα μετάσταση του.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι τα σωματικά κύτταρα μπορούν να επαναπρογραμματιστούν σε πολυδύναμα εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν με συν-έκφραση δεικτών κυτταρικής πλειοδυναμίας βλαστικών όπως Oct4, Sox2, Nanog και Lin28 [4], [5], η οποία αυξάνει την πιθανότητα ότι συνδυασμένη έκφραση του κυττάρου-σχετιζόμενων παραγόντων βλαστικών και των ειδικών ογκογονιδίων θα μπορούσε επίσης να προκαλέσει μια αδιαφοροποίητη κατάσταση σε καρκινικά κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι, οι κυτταρικές σειρές που προέρχονται από ανθρώπινο δείγμα προστάτη έδειξε επιθηλιακά φαινότυπο. Ωστόσο, αθανατοποίηση των κυττάρων αυτών με hTERT έδειξαν την έκφραση των δεικτών πλειοδυναμίας βλαστικών κυττάρων, συμπεριλαμβανομένων των Oct4, Nonag, και Sox2 [6], η οποία θα μπορούσε να συσχετιστεί με την εξέλιξη της νόσου, επειδή η υπερ-έκφραση του Oct4, Sox2, Nanog και c-myc έχει έχουν βρεθεί σε φτωχά διαφοροποιημένοι όγκοι [7]. Jeter et al. έχουν δείξει ότι το knock-down του Nanog στα κύτταρα του προστάτη μειώθηκε σημαντικά μακροπρόθεσμα κλωνογόνο ανάπτυξη και την αύξηση του όγκου ανέστειλε [8]. Oct4 έχει επίσης αποδειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της προστάτη [9].

Τα επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβαση (ΕΜΤ) είναι ένα ζωτικής σημασίας διαδικασία για τη μορφογένεση κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη, αλλά πιο πρόσφατα έχει επίσης εμπλακεί σε η μετατροπή του πρώιμο στάδιο όγκων σε επεμβατική κακοήθειες [10]. Πρόοδος των περισσότερα καρκινώματα προς κακοήθεια συνδέεται με την απώλεια της διαφοροποίησης επιθηλιακών και αλλάζοντας προς μεσεγχυματικά φαινότυπο, η οποία συνοδεύεται από αυξημένη κινητικότητα κυττάρων και εισβολή. Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει ότι η EMT διαδραματίζει έναν κρίσιμο ρόλο όχι μόνο στη μετάσταση του όγκου, αλλά και σε όγκο επανάληψης που πιστεύεται ότι είναι στενά συνδεδεμένες με την βιολογία του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν ή καρκινικά κύτταρα έναρξη [11] – [13]. Πάντως, οι μηχανισμοί με τους οποίους τα κύτταρα ΕΜΤ παράγουν τα βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν παραμένουν να διευκρινισθούν. Τα Τα microRNAs (miRNAs) αναδύεται ως κύριο ρυθμιστές της κυτταρικής διαφοροποίησης και ενέχονται στην απόκτηση του EMT φαινοτύπου κατά την εξέλιξη του όγκου [14]. Δύο εξελικτικά συντηρημένη οικογένειες, miR-200 και αφήστε-7 έχουν δειχθεί ότι ρυθμίζουν τις διαδικασίες διαφοροποίησης κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης. Είναι ενδιαφέρον ότι, πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι miR-200 οικογένεια όχι μόνο μπορεί να ρυθμίζει τις διαδικασίες της ΕΜΤ με τη στόχευση πρωτεΐνη σύνδεσης ZEB1 και E-box ZEB2 [15], αλλά επίσης συνδέονται με το κυτταρικό υπογραφές στέλεχος που μοιάζει με τη ρύθμιση της έκφρασης του Bmi1 [ ,,,0],16], [17]. Ας-7 οικογένεια miRNAs έχει δειχθεί ότι δρα ως καταστολέας όγκου μέσω στόχευσης Ras, ομάδα υψηλής κινητικότητας Α2 (HMGA2) και c-myc, και μειωμένη ας-7 έκφραση έχει συνδεθεί με αυξημένη ογκογονικότητα και φτωχή πρόγνωση ασθενούς. Το πιο σημαντικό, τα μέλη Ας-7 οικογένεια ρυθμίζουν την αυτο-ανανέωση των κυττάρων καρκίνου του μαστού [18], η οποία συνδέεται με φαινότυπο βλαστοκυττάρων. Πρόσφατες μελέτες έχουν επίσης τεκμηριωθεί ότι lin28B θα μπορούσε να μπλοκάρει την συσσώρευση του ώριμου ας-7 [19], η οποία με τη σειρά της ρυθμίζει «βλαστική ικανότητα» με αναστολή αυτο-ανανέωση, τα κυτταρικά χαρακτηριστικά του καρκίνου βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν σχετίζονται με υποτροπή του όγκου. Η επανάληψη του προστάτη πιστεύεται ότι συνδέεται ισχυρά με τη βιολογία των βλαστικών κυττάρων καρκίνου του προστάτη ή κύτταρα καρκίνου κίνηση [11], [20], [21], ενώ αυξανόμενες ενδείξεις έχουν δείξει ότι τα κύτταρα με EMT που επάγεται από διάφορους παράγοντες είναι πλούσια πηγή των καρκινικών κυττάρων στελέχους-όπως [12], [13], [22], [23].

Ως εκ τούτου, είναι σημαντικό να προσδιοριστούν οι παράγοντες που θα μπορούσαν να προκαλέσουν EMT και πώς τα κύτταρα EMT θα μπορούσε να γίνει ένας πόρος για καρκινικά βλαστικά κύτταρα όμοια, η οποία υπογραμμίζει περαιτέρω τη μηχανιστική ρόλος αυτών των παραγόντων προς την ανάπτυξη νέων και στοχευμένων θεραπειών για CRPC. Μελέτες έχουν δείξει ότι η σηματοδότηση που προέρχεται από αιμοπετάλια αυξητικού παράγοντα (PDGF) συμβάλλει στην EMT [24], [25]. Πρόσφατα, εμείς και άλλοι έχουν δείξει ότι PDGF-D θα μπορούσε να ρυθμίσει την προσβολή καρκινικών κυττάρων και την αγγειογένεση, η οποία ήταν σύμφωνη με την απόκτηση του φαινοτύπου ΕΜΤ [26] – [30]. Είναι ενδιαφέρον ότι, η αυξημένη έκφραση του PDGF-D έχει βρεθεί επίσης σε ανθρώπινο προστάτη [31], υποδηλώνοντας ότι PDGF-D θα μπορούσαν να παίξουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη της ανθρώπινης προστάτη εισφέρει ΕΜΤ-φαινοτυπική ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε ότι PDGF-D υπερ-εκφράζοντα κύτταρα PC3 αποκτήσει φαινότυπο ΕΜΤ και λειτουργίες κοινόχρηστης βλαστικών κυττάρων που μοιάζουν χαρακτηρίζονται από αυξημένη έκφραση των δεικτών των βλαστικών κυττάρων όπως Notch 1, Sox2, Nanog, Oct4 και Lin28B, η οποία ήταν σύμφωνη με ενισχυμένη κλωνογονικού, prostasphere-ικανότητα σχηματισμού καθώς και η αυξημένη ογκογονικότητα σε ποντίκια. Ταυτόχρονα, βρήκαμε ARCaP

Μ κυττάρων με EMT φαινότυπο συμμερίζεται επίσης τις υπογραφές των βλαστικών κυττάρων, όπως χαρακτηρίζεται από αυξημένη έκφραση του μεταγραφικού παράγοντα Notch1 και ενισχυμένη κλωνογονικού, ικανότητα prostasphere σχηματισμού σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου (ARCaP

Ε κύτταρα) με επιθηλιακά φαινότυπο. Αυτά τα κύτταρα ΕΜΤ-τύπου επίσης έδειξαν μειωμένη έκφραση του miR-200 ή ας-7, και αναστροφή της ΕΜΤ εξαναγκάζοντας έκφραση του miR-200 ανέστειλε σημαντικά κλωνογόνο και prostasphere σχηματισμού ικανότητα, η οποία ήταν σύμφωνη με την αναστολή της έκφρασης Notch 1 και Lin28B. Επιπλέον, knock-down της Lin28B σημαντικά αυξημένη ας-7 έκφραση, γεγονός που υποδηλώνει ότι το miR-200 και αφήστε-7 θα μπορούσε να λειτουργήσει ως στόχο για την πρόληψη της υποτροπής του όγκου και των μεταστάσεων στον προστάτη.

Αποτελέσματα

κλωνογόνος ικανότητα αυξήθηκε σε PC3 PDGF-D και ARCaP

Μ κυττάρων που έχουν φαινότυπο ΕΜΤ

Τα αποτελέσματα από την ανάλυση Western blot και η μορφολογία των κυττάρων, καθώς και τα δημοσιευμένα δεδομένα μας έδειξαν ότι η υπερ-έκφραση του PDGF -D επαγόμενη φαινότυπο ΕΜΤ σε κύτταρα PC3 [26], [28] (Εικ. 1Α), η οποία ήταν σύμφωνη με τα υψηλότερα επίπεδα του PDGF-D στα κυτταρολύματα και ρυθμισμένο μέσο (CM) από κύτταρα PDGF-D PC3 σε σύγκριση με PC3 Neo κύτταρα (Σχ. S1A και S1B). ARCaP

Μ κυττάρων έχοντας μεσεγχυματικά μορφολογία έδειξαν αυξημένη έκφραση των δεικτών μεσεγχυματικών και μειωμένη έκφραση των επιθηλιακών δεικτών σε σύγκριση με ARCaP

E κυττάρων με επιθηλιακά φαινότυπο (Εικ. 1Β). Για να καθοριστεί εάν τα κύτταρα με φαινότυπο EMT θα μπορούσαν να έχουν τα χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων, όπως, πραγματοποιήσαμε κλωνογονική δοκιμασία. Βρήκαμε ότι κλωνογόνο ικανότητα ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα PDGF-D PC3 σε σύγκριση με τα κύτταρα PC3 Neo (Σχ. 1C, αριστερό πλαίσιο). Σύκο. 1Γ, δεξιό πλαίσιο, ανέφεραν επίσης ότι τα κύτταρα PC3 PDGF-D έδειξε μια 11-πλάσια αύξηση του αριθμού των αποικιών σε σχέση με κύτταρα PC3 Neo. ARCaP

Μ κυττάρων εμφανίζεται επίσης αυξημένη κλωνογόνο ικανότητα που δείχνει 3-πλάσια αύξηση του αριθμού των αποικιών σε σύγκριση με ARCaP

E κύτταρα (Σχ. 1D). Μαλακό δοκιμασία άγαρ, επίσης γνωστή ως αγκύρωση ανεξάρτητη δοκιμασία ανάπτυξης, διεξήχθη. PC3 κύτταρα PDGF-D έδειξε δραματική αύξηση στην κλωνογόνο δυναμικό σε σύγκριση με κύτταρα PC3 Neo (Σχ. 1Ε, αριστερό πάνελ). Σύκο. 1Ε, δεξιά πάνελ, έδειξε ξεκάθαρα στους αριθμούς των αποικιών που παράγεται από τα κύτταρα ανά μικροσκοπικό πεδίο (40 Χ) PC3 Neo και PC3 PDGF-D. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν μια αύξηση στην κλωνογόνο ικανότητα των κυττάρων ΕΜΤ

(Α) Οι φωτογραφίες των κυττάρων που εμφανίζονται:. PC3 κύτταρα Neo εμφανίζεται στρογγυλεμένο σχήμα επιθηλιακών κυττάρων και κυττάρων PDGF-D PC3 παρουσίασαν φαινότυπο ινοβλαστική τύπου (αριστερό πάνελ , αρχική μεγέθυνση, 200 Χ). Η ανάλυση στυπώματος Western έδειξε την έκφραση του καταστολείς της μεταγραφής που σχετίζονται με EMT, και μεσεγχυματικά καθώς και επιθηλιακά κύτταρα δείκτες σε PC3 Neo και PC3 PDGF-D (δεξιά πάνελ, πέρασμα 10 έως 20). (Β) Η μορφολογία του ARCaP

Μ και ARCaP

E κύτταρα δείχθηκε (αριστερό πάνελ) ανάλυση κηλίδας .western έδειξε την αυξημένη ZEB1, βιμεντίνη και Notch 1 έκφρασης και μειωμένη έκφραση Ε-καδερίνης σε ARCaP

Μ κυττάρων σε σύγκριση με ARCaP

E (δεξί πάνελ). (Γ) και (Δ) Οι φωτογραφίες των αποικιών από PC3 Neo και PC3 PDGF-D ή ARCaP

Μ και ARCaP

E δείχθηκαν (αριστερό πάνελ). Οι αριθμοί αποικιών μετρήθηκαν και τα δεδομένα παρουσιάζονται ως σχετικοί αριθμοί των αποικιών των PC3 Neo ή ARCaP

E σχεδιαστεί ως 1 (δεξί πάνελ). (Ε) Οι αποικίες που αναπτύσσονται σε μαλακό άγαρ φωτογραφήθηκαν (αριστερό πάνελ, μπαρ, 200 μm). Οι αριθμοί αποικιών μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως αριθμοί αποικιών ανά πεδίο (δεξιά πλευρά). **, P & lt? 0,01 σε σύγκριση με το Νέο ή ARCaP

E κύτταρα (Ν: κύτταρα PC3 Neo, D: PC3 κύτταρα PDGF-D, p10: πέρασμα 10, E-CAD: E-cadherin)

ικανότητα αυτο-ανανέωσης αυξήθηκε κατά EMT κύτταρα

Για να προσδιοριστεί περαιτέρω κατά πόσο τα κύτταρα με φαινότυπο EMT θα μπορούσε να δείξει τα χαρακτηριστικά των βλαστικών κυττάρων, όπως, ελέγξαμε σχηματισμού σφαίρας (όπως ονομάζεται prostasphere) ικανότητα των PC3 ΡϋΟΡ D κυττάρων σε σύγκριση με PC3 Neo καθώς ARCaP

Μ κυττάρων σε σύγκριση με ARCaP

E κύτταρα όταν καλλιεργούνται σε καλλιέργειες εναιωρήματος, το οποίο είναι ένα

in vitro

μέτρο των χαρακτηριστικών βλαστικών σαν κύτταρο. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα PC3 PDGF-D έδειξε σημαντικά αυξημένη ικανότητα να σχηματίζουν prostaspheres σχέση με τα κύτταρα PC3 Neo (Σχ. 2Α και 2Β). Οι prostaspheres από PC3 Neo ήταν μικρότερο από 100 μm σε διάμετρο μετά από 6 ημέρες, ενώ το 40% των prostaspheres από κύτταρα PC3 PDGF-D ήταν 100-200 μm, το 20% των prostaspheres από κύτταρα PC3 PDGF-D ήταν μεγαλύτερη από 200 μm (Σχ. 2C). Για να επιβεβαιωθεί περαιτέρω εάν οι prostaspheres έχουν γεννηθεί από μεμονωμένα κύτταρα και όχι τα συσσωματώματα των πολλαπλών κυττάρων, οι prostaspheres (Ρ1) συλλέχθηκαν και τα κύτταρα απλώθηκαν σε ένα κύτταρο ανά φρεάτιο σε πλάκα 96-φρεατίων με εξαιρετικά χαμηλή προσκόλληση. Μετά από 12 ημέρες, βρήκαμε ότι μία σε δύο νέες prostaspheres παρήχθησαν από κύτταρα PDGF-D ενιαίο PC3, ενώ μόνο το 20% απλά κύτταρα του PC3 Neo δημιουργούνται νέα prostaspheres (Ρ2, Σχ. 2D). ARCaP

Μ κύτταρα παρουσίασαν επίσης αυξημένη ικανότητα prostasphere σχηματισμού (Σχ. 2Ε και 2F), γεγονός που υποδηλώνει ότι τα κύτταρα με φαινότυπο EMT απέκτησε αυξημένη ικανότητα αυτο-ανανέωσης. Βάσει αυτών των αποτελεσμάτων, περαιτέρω μηχανιστικών πειράματα επικεντρώθηκαν χρησιμοποιώντας κύτταρα PC3 PDGF-Α σε σύγκριση με PC3 κύτταρα Neo και συγκρίθηκε με ARCaP

Μ και ARCaP

E κύτταρα οπουδήποτε δικαιολογημένη.

(Α) Prostaspheres από PC3 Neo και PC3 PDGF-D κύτταρα φωτογραφήθηκαν και εμφανίζονται (bar, 100 μm). (Β) Οι αριθμοί των prostaspheres μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο. (C) Prostaspheres φωτογραφήθηκαν και το μέγεθος των prostaspheres σε διάμετρο μετρήθηκε χρησιμοποιώντας πρόγραμμα ανάλυσης εικόνας λογισμικού Scion Image. (Δ) Η prostaspheres (Ρ1) συλλέχθηκαν και επανα-επιστρώνονται σε πυκνότητα ενός κυττάρου ανά φρεάτιο σε πλάκα 96-φρεατίων με εξαιρετικά χαμηλή προσκόλληση. Μετά από 12 ημέρες επώασης, οι αριθμοί των prostaspheres (Ρ2) μετρήθηκαν κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. (Ε) Οι αριθμοί των prostaspheres από ARCaP

Ε και ARCaP

Μ κύτταρα μετρήθηκαν κάτω από το μικροσκόπιο. (F) Prostaspheres από ARCaP

Ε και ARCaP

κύτταρα Μ φωτογραφήθηκαν και εμφανίζονται (bar, 100 μm). **, P & lt? 0,01 σε σύγκριση με το Νέο ή ARCaP

E κύτταρα. (Νέο: κύτταρα PC3 Νέο, PDGF-D: κύτταρα PC3 PDGF-D)

Η

Η γονιδιακή έκφραση των χαρακτηριστικών των δεικτών των βλαστικών κυττάρων σε κύτταρα με EMT φαινότυπο

για να ανακαλύψετε τα γονίδια που ρυθμίζουν και τη διατήρηση του φαινοτύπου των βλαστικών κυττάρων των κυττάρων PC3 PDGF-D με υπογραφές EMT, πραγματοποιήσαμε μικροσυστοιχιών για να καθοριστεί προφίλ γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων PDGF-D PC3 σε σύγκριση με PC3 Νέο κύτταρα. Βρήκαμε ότι τα κύτταρα PC3 PDGF-D έδειξε δραματικές αλλαγές στην έκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με EMT φαινότυπο (Πίνακας S1). Είναι ενδιαφέρον, μεταγραφικοί παράγοντες Sox2, Nanog, Oct4 και Lin28B, είναι γνωστό ότι είναι επαρκής για να επαναπρογραμματίσει ποντικού ή ανθρώπινων σωματικών κυττάρων σε αδιαφοροποίητα, πολυδύναμα βλαστικά κύτταρα, βρέθηκαν να αυξηθεί σημαντικά σε κύτταρα PDGF-D PC3 σε σύγκριση με κύτταρα PC3 Neo. Ταυτόχρονα, προς τα κάτω τους στόχους αυτών των παραγόντων μεταγραφής όπως Zic2, Zic3, Sall2 και Sall4 ήταν επίσης σημαντικά πάνω ρυθμισμένα (Πίνακας S2). Για την περαιτέρω επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων από την έκφραση του γονιδίου microarray αναλύσεων, έχουμε διεξάγει πραγματικού χρόνου RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western των επιλεγμένων γονιδίων. Τα αποτελέσματα από πραγματικού χρόνου RT-PCR έδειξε 2 έως χίλιες φορές αύξηση στα επίπεδα mRNA αυτών των παραγόντων μεταγραφής και κατάντη τους στόχους σε κύτταρα PC3 PDGF-D (Σχ. 3Α). Η ανάλυση στυπώματος Western κατέδειξε επίσης ότι τα πρωτεϊνικά εκφράσεις Sox2, Nanog, Stat3, Lin28B και Oct4 ήταν σημαντικά υψηλότερα σε κύτταρα PDGF-D PC3 σε σύγκριση με τα κύτταρα PC3 Neo από πέρασμα 10 έως το πέρασμα 20 (Σχ. 3Β).

(Α) Η έκφραση των γονιδίων στα επίπεδα mRNA για Oct4, Nanog, Sox οικογένεια γονιδίων και Lin28B σε κύτταρα PC3 Neo και PC3 PDGF-D προσδιορίστηκαν με χρήση πραγματικού χρόνου RT-PCR. (Β) Τα αποτελέσματα από κηλίδα Western έδειξε ότι οι εκφράσεις του Oct4 Sox2, Nanog, Stat3 και Lin28B ήταν σημαντικά αυξημένη στα κύτταρα PC3 PDGF-D. (Γ) πραγματικού χρόνου RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του mRNA του ΕΤΔ, ΕΖΗ2 και Suz12a. Σχετικά επίπεδα mRNA κανονικοποιήθηκαν προς GAPDH. (D) Τα αποτελέσματα από κηλίδα Western έδειξε ότι η έκφραση του ΕΖΗ2 ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα PC3 PDGF-D. (Ε) Τα επίπεδα mRNA των παραγόντων σηματοδότησης Notch σε PC3 Neo και τα κύτταρα PC3 PDGF-D προσδιορίστηκαν με χρήση πραγματικού χρόνου RT-PCR. (F) Τα αποτελέσματα από κηλίδα Western έδειξε ότι οι εκφράσεις του Notch και συνδετήρων Notch αυξήθηκαν σημαντικά σε κύτταρα PC3 PDGF-D. GAPDH χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο πρωτεΐνης φόρτωσης. (Ν: PC3 κύτταρα Neo, D: PC3 κύτταρα PDGF-D, p10: πέρασμα 10).

Η

Polycomb πρωτεΐνες ομάδα είναι γνωστό ότι εμπλέκεται στη ρύθμιση της γονιδιακής καταστολής μέσω τροποποιήσεων της χρωματίνης, η οποία είναι απαραίτητη για τη διατήρηση των εμβρυϊκών και ενήλικων βλαστικών κυττάρων [32], [33]. Polycomb κατασταλτική συγκρότημα 2 (PRC2) περιέχει Suz12, ΕΖΗ2, ΕΤΔ και RBAP υπομονάδες και λειτουργεί στα εμβρυϊκά και τα ενήλικα βλαστικά κύτταρα για να καταστείλει αναπτυξιακών γονιδίων που ενεργοποιούνται επιλεκτικά κατά τη διάρκεια της διαφοροποίησης. Επιπλέον, περαιτέρω μελέτες έχουν δείξει ότι PRC2 γονίδια στόχοι είναι συν-καταλαμβάνεται από τις ρυθμιστικές αρχές των βλαστικών κυττάρων, όπως Oct4, Sox2 και Nanog [34]. Κατά την ανάλυση των δεδομένων των δεδομένων των μικροσυστοιχιών μας βρήκαμε ότι τα επίπεδα του ΕΖΗ2 και Suz12a mRNA αυξήθηκαν σε κύτταρα PDGF-D PC3 σε σύγκριση με τα κύτταρα PC3 Neo (Πίνακας S2), που επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με πραγματικού χρόνου RT-PCR (Σχ. 3C). Επιπλέον, τα επίπεδα της πρωτεΐνης του ΕΖΗ2 ήταν σημαντικά πάνω ρυθμισμένα σε κύτταρα PC3 PDGF-D σε σχέση με κύτταρα PC3 Neo (Σχ. 3D) και αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν σαφώς ότι τα χαρακτηριστικά ΕΜΤ-τύπος των κυττάρων PC3 PDGF-D είναι συνεπείς με το υπογραφές των βλαστικών κυττάρων ή καρκινικά βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν.

σηματοδότηση Notch έχει δειχθεί ότι παίζουν σημαντικό ρόλο στη pluripotency και αυτο-ανανέωση ικανότητα και των δύο εμβρύων και ενήλικων βλαστικών κυττάρων [35], [36]. Τα αποτελέσματα από τα δεδομένα μικροσυστοιχιών μας έδειξε ότι τα επίπεδα mRNA του Notch, συνδέτες Notch, δέλτα-όπως, Jagged καθώς Notch κατάντη στόχοι όπως Hes και Hey ήταν σημαντικά υψηλότερα σε κύτταρα PDGF-D PC3 σε σύγκριση με τα κύτταρα PC3 Neo (Πίνακας S2) . Πραγματικού χρόνου RT-PCR έδειξε 2 να 350 φορές αύξηση στα επίπεδα mRNA των γονιδίων σηματοδότησης Notch (Εικ. 3Ε), οι οποίες επιβεβαιώθηκαν περαιτέρω με ανάλυση κηλίδος Western όπως φαίνεται στο Σχ. 3F. Παρομοίως, βρήκαμε επίσης σημαντικά αυξημένο επίπεδο έκφρασης Notch 1 σε ARCaP

M κυττάρων σε σύγκριση με ARCaP

E κύτταρα (Σχ. 1Β, δεξί πάνελ).

συνδέονται έκφραση MiR-200b και miR-200c κυττάρων υπογραφές καρκινικά βλαστικά με EMT φαινότυπο

σε προηγούμενες μελέτες μας, βρήκαμε σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση του miR-200 οικογένεια σε κύτταρα PDGF-D PC3 με EMT φαινότυπο [28], η οποία ήταν σύμφωνη με τα δεδομένα miRNA μικροσυστοιχιών μας (Πίνακας S3). Να αποκαλύψει αν οι εκφράσεις του miR-200 οικογένειας που σχετίζονται με βλαστοκυττάρων υπογραφές, κύτταρα PDGF-D PC3 διαμολύνθηκαν με miR-200a, miR-200b και miR-200c. Βρήκαμε ότι η επιμόλυνση του miR-200b και miR-200c που προκαλείται από αναστροφή της EMT να ΚΟΑ φαινότυπο (Σχ. 4Α). Το πιο σημαντικό, η εκ νέου έκφραση του miR-200b και miR-200c ανέστειλε σημαντικά την ικανότητα prostasphere σχηματισμού των κυττάρων PC3 PDGF-D (Σχ. 4Β). Επιπλέον, το μέγεθος του prostaspheres ήταν επίσης μειωμένη σε κύτταρα PDGF-D PC3 διαμολύνθηκαν με miR-200b και miR-200c σε σύγκριση με την επιμόλυνση με τον έλεγχο miRNA (Σχ. S2A και S2B). Ωστόσο, η επιμόλυνση των κυττάρων PC3 PDGF-D με miR-200A είχε καμία επίδραση στην ικανότητα prostasphere σχηματισμού αλλά αύξησε το μέγεθος του prostaspheres σύγκριση με τον έλεγχο (Εικ. 4Β, Σχ. S2A και το Σχ. S2B). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-200b και miR-200c αλλά όχι miR-200a ανέστειλε αυτο-ανανέωση των κυττάρων PC3 PDGF-D από τον έλεγχο του γονιδίου-στόχου εκφράσεις του miR-200b και miR-200c. Έτσι, αξιολόγησε την έκφραση των υποθετικών στόχων του miR-200b και miR-200c όπως Notch 1, Bmi1 και lin28B σε κύτταρα PDGF-D PC3 διαμολύνθηκαν με την οικογένεια miR-200 επειδή miR-200b και miR-200c έχουν τρεις ή μία υποθετική sites στην 3’UTR του Lin28B, Bmi1 mRNA (Εικ. S3) και Notch 1 mRNA δεσμευτική. Η διαμόλυνση miR-200b και miR-200c μειώνεται δραματικά την έκφραση του Notch 1 και lin28B, αλλά δεν είχε καμία επίδραση στην έκφραση του Bmi1 (Εικ. 4C). Η έκφραση του ZEB1 βρέθηκε να ρυθμίζεται προς τα κάτω από την αναγκαστική έκφραση του miR-200b και miR-200c (Εικ. 4C), η οποία ήταν σύμφωνη με την αντιστροφή του ΕΜΤ φαινότυπο (Σχήμα 4Α). Βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση του miR-200c είχε κατασταλεί σε ARCaP

Μ κυττάρων σε σύγκριση με ARCaP

E κύτταρα (Εικ. 4D). Επιπλέον, η εκ νέου έκφραση του miR-200c σε ARCaP

M κύτταρα με επιμόλυνση με προδρόμους προ-miR-200c μείωσε σημαντικά την ικανότητα prostasphere σχηματισμού σε σύγκριση με την επιμόλυνση με miRNA ελέγχου (Εικ. 4Ε). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Notch 1 και αντιστροφή του EMT φαινοτύπου όπως χαρακτηρίζεται από αυξημένη έκφραση Ε-καδερίνης και μειωμένη έκφραση ZEB1 καθώς και την αλλαγή κυτταρική μορφολογία σε ARCaP

Μ κύτταρα επιμολυσμένα με προ-miR-200c πρόδρομες ουσίες (Σχ. 4F και Σχ. 4G).

κύτταρα PDGF-D PC3 διαμολύνθηκαν με προ-miR-200. 3 ημέρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα χωρίστηκαν και επιμολύνθηκαν επανειλημμένα με προ-miR-200 κάθε 3-4 ημέρες για 14 ημέρες. Τα (Α) Φωτογραφίες των κυττάρων που εμφανίζονται: επιμόλυνση των κυττάρων PC3 PDGF-D με προ-miR-200 για 14 ημέρες, miR-200b και miR-200c αντιστραφεί κύτταρα EMT στην μορφολογία των κυττάρων ΚΟΑ. (Β) Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για παραγωγή prostaspheres μετά από 14-ημερών επιμόλυνση με προ-miR-200. MiR-200b και miR-200c μείωσε τον αριθμό των prostaspheres. (Γ) Western Blot δείχνει ότι Notch 1, Lin28B και εκφράσεις ZEB1 ήταν ρυθμισμένα προς τα κάτω σε κύτταρα PDGF-D PC3 διαμολύνθηκαν με miR-200b και miR-200c. (Δ) Το επίπεδο των miR-200c μειώθηκε σημαντικά σε ARCaP

Μ, χρησιμοποιώντας σε πραγματικό χρόνο RT-PCR. (Ε) Επιμόλυνση των προ-miR-200c μετά από 6 ημέρες μείωσε την ικανότητα prostasphere σχηματισμού σε ARCaP

κύτταρα Μ (Bar: 100 μm). (F) κηλίδα Western έδειξε ότι η εκ νέου έκφραση του miR-200c με επιμόλυνση των προ-miR-200c αύξησε την έκφραση Ε-καδερίνης και καταπιεσμένη έκφραση ZEB1 και Notch1 στη ARCaP

κύτταρα Μ, η οποία συνάδει με την αλλαγή από μεσεγχυματικά σε επιθηλιακά μορφολογία κυττάρων (G). *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο? **, P & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Con: έλεγχος, 200A: προ-miR-200a, 200b: προ-miR-200b, 200c: προ-miR-200c, E-CAD: E-cadherin)

Η

κάτω ρύθμιση. του Notch 1 από miR-200 ήταν εν μέρει υπεύθυνος για την αναστολή των colonogenic και prostasphere σχηματίζουν ικανότητα των κυττάρων του PDGF-D PC3

το miR-200b και miR-200c έχει ένα θέσεις πρόσδεσης στην 3’UTR του Notch1 (Εικ. 5Α). Για να καθοριστεί εάν Notch 1 είναι ο άμεσος στόχος του miR-200b και miR-200c, αναλύσαμε την δραστικότητα του 3 ‘UTR του Notch 1 σε PC3 Neo και κυττάρων PDGF-D PC3 διαμολύνθηκαν με 3’UTR του πλασμιδίου λουσιφεράσης Notch 1, καθώς και PC3 PDGF -D κύτταρα συν-επιμολυσμένα με 3’UTR του πλασμιδίου λουσιφεράσης Notch1 και miR-200b ή miR-200c. Βρήκαμε ότι η δραστικότητα του 3’UTR της Notch 1 λουσιφεράσης ήταν σημαντικά αυξημένη σε κύτταρα PDGF-D PC3 σε σύγκριση με τα κύτταρα PC3 Neo λόγω των χαμηλότερων επιπέδων miR-200b και miR-200c σε κύτταρα PC3 PDGF-D. Επιπλέον, η εκ νέου έκφραση του miR-200b ή miR-200c μείωσε δραματικά τη δραστηριότητα του 3’UTR της Notch 1 λουσιφεράσης σε κύτταρα PDGF-D PC3, ενώ εκ νέου έκφραση του miR-200α με μία βάση αλληλουχίας σπόρων διαφορετική από miR-200b και miR-200c είχε καμία επίδραση στη δραστηριότητα της 3’UTR του Notch1 λουσιφεράσης (Σχ. 5Β). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι η miR-200b και miR-200c ρυθμίζουν την έκφραση του Notch1 μέσω σύνδεσης με 3’UTR του Notch 1 mRNA. Για να καθοριστεί εάν Notch 1 διαδραμάτισε σημαντικό ρόλο στη διατήρηση των βλαστικών κυττάρων, υποβάλλαμε σε αγωγή τα κύτταρα PDGF-D PC3 με DAPT, έναν αναστολέα γ-σεκρετάσης που αναστέλλει την ενεργοποίηση του Notch. Πλήρους μήκους Notch 1 είναι συνήθως πολύ χαμηλή λόγω της διάσπασης του από πολλά ένζυμα σε αυτά τα κύτταρα? Ωστόσο, βρήκαμε ότι η έκφραση της πλήρους μήκους Notch 1 ήταν ελαφρώς πιο σε κύτταρα κατεργασμένα γ-σεκρετάσης. Βρήκαμε επίσης ότι DAPT μείωσε σημαντικά κλωνογόνο ικανότητα των κυττάρων PC3 PDGF-D (Σχ. 5C, άνω πίνακας), η οποία ήταν σύμφωνη με τα δεδομένα κηλίδα Western που δείχνει ότι DAPT θεραπεία ανέστειλε δραστική μορφή του Notch 1 (Εικ. 5C, κάτω πίνακας). Επιπλέον, η επιμόλυνση του Notch 1 siRNA κατασταλεί θεαματικά την ικανότητα prostasphere σχηματισμού των κυττάρων PC3 PDGF-D (Σχ. 5D και 5Ε), η οποία ήταν σύμφωνη με τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης της πρωτεΐνης Notch 1 (Εικ. 5F). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το miR-200 μεσολάβηση κάτω ρύθμιση του Notch1 ήταν εν μέρει υπεύθυνη για την ικανότητα αυτο-ανανέωσης και colonogenic ανάπτυξη της EMT-όπως τα κύτταρα που έχουν χαρακτηριστικά αρχέγονων κυττάρων.

(Α) Οι συντηρητικές, προέβλεψε θέσεις δέσμευσης για την ακολουθίες σπόρο του miR-200b και mir-200c στην 3’UTR του Notch 1 mRNA. (Β) MiR-200b και miR-200c ανέστειλε την δραστηριότητα λουσιφεράσης Notch1 3’ΙΙΤΡ. **, P & lt? 0,01 σε σύγκριση με το Νέο κύτταρα ελέγχου? #, P & lt? 0,01 σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου PDGF-D. (Γ) DAPT θεραπεία, ένας αναστολέας γ-σεκρετάσης, μείωσε την κλωνογόνο ικανότητα σε κύτταρα PC3 PDGF-D (άνω πάνελ) .western Blot δείχνει ότι DAPT αγωγή μείωσε δραστική μορφή του Notch 1 σε δοσο-εξαρτώμενο τρόπο (κάτω πίνακας). (Δ) και (Ε) δείχνει ότι η επιμόλυνση των Notch 1 siRNA μετά από 9 ημέρες κατασταλεί η ικανότητα prostasphere σχηματισμού σε κύτταρα PDGF-D PC3 (Bar: 100 μm), η οποία είναι συνεπής με προς τα κάτω ρύθμιση της έκφρασης Notch 1 (F). **, P & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Νέο: κύτταρα PC3 Νέο, PDGF-D: κύτταρα PC3 PDGF-D, Con: έλεγχος, 200A: προ-miR-200a, 200b: προ-miR-200b, 200c: προ-miR-200c)

lin28B ανέστειλε την παραγωγή της ας-7, που ρυθμίζουν αυτο-ανανέωση ελέγχοντας την έκφραση του Sox2, Nanog και Oct4

τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται παραπάνω έδειξε ότι το miR-200b και miR-200c ανέστειλε την έκφραση lin28B (Εικ. 4C), η οποία είναι γνωστό ότι συνδέονται με πρωτογενή ας-7 και προ-ας-7 RNA και αναστέλλει τη συσσώρευση του ώριμου ας-7 miRNA [19]. Τα αποτελέσματα από τα δεδομένα μας μικροσυστοιχιών miRNA έδειξε ότι όλα τα μέλη της ας-7 οικογένεια ήταν σημαντικά μειωμένες σε κύτταρα PC3 PDGF-D (Πίνακας S3). Αυτά τα αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με πραγματικού χρόνου RT-PCR δοκιμασίας (Σχ. 6Α). Νοκ-κάτω της Lin28B από siRNA αυξήθηκε σημαντικά ώριμη ας-7 εκφράσεις (Σχήμα 6Β.)? προτείνοντας lin28B ρυθμίζονται ώριμη ας-7 έκφραση σε κύτταρα PC3 PDGF-D. Είναι γνωστό ότι η οικογένεια ας-7 παίζει έναν κρίσιμο ρόλο στη ρύθμιση των αυτο-ανανέωσης σε εμβρυϊκά βλαστικά κύτταρα και τον καρκίνο του μαστού βλαστικά κύτταρα που μοιάζουν [18], [37]. Για να προσδιορίσετε αν ας-7 θα μπορούσε να ελέγξει αυτο-ανανέωση των κυττάρων PDGF-D PC3, πραγματοποιήσαμε την δοκιμασία σχηματισμού σφαίρας. Re-έκφραση των επιλεγμένων οικογένεια ας-7, όπως ας-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7d ή συνδυασμός ας-7α, αφήστε-7b και αφήστε-7η σημαντικά ανέστειλε την ικανότητα prostasphere σχηματισμού (Εικ. 6C και 6D) και μειώνεται ταυτόχρονα το μέγεθος του prostaspheres (Σχ. 6C, S4A και S4B). Από Lin28B αναστέλλει τη συσσώρευση του ώριμου ας-7 με σύνδεση προς προ-ας-7 RNA και με τον τρόπο αυτό εμποδίζουν την επεξεργασία των προ-ας-7 RNA, PC3 κύτταρα PDGF-D με υψηλό επίπεδο Lin28B συν-επιμολύνθηκαν με προ-γράμ- 7 και Lin28B siRNA. Βρήκαμε ότι οι αριθμοί prostasphere από κύτταρα συν-επιμολυσμένα με προ-ας-7 και Lin28B siRNA ήταν μικρότερη από εκείνη των επιμόλυνση με προ-ας-7 μόνο του (Σχήμα 6D).? Ωστόσο, εκτός από το let-7d, δεν υπήρχε διαφορά στο μέγεθος prostasphere μεταξύ των προ-ας-7 μόνο και συν-επιμόλυνση με προ-ας-7 και Lin28B siRNA (Σχ. 6C, S4A και S4B). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τα δεδομένα από την ανάλυση κηλίδος Western που δείχνει ότι η εκ νέου έκφραση ας-7 σημαντικά ανέστειλε την έκφραση Sox2 και Nanog στα κύτταρα PC3 PDGF-D με επιμόλυνση των προ-ας-7α, προ-ας-7b ή συν- επιμόλυνση του προ-ας-7α, προ-ας-7b ή προ-ας-7d με Lin28B siRNA. Επιμόλυνση του προ-ας-7η μόνο ήταν σε θέση να αναστέλλουν την έκφραση Lin28B και Oct4 αλλά είχε οριακές επιπτώσεις στην Sox2 και την έκφραση Nanog (Σχ. 6Ε).

(Α) Τα επίπεδα για let-7 οικογένεια στην PC3 κύτταρα Neo και PC3 PDGF-D προσδιορίστηκαν με χρήση πραγματικού χρόνου RT-PCR. (Β) πραγματικού χρόνου RT-PCR χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση της έκφρασης του ας-7 στα κύτταρα PDGF-D PC3 διαμολύνθηκαν με Lin28B siRNA για 3 ημέρες. (Γ) φωτομικρογραφίες που δείχνουν prostaspheres παράγεται από κύτταρα PC3 PDGF-D επιμολυσμένα με προ-ας-7 ή συνδυασμός των προ-ας-7 και Lin28B siRNA 14 ημέρες μετά την επιμόλυνση (bar: 100 μm). (D) Τα κύτταρα συλλέχθηκαν για prostasphere σχηματισμού δοκιμασία μετά από 14-ημερών διαμόλυνση. Ας-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7d και ο συνδυασμός του Let-7α, αφήστε-7b, αφήστε-7δ, καθώς και συν-επιμόλυνση με αφήσει-7 και Lin28B siRNA μείωσε τον αριθμό των prostaspheres. (Ε) Τα αποτελέσματα από κηλίδας Western έδειξε την έκφραση της Lin28B, Sox2, Nanog και Oct4 στα κύτταρα PDGF-D PC3 επιμολυσμένα με προ-ας-7 ή συν-επιμολυσμένα με προ-ας-7 και Lin28B siRNA μετά από 9 ημερών διαμόλυνση. *, P & lt? 0,05 σε σύγκριση με τον έλεγχο? **, P & lt? 0,01 σε σύγκριση με τον έλεγχο. (Con: έλεγχος, Α: προ-ας-7α, Abd: συνδυασμός προ-ας-7α, προ-ας-7α, προ-ας-7δ, Αλ: ο συνδυασμός των προ-ας-7α και Lin28B siRNA, Lin28B- si: Lin28B siRNA, Neo: κύτταρα PC3 Νέο, PDGF-D:. κύτταρα PC3 PDGF-D)

Η

Sox2, Nanog, Oct4 και Lin28B απαιτήθηκαν για την αυτο-ανανέωση των κυττάρων PDGF-D PC3

Έχουμε δείξει ότι ας-7 οικογένειας ρυθμίζεται αυτο-ανανέωση και ανέστειλε Sox2, Nanog, Oct4 και έκφραση Lin28B στα PC3 κύτταρα PDGF-D με EMT φαινότυπο. Προκειμένου να εκτιμηθεί η μηχανιστική σύνδεση αυτών των μορίων (Sox2, Nanog, Oct4 και Lin28B) με την ικανότητα αυτο-ανανέωσης των κυττάρων PC3 PDGF-D, μπορούμε γκρέμισε την έκφραση του Sox2, Nanog, Oct4 και Lin28B από siRNA επιμόλυνση χρησιμοποιώντας Sox2 , Nanog, Oct4 και Lin28B συγκεκριμένες siRNA. Βρήκαμε ότι knock-down του Sox2, Nanog, Oct4 και Lin28B σημαντικά καταπιεσμένη prostasphere-ικανότητα σχηματισμού (Εικ. 7Α). Επιπλέον, τα κύτταρα του PDGF-D PC3 επιμολυσμένα με Sox2, Nanog, Oct4 και Lin28B siRNA εμφάνισαν σημαντική αύξηση του αριθμού των prostaspheres σε μικρότερο μέγεθος (30-50 μm) σε σύγκριση με εκείνη επιμολυσμένα με siRNA ελέγχου ταυτόχρονα με μείωση του αριθμού των prostaspheres με & gt? 50 μm σε διάμετρο (Εικ. 7Β). Αυτά τα αποτελέσματα ήταν σύμφωνα με τα αποτελέσματα έκφρασης πρωτεΐνης όπως φαίνεται στο Σχ. 7C, γεγονός που υποδηλώνει ότι Sox2, Nanog, Oct4 και Lin28B απαιτούνται για την αυτο-ανανέωση των κυττάρων PC3 PDGF-D.

(Α) Ενιαία κυτταρικά εναιωρήματα των PC3 PDGF-D επιμολυσμένα με Sox2, Nanog, Oct4 και Lin28B siRNA και επωάστηκαν για 24 ώρες απλώθηκαν σε εξαιρετικά χαμηλής προσκολλημένα τα φρεάτια της πλάκας 6-φρεατίων σε 2000 κύτταρα /φρεάτιο. Μετά από 3 ημέρες, οι αριθμοί των prostaspheres μετρήθηκαν υπό μικροσκόπιο. (ΝΤΟ).