Αφηρημένο

Cdc37 είναι ένας μοριακός συνοδός 50 kDa η οποία στοχεύει εγγενώς ασταθές πρωτεϊνικών κινασών στη μοριακή συνοδό HSP90. Είναι επίσης ένα υπερ-εκφράζεται ογκοπρωτεϊνης που διαμεσολαβεί καρκινογένεση και τη διατήρηση του κακοήθους φαινοτύπου σταθεροποιώντας τους εκτεθειμένους δομές των μεταλλαγμένων ή /και υπερ-εκφράζεται ογκογόνο κινασών. Εδώ αναφέρουμε ότι Cdc37 δεν περιορίζεται ενδοκυτταρικά αλλά αντ ‘αυτού είναι επίσης παρούσα στην επιφάνεια των κυττάρων MDA-MB-453 και MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου μαστού ανθρώπου, όπου φαίνεται να συμμετέχει σε διαδικασίες κυτταρική κινητικότητα του καρκίνου. Επιπλέον, έχουμε καταδείξει χρησιμοποιώντας ένα αδιαπέραστο αντίσωμα κυττάρου αντι-Cdc37, ότι παρομοίως σε ενδοκυτταρικά ομόλογό της, αυτή η ομάδα επιφάνεια του Cdc37 αλληλεπιδρά ειδικά με HSP90, καθώς και τους υποδοχείς κινάσης HER2 και EGFR στην επιφάνεια του κυττάρου, πιθανώς δρα ως συν-παράγοντας στο εξωκυττάριο δραστηριότητες συνοδό HSP90 του. Τέλος, δείχνουμε ότι η λειτουργική αναστολή της επιφάνειας της HSP90 χρησιμοποιώντας mAb 4C5, ένα κύτταρο αδιαπέραστο μονοκλωνικό αντίσωμα εναντίον αυτής της πρωτεΐνης, οδηγεί όχι μόνο σε διαταραχή της Cdc37 /HSP90 συγκρότημα, αλλά και στην αναστολή των υποδοχέων συμπλοκών Cdc37 /ErbB. Αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν έναν ουσιαστικό ρόλο για τα επιφανειακά Cdc37 σε συνεννόηση με HSP90 στην επιφάνεια των κυττάρων κατά τις διεργασίες εισβολής καρκινικών κυττάρων και να ενισχύσει το θεραπευτικό δυναμικό του mAb 4C5 για τη θεραπεία του καρκίνου

Citation: Ελ. Hamidieh Α, Γραμματικάκης Ν , Patsavoudi Ε (2012) Cell Surface Cdc37 Συμμετέχει στο εξωκυττάριο HSP90 Mediated Cancer Cell εισβολή. PLoS ONE 7 (8): e42722. doi: 10.1371 /journal.pone.0042722

Επιμέλεια: Wanjin Χονγκ, Ινστιτούτο Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Σιγκαπούρη

Ελήφθη: 29 Μαρτίου, 2012? Αποδεκτές: 10, Ιουλίου του 2012? Δημοσιεύθηκε: 17 Αυγούστου του 2012

Copyright: © El Hamidieh et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. AEH λάβει μια υποτροφία από το Ελληνικό Ινστιτούτο Παστέρ. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

HSP90 είναι ένας μοριακός συνοδός που λειτουργεί σε συνδυασμό με μία ομάδα από συν-συνοδοί να καθοδηγήσει τη σταθεροποίηση και την ενεργοποίηση του μια σειρά από πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων ογκογονικές κινάσες, παράγοντες μεταγραφής και υποδοχείς ορμονών [1], [2 σηματοδότηση ]. Cdc37 (διαίρεση των κυττάρων πρωτεΐνη του κύκλου 37) θεωρείται ως ένα βασικό συστατικό αυτής της πολυμερικής μηχανημάτων συνοδός, παίζοντας ένα εξειδικευμένο και απαραίτητο ρόλο στην ωρίμανση ή /και σταθεροποίηση ενός μεγάλου υποσύνολο των πρωτεϊνικών κινασών, που εμπλέκονται στη μεταγωγή σήματος, πολλαπλασιασμό και την επιβίωση [ ,,,0],3]. Αποκλείοντας το κλείσιμο του Ν-τερματική θέση της HSP90 ΑΤΡ-δέσμευσης, Cdc37 αναστέλλει την δραστικότητα ΑΤΡάσης της HSP90 [4] και βοηθά φόρτωση των πρωτεϊνών πελάτη κινάσης επί της μηχανής συνοδού [4], [5]. Ιn Ειδικότερα, Cdc37 λειτουργεί ως έναν προσαρμογέα ή ικρίωμα, διευκόλυνση της αλληλεπίδρασης κινάσης πελάτη με HSP90 [6] και στη συνέχεια με την πρόσληψη αυτών πελάτη κινάσες στο σύνθετο HSP90, σταθεροποιεί ή /και να τα διατηρεί σε ένα πτυσσόμενο-αρμόδιες διάπλασης [7]. Επιπλέον, Cdc37 προάγει τη δημιουργία συμπλεγμάτων κινάσης HSP90-πρωτεΐνης [8] και την έκφραση ενός κυρίαρχο-αρνητικό μορφή η οποία στερείται τομέως HSP90 δέσμευσης αναστέλλει την ενεργοποίηση κινάσης σε κύτταρα θηλαστικών [9]. Πολλές πρωτεΐνες πελάτες αλληλεπιδρούν άμεσα τόσο με Cdc37 και HSP90 και αναδίπλωση, την ωρίμανση και τη σταθερότητα τους εξαρτάται από τη δραστικότητα των δύο συνοδών. Ως εκ τούτου, Cdc37 μεσολαβεί ο σχηματισμός HSP90-Raf1 [9] και σύμπλοκα HSP90-Cdk4 [10] και αυτές τις αλληλεπιδράσεις είναι απαραίτητες για τη σταθερότητα της πρωτεΐνης και τη λειτουργία της κινάσης. Η πολύπλοκη σχέση μεταξύ Cdc37 και HSP90 απεικονίζεται από το εύρημα ότι η αλληλεπίδραση τους σταθεροποιείται με την πρωτεΐνη πελάτης [11]. Κατά τα τελευταία χρόνια έχει υπάρξει αυξανόμενα στοιχεία που αποδεικνύουν ότι η ενδοκυτταρική HSP90 διαδραματίζει κεντρικό ρόλο στην απόκτηση και τη διατήρηση του κακοήθους φαινοτύπου [12], [13], [14], [15]. Κατά συνέπεια, υπάρχει αυξανόμενο ενδιαφέρον για Cdc37 στο πλαίσιο της κακοήθειας [16], [17] από το Cdc37 ρυθμίζει επίσης πολλαπλές ογκογόνο πελάτες κινάσης. Πράγματι τα επίπεδα Cdc37 βρέθηκαν αυξημένα σε πολλές κλινικές καρκίνους [17]. Ειδικότερα, Cdc37, αυξάνεται σε πολλαπλασιαζόμενους ιστούς, και είναι σε μεγάλο βαθμό εκφράζεται σε ορισμένους καρκίνους συμπεριλαμβανομένων αναπλαστικό λέμφωμα μεγάλων κυττάρων [18] οξεία μυελοκυτταρική λευχαιμία [19], ηπατοκυτταρικό καρκίνωμα [20] και του πολλαπλού μυελώματος [21]. Επιπλέον, τα δεδομένα που παρουσιάζονται δείχνουν ότι Cdc37 μπορεί να λειτουργήσει ως ένα ογκογονίδιο, όπως ποντίκια γενετική μηχανική για να υπερεκφράζουν Cdc37 αναπτύξουν όγκους σε υψηλή συχνότητα [22], υποδηλώνοντας ότι η δημιουργία των οδών κινάσης πρωτεΐνης διαμεσολαβείται από HSP90 /Cdc37 μπορεί να είναι ένας συντελεστής περιοριστική, εκδήλωση στο μετασχηματισμό των επιθηλιακών κυττάρων [22]. Πιο πρόσφατα έχει δειχθεί ότι Cdc37 είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της ανάπτυξης των καρκινικών κυττάρων του προστάτη [23]. Επιπλέον, το άλφα υποδοχέα αυξητικού παράγοντα που προέρχεται από αιμοπετάλια η οποία ρυθμίζεται πάνω και ενεργοποιείται σε διάφορες κακοήθειες σχηματίζει ένα σύμπλοκο με HSP90 και τη συν-συνοδού Cdc37 σε ωοθηκών, γλοιοβλάστωμα, καρκίνο του πνεύμονα και κυττάρων [24]. Μαζί, αυτά τα αποτελέσματα υποστηρίζουν την στόχευση του Cdc37 για τη θεραπεία του καρκίνου.

Εμείς και άλλοι έχουν προηγουμένως ταυτοποιηθεί ένα εξωκυτταρικό πισίνα του HSP90, τόσο σε φυσιολογικά και καρκινικά κύτταρα τα οποία αποδείχθηκε ότι εμπλέκεται σε διαδικασίες μετανάστευση και εισβολή, αντίστοιχα [ ,,,0],25], [26], [27], [28], [29], [30]. Επιπλέον, και με την αξιοποίηση του ιδιότητες αποκλεισμού ενός μονοκλωνικού αντισώματος κύτταρο αδιαπέραστο ονομάστηκε mAb 4C5, που στοχεύουν ειδικά έναντι της HSP90 λειτουργία έχουμε δείξει ότι εξωκυττάρια HSP90 αλληλεπιδρά με HER-2 στην επιφάνεια του κυττάρου [28], καθώς και μεταλλοπρωτεϊνάσες ΜΜΡ-2 και ΜΜΡ-9 [29]. Παρά το γεγονός ότι ένας αυξανόμενος αριθμός των συν-συνοδοί HSP90, όπως HSP70, Hop και p23 βρέθηκαν επίσης στην επιφάνεια των κυττάρων [31], [32], [33], τη δράση τους και υποκείμενοι μηχανισμοί δεν έχουν διευκρινιστεί ακόμα. Λαμβάνοντας υπόψη τα παραπάνω, στην παρούσα εργασία θα διερευνήσει την επιφάνεια του κυττάρου εντοπισμό των Cdc37 και εξετάζουμε πιθανή συμμετοχή του σε διαδικασίες εισβολή των καρκινικών κυττάρων, καθώς και τους δυνητικούς εταίρους που αλληλεπιδρούν κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, με τη χρήση του MDA-MB-453 και MDA- καρκινικές κυτταρικές γραμμές ανθρώπινου μαστού ΜΒ-231 και ένα εμπορικά διαθέσιμο πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι Cdc37. Επιπλέον, και λαμβάνοντας υπόψη την έχουν αναφερθεί στο παρελθόν στοιχεία που δείχνουν ότι το mAb 4C5 αναστέλλει τον καρκίνο κυτταρική εισβολή διασπώντας ένωση της εξωκυττάριας HSP90 με HER2 [28] και μεταλλοπρωτεϊνάσες ΜΜΡ2 και ΜΜΡ9 [29] σε αυτό το έργο θα διερευνηθεί η πιθανή επίδραση αυτού του κυττάρου αδιαπέραστο αντι-HSP90 αντίσωμα σχετικά με τις αλληλεπιδράσεις των επιφανειακών Cdc37 με HSP90 και τους υποδοχείς ErbB.

Υλικά και Μέθοδοι

αντισώματα και αντιδραστήρια

MAb 4C5 παρήχθη στο εργαστήριο μας, όπως περιγράφηκε προηγουμένως [ ,,,0],34]. Στην παρούσα μελέτη, το mAb 4C5 χρησιμοποιήθηκε ως συμπυκνωμένο υπερκείμενο ελεύθερο ορού σε όλα τα πειράματα που εκτελέστηκαν. Πολυκλωνικά αντισώματα έναντι EGFR, HER-2 και μονοκλωνικό αντίσωμα έναντι Κυκλίνη D1 λήφθηκαν από Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Δύο αντι-Cdc37 αντισώματα, από την Santa Cruz Biotechnology και Abcam αναγνωρίζουν διαφορετικά επιτόπια χρησιμοποιήθηκαν. Πολυκλωνικά αντισώματα έναντι της HSP90 ήταν από την Chemicon International. DMEM, RPMI και εμβρυϊκό βόειο ορό (FBS), ήταν από την Invitrogen. Όλα τα άλλα υλικά ήταν από πηγές που περιγράφηκαν προηγουμένως [25].

Κυτταροκαλλιέργειες και ανοσοφθορισμού

HER-2-υπερεκφράζουν MDA-MB-453, EGFR-υπερεκφράζουν MDA-MB- 231 καρκίνου του μαστού κυτταρικές γραμμές και μη καρκινικά κύτταρα του μαστού επιθηλιακών MCF-12Α αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection. MDA-MB-453 και MDA-MB-231 κύτταρα διατηρήθηκαν σε RPMI και DMEM, αντίστοιχα, συμπληρωμένο με 10% FBS. Τα κύτταρα MCF-12Α διατηρήθηκαν σε DMEM-F12 ΗΑΜ συμπληρωμένο με 20 ng /ml ανθρώπινο EGF, 100 ng /ml υδροκορτιζόνη, 0,01 mg /ml βόεια ινσουλίνη και 10% FBS.

Για μελέτες ανοσοφθορισμού, τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε πολυ L λυσίνης-επικαλυμμένες–καλυπτρίδες, σε πυκνότητα 5 χ 10

4 κύτταρα /φρεάτιο σε 48 φρεατίων και καλλιεργήθηκαν στο κατάλληλο μέσο συμπληρωμένο με 10% FBS. Μετά από 24 ώρες, τα κύτταρα μετατοπίστηκαν σε μέσο άνευ ορού για 18 ώρες. Ζωντανά MDA-MB-453, MDA-MB-231 και MCF-12Α κύτταρα σημάνθηκαν με έμμεσο ανοσοφθορισμό όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [28]. Εν συντομία, μη μονιμοποιημένα κύτταρα επωάστηκαν με 2 μg /ml αντισώματος αντι-Cdc37 για 2 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν σε παγωμένης ακετόνης και επισημάνθηκαν με Alexa488-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα.

Παρασκευή κυτταρολύματα, ανάλυση Western blot και συνανοσοκαθίζησης

Τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε 25 cm

2 φιάλες σε μέσο καλλιέργειας συμπληρωμένο με 10% FBS μέχρι υπο-συρροής, μετατοπίζεται σε μέσο ελεύθερο ορού για 24 ώρες και μετά εκτέθηκαν σε αντι-Cdc37 ή /και mAb 4C5 επί 16 ώρες. Καλλιέργειες ελέγχου αναπτύχθηκαν είτε σε μέσον καλλιέργειας μόνο του ή σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει 200 ​​μg /ml ενός μονοκλωνικού αντισώματος IgG2a εναντίον του άσχετη πρωτεΐνη ΒΜ88 [35]. Η περίσσεια μη-δεσμευμένου αντισώματος στη συνέχεια απομακρύνθηκε με πλύση με φρέσκο ​​μέσο. Οι καλλιέργειες αμέσως πλύθηκαν δύο φορές με παγωμένο PBS και λύθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28].

Κινητή κλασματοποίηση διεξήχθη σε κυτταρικές καλλιέργειες παρασκευάστηκαν και κατεργάστηκαν όπως περιγράφεται ανωτέρω, χρησιμοποιώντας το κιτ εκχύλισης πρωτεΐνης Διαμερισματοποιημένα (Chemicon), σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

ολικό ή /και διαμερισματική λύματα πρωτεΐνη ποσοτικοποιήθηκαν, και ίσες ποσότητες ολικής πρωτεΐνης υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE που ακολουθείται από κηλίδα Western με τα κατάλληλα αντισώματα. Ανοσοαντιδραστικές ζώνες ανιχνεύθηκαν χρησιμοποιώντας ένα αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας ECL (Amersham Biosciences) και φιλμ Χ-Omat AR (Eastman Kodak Co.) όπως περιγράφεται από τους κατασκευαστές.

συνανοσοκαθίζησης διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [25]. Εν συντομία, ίσες ποσότητες των προ-εκκαθαρίζονται κυτταρολύματα επωάστηκαν με τα κατάλληλα αντισώματα για 18 ώρες στους 4 ° C. Τα ανοσοσύμπλοκα στη συνέχεια επωάστηκαν για 2 ώρες σε θερμοκρασία δωματίου με πρωτεΐνη G-Sepharose και πλύθηκε τρεις φορές με ρυθμιστικό διάλυμα λύσης. Οι δεσμευμένες πρωτεΐνες αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα ακολουθούμενη από στύπωμα Western όπως περιγράφεται παραπάνω. Για όλα τα πειράματα ανοσοκαθίζησης, αρνητικοί έλεγχοι διεξήχθησαν χρησιμοποιώντας άσχετο IgGs.

Antibody Εσωτερικοποίηση Δοκιμασία

Antibody πειράματα εσωτερίκευσης πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφηκε προηγουμένως [28]. Εν συντομία, τα κύτταρα επωάστηκαν ενώ σε καλλιέργεια με 200 μg /ml αντισώματος αντι-Cdc37 για 16 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν και σταθεροποιήθηκαν σε ψυχρή ακετόνη για 3 λεπτά. Για την ανίχνευση πιθανών εσωτερικοποίηση του αντισώματος, τα κύτταρα διαπερατά με 0,1% Triton Χ-100 σε PBS και στη συνέχεια επωάστηκαν με Alexa488-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα (Molecular Probes). Για όλα τα πειράματα, οι έλεγχοι πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση mAb 4C5 το οποίο είναι κύτταρο αδιαπέραστη και η εμπορική αντι-HSP90 που εσωτερικοποιείται [27].

παρεμβολή RNA

Το πλασμίδιο pLL3.7 με ένθεση στόχευσης Cdc37 χρησιμοποιήθηκε. Cdc37 χτυπήθηκε κάτω, χρησιμοποιώντας μικρές RNAs φουρκέτα. Για το σκοπό αυτό η «WI siRNA Πρόγραμμα Επιλογής» από Whitehead Institute for Biomedical Research χρησιμοποιήθηκε, για να σχεδιάσει και να επιλέξετε το siRNA Cdc37 στόχευση. Προκειμένου να δημιουργηθεί μια δομή στελέχους-βρόχου, ένας διαχωριστής (TTCAAGAGA) εισήχθη στις αλληλουχίες με νόημα και αντινόημα. ολιγομερή DNA ανοπτήθηκαν και κλωνοποιήθηκε στο πλασμίδιο pLL3.7. Η ένθεση επιβεβαιώθηκε με αλληλούχιση. MDA-ΜΒ 453 και MDA-ΜΒ κύτταρα 231 αναπτύσσονται σε πυκνότητα 70% και στη συνέχεια επιμολύνθηκαν με 3 μg DNA πλασμιδίου με τις εισαγμένες αλληλουχίες ή όχι (έλεγχος), χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο Xfect Επιμόλυνση από την Clontech, σύμφωνα με το πρωτόκολλο των κατασκευαστών. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν, λύθηκαν και υποβλήθηκαν σε ανάλυση κηλίδος Western. Για την ανίχνευση ανοσοφθορισμού της Cdc37, τα κύτταρα απλώθηκαν σε πολυ-L-λυσίνη καλυπτρίδες και επιμολύνθηκαν με πλασμίδιο DNA ως ανωτέρω. 72 ώρες μετά την επιμόλυνση, τα ζωντανά κύτταρα πλύθηκαν με PBS, επωάστηκαν με αντι-Cdc37 αντισώματος για 2 ώρες, μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη ακετόνη και επισημάνθηκαν με Alexa647-δευτερεύον αντίσωμα.

Επούλωση Κινητικότητα Δοκιμασία

Η δοκιμασία διεξήχθη όπως περιγράφεται προηγουμένως [28]. Εν συντομία, MDA-MB-453 και MDA-MB-231 κύτταρα τοποθετήθηκαν σε ένα 48-φρεατίων σε πυκνότητα 1,5 × 10

5 κύτταρα /φρεάτιο και 5 × 10

4 κύτταρα /φρεάτιο, αντιστοίχως, και αφέθηκαν για 24 ώρες σε μέσο που περιέχει ορό, χωρίς περαιτέρω επεξεργασία. Το μέσο στη συνέχεια άλλαξε σε ελεύθερο ορού, και 16 ώρες αργότερα, ένα ελεύθερο κυττάρων περιοχής δημιουργήθηκε με ήπια ξύσιμο μονοστοιβάδα των κυττάρων με ένα στείρο κίτρινο άκρο Gilson-σιφωνίου, έτσι με αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός 1-mm σε επίπεδο κύτταρο -δωρεάν περιοχή. Αμέσως μετά το ξύσιμο, το μέσο αντικαταστάθηκε με φρέσκο ​​μέσο, ​​ή μέσο που περιέχει το αντίσωμα αντι-Cdc37. Καλλιέργειες ελέγχου αναπτύχθηκαν είτε σε μέσον καλλιέργειας μόνο του ή σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει 200 ​​μg /ml ενός μονοκλωνικού αντισώματος IgG2a εναντίον του άσχετη πρωτεΐνη ΒΜ88 [35].

Η μετανάστευση των κυττάρων καρκίνου του μαστού εντός του κενού παρακολουθήθηκε μικροσκοπικά σε δεδομένα χρονικά διαστήματα, χρησιμοποιώντας ένα Leica DM IL ανεστραμμένο μικροσκόπιο εφοδιασμένο με μια βιντεοκάμερα LEICA DM300 συνδέεται με έναν υπολογιστή. Η αναστολή της μετανάστευσης εκτιμήθηκε από την απόκτηση και την ανάλυση των ψηφιακών εικόνων, χρησιμοποιώντας το Image Pro Plus λογισμικό ανάλυσης [36] και αξιολογήθηκαν με δύο διαφορετικούς τρόπους, ανάλογα με την κυτταρική σειρά που μελετήθηκαν. Ειδικότερα για τα κύτταρα MDA-ΜΒ-453 που εκφράζεται ως ποσοστό της απόστασης που καλύπτεται από τα κύτταρα στις καλλιέργειες ελέγχου, ενώ για τα κύτταρα MDA-MB-231 εκφράστηκε ως το ποσοστό των κυττάρων που παρατηρούνται μέσα στο διάκενο του τραύματος σε καλλιέργειες ελέγχου η στατιστική ανάλυση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του

t

δοκιμή Student.

Αποτελέσματα

Cdc37 εκφράζεται στην κυτταρική επιφάνεια των κυττάρων MDA-MB-453 και MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού

για να εξεταστεί η κυτταρική επιφάνεια εντοπισμό του Cdc37, αόριστης MDA-MB-453 και MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου ανθρώπινου μαστού επωάστηκαν με το αντίσωμα αντι-Cdc37. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλύθηκαν, σταθεροποιήθηκαν και σημάνθηκαν με Alexa488-συζευγμένο δευτερογενές αντίσωμα. Έτσι το πρωτογενές αντίσωμα είχε πρόσβαση μόνο στην εξωτερική επιφάνεια του κυττάρου. Η παρατηρούμενη ανοσοχρώση επιβεβαίωσε την κυτταρική επιφάνεια εντοπισμό του Cdc37 σε αμφότερες τις ανθρώπινες κυτταρικές γραμμές καρκίνου μαστού που μελετήθηκαν (Εικ. 1). Ως θετικός έλεγχος, mAb 4C5 που δεσμεύεται ειδικά σε επιφανειακά HSP90 των οποίων η παρουσία έχει προηγουμένως δειχθεί στις δύο κυτταρικές σειρές [28] [26] χρησιμοποιήθηκε. Σε αυτό το σημείο είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι τα πειράματα ανοσοφθορισμού έδειξαν, όπως ήταν αναμενόμενο, η απουσία όχι μόνο Cdc37, αλλά και του HSP90 στην επιφάνεια των ενήλικων μη καρκινικών κυττάρων MCF-12Α (Εικ. S1). εφαρμόστηκαν Πρόσθετες θετικοί μάρτυρες, χρησιμοποιώντας αντισώματα έναντι HER-2 και EGFR για τα κύτταρα MDA-MB-453 και MDA-MB-231, αντίστοιχα. Τέλος αντισώματα εναντίον EGFR και HER2 χρησιμοποιήθηκαν ως αρνητικοί έλεγχοι σε MDA-MB-453 και MDA-MB-231 κύτταρα, αντίστοιχα (Εικ. 1Α και Β). Τα παραπάνω αποτελέσματα επιβεβαιώθηκαν με κηλίδα Western χρησιμοποιώντας μεμβράνη κλάσματα που προέρχονται από τις δύο κυτταρικές σειρές (Σχ. 1 C και D). (1D Σχ.) Αντισωμάτων ως θετικός μάρτυρας αντι-ΗΕΚ2 (Εικ. 1 C) και αντι-EGFR χρησιμοποιήθηκαν, σε MDA-MB-453 και τα προϊόντα λύσης της κυτταρικής μεμβράνης MDA-MB-231, αντίστοιχα. Στα κυτοσολικά κλάσματα και όπως αναμένεται αντι-Cdc37 έδωσαν θετικά ανοσοχρώση ενώ τα αντισώματα έναντι των υποδοχέων ErbB ήταν αρνητικές. Επιπλέον, οι κυτοσολικά κλάσματα δύο κυτταρικές σειρές έδωσαν θετικά ανοσοχρώση όταν immunobloted με αντίσωμα εναντίον της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης Κυκλίνη D1, ενώ τα κλάσματα μεμβράνης ήταν αρνητικές (Εικ. 1 C και D), επιβεβαιώνοντας έτσι την καθαρότητα των κλασμάτων που χρησιμοποιείται εδώ και στο immunoprecipitaion πειράματα που περιγράφονται παρακάτω.

Α, Έμμεση ανοσοφθορισμού ζωντανών κυττάρων MDA-ΜΒ 453 χρησιμοποιώντας αντι-Cdc37 αντίσωμα. Η ανοσοσήμανση αποκαλύπτει την επιφάνεια εντοπισμό των Cdc37. Αντι-HER2 και mAb 4C5 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι. Αντίσωμα -EGFR χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. Β, Έμμεσος ανοσοφθορισμός των ζώντων κυττάρων MDA-ΜΒ 231 χρησιμοποιώντας αντι-Cdc37 αντίσωμα. Αντι-ΕΟΡΚ mAb 4C5 και χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί έλεγχοι. Αντι -HER2 αντισώματα χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός μάρτυρας. C, Cell κλασματοποίηση των κυττάρων MDA-ΜΒ 453 κυττάρων που ακολουθείται από ανάλυση κηλίδος Western επιβεβαίωσε την παρουσία Cdc37 σε κλάσματα κυτταρικής μεμβράνης. Αντι-HER2 αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες στη μεμβράνη και κυτοσολικά κλάσματα αντίστοιχα. D, Cell κλασματοποίηση των κυττάρων MDA-ΜΒ 231 κυττάρων που ακολουθείται από ανάλυση στυπώματος western επιβεβαίωσε την παρουσία του Cdc37 σε κλάσματα κυτταρικής μεμβράνης. Αντι-ΕΟΡΚ αντισώματα χρησιμοποιήθηκαν ως θετικοί και αρνητικοί μάρτυρες στη μεμβράνη και κυτοσολικά κλάσματα αντίστοιχα. Στην Γ και Δ αντίσωμα εναντίον της ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης Κυκλίνη D1 έδωσαν θετικές και αρνητικές ανοσοχρώση στα κυτοσολικά και μεμβράνη κλάσματα αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, αντίστοιχα. CF, κυτοσολικό κλάσμα? MF, κλάσμα μεμβράνης. μπαρ κλίμακας = 20 μm.

Η

Για να επιβεβαιωθεί η ειδικότητα της εμπορικής αντίσωμα αντι-Cdc37 που χρησιμοποιούνται στις μελέτες μας, εφαρμόστηκε η τεχνολογία siRNA. Πιο συγκεκριμένα, όταν MDA-MB-453 και MDA-MB-231cells επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύει Cdc37 ανοσοχρωματίστηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω με το αντίσωμα αντι-Cdc37, ένας εξαιρετικά αδύναμος επισήμανση παρατηρήθηκε όταν συγκρίθηκαν με κύτταρα επιμολυσμένα με τον φορέα ελέγχου (Σχ. 2 Α και Β). Παρομοίως, όταν η ανάλυση κηλίδος Western χρησιμοποιώντας το αντίσωμα αντι-Cdc37 εκτελέστηκε σε συνολικό προϊόντα λύσης κυττάρων που προέρχονται από τις ανωτέρω κύτταρα, μία σημαντικά μειωμένη ανοσοχρώση λήφθηκε στα προϊόντα λύσης των επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύουν ενάντια Cdc37 σε σύγκριση με contols (Σχ. 2C και D ).

Α, Β, ανοσοφθορισμό ζωντανών ΜϋΑ-ΜΒ 453 και MDA-ΜΒ 231 κύτταρα, αντιστοίχως, με τη χρήση αντι-Cdc37 αντίσωμα. Τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με siRNA που στοχεύει Cdc37 (shRNA Cdc37) ή με πλασμιδιακό DNA, χωρίς καμία παρεμβολή (έλεγχος). ShRNA Cdc37 επιμολυσμένα κύτταρα εμφανίζουν εξαιρετικά χαμηλά επίπεδα χρώσης ανοσοφθορισμού επιφάνεια σε σύγκριση με τους ελέγχους. μπαρ κλίμακας = 20 μm. C, D, ανάλυση στυπώματος Western των συνολικών προϊόντων λύσης κυττάρου που λαμβάνονται από MDA-ΜΒ 453 και MDA-ΜΒ 231 κύτταρα, αντιστοίχως, με τη χρήση του αντισώματος αντι-Cdc37, σε κύτταρα επιμολυσμένα με siRNA που στοχεύει Cdc37 και κύτταρα ελέγχου. Το επίπεδο της Cdc37 ανιχνεύεται είναι σημαντικά χαμηλότερη σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές επιμολύνθηκαν με siRNA που στοχεύει Cdc37, σε σύγκριση με επιμολύνσεις ελέγχου.

Η

Το αντι-Cdc37 αντίσωμα είναι κύτταρο αδιαπέραστο

Το κύτταρο αδιαπέραστη φύση του αντι-Cdc37 χρησιμοποιείται εξετάστηκε με επώαση των κυττάρων MDA-MB-453 και MDA-MB-231, ενώ σε καλλιέργεια με το αντίσωμα για 16 ώρες. Τα κύτταρα στη συνέχεια πλένονται προσεκτικά, και δέσμευση του αντισώματος αναλύθηκε μετά από στερέωση και διαπερατοποίηση των κυττάρων, χρησιμοποιώντας ένα Alexa488-συζευγμένο δευτερεύον αντίσωμα. Παρατηρήσαμε ότι και για τις δύο κυτταρικές σειρές δεν εσωτερικοποιείται το αντίσωμα αντι-Cdc37 και παρέμεινε δεσμευμένο στην κυτταρική επιφάνεια (Σχ. 3). MAb 4C5 και το πολυκλωνικό αντι-HSP90 που έχουν προηγουμένως δειχθεί να παραμένουν στην επιφάνεια και να εσωτερικευθεί αντίστοιχα [27], χρησιμοποιήθηκαν ως μάρτυρες (Εικ. 3). Θα πρέπει να σημειωθεί ότι όταν τα προαναφερθέντα κύτταρα επωάστηκαν με μέσο καλλιέργειας μόνο σαν αρνητικός έλεγχος, δεν ανοσοχρώση ελήφθη (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Anti-Cdc37 εσωτερικοποίηση αντισώματος ελέγχθηκε σε δύο MDA-ΜΒ 453 και ΜΟΑ-ΜΒ 231 κυττάρων. Ζωντανά κύτταρα από τις δύο κυτταρικές γραμμές αναπτύχθηκαν πάνω σε καλυπτρίδες και επωάστηκαν στους 37 ° C για 16 ώρες με αντι-Cdc37. MAb 4C5 και αντι-HSP90 χρησιμοποιήθηκαν ως θετικός και αρνητικός έλεγχος αντίστοιχα. Για την ανίχνευση της εσωτερίκευσης αντισωμάτων, τα κύτταρα σταθεροποιήθηκαν και κατέστησαν διαπερατά, όπως περιγράφεται στα υλικά και μεθόδους και αντισώματα ανιχνεύθηκαν με συνεστιακή μικροσκοπία χρησιμοποιώντας ένα δευτερογενές αντίσωμα Alexa 488. Αριθ εσωτερικοποίηση του αντισώματος αντι-Cdc37 παρατηρήθηκε ακόμη και στις δύο κυτταρικές σειρές. μπαρ κλίμακας = 20 μm.

Η

Surface Cdc37 εμπλέκεται στην κινητικότητα των κυττάρων του καρκίνου του μαστού

Αφού διαπιστώθηκε ότι το αντίσωμα αντι-Cdc37 δεν εσωτερικεύεται, αλλά αντ ‘αυτού παραμένει ειδικά συνδεδεμένη με το κύτταρο- επιφάνεια όταν επωάζεται με ζώντα MDA-MB-453 και MDA-MB-231 κύτταρα, εξετάσαμε έπειτα την πιθανή εμπλοκή της επιφάνειας Cdc37 στην κινητικότητα των καρκινικών κυττάρων του μαστού, με τη χρήση της πληγής δοκιμασία επούλωσης. Καλλιέργειες ελέγχου αναπτύχθηκαν είτε σε μέσον καλλιέργειας μόνο του ή σε μέσο καλλιέργειας που περιέχει 200 ​​μg /ml ενός αντισώματος εναντίον της πρωτεΐνης ΒΜ88 άσχετη [35]. Είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι δεν παρατηρήθηκε καμία στατιστικά σημαντική διαφορά μεταξύ των δύο τύπων ελέγχου που χρησιμοποιούνται. Η τιμή ελέγχου που απεικονίζεται είναι η μέση τιμή των δύο τύπων ελέγχου. Όπως φαίνεται στο Σχ. 4Α, και το Σχ. παρουσία 5Α του αντισώματος αντι-Cdc37 στο μέσο καλλιέργειας τόσο του MDA-MB-453 και MDA-MB-231 κυττάρων, είχε ως αποτέλεσμα μια σημαντικά πιο αργό ρυθμό κλεισίματος τραύματος, όταν συγκρίθηκε με τους ελέγχους καλλιέργειες που αναπτύσσονται σε μέσο καλλιέργειας μόνο. Πιο συγκεκριμένα, ένα 57,7% και 35,8% αναστολή του καρκίνου κυτταρικής κινητικότητας ελήφθη όταν 200 μg /ml του αντι-Cdc37 συμπεριλήφθηκε στο μέσο καλλιέργειας των MDA-MB-453 και MDA ΜΒ-231 κύτταρα, αντίστοιχα (Σχ. 4C και 5C). μπλε χρώση Trypan διεξάγεται στο τελικό σημείο της δοκιμασίας επούλωσης πληγών, έδειξε ότι το ποσοστό θάνατο των κυττάρων που έλαβαν θεραπεία με το αντίσωμα ήταν παρόμοια με εκείνη που παρατηρήθηκε στις καλλιέργειες ελέγχου και για τις δύο κυτταρικές σειρές (Σχ. 4Β και 5Β). Αυτό το αποτέλεσμα υποστηρίζει περαιτέρω ότι η μειωμένη κυτταρική κινητικότητα που παρατηρείται στην παρουσία του αντισώματος αντι-Cdc37 οποίο δεν εσωτερικοποιείται δεν προκαλείται από τον κυτταρικό θάνατο, αλλά αντ ‘αυτού με την αναστολή της πισίνας επιφάνεια του Cdc37. Σε αυτό το σημείο είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι σε αυτή τη δοκιμασία, η επίδραση του αντισώματος αντι-Cdc37 κατευθύνεται προς κύτταρο εισβολή και όχι προς τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, δεδομένου ότι πολύ χαμηλά (& lt? 7%) ενσωμάτωσης BrdU παρατηρήθηκε τόσο σε ανθρώπινο καρκίνο του μαστού καλλιέργειες κυττάρων κατεργάζεται όπως παραπάνω, χωρίς εμφανείς διαφορές μεταξύ των διαφορετικών πειραματικών συνθηκών (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται).

Α, Wound δοκιμασία επούλωσης. Εικόνες που λαμβάνονται σε 0 ώρες και 24 ώρες μετά το σχηματισμό μηδέν. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν σε συνθήκες ελέγχου ή υπό την παρουσία 200 μg /ml του αντι-Cdc37 αντίσωμα. Β, Στο τέλος των κυττάρων χρονικό σημείο βάφτηκαν με Trypan Blue. Καμία σημαντική κυτταρικός θάνατος παρατηρείται και στις δύο περιπτώσεις. C, ποσοτικού επίδραση της Cdc37 στην κυτταρική μετανάστευση. Η προσθήκη 200 μg /ml του αντι-Cdc37 αντίσωμα στο μέσο καλλιέργειας κυττάρων οδήγησε σε αναστολή 57,7% του κλεισίματος τραύματος σε σύγκριση με τον έλεγχο που θεωρήθηκε ως 100% κλείσιμο της πληγής (Ρ & lt? 0.005). Στήλη είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SE. Μέσα σε ένα μόνο πείραμα κάθε κατάσταση εξετάστηκε εις τριπλούν. Ράβδοι κλίμακας Α = 165 μm, Β = 80 μm.

Η

Ένα, Ναρκωτικά επούλωσης της πληγής δοκιμασία. Εικόνες που λαμβάνονται σε 0 ώρες και 24 ώρες μετά το σχηματισμό μηδέν. Τα κύτταρα αφέθηκαν να μεταναστεύσουν σε συνθήκες ελέγχου όπως περιγράφεται στο Υλικά και Μέθοδοι ή με την παρουσία 200 μg /ml του αντι-Cdc37 αντίσωμα. Β, Στο τέλος των κυττάρων χρονικό σημείο βάφτηκαν με Trypan Blue. Καμία σημαντική κυτταρικός θάνατος παρατηρείται και στις δύο περιπτώσεις. C, ποσοτικού επίδραση της Cdc37 στην κυτταρική μετανάστευση. Η προσθήκη 200 μg /ml του αντι-Cdc37 αντίσωμα στο μέσο καλλιέργειας κυττάρων οδήγησε σε 35,8% αναστολή των κυττάρων που εισβάλλουν το χάσμα σε σύγκριση με τον έλεγχο που θεωρήθηκε ως 100% κλείσιμο της πληγής (Ρ & lt? 0.005). Στήλη είναι ο μέσος όρος τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ± SE. Μέσα σε ένα μόνο πείραμα κάθε κατάσταση εξετάστηκε εις τριπλούν. Ράβδοι κλίμακας Α = 165 μm, Β = 80 μm.

Η

Surface Cdc37 αλληλεπιδρά με HSP90 σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού και με HER-2 και EGFR σε MDA-MB-453 και MDA-MB- 231cells

αντίστοιχα

Λαμβάνοντας υπόψη την ανωτέρω φαίνεται εμπλοκή των επιφανειακών Cdc37 σε διεργασίες εισβολή καρκινικών κυττάρων εξετάσαμε την επόμενη τις πιθανές αλληλεπιδράσεις αυτού του μορίου με HSP90 και των υποδοχέων κινάσης ErbB. Για το σκοπό αυτό πραγματοποιήσαμε πειράματα συν-ανοσοκατακρήμνισης χρησιμοποιώντας μεμβράνη κλάσματα που προέρχονται από τα κύτταρα MDA-MB-453 και MDA-MB-231 καλλιεργήθηκαν είτε σε θρεπτικό μέσο ελέγχου όπως αναφέρεται στο Υλικά και Μέθοδοι ή με την παρουσία 200 μg /ml του αντι αντίσωμα Cdc37 για 16 ώρες και ανοσοκαταβυθίστηκαν με το αντίσωμα αντι-Cdc37. ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-HSP90, αντι-HER2 και αντι-ΕΟΡΚ αντισώματα αντίστοιχα, αποκάλυψε ότι το αντίσωμα αντι-Cdc37 διαταράσσει ειδικά την επιφάνεια αλληλεπίδραση του Cdc37 με HSP90 και τους δύο υποδοχείς στις δύο κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν (Εικ. 6Α), δεδομένου ότι ένα μειωμένη ποσότητα αυτών των μορίων παρατηρήθηκε στα επεξεργασμένες καλλιέργειες σε σύγκριση με τους ελέγχους. Σε αυτό το σημείο είναι σημαντικό να σημειωθεί ότι η παρατηρούμενη αναστάτωση επιβεβαιώνει την κυτταρική επιφάνεια εντοπισμό των μοριακών αλληλεπιδράσεων που μελετήθηκαν, αφού όπως φαίνεται παραπάνω, το αντι-Cdc37 αντίσωμα δεν εσωτερικεύεται και παραμένει δεσμευμένη στην κυτταρική επιφάνεια όταν περιλαμβάνεται στο μέσο καλλιέργειας.

Α, κλάσματα πρωτεϊνών μεμβράνης από MDA-ΜΒ 453 και MDA-ΜΒ 231 κύτταρα (ελέγχου) immunoprecipitaded με αντι-Cdc37 αντίσωμα. Ανάλυση των δεσμευμένων πρωτεϊνών με στύπωμα Western με αντίσωμα αντι HSP90 και αντι HER-2 και αντισώματα αντι -EGFR αντίστοιχα, αποκάλυψε ότι Cdc37 αλληλεπιδρά όχι μόνο με HSP90, αλλά και με τους δύο υποδοχείς ErbB μελετηθεί. Παρουσία 200 μg /ml του κυτταρικού αδιαπέραστο αντι-Cdc37 επί 16 ώρες στο μέσο καλλιέργειας των δύο κυτταρικών σειρών που ακολουθείται από ανοσοκαταβύθιση και ανάλυση στυπώματος Western όπως παραπάνω αποκάλυψε ότι το αντίσωμα αντι-Cdc37 διαταράσσει τη σύνδεση της Cdc37 με HSP90 και ο ErbB υποδοχέων στις δύο κυτταρικές σειρές. κύτταρα Β, MDA-ΜΒ 453 και MDA-ΜΒ 231 υποβλήθηκαν σε θεραπεία ή όχι με 200 μg /ml mAb 4C5 επί 16 ώρες. πρωτεϊνικά κλάσματα μεμβράνης που προέρχονται από αυτές τις καλλιέργειες immunoprecipitaded με αντι-Cdc37 ακολουθούμενη από ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας αντι-HSP90 και αντι-HER2 και αντισώματα αντι EGFR, αντίστοιχα. C, κλάσματα πρωτεϊνών μεμβράνης από MDA-ΜΒ 231 κύτταρα που καλλιεργήθηκαν εν τη απουσία ή παρουσία 200 μg /ml του mAb 4C5 επί 16 ώρες ανοσοκαταβυθίστηκαν με το αντι-EGFR αντίσωμα. Ανάλυση των δεσμευμένων πρωτεϊνών με κηλίδα western με αντι-HSP90 αντίσωμα αποκάλυψε ότι επιφάνεια HSP90 αλληλεπιδρά με EGFR και ότι αυτή η αλληλεπίδραση διαταράσσεται από το mAb 4C5. Άσχετο IgGs χρησίμευσε ως αρνητικός έλεγχος για όλα τα παραπάνω πειράματα. D, Πυκνομετρία ποσοτικοποίηση των παρατηρούμενων μειωμένη αλληλεπιδράσεων στην παρουσία αντι-Cdc37 στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων MDA-ΜΒ 453 και MDA-ΜΒ 231 κυττάρων οδήγησαν σε 33% και 59% μείωση με HSP90 και HER-2 αντίστοιχα σχετικά με τη MDA -ΜΒ 453 κύτταρα και σε 56% και 47% μείωση με HSP90 και EGFR αντίστοιχα όσον αφορά τα κύτταρα MDA-ΜΒ 231. Παρουσία του mAb 4C5 στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων MDA-ΜΒ 453 και MDA-ΜΒ 231 κυττάρων οδήγησαν σε 60% και 58% μείωση με HSP90 και HER-2 αντίστοιχα σχετικά με τα κύτταρα MDA-ΜΒ 453 και σε ένα 88% και 70% μειώνεται με την HSP90 και EGFR αντίστοιχα σχετικά με τα κύτταρα MDA-MB 231.

η

MAb 4C5 διαταράσσει ειδικά την επιφάνεια αλληλεπίδρασης της Cdc37 με HSP90 και τους υποδοχείς ErbB

Αφού διαπιστώθηκε ότι παρόμοια με της ενδοκυτταρική αντιστάθμισμα, επιφάνεια Cdc37 συνδέεται φυσικώς με την επιφάνεια HSP90, εμείς δίπλα προσπάθησε να διερευνήσει την επίδραση της παρεμπόδισης μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-HSP90, mAb 4C5, σε αυτή την αλληλεπίδραση λειτουργία. Για το σκοπό αυτό, μεμβράνη κλάσματα που προέρχονται από MDA-MB-453 και MDA-MB-231 καλλιέργειες που υποβλήθηκαν σε αγωγή με 200 μg /ml του mAb 4C5 επί 16 ώρες ανοσοκαταβυθίστηκαν με το αντίσωμα αντι-Cdc37. Η ανάλυση στυπώματος Western χρησιμοποιώντας αντι- HSP90 αποκάλυψε ότι το mAb 4C5 διαταράσσει ειδικά την επιφάνεια αλληλεπίδραση του Cdc37 με HSP90 σε αμφότερες τις καρκινικές κυτταρικές γραμμές που χρησιμοποιήθηκαν (Εικ. 6Β). Πιο συγκεκριμένα το αντι-αντίσωμα Cdc37 συν-ανοσοκαταβυθίστηκε χαμηλότερα επίπεδα HSP90 στις καλλιέργειες αγωγή mAb 4C5 σε σύγκριση με τους μάρτυρες.

Έχουμε δείξει προηγουμένως χρησιμοποιώντας mAb 4C5 που επιφανειακά HSP90 αλληλεπιδρά ειδικά με την εξωκυτταρική περιοχή του HER -2 σε MDA-MB-453 κύτταρα [28] .Στην παρούσα εργασία και προκειμένου να εξετάσουν περαιτέρω τον τρόπο δράσης των επιφανειακών Cdc37 στις δύο κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν, ήταν απαραίτητο να διερευνηθεί πρώτα την πιθανή αλληλεπίδραση της πισίνας επιφάνειας του HSP90 με EGFR. Για το σκοπό αυτό, μεμβράνη κλάσματα που προέρχονται από MDA-MB-231 καλλιέργειες που κατεργάζονται με την απουσία ή παρουσία 200 μg /ml mAb 4C5 για 16 ώρες, ανοσοκαταβυθίστηκαν με το αντίσωμα αντι-HSP90 και ανοσοστυπώθηκαν με αντι-EGFR. Όπως φαίνεται στο Σχ. 6C EGFR αλληλεπιδρά ειδικά με HSP90. Η παρατηρούμενη μείωση στην παρουσία του αδιαπέραστου κυττάρου mAb 4C5 υποδεικνύει ότι το εντοπισμό επιφανείας κυττάρου αυτής της αλληλεπίδρασης Έχοντας δείξει τη σύνδεση των επιφανειακών HSP90 και EGFR και επιπροσθέτως ότι Cdc37 αλληλεπιδρά όχι μόνο με HSP90, αλλά και με HER2 και EGFR εμείς δίπλα επιδίωξε να διερευνήσει την πιθανή επίδραση του mAb 4C5 για την αλληλεπίδραση του συν-συνοδός με τους υποδοχείς ErbB. Συνεπώς μεμβράνη κλάσμα που προέρχεται από MDA-MB-453 και MDA-MB-231 καλλιέργειες που κατεργάζονται ή όχι με 200 μg /ml mAb 4C5 επί 16 ώρες ανοσοκαταβυθίστηκαν με το αντίσωμα αντι-Cdc37. ανάλυση κηλίδας Western χρησιμοποιώντας αντι-HER2 και αντι-ΕΟΡΚ αντισώματα αντίστοιχα, αποκάλυψε ότι το mAb 4C5 διαταράσσει ειδικά την επιφάνεια αλληλεπίδραση του Cdc37 και με τα δύο μόρια υποδοχέα αφού παρατηρήθηκαν χαμηλότερα επίπεδα των υποδοχέων ErbB στις καλλιέργειες αγωγή mAb 4C5 (Εικ. 6Β).

Συζήτηση

στην παρούσα εργασία έχουμε αποδείξει ότι ο συν-συνοδός Cdc37 εντοπίζεται στην επιφάνεια των κυττάρων MDA-MB-453 και MDA-MB-231 κυττάρων καρκίνου του μαστού, όπου είναι απαραίτητο για την κινητικότητα αυτών των κυττάρων και παρομοίως σε ενδοκυτταρική ομόλογό του, αλληλεπιδρά ειδικά με το μοριακό συνοδό HSP90. Επιπλέον τα ευρήματα μας δείχνουν ότι αυτή η ομάδα επιφάνεια του Cdc37 αλληλεπιδρά άμεσα με τα μέλη της οικογένειας ErbB υποδοχέων αυξητικού παράγοντα πιθανώς δρουν ως συν-παράγοντας για HSP90 δραστηριότητες εξωκυτταρικό συνοδό εμπλέκονται σε διεργασίες των καρκινικών κυττάρων εισβολής και ότι το αντίσωμα mAb αντι-HSP90 4C5 διαταράσσει αυτές οι αλληλεπιδράσεις.

εντοπισμό επιφανείας κυττάρου της Cdc37 καταδείχθηκε τόσο από ανοσοκυτταροχημεία σε ζωντανά MDA-MB-453 και MDA-MB-231 κύτταρα καρκίνου του μαστού και στύπωμα western χρησιμοποιώντας λύματα κλάσμα μεμβράνης που προέρχονται από αυτές τις κυτταρικές γραμμές.

Η αναστολή των κυττάρων MDA-MB-453 και MDA-MB-231 κινητικότητα κυττάρου καρκίνου του μαστού, από το αντίσωμα αντι-Cdc37 δείχθηκε χρησιμοποιώντας την πληγή δοκιμασία επούλωσης. Παρουσία αυτού του αντισώματος στο μέσο καλλιέργειας μείωσε σημαντικά το ποσοστό κινητικότητα του αμφότερες τις κυτταρικές σειρές που μελετήθηκαν. Σε αυτό το σημείο είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι όταν το αντίσωμα αντι-HSP90 mAb 4C5 και το αντίσωμα αντι-Cdc37 συμπεριλήφθηκαν είτε χωριστά είτε σε συνδυασμό στο μέσο καλλιέργειας των παραπάνω κυττάρων δεν παρατηρήθηκαν στατιστικά σημαντικές διαφορές στις κλεισίματα του τραύματος.