Αφηρημένο

Είναι γνωστό ότι η έκθεση των κυτταρικών σειρών

in vitro

με παραβολική πτήσεις αλλάζει τους γονιδιακή έκφραση και παραγωγή της πρωτεΐνης μοτίβα. Οι παραβολικές πτήσεις και διαστημικές πτήσεις, γενικά συνοδεύεται από παροδική hypergravity και τους κραδασμούς, που μπορεί να επηρεάσουν τα κύτταρα και, ως εκ τούτου, πρέπει να θεωρούνται υπερβολικά. Για να εκτιμηθεί η πιθανή επίπτωση της παροδικής hypergravity και τους κραδασμούς, μελετήσαμε τα αποτελέσματα αυτών των δυνάμεων ξεχωριστά χρησιμοποιώντας ειδικές εγκαταστάσεις εδάφους. Τοποθετήσαμε θυρεοειδή θυλακιώδη ML-1 και CGTH W-1 καρκινικών κυττάρων σε μια συγκεκριμένη φυγόκεντρο (μουσική πολλαπλών Δείγμα Incubator Φυγόκεντρος? SAHC βραχύ σκέλος του Ανθρώπου Centrifuge) προσομοίωση των φάσεων hypergravity που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια ενός (Ρ1) και 31 παραβολές (Ρ31) του παραβολικού πτήσεις, αντίστοιχα. Στη συσκευή Vibraplex, οι ίδιες κυτταρικές γραμμές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με κύματα δονήσεων που αντιστοιχούν σε αυτές που συμβαίνουν κατά την διάρκεια σύνολό παραβολική πτήση διαρκεί για δύο ώρες. Μετά τις διάφορες θεραπείες, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και αναλύθηκαν με ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου, με έμφαση στα γονίδια που εμπλέκονται στη διαμόρφωση (

ACTB

,

MYO9

,

Tubb

,

VIM

,

TLN1

, και

ITGB1

) και διαμόρφωσης (

EZR

,

RDX

, και

MSN

) ο κυτταροσκελετός, καθώς επίσης και εκείνες που κωδικοποιεί την ανάπτυξη παραγόντων (

EGF

,

CTGF

,

IL6

, και

IL8

) ή πρωτεϊνικών κινασών (

PRKAA1

και

PRKCA

). Η ανάλυση αποκάλυψε αλλοιώσεις σε αρκετά γονίδια σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές? Ωστόσο, λιγότερα γονίδια είχαν επηρεαστεί σε ML-1 από CGTH κύτταρα W-1. Είναι ενδιαφέρον ότι,

IL6

ήταν το μόνο γονίδιο του οποίου η έκφραση έχει αλλάξει στις δύο κυτταρικές σειρές από κάθε θεραπεία, ενώ

ΡΚΑο

μεταγραφή παρέμεινε ανεπηρέαστη σε όλα τα πειράματα. Καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι μια ΡΚΑο-ανεξάρτητο μηχανισμό του

IL6

ενεργοποίηση του γονιδίου είναι πολύ ευαίσθητη σε φυσικές δυνάμεις στα κύτταρα του θυρεοειδούς καλλιεργημένα

in vitro

ως μονοστιβάδες

Παράθεση:. Ma Χ, Wehland Μ, Aleshcheva G, Hauslage J, Wasser Κ, Hemmersbach R, et al. (2013) Η ιντερλευκίνη-6 Έκφραση υπό βαρυτική πίεση λόγω κραδασμών και Hypergravity σε κύτταρα Θυλακιώδες καρκίνο του θυρεοειδούς. PLoS ONE 8 (7): e68140. doi: 10.1371 /journal.pone.0068140

Επιμέλεια: Gayle Ε Woloschak, Northwestern University Feinberg School of Medicine, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 15 Απριλίου του 2013? Αποδεκτές: 25 Μαΐου του 2013? Δημοσιεύθηκε: 2 Ιούλη, 2013

Copyright: © 2013 Ma et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η μελέτη υποστηρίχθηκε από τη γερμανική Υπηρεσία Διαστήματος DLR (BMWi χορηγήσει 50WB1124), καθώς και από τον Ευρωπαϊκό Οργανισμό Διαστήματος (ESA επιχορήγηση CORA-GBF-2010 – 203 με αριθμό σύμβασης 4000102119) και στο Πανεπιστήμιο Aarhus της Δανίας. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

In vivo

όγκοι περιλαμβάνουν νεοπλασματικά κύτταρα, μη κακοήθη στρωματικά κύτταρα, και τα μεταναστευτικά αιμοποιητικών κυττάρων [1]. Διαφορετικές όγκοι κυριαρχούνται από φαινοτυπικά και λειτουργικά ετερογενή καρκινικά κύτταρα, τα οποία καθοδηγούν τις πολύπλοκες αλληλεπιδράσεις μεταξύ των κυτταρικών τύπων και ρυθμίζουν την ανάπτυξη του όγκου, εξέλιξη, μετάσταση, και την αγγειογένεση [2]. Έτσι, νεοπλαστικά ή καρκινικά κύτταρα είναι το κύριο συστατικό των κακοηθών όγκων. Η ανάλυσή τους μπορεί να υποδεικνύει πιθανούς τρόπους κακοήθη ανάπτυξη και τη θεραπεία των όγκων.

Είμαστε επικεντρώθηκε στην θυλακιώδη καρκινώματα του θυρεοειδούς, που είναι κακοήθεις όγκους του επιθηλίου που εκφράζει ωοθυλακίων μοτίβα. Κανονικά, αυτά ενθυλακώνονται [3] – [5].

In vivo

, τα νεοπλασματικά κύτταρα οδηγώντας την πρόοδο του καρκίνου είναι επιθηλιακών κυττάρων σε διαφορετικά στάδια της αποδιαφοροποίησης. Οι νεοπλαστικές θυρεοειδούς θυλακιώδη κύτταρα καρκίνου που αντιπροσωπεύεται από τις γραμμές ML-1, FTC-133 και CGTH-W1 για αυτή τη μελέτη [5] – [7]. Τα τελευταία χρόνια, έχουν καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα έχουν δειχθεί να επηρεάζεται επωάζονται σε τυχαία Positioning Machine (RPM) ή ένα clinostat, συσκευές που αναπτύχθηκε για την προσομοίωση μικροβαρύτητας στη Γη [8] – [12]. Βρήκαμε αλλαγές στο δύο έως τριών διαστάσεων ανάπτυξη του καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα καλλιεργούνται στην RPM, που συνοδεύεται από μία μεταβολή στη συγκέντρωση διαφόρων πρωτεϊνών και την έκφραση ενός μεγάλου αριθμού γονιδίων [8] – [12].

Το RPM είναι μια συσκευή που έχει σχεδιαστεί για την προσομοίωση μικροβαρύτητας στη Γη. Για το σκοπό αυτό, τα δείγματα περιστρέφονται γύρω από όλες τις τρεις χωρικές κατευθύνσεις σε ένα τυχαίο τρόπο. Κατά τη διάρκεια του πειράματος, η κατεύθυνση του διανύσματος της βαρύτητας αλλάζει συνεχώς και τα αποτελέσματά της θα μπορούσε να ακυρωθεί την πάροδο του χρόνου [13]. Η αλλαγμένη συμπεριφορά των καρκινικών κυττάρων που επωάζονται σε αυτό το μηχάνημα μπορεί να οφείλεται σε αλλοιωμένη βαρύτητας (προσομοιωμένη μικροβαρύτητα). Για να αποδειχθεί αυτό, είμαστε εκτεθειμένοι καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα και ενδοθηλιακά κύτταρα σε βραχυπρόθεσμο πραγματικό μικροβαρύτητας που παράγονται σε αεροσκάφη κατά τη διάρκεια παραβολικές πτήσεις. Η έκθεση σε πραγματικό μικροβαρύτητα οδήγησε σε παρόμοιες, αλλά όχι ταυτόσημες, τα αποτελέσματα σε σύγκριση με τα πειράματα RPM [14], [15]. Αυτές οι διαφορές μπορεί να οφείλονται στο γεγονός ότι η RPM δεν προσομοιώνουν μικροβαρύτητα για τις επιλεγμένες κυτταρικό σύστημα μας και διερευνήθηκαν παραμέτρους, ή ότι μικροβαρύτητα διακόπτεται από τις φάσεις hypergravity και συνοδεύεται από δονήσεις. Κατά τη διάρκεια μιας παραβολικής πτήσης, κάθε ένα από τα 31 παραβολών κανονικά πετάξει περιλαμβάνει 22 s της μικροβαρύτητας και των περιόδων 1

g

και 1,8

g

, καθώς και κραδασμών που προκαλούνται από τον κινητήρα [14], [16].

για να διερευνηθούν οι πολύπλοκες μηχανικές επιδράσεις που επηρεάζουν τα κύτταρα κατά τη διάρκεια μιας παραβολικής πτήσης, είναι σημαντικό να χαρακτηρίσουμε την επίδραση των βραχυπρόθεσμων hypergravity και κραδασμών σε κύτταρα χωρίς να τους εκθέτουν σε μικροβαρύτητα. Έτσι, πραγματοποιήθηκαν ξεχωριστές δοκιμές hypergravity και προσομοίωση δόνηση, χρησιμοποιώντας μεθόδους που προσομοιώνεται το προφίλ επιτάχυνση ενός ή 31 παραβολές, καθώς επίσης και τις δονήσεις που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια όλης της πτήσης. Επιπλέον, επικεντρώθηκε στην έκφραση των κυτοκινών IL-6 και IL-8 καθώς και των πρωτεϊνικών κινασών.

Μέθοδοι

Cell Culture

Οι ανθρώπινες κυτταρικές σειρές καρκίνου του θυρεοειδούς ML-1 [5] και CGTH-W1 [6] σπάρθηκαν σε Τ75 cm

2 ή T25 cm

2 φιάλες καλλιέργειας και τροφοδοτούνται RPMI 1640 (Invitrogen, Eggenstein, Γερμανία) συμπληρωμένο με 10% ορό εμβρύου μόσχου (Biochrom, Βερολίνο, Γερμανία), 100 μονάδες πενικιλίνης /mL και 100 μg στρεπτομυκίνη /ml, και καλλιεργούνται μέχρι τη συρροή.

Πειράματα Hypergravity

Hypergravity δημιουργήθηκε με τη χρήση του πολλαπλών Δείγμα Θερμοκοιτίδα Φυγόκεντρος ( ΜΟΥΣΙΚΗ, DLR, Κολωνία, Γερμανία), η οποία είχε τοποθετηθεί σε μια θερμοκοιτίδα στους 37 ° C και 5% CO

2. Καθοδηγείται από ένα ειδικό πρόγραμμα ηλεκτρονικού υπολογιστή, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε ένα προφίλ hypergravity που συμβαίνει κατά τη διάρκεια μιας παραβολής (Ρ1) και 31 παραβολές (P31). Αυτή η συσκευή χρησιμοποιείται για τη θεραπεία των κυττάρων, των οποίων η mRNA προσδιορίστηκε στη συνέχεια. Confluently καλλιεργούνται κύτταρα από φιάλες καλλιέργειας κυττάρων Τ75 θρυψινοποιήθηκαν και μεταφέρθηκαν σε σωλήνες των 5-mL. Οι σωλήνες γεμίζουν με μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και τα κύτταρα αφέθηκαν να εξισορροπηθούν πριν τη φυγοκέντρηση. Αντίστοιχα με τους χρόνους στερέωσης των κυττάρων κατά τη διάρκεια μιας παραβολικής πτήσης, τα κύτταρα εκτέθηκαν είτε σε έναν κύκλο δύο 20-s-μήκους 1,8

g

φάσεις διακοπεί από μια 22-s παύσης (Ρ1) ή έως 2 h διαρκεί 1,8

g

φάσεις (Ρ31). Επιπλέον, εκτελέσαμε πειράματα στο μικρό βραχίονα του Ανθρώπου Φυγόκεντρος (SAHC, DLR, Κολωνία, Γερμανία), με κύτταρα από φιάλες καλλιέργειας κυττάρων Τ75 λόγω της υψηλής ποσότητας του υλικού που απαιτείται για την ανάλυση. Σε αυτή τη συσκευή, εκθέσαμε τα κύτταρα σε μία συνεχή φάση hypergravity περίπου 2 ωρών που αντιστοιχούν στο 31 παραβολές. Συλλέξαμε n = 5 στατικές 1

g

ελέγχων και η = 5 1.8

g

υπερ-

g

δείγματα για αναλύσεις Western blot (η = 5? Ρ31), όπως καθώς και η = 5 στατικές 1

g

ελέγχους (Ρ1), η = 5 στατικές 1

g

ελέγχους (Ρ31), και η = 5 1.8

g

υπερ-

g

(Ρ1 και Ρ31) για PCR πραγματικού χρόνου, αντίστοιχα. Η 1

g

έλεγχοι αναπτύχθηκαν παράλληλα σε μια γειτονική πανομοιότυπη θερμοκοιτίδα.

Πειράματα κραδασμών

φιαλών καλλιέργειας Τ25 που περιέχουν 90% συρρέουσες μονοστοιβάδες μονιμοποιήθηκαν στην πλατφόρμα Vibraplex σε ένα επωαστήρα στους 37 ° C με 5% CO

2 στον αέρα και υποβλήθηκε σε επεξεργασία σύμφωνα με ένα πρωτόκολλο που δημοσιεύτηκε νωρίτερα [14]. Εν συντομία, εφαρμόζοντας Vibraplex, τα κύτταρα εκτέθηκαν σε κραδασμούς συγκρίσιμα με εκείνα που συμβαίνουν κατά τη διάρκεια παραβολική πτήσεις [16]. Συχνότητες που κυμαίνονται από 0,2 Hz έως 14 kHz προσαρμόστηκαν, που αντιστοιχούν στις τρεις φάσεις: τραβήξτε προς τα πάνω (1,8

g

), ελεύθερη πτώση (μικροβαρύτητας, μ

g

), και τραβήξτε προς τα έξω (1,8

g

), όπως καταγράφονται και αναλύονται από Schmidt [16] πάνω από περίπου 2 ώρες, το οποίο είναι για πόσο καιρό οι 31 παραβολές του πραγματικού παραβολικές αποστολές τελευταία. Στη συνέχεια, το μέσο απομακρύνθηκε και τα κύτταρα αποξέστηκαν και συλλέγεται σε 3 ml ρυθμισμένου αλατούχου κρύο φωσφορικά (PBS). Μετά από επακόλουθη φυγοκέντρηση (4000 rpm), το ίζημα αποθηκεύεται στους -80 ° C για ανάλυση Western blot και PCR.

Το 1

g

μάρτυρες αναπτύχθηκαν χωριστά στο ίδιο επωαστήρα. Συλλέξαμε n = 5 στατικές 1

g

ελέγχων και η = δείγματα δόνηση 5 2-ωρών για στύπωμα Western αναλύσεις (η = 5? Ρ31), καθώς και η = 5 δείγματα για πραγματικού χρόνου PCR, αντίστοιχα.

Απομόνωση RNA

τα κύτταρα για την ποσοτική PCR πραγματικού χρόνου μονιμοποιήθηκαν με RNA

αργότερα

(Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία) σε αναλογία 4:01. Στη συνέχεια, οι φιάλες φυλάχθηκαν στους 4 ° C. Αμέσως πριν τη χρήση, ο RNAlater αντικαταστάθηκε από PBS (Invitrogen, Darmstadt, Germany). Τα κύτταρα αποξέονται χρησιμοποιώντας κύτταρο ξύστρες (Sarstedt, Nümbrecht, Γερμανία), μεταφέρθηκαν σε σωλήνες και σφαιροποιήθηκαν με φυγοκέντρηση (2.500 χ

g

, 10 λεπτά, 4 ° C). Η RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) χρησιμοποιήθηκε σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή για την απομόνωση ολικού RNA. Οι συγκεντρώσεις και η ποιότητα του RNA προσδιορίστηκαν φασματοφωτομετρικά στα 260 nm χρησιμοποιώντας ένα όργανο NanoDrop (Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA). Το απομονωμένο RNA είχε 280 αναλογία Α260 /των & gt?. 1.5

cDNA για τον ποσοτικό πραγματικό χρόνο PCR ακολούθως λαμβάνονται με το First Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, St. Leon-Rot, Γερμανία) με τη χρήση 1 μg του ολικού RNA σε μια 20-μί αντίστροφη μίγμα της αντίδρασης μεταγραφής.

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR

ποσοτική πραγματικού χρόνου PCR χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που ενδιαφέρουν. Το λογισμικό Primer Express® χρησιμοποιήθηκε για το σχεδιασμό κατάλληλων εκκινητών με ένα T

m περίπου 60 ° C (Πίνακας 1).

Η

Οι εκκινητές συντέθηκαν από την ΤΙΒ Molbiol (Βερολίνο, Γερμανία). Όλες οι δοκιμασίες τρέχουν σε StepOnePlus Real-Time PCR System χρησιμοποιώντας τη δύναμη SYBR®Green PCR Master Mix (τόσο Applied Biosystems, Darmstadt, Γερμανία). Ο όγκος της αντίδρασης ήταν 25 μL, συμπεριλαμβανομένου 1 μι cDNA εκμαγείου και μια τελική συγκέντρωση εκκινητή 500 ηΜ. Οι συνθήκες PCR ήταν ως εξής: 10 λεπτά στους 95 ° C, 40 κύκλοι των 30 s στους 95 ° C και 1 λεπτό στους 60 ° C, που ακολουθείται από ένα βήμα ανάλυση καμπύλης τήξης (κλίση θερμοκρασίας από 60 ° C έως 95 ° C με + 0,3 ° C ανά κύκλο). Εάν όλες οι αμπλικόνια έδειξε ένα μονό Τ

m παρόμοια με εκείνη που προβλέπεται από το λογισμικό Primer Express, οι αντιδράσεις PCR θεωρήθηκαν συγκεκριμένες. Κάθε δείγμα μετρήθηκε εις τριπλούν και εφαρμόσαμε το συγκριτικό C

T (ΔΔC

Τ) μέθοδος για τη σχετική ποσοτικοποίηση των επιπέδων μεταγραφής. 18S rRNA χρησιμοποιήθηκε ως γονίδιο οικοκυρική για την κανονικοποίηση των δεδομένων εκφράσεως μας.

Ανάλυση Western Blot

Μετά την θεραπεία, τα δείγματα για ανάλυση κηλίδος Western σταθεροποιήθηκαν με προσθήκη αιθανόλης έως τελικής συγκέντρωσης 70 %. Για την ανάλυση, SDS-PAGE, ανοσοκηλιδώσεως και πυκνομετρία διεξήχθησαν σε έξι αντίγραφα ακόλουθα πρωτόκολλα ρουτίνας [17] – [19]. Αντισώματα κατά των ακόλουθων αντιγόνων χρησιμοποιήθηκαν: α-τουμπουλίνης, παν-ακτίνη, β-ακτίνη, μοεσίνη και εζρίνη (Οι αραιώσεις 1:1000, εκτός από παν-ακτίνη, 1:4000). Όλα τα αντισώματα αγοράστηκαν από Cell Signaling Technology Inc. (MA, USA). Για την πυκνομετρική ποσοτικοποίηση των ζωνών, οι βάφονται μεμβράνες σαρώθηκαν και αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας το Image J (https://rsb.info.nih.gov/ij/) λογισμικού [20]. Δεδομένου ότι δεν κατάλληλη πρωτεΐνη βρέθηκε ότι θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως μάρτυρας φόρτωσης κάτω από τις πειραματικές συνθήκες διερευνώνται, εμείς προσεκτικά φορτωθεί ίσες ποσότητες πρωτεΐνης (40 μg σε 10 μL) σε κάθε λωρίδα τζελ και ομαλοποιηθούν τα πυκνομετρική δεδομένα σε αυτή την τιμή.

STRING 9.0 Δίκτυο Ανάλυσης

Οι πρωτεΐνες διερευνηθεί συνοψίζονται. Για κάθε πρωτεΐνη, ο αριθμός εισόδου και γονίδιο όνομα UniProtKB αποκτήθηκε σε UniProtKB και τα ονόματα αυτά χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία δικτύου με STRING 9.0 (www.string-db.org) [21]. Οι αριθμοί εισόδου UniProtKB εισήχθησαν στη μορφή εισόδου ως «πολλαπλών πρωτεϊνών» και «Homo sapiens» επιλέχθηκε ως ο οργανισμός. Η προκύπτουσα προβολή δίκτυο κατεβάσει ως a.jpg εικόνα.

Στατιστική Ανάλυση

Όλες οι στατιστικές αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση του λογισμικού SPSS 16.0 (SPSSS, Inc, Chicago, IL, USA). Εμείς χρησιμοποιούνται είτε μονόδρομη ANOVA ή το Mann-Whitney test-U, κατά περίπτωση. Οι διαφορές θεωρήθηκαν σημαντικές στο επίπεδο του

σ

& lt? 0,05. Όλα τα δεδομένα παρουσιάζονται ως μέσες τιμές ± τυπική απόκλιση.

Αποτελέσματα

Επιλεγμένα Γονίδια και Πρωτεΐνες

Για να δοκιμαστεί η επίδραση των κραδασμών και hypergravity στη συμπεριφορά των κυττάρων, ερευνήσαμε δύο καρκίνου του θυρεοειδούς κυτταρικές γραμμές. Εκτιμήσαμε κυτταροσκελετικών πρωτεϊνών, επειδή είχαμε παρατηρηθεί στο παρελθόν ότι η κυτταροσκελετού επηρεάστηκε κατά τη διάρκεια παραβολικές πτήσεις [14]. Έτσι, εστιάσαμε στην γονίδια και πρωτεΐνες που εμπλέκονται στον σχηματισμό (ακτίνη, μυοσίνη, τουμπουλίνη, βιμεντίνη, ταλίνη, και ιντεγκρίνης) και διαμόρφωση (εζρίνης, ραδιξίνη, μοεσίνη και) ο κυτταροσκελετός. Επιπλέον, διερευνήσαμε αυτών των αυξητικών παραγόντων που κωδικοποιεί (IL-6, IL-8, EGF, και CTGF) και πρωτεϊνικές κινάσες (PRKCA και PRKAA1). Παρά την λειτουργική ποικιλομορφία των πρωτεϊνών, που σχηματίζουν ένα δίκτυο αλληλεπιδράσεων (Εικ. 1), με την εξαίρεση του PRKAA1, η καταλυτική υπομονάδα του ΑΜΡ-ενεργοποιημένης κινάσης πρωτεΐνης (ΑΜΡΚ), που παίζει ένα ρόλο κλειδί στη ρύθμιση του μεταβολισμού κυτταρικής ενέργειας.

Διακύμανση στην έκφραση του mRNA Induced με δόνηση

Και οι δύο κυτταρικές σειρές συνέχισε να αυξάνεται κατά τη διάρκεια της θεραπείας τους κραδασμούς που διαρκεί δύο ώρες. Στη συνέχεια, μικροσκοπική παρατήρηση αποκάλυψε ότι προσκόλληση των κυττάρων εξακολουθούσαν να υπάρχουν. Ωστόσο, προσδιορισμό των συγκεντρώσεων mRNA των πρωτεϊνών έδειξαν ότι ML-1 και CGTH-W1 κύτταρα επηρεάζονται με διαφορετικό τρόπο από τους κραδασμούς. Ενώ μόνο

IL6

συγκεντρώσεις mRNA μειώθηκε σε κύτταρα ML-1, οι συγκεντρώσεις των άλλων μεταγραφές διερευνήθηκαν παρέμεινε αμετάβλητη (Σχ. 2). Στα κύτταρα CGTH W-1, η mRNAs του

CTGF

,

IL6

,

ACTB

,

MSN, ITGB1

και

PRKAA1

ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω, ενώ η

Tubb

mRNA ήταν κάτω-ρυθμίζονται. Όλα τα άλλα επίπεδα του mRNA δεν επηρεάζονται από τις δονήσεις (Εικ. 3). Ως εκ τούτου, ML-1 κύτταρα φάνηκε να είναι πιο ανθεκτικά κατά των κραδασμών από τα κύτταρα CGTH-W1.

Η

Διαφορικές Gene Expression Induced από βραχυπρόθεσμες Hypergravity

Κατά τη διάρκεια μιας παραβολικής πτήσης , τα κύτταρα εκτίθενται σε κραδασμούς, καθώς και να hypergravity. Σε προηγούμενα πειράματα πτήσεων [14], [15], παρατηρήσαμε ότι οι μεγάλες κυτταρικές αλλαγές που σημειώθηκαν κατά την πρώτη παραβολή. Ως εκ τούτου, εδώ, εκθέσαμε τα κύτταρα σε ένα προφίλ επιτάχυνσης που συνέβη κατά την πρώτη παραβολή. Ακόμη και κατά τη διάρκεια αυτών σύντομες περιόδους (2 χ 20 δευτερόλεπτα) της φυγοκέντρησης, σημαντικές αλλαγές στη μεταγραφή των γονιδίων μας ενδιαφέροντος συμβεί. Στην ML-1 κύτταρα, που εντοπίστηκε σημαντική προς τα κάτω ρύθμιση των συγκεντρώσεων mRNA της

IL6

και

IL8

, ενώ καμία σημαντική αλλαγή δεν παρατηρήθηκε για

Tubb, MYO9, VIM, EZR? RDX? MSN, EGF, CTGF, PRKCA,

και

PRKAA1

(Εικ. 4).

Η

Στα κύτταρα CGTH W-1, η mRNAs του

CTGF, IL6 , IL8, ITGB1, VIM, TLN1, MYO9B

και

RDX

ρυθμίστηκαν προς τα κάτω, ενώ οι συγκεντρώσεις των άλλων mRNA που δοκιμάστηκαν παρέμειναν un-επηρεάζονται (Εικ. 5). Και πάλι, ML-1 κύτταρα εμφανίστηκαν πιο ανθεκτικά από CGTH κύτταρα W-1, ιδίως όσον αφορά την κυτταροσκελετού πρωτεϊνών.

Η

Διαφορικές mRNA έκφραση που προκαλείται από επαναλαμβανόμενες έκθεση σε Hypergravity

Παρά το γεγονός ότι το μείζον επίδραση μιας παραβολικής πτήσης παρατηρείται μετά την πρώτη παραβολή, εκθέσαμε τα κύτταρα να hypergravity που συμβαίνει κατά τη διάρκεια μιας συνολικά 31 παραβολές και εξέτασε τα επίπεδα mRNA μετά. Επαναλαμβανόμενη έκθεση σε hypergravity ανέστρεψε τα αποτελέσματα του πρώτου παραβολής στο

IL6

και

IL8

επίπεδα mRNA σε κύτταρα ML-1. Τώρα,

IL6

και

IL8

μεταγραφές έγιναν up-ρύθμιση, μαζί με το

CTGF, EZR

και

RDX

mRNAs (Εικ. 4).

Στη γραμμή κυττάρων CGTH W-1, η έκφραση

ITGB1, VIM, MYO9, RDX, IL6,

και

IL8

μειώθηκαν μετά P31, ενώ οι συγκεντρώσεις των άλλα επτά τύποι mRNA παρέμεινε ανεπηρέαστη (Σχ. 5). Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η hypergravity που συμβαίνει κατά τη διάρκεια 31 παραβολές κυρίως up-ρυθμίζει τη μεταγραφή του στόχου-γονιδίων μας στην ML-1 κύτταρα, αλλά τα ρυθμίζει προς τα κάτω στη CGTH κύτταρα W-1.

Αλλαγές στην ενδοκυτταρική πρωτεΐνη οι συγκεντρώσεις που προκαλείται από την δόνηση ή Hypergravity που εμφανίζεται κατά τη διάρκεια 31 Παραβολές

τα δημοσιευμένα στοιχεία σχετικά με τις συσχετίσεις μεταξύ ενδοκυτταρικά επίπεδα του mRNA και οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης είναι ασυνεπής [22] – [24]. Συνεπώς, διερευνήσαμε τις συγκεντρώσεις πρωτεΐνης ακτίνης, τουμπουλίνης, μοεσίνη και εζρίνης, εκτός από τις συγκεντρώσεις mRNA. Χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα που δεσμεύεται με όλες τις παραλλαγές των αλυσίδων ακτίνης (παν-ακτίνη), παρατηρήσαμε ότι παν-ακτίνης συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μειώθηκαν σε κάθε κυτταρική σειρά μετά από κάθε είδος της θεραπείας, σε σύγκριση με 1

g

κύτταρα ελέγχου ( Σχ. 6Α, 7Α). Τα επίπεδα πρωτεΐνης της άλφα-τουμπουλίνης αλυσίδες ήταν διαφορετικές σε ML-1 και CTGH κύτταρα W-1. Σε κύτταρα ML-1, οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης μειώθηκαν μετά την επεξεργασία τους κραδασμούς και την έκθεση hypergravity, ενώ το αντίστροφο παρατηρήθηκε σε κύτταρα CGTH W-1 (Εικ. 6C και 7C). Σε αυτές τις περιπτώσεις, η άμεση σύγκριση μεταξύ πρωτεΐνης και οι συγκεντρώσεις mRNA δεν ήταν δυνατόν επειδή τα διάφορα γονίδια κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες με ετικέτα από τα αντισώματα. Όταν χρησιμοποιείται ένα αντίσωμα που κατευθύνεται έναντι μόνο βήτα-ακτίνης αλυσίδες, τα οποία κωδικοποιούνται από το

ACTB

γονίδιο, ανιχνεύσαμε καμία αλλαγή σε κύτταρα ML-1 μετά από αγωγή δόνηση και αυξημένες συγκεντρώσεις μετά από έκθεση σε hypergravity. Σε CTGH κύτταρα W-1, ανοδική ρύθμιση αυτής της πρωτεΐνης παρατηρήθηκε μετά από δόνηση και ρύθμιση προς τα κάτω μετά την έκθεση hypergravity (Σχ. 6Β και 7Β). Έτσι, η πρωτεΐνη και οι αλλαγές mRNA αντιστοιχούσε καλά σε CGTH κύτταρα W-1 μετά από έκθεση σε δόνηση (Εικ. 3, 7Β), αλλά όχι μετά την επαναλαμβανόμενη hypergravity (Σχ. 5, 7Β). Υπήρξε επίσης μια συσχέτιση σε ML-1 κύτταρα μεταξύ της πρωτεΐνης και των αλλαγών mRNA σε απόκριση σε δόνηση (Εικ. 2), αλλά όχι με την έκθεση hypergravity (Εικ. 4) [14]. Επιπλέον, αναλύσεις κηλίδος Western διεξήχθησαν για μοεσίνη και εζρίνης. Σε κύτταρα ML-1, μόνο εζρίνη επηρεάστηκε από δόνηση, ενώ μοεσίνη και εζρίνης επηρεάστηκαν από hypergravity (Εικ. 6D και 6Ε). Σε CGTH κύτταρα W-1, και οι δύο τύποι πρωτεϊνών κάτω ρυθμισμένα με δόνηση, αλλά μόνο μοεσίνη έκφραση πρωτεΐνης μειώθηκε υπό hypergravity (Σχ. 7D και 7Ε). Σε αυτές τις περιπτώσεις, οι συγκεντρώσεις πρωτεΐνης και mRNA αντιστοιχούσε μόνο σε τρεις από τις οκτώ αναλύσεις (Εικ. 3-7).

Η

Συζήτηση

Για να μελετηθεί η πιθανή επίδραση των κραδασμών ή hypergravity για τον καρκίνο του θυρεοειδούς κύτταρα, επιλέξαμε πρωτεΐνες που εμπλέκονται στη διατήρηση ή τη διαμόρφωση δομών των κυττάρων. Ο λόγος για την επιλογή τους οφείλεται στις προηγούμενες παρατηρήσεις ότι αυτές οι πρωτεΐνες αντιδρούν με μεγάλη ευαισθησία όταν τα κύτταρα εκτίθενται σε μικροβαρύτητα [8], [10], [12]. Επιπλέον, με στόχο να βρούμε ένα άμεσο στόχο πρωτεΐνη /γονίδιο των μηχανικών δυνάμεων που με τη σειρά του προκάλεσε αλλαγές σε άλλες πρωτεΐνες [25].

Οι πρωτεΐνες των οποίων τα γονίδια ερευνήσαμε έχουν διαφορετικές κυτταρικές λειτουργίες. Ακτίνη, μυοσίνη, τουμπουλίνη, βιμεντίνη και αποτελούν τα κύρια συστατικά του κυτταροσκελετού, την υποστήριξη και την ενίσχυση της κυτταρικής δομής [26]. Ezrin και μοεσίνη ανήκουν στην οικογένεια του ΜΣΙ, η οποία περιλαμβάνει επίσης ραδιξίνης. Αυτές οι πρωτεΐνες μπορούν να αλληλεπιδράσουν με αμφότερα πρωτεΐνες της πλασματικής μεμβράνης και νηματοειδείς ακτίνης [27], και ρυθμίζει την οργάνωση και τη δυναμική του κυτταροσκελετού της ακτίνης σε γενικές γραμμές [28]. Συνδεδεμένο με νημάτια ακτίνης μέσω ταλίνη, ιντεγρίνη διαπερνά την κυτταρική μεμβράνη και αλληλεπιδρά με την εξωκυτταρική μήτρα που περιβάλλει τα κύτταρα. Αυτή η σύνδεση είναι απαραίτητη για τη μετάδοση σημάτων από το κύτταρο περιβάλλον προς το εσωτερικό [29]. Επιθηλιακό αυξητικό παράγοντα (EGF), του αυξητικού παράγοντα του συνδετικού (CTGF) και οι ιντερλευκίνες 6 και 8 παράγονται από τα κύτταρα του θυρεοειδούς και ενεργούν για κυτταροσκελετού τους με αυτοκρινή τρόπο [30].

Στην παρούσα μελέτη, η σύγκριση των πρωτεϊνών και των σχετικών συγκεντρώσεων mRNA αποκάλυψε φτωχή συσχέτιση σε σχέση με βήτα-ακτίνη, εζρίνη και μοεσίνη. Αυτό μπορεί να εξηγηθεί από το πρόσφατο εύρημα ότι η κυτταρική αφθονία των πρωτεϊνών ελέγχεται κυρίως στο επίπεδο της μετάφρασης [31]. Ακόμα, δεδομένα γονιδιακής έκφρασης μπορεί να παράσχει σημαντικές πληροφορίες σχετικά με τις παραλλαγές δομή κυττάρων που προκαλείται από διάφορα ερεθίσματα.

Ο πρωτεϊνική κινάση άλφα ανήκει στην οικογένεια της πρωτεϊνικής κινάσης C και είναι ένας ρυθμιστής του κυτταροσκελετού [32], [33]. Στο επίπεδο πρωτεΐνης, ενεργοποιείται από την κινάση mTORC2 [34]. γονιδιακή έκφραση της PKC-άλφα μπορούν να τροποποιηθούν με χημικές ουσίες, οι αυξητικοί παράγοντες και οι ορμόνες [35]. Στο σύστημά μας, οι φυσικές δυνάμεις που εφαρμόζονται στα κύτταρα δεν επηρέασε το ένζυμο αυτό. Σε πολλά συστήματα, ΡΚΟ-άλφα ενεργοποιεί την έκφραση γονιδίου IL-6 [36], [37], η οποία είναι μια πολυλειτουργική κυτοκίνη που εκφράζεται από ανθρώπινα θυρεοκύτταρα [38], [39]. Παρατηρήσαμε ότι

IL6

έκφραση αυτή τροποποιήθηκε, ενώ η έκφραση του γονιδίου της PKC-α παρέμεινε ανεπηρέαστη. Ως εκ τούτου, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι οι παρατηρούμενες αλλαγές στο

IL6

επίπεδα mRNA συνέβη ανεξάρτητα της PKC άλφα. Είναι γνωστό από τη βιβλιογραφία ότι διαφορετικοί ρυθμιστικοί μηχανισμοί είναι υπεύθυνοι για

IL6

γονιδιακή έκφραση [40]. Σε FRTL-5 θυρεοειδούς κύτταρα,

IL6

έκφραση mRNA ενισχύεται από μηχανισμούς που περιλαμβάνουν την οδό οΑΜΡ /ΡΚΑ [41]. Επιπλέον, η μηχανική καταπόνηση ή τέντωμα ενισχύει παραγωγή IL-6 σε ανθρώπινα επιθηλιακά κύτταρα πνεύμονα και κυττάρων λείου μυός μέσω ΝΡκΒ [42], [43]. Για το καλύτερο της γνώσης μας, ήταν άγνωστο μέχρι τώρα κατά πόσον ή όχι εμβιομηχανικής του στρες που προκαλείται από IL-6 στα κύτταρα του θυρεοειδούς. Κάναμε ήδη παρατηρούμε ότι

IL6

γονιδιακής έκφρασης ενισχύθηκε σε FTC-133 καρκίνου του θυρεοειδούς κύτταρα, τα οποία παρέμειναν προσκολλημένα για 24 ώρες από την RPM [12]. Σε ενδοθηλιακά κύτταρα, παρατηρήθηκε IL-6 ευαισθησία σε προσομοίωση μικροβαρύτητα.

IL6

ενεργοποίηση του γονιδίου ήταν υψηλότερη σε προσκολλημένη και σωλήνα που σχηματίζουν τα κύτταρα μετά από 5 ημέρες από την RPM σε σχέση με το 1

g

τον έλεγχο των κυττάρων. Κατά τις επόμενες δύο ημέρες,

IL6

συγκέντρωση mRNA μειώθηκε σε προσκολλημένα κύτταρα, αλλά αυξήθηκε σε κύτταρα σωλήνας σχηματισμού [44]. Αυτές οι αλλαγές συσχετίστηκαν καλά με εκείνα των επιπέδων πρωτεΐνης IL-6, όπως υψηλότερες ποσότητες IL-6 πρωτεΐνες που εκκρίνεται στο υπερκείμενο της καλλιέργειας όταν τα ενδοθηλιακά κύτταρα επωάστηκαν για την RPM για 24 ώρες σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου. Αυτό το αποτέλεσμα καταργήθηκε με την παρουσία bFGF [45].

Από επιστημονικής απόψεως, όμως, είναι ακόμα πιο ενδιαφέρον ότι οι συγκεντρώσεις mRNA των αυξητικών παραγόντων μεταβάλλεται με μεγαλύτερη ευαισθησία κάτω από την επίδραση των μηχανικών δυνάμεων που δημιουργούνται από hypergravity και τους κραδασμούς από τα επίπεδα mRNA των πρωτεϊνών που χτίζουν ή ρυθμίζουν άμεσα τον κυτταρικό σκελετό.

IL6

επίπεδα αλλάξει κάτω από κάθε θεραπεία. Εκτός

EZR

στην ML-1 κύτταρα και

Tubb

στα κύτταρα CGTH-W1, όλες οι μεταγραφικές αλλαγές σημειώθηκαν στην ίδια κατεύθυνση με την τροποποίηση του

IL6

γονίδιο. Επιπλέον, οι αλλαγές στην IL-6 ποσά πρωτεΐνης σε υπερκείμενα καλλιέργειας παρατηρήθηκαν νωρίτερα, όταν τα ενδοθηλιακά κύτταρα καλλιεργήθηκαν υπό αλλαγμένες συνθήκες βαρύτητας σε RPM [45]. Έτσι, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η IL-6 παίζει σημαντικό ρόλο όταν μηχανικές δυνάμεις ενεργούν σε ανθρώπινα κύτταρα του θυρεοειδούς

in vitro

. Αν το συμπέρασμα αυτό είναι αλήθεια, θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί τόσοι πολλοί γονίδιο αλλαγές που παρατηρούνται μετά τα κύτταρα έχουν εκτεθεί σε μικροβαρύτητας [46], ενώ οι ολόκληροι οργανισμοί επηρεάζονται μέτρια κατά τη διάρκεια των αντίστοιχων περιόδων έκθεσης. Στους ανθρώπους,

IL6

γονιδιακή έκφραση ρυθμίζεται προς τα κάτω από τις ορμόνες, όπως τα οιστρογόνα και η τεστοστερόνη [40]. Ορμόνες έλεγχο

IL6

έκφρασης είναι απούσα όταν απομονωθούν κύτταρα καλλιεργούνται

in vitro

.

Στο μέλλον, θα είναι σημαντικό να ληφθούν υπόψη οι επιπτώσεις αυτές κατά τη διεξαγωγή πειραμάτων σε πραγματικό μικροβαρύτητας. Ειδικά αυτές οι ρυθμίσεις με μεγαλύτερη ή περισσότερες φάσεις της hypergravity και τους κραδασμούς, όπως παραβολικές πτήσεις, θα επηρεαστούν περισσότερο από αυτούς. Για μεγαλύτερες αποστολές στο διάστημα επί του σκάφους, η hypergravity ISS δεν θα πρέπει να είναι ένας παράγοντας, αλλά ένα ορισμένο επίπεδο κραδασμών που προέρχονται από τα διάφορα μηχανήματα, καθώς και από τους ίδιους τους (για παράδειγμα, κατά τη διάρκεια της προπόνηση) αστροναύτες θα είναι επίσης πάντα παρούσα και θα πρέπει να θεωρηθεί . Χρησιμοποιώντας διαφορετικά κύτταρα, η ομάδα μας έχει πρόσφατα προσπάθησε να αναλύσει τον αντίκτυπο των hypergravity και τους κραδασμούς στο συνολικό αποτέλεσμα της τροποποιημένης γονιδιακής έκφρασης κατά τη διάρκεια παραβολικές πτήσεις [47], καθώς και τα πρώτα αποτελέσματα φαίνεται να δείχνουν, ότι ενώ hypergravity και τους κραδασμούς να προκαλέσουν αντίθετα αποτελέσματα από αυτά που των μικροβαρύτητα στα κύτταρα, έλλειψη βαρύτητας είναι η συνολική ισχυρότερο ερέθισμα. Ωστόσο, περισσότερα πειράματα πρέπει να διεξάγονται για να βελτιώσετε τα αποτελέσματα αυτά και πρέπει επίσης να συμπληρωθεί με μακροπρόθεσμες μελέτες. Τα δεδομένα αυτά θα είναι υψηλής σημασίας για το μέλλον πείραμά μας Διαστημικών Πτήσεων (καρκίνος του θυρεοειδούς κύτταρα in Space) στο ISS το Νοέμβριο του τρέχοντος έτους.

Στο σύνολό τους, παρατηρήσαμε μια επίδραση των κραδασμών και hypergravity στην έκφραση γονιδίων του θυρεοειδούς τα καρκινικά κύτταρα. Αξίζει να σημειωθεί ότι, οι δύο τύποι κυττάρων αντέδρασε διαφορετικά. ML-1 κύτταρα εμφανίστηκαν πιο ανθεκτικά κατά των κραδασμών από τα κύτταρα CGTH-W1. Ως εκ τούτου, πειράματα ελέγχου σχετικά με τις κατάλληλες συσκευές φυγοκέντρησης και παλμού είναι απαραίτητο να ερμηνεύουν τα δεδομένα που λαμβάνονται από τα πειράματα μικροβαρύτητας.

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε την κα Heidi Schou Knudsen για την εξαιρετική τεχνική βοήθεια της.