Αφηρημένο

microRNAs (miRNA) καταστέλλουν αγγελιαφόρο RNA μετα-μεταγραφικά μέσω της σύνδεσης με το 3 ‘UTR του mRNA με την περιοχή σπόρο miRNA. Έχει υποτίθεται ότι πλέον οι περιοχές σπόρων έχουν μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα στην καταστολή mRNA. Ελέγξαμε αυτή την υπόθεση με την αξιολόγηση διαφορικής έκφρασης των miRNAs που εμπλέκονται στη ρύθμιση της ανοσολογικής απόκρισης, έναν σημαντικό μηχανισμό σε ορθοκολικό καρκίνο (CRC), με την κατηγορία μήκος σπόρων. Εμείς στη συνέχεια αξιολογείται η διαφορική έκφραση των στόχων αυτών miRNAs »σε κολικό ιστό και την επίδραση αυτών των miRNAs στην CRC επιβίωση. Προσδιορίσαμε συμπληρωματικότητα αλληλουχίας μεταξύ κάθε περιοχής σπόρος miRNA και το 3 ‘UTR του κάθε πειραματικά επαληθευτεί γονιδίου στόχου mRNA. Εμείς κατατάσσονται miRNAs σε ομάδες με βάση τις περιοχές σπόρων που ταιριάζουν τέλεια με ένα mRNA UTR με έξι βάσεις που αρχίζει στη θέση δύο, επτά βάσεις που αρχίζει στη θέση ένα, επτά βάσεις που αρχίζει στη θέση δύο, ή οκτώ βάσεις που αρχίζει στη θέση ένα. Αναλύσαμε τις ομάδες αυτές από την άποψη της διαφορικής έκφρασης των miRNAs μεταξύ καρκίνωμα και φυσιολογικό ορθοκολικό βλεννογόνου, η έκφραση του mRNA του παχέος στόχο διαφορικό, και ο κίνδυνος θανάτου από CRC. Μετά τη διόρθωση για πολλαπλές συγκρίσεις, η αναλογία των miRNAs που σχετίζονται με την έκφραση απόκλιση mRNA ήταν 0% για την 6-μερές, 13,64% για την ομάδα 7α-μερές, 12,82% για την ομάδα 7β-μερές, και 8,70% για το ομάδα 8-Mer. Το ποσοστό των miRNAs που σχετίζονται με την επιβίωση ήταν 20% για την ομάδα 6-μερές, 27,27% για την ομάδα 7α-μερές, 10,23% για την ομάδα 7β-μερές, και 21,74% για την ομάδα 8-μερές. Δεν είδαμε μια γραμμική σχέση μεταξύ του μήκους των σπόρων και των miRNA απορύθμιση της έκφρασης, έκφραση του mRNA, ή την επιβίωση. Τα ευρήματά μας δεν υποστηρίζουν την υπόθεση του σπόρου μήκους της περιοχής και μόνο επιρροές καταστολής mRNA

Παράθεση:. Mullany LE, Herrick JS, Wolff RK, Slattery ML (2016) microRNA Seed Περιφέρεια Μήκος Επιπτώσεις στο στόχο Messenger RNA έκφρασης και επιβίωσης στον Καρκίνο του παχέος εντέρου. PLoS ONE 11 (4): e0154177. doi: 10.1371 /journal.pone.0154177

Επιμέλεια: Geraldo Α Passos, Πανεπιστήμιο του Σάο Πάολο, Βραζιλία

Ελήφθη: 25 του Φεβρουαρίου, 2016? Αποδεκτές: 8 Απριλίου 2016? Δημοσιεύθηκε: 28 Απριλίου, 2016

Copyright: © 2016 Mullany et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Δεδομένα Διαθεσιμότητα:. Σύμφωνα με τα υπογεγραμμένα έντυπα συγκατάθεσης και κατόπιν έγκρισης των συμφωνιών κοινοχρησίας δεδομένων, όπως καθορίζεται από το Πανεπιστήμιο της Γιούτα Institutional Review Board (https://irb.utah.edu/), τα δεδομένα μπορεί να απελευθερωθεί μόνο από τους ερευνητές της μελέτης, για τους σκοπούς της μη εμπορικές, έρευνα για τον καρκίνο του παχέος εντέρου, και πρέπει να είναι σε αποχαρακτηριστούν μορφή. Παρακαλείστε να επικοινωνήσετε με [email protected] σε σχέση με την κοινοχρησία δεδομένων

Χρηματοδότηση:. Η χρηματοδότηση για τη μελέτη αυτή δόθηκε από το Εθνικό Ινστιτούτο Καρκίνου, χορηγεί αριθμούς CA163683 και CA48998. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

τα microRNAs (miRNAs) έχουν όλο και περισσότερο υπό έρευνα για το ρόλο που παίζουν σε βιολογικές διεργασίες, ιδιαίτερα καθότι σχετίζεται με την ανάπτυξη και την εξέλιξη του καρκίνου. Ώριμη miRNAs είναι μικρές (~ 22-23 νουκλεοτίδια μακρύ), ενδογενώς εκφρασμένη, RNA μόρια μη-κωδικοποίησης πρωτεΐνης που ρυθμίζουν μετα-μεταγραφικά αγγελιαφόρο RNA (mRNAs) [1-3]. Κάνουν αυτό με σύνδεση προς το 3 ‘αμετάφραστη περιοχή (UTR) του mRNA και προκαλώντας είτε αποικοδόμηση του mRNA, με πιο ακριβή σύνδεση, ή την αναστολή της μετάφρασης του mRNA, από λιγότερο ακριβής δέσμευσης [4, 5]. MiRNAs είναι σε θέση να ρυθμίζουν πολλά mRNAs ατομικά [4], και περισσότερες από μία miRNA μπορεί να στοχεύσει ένα μεμονωμένο mRNA, δημιουργώντας μια σύνθετη δυναμική των συνεργατικών κανονισμού [6].

Το 2015, η Αμερικανική Αντικαρκινική Εταιρεία αναφέρει ότι του παχέος εντέρου καρκίνο (CRC) είναι η δεύτερη κύρια αιτία του καρκίνου που σχετίζονται με θανάτους στις Ηνωμένες Πολιτείες, όταν άνδρες και γυναίκες εξετάζονται από κοινού, και η τρίτη, όταν αυτά θεωρούνται ξεχωριστά, σκοτώνοντας 100.000 ανθρώπους στις ΗΠΑ κάθε χρόνο [7]. CRC έχει αποδειχθεί ότι είναι μια πολύπλοκη ασθένεια, που περιλαμβάνει πολλές βιολογικές διαδικασίες [8], και ως τέτοιες miRNAs προταθεί ως ρυθμιστές κλειδιά του CRC [9]. Μία κεντρική διαδικασία στην ογκογένεση που έχει προταθεί να εξέχον στην ανάπτυξη και την εξέλιξη του CRC είναι χρόνιας φλεγμονής [10], και ευρύτερα, η συμμετοχή της ανοσολογικής απόκρισης [8, 11]. Οι όγκοι είναι γνωστό ότι είναι ανοσογόνος, κατά το ότι προκαλούν μία ανοσολογική απόκριση [11]. Εκτός από τη ρύθμιση διαφόρων mRNAs στόχευση γονιδίων που εμπλέκονται στην ανοσολογική απόκριση, οι miRNAs εμπλακεί στην διαφοροποίηση των αιμοποιητικών καταγωγών, που παίζουν ένα σημαντικό ρόλο τόσο στην Β και Τ κυτταρικές αποκρίσεις [3].

Ενώ πολλοί παράγοντες μπορούν να συμβάλουν στην miRNA-mRNA δέσμευσης, η πληρότητα με την οποία η miRNA προσδένεται στο mRNA, και το προκύπτον επιπτώσεων η miRNA έχει επί της έκφρασης mRNA, γενικά πιστεύεται ότι καθορίζεται από την αλληλουχία σπόρου στο miRNA [1, 12, 13 ]. Ο ακριβής ορισμός της περιοχής σπόρου είναι κάπως συζητηθεί στη βιβλιογραφία, αλλά γενικά το κανονικό, ή «πυρήνα», περιοχή σπόρων πιστεύεται ότι περιλαμβάνουν μια συνεχόμενη σειρά από τουλάχιστον 6 νουκλεοτίδια που αρχίζει στη θέση δύο [13]. Πιο συγκεκριμένα, οι βασικές σπόροι έχουν περιγραφεί ως ένα 6-mer (βάσεις 2-7), 7-mer ( «7-μερές-Α1″ είναι βάσεις 1-7, και «7-μερές-Μ8″ είναι βάσεις 2- 8), και 8-mer (βάσεις 1-8)? σε ορισμένα σχόλια τα 7-Mer-Α1 και 8-mer σπόροι πρέπει να έχουν μια αδενίνη, «Α», ως το πρώτο νουκλεοτίδιο [1, 13-16]. Ellwanger et al. διαπίστωσε ότι πλέον σπόρους, δηλαδή τους σπόρους της 7 ή 8 νουκλεοτίδια σε μήκος, ήταν πιο εξελικτικά συντηρημένη από μικρότερου μεγέθους [13].

Σε αυτή τη μελέτη, εξετάζουμε ομοιότητα ακολουθίας σπόρων μεταξύ των miRNAs και τις αντίστοιχες επαληθεύεται στόχους τους mRNA που συμμετέχουν στην ανοσολογική απόκριση, και να αξιολογεί διάρκεια των αγώνων σπόρων που σχετίζεται με την έκφραση miRNA σε φυσιολογικό ορθοκολικό βλεννογόνο, ιστό ορθοκολικού καρκινώματος, και διαφορικής έκφρασης, καθώς και επιπτώσεις στην επιβίωση miRNA και του κόλου διαφορική έκφραση mRNA. Αξιολογώντας ένα υποσύνολο των miRNAs, εκείνες που στοχεύουν την ανοσολογική απόκριση, εστιάζουμε την έρευνά μας για miRNAs εμπλέκονται σε φυσιολογικές αντιδράσεις σημαντικό για τον καρκίνο, και να περιορίσει τον αριθμό των αλληλεπιδράσεων αξιολογούμε, για μια πιο στοχευμένη προσέγγιση. Καθώς τα πλέον περιοχές σπόρου αποσκοπούσε να έχουν μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα, δεδομένου ότι σχετίζεται με καταστολή mRNA [1], και πιο ακριβή δεσμευτικό αποτέλεσμα αποικοδόμηση του mRNA, υποθέτουμε ότι miRNAs που δεσμεύονται με στόχο γονίδια με μεγαλύτερη περιοχή σπόρος θα συσχετιστεί περισσότερο σημαντικά με CRC-ειδική επιβίωση και την υποβάθμιση του mRNA.

Υλικά και Μέθοδοι

πληθυσμός μελέτης

τα στοιχεία προέρχονται από τους συμμετέχοντες στη διατροφή, άσκηση, και η μελέτη Lifestyle βασισμένη στον πληθυσμό που είχαν προσληφθεί από Γιούτα ή το Kaiser Permanente Medical Care Πρόγραμμα της Βόρειας Καλιφόρνιας (KPMCP). περιπτώσεις καρκίνου του παχέος εντέρου αναγνωρίστηκαν ως κύρια αδενοκαρκίνωμα διαγνώστηκαν μεταξύ 1ης Οκτωβρίου 1991 και 30 Σεπτεμβρίου 1994, ενώ οι περιπτώσεις καρκίνου του ορθού, διαγνώστηκαν μεταξύ Μαΐου 1997 και Μαΐου 2001. Όλες οι επιλέξιμες περιπτώσεις ήταν μεταξύ 30 και 79 ετών κατά τη διάγνωση, που ζουν σε η περιοχή μελέτης, μιλούσε αγγλικά, ήταν σε θέση να ολοκληρώσει μια συνέντευξη και δεν είχαν προηγούμενο ιστορικό CRC, η νόσος του Crohn, η ελκώδης κολίτιδα, ή είναι γνωστό οικογενή αδενωματώδη πολυποδίαση. Η μελέτη αυτή εγκρίθηκε από το Διοικητικό Συμβούλιο Institutional Review στο Πανεπιστήμιο της Γιούτα? όλοι οι συμμετέχοντες υπέγραψαν έντυπο συγκατάθεσης.

Επεξεργασία miRNA

Το RNA που εξάγεται από φορμόλη σταθερό παραφίνη παραφίνη ιστούς και υποβάλλονται σε επεξεργασία όπως περιγράφηκε προηγουμένως [17]. 100 ng ολικού RNA σημάνθηκε με Cy3 και υβριδοποιήθηκε σε Agilent Ανθρωπίνων miRNA μικροσυστοιχίες V19.0 και σαρώθηκαν σε ένα Agilent SureScan μικροσυστοιχιών μοντέλο σαρωτή G2600D χρησιμοποιώντας Agilent v.11.5.1.1 Χαρακτηριστικό λογισμικού Απόσπασμα. Τα δεδομένα που απαιτούνται για να περάσει αυστηρές παραμέτρους QC ιδρύθηκε από Agilent, που περιλάμβαναν δοκιμασίες για υπερβολική φθορισμό υποβάθρου, η υπερβολική διακύμανση μεταξύ αλληλουχία του ανιχνευτή αναπαράγει στη συστοιχία, και τα μέτρα του συνολικού σήματος γονιδίου στη συστοιχία να αξιολογήσει χαμηλό σήμα. Αν τα δείγματα δεν πληρούν τις προδιαγραφές, QC, το δείγμα επαναλήφθηκε, και αν ένα δείγμα απέτυχε εκτίμηση QC για δεύτερη φορά το δείγμα θεωρείται ότι είναι κακής ποιότητας και αποκλείστηκε από κατάντη ανάλυση. Η πλατφόρμα Agilent βρέθηκε να είναι ιδιαίτερα αξιόπιστη (r = 0.98), να έχει λογική συμφωνία με NanoString [18], καθώς και εξαιρετική συμφωνία με qRT-PCR (Pellatt, in press). Για αταίριαστα δείγματα λόγω της απουσίας κανονικές σαρώσεις, εμείς τεκμαρτές τιμές για την κανονική βλεννογόνο όπως περιγράφηκε προηγουμένως στο [19]. Για να ελαχιστοποιηθούν οι διαφορές που θα μπορούσαν να αποδοθούν στη συστοιχία, ποσότητα του RNA, τη θέση σε συστοιχία, ή άλλους παράγοντες που θα μπορούσαν εσφαλμένα να επηρεάσει την έκφραση, συνολικό σήμα γονίδιο ομαλοποιήθηκε πολλαπλασιάζοντας κάθε δείγμα από ένα συντελεστή κλίμακας η οποία ήταν η διάμεση τιμή της 75

th εκατοστημόριο όλων των δειγμάτων διαιρείται με το 75

ο εκατοστημόριο του κάθε δείγματος [20]. Αυτός ο παράγοντας κλιμάκωσης υλοποιήθηκε χρησιμοποιώντας SAS 9.4.

mRNA αλληλουχίας Βιβλιοθήκη Παρασκευής, αλληλουχίας, και Επεξεργασία Δεδομένων

κατασκευή της βιβλιοθήκης RNA έγινε με την Illumina TruSeq Stranded ολικό RNA δείγματος Προετοιμασία Kit με ριβο-Zero . Τα δείγματα στη συνέχεια κατακερματισμένη και γεμάτοι για σύνθεση cDNA, προσαρμογείς στη συνέχεια συνδέθηκαν πάνω στο cDNA, και τα προκύπτοντα δείγματα στη συνέχεια ενισχύθηκε χρησιμοποιώντας PCR? το ενισχυμένο βιβλιοθήκη στην συνέχεια καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας σφαιρίδια Agencount AMPure XP. Μια πιο λεπτομερής περιγραφή των μεθόδων που μπορεί να βρεθεί σε προηγούμενες εργασίες μας [21].

αλληλουχίας έγινε με τη χρήση απλού κυττάρου ροής διαβάσετε ένα Illumina TruSeq v3 και 50 κύκλων τρέξιμο και μόνο ανάγνωση ακολουθία πραγματοποιήθηκε σε ένα Illumina όργανο HiSeq. Διαβάζει στη συνέχεια ευθυγραμμισμένα σε μια βάση δεδομένων ακολουθίας που περιέχει το ανθρώπινο γονιδίωμα (build GRCh37 /hg19, Φεβρουαρίου 2009 genome.ucsc.edu) και ευθυγράμμιση έγινε χρησιμοποιώντας novoalign v2.08.01. Python και μια βιβλιοθήκη pysam χρησιμοποιήθηκαν για τον υπολογισμό μετρήσεις για κάθε εξόνιο και UTR των γονιδίων χρησιμοποιώντας μια λίστα των γονιδίων συντεταγμένες που λαμβάνονται από https://genome.ucsc.edu. Θα πέσει χαρακτηριστικά που δεν εκφράστηκαν σε δεδομένα μας ή για τους οποίους έλειπε η έκφραση για την πλειοψηφία των δειγμάτων. Μια πιο λεπτομερής περιγραφή των μεθόδων που μπορεί να βρεθεί σε προηγούμενες εργασίες μας [21].

Βιοπληροφορική ανάλυση

Ο κατάλογος των γονιδίων mRNA που λήφθηκε από Ensembl χρησιμοποιώντας το εργαλείο Biomart Ensembl, χρησιμοποιώντας την έκδοση χαρτογραφηθεί σε ανθρώπινο γονιδίωμα GRCh38. Ζητήσαμε μια λίστα Ensembl Gene ταυτοτήτων και των συνδεδεμένων Gene Ονόματα που είχε τον όρο χαρακτηριστικό GO «ανοσολογική απόκριση». Αυτό έδωσε μια λίστα με 1.762 Ensembl αναγνωριστικά, που αντιστοιχούν σε 1.355 μοναδικά ονόματα γονίδιο. Ο κατάλογος των ενώσεων miRNA γονιδίων στη συνέχεια δημιουργήθηκε χρησιμοποιώντας το αποθετήριο Homo sapiens από miRTarBase, η οποία χρησιμοποιεί miRBase 21. miRNAs που σχετίζονται με τα γονίδια που βρέθηκαν στη λίστα «ανοσολογική απόκριση» και πειραματικά επαληθεύεται είτε με το «δοκιμασία ρεπόρτερ», «qRT -PCR «, ή» κηλίδα western «, όπως οι μέθοδοι αυτές θεωρούνται ισχυρότερη από miRTarBase, αναλύθηκαν περαιτέρω. Αυτοί οι περιορισμοί απέδωσε 1.413 ενώσεις miRNA-στόχος περιλαμβάνει 395 μοναδικά γονίδια »του ανοσοποιητικού Response» και 327 μοναδικά miRNAs. Η πλατφόρμα Agilent αντιστοιχεί σε miRBase 19 ονοματολογίας, καθώς και από τη χρήση αυτής της έκδοσης για το αλληλουχιών FASTA μπορούμε να δούμε που τρέχουσας αλληλουχίες που εκφράζονται διαφορικά σε σύνολο δεδομένων μας. Όπως miRTarBase v6.0 βασίζεται στα ανοικτά της miRBase 21, αυτό μας επιτρέπει να γνωρίζουμε τις πιο πρόσφατες ενώσεις, και μόνο αυτά τα miRNAs που ταιριάζουν στο όνομα μεταφέρθηκαν στην ανάλυση. αλληλουχίες FASTA UTR MRNA 3 ‘ελήφθησαν για τα γονίδια που ελέγχθηκαν στόχοι για miRNAs από Biomart Ensembl του? εφαρμόσαμε μια απαίτηση φίλτρο «CCDS ID» προκειμένου να ληφθεί μόνο ακολουθίες συναίνεσης. περιοχές Seed δημιουργήθηκαν για κάθε miRNA υπολογίζοντας το αντίστροφο συμπλήρωμα των νουκλεοτιδίων DNA 2-7, 1-7, 2-8, ή 1-8 του 5 ‘άκρου του miRNA να κάνει το 6-μερές, 7α-mer ( που ονομάζεται επίσης 7-μερές-Α1 στη βιβλιογραφία), 7β-mer (ονομάζεται επίσης 7-μερές-M8 στη βιβλιογραφία), και 8-μερές σπόρους αντίστοιχα. Στη συνέχεια έψαξαν το 3 ‘UTR του mRNA που πειραματικά επαληθευτεί να θέτει ως στόχο την miRNA από το οποίο είχαν παραχθεί για κάθε ένα από τις αλληλουχίες σπόρων. MiRNAs που συνέβησαν σε μία μόνο κατηγορία σπόρων έγιναν για την ανάλυση? Αυτό έγινε για να πολώσει τα ευρήματα καθώς και να μειώσει ασάφεια στην τεκμαιρόμενη ενώσεις miRNA γονιδίων. Ένα διάγραμμα της διαδικασίας αυτής μπορεί να φανεί στο Σχήμα 1. Οι τελικές ομάδες miRNA αποτελούνταν από 99 miRNAs: 15, 22, 39, και 23 miRNAs για 6-μερές, 7α-μερές, 7β-μερές, και 8-μερές σπόρους αντίστοιχα. Ο αριθμός των miRNAs που αντιστοιχούν σε κάθε ομάδα μπορεί να φανεί στο Σχήμα 2. Μετά τον προσδιορισμό των miRNAs ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο μεταξύ της κανονικής ορθοκολικό βλεννογόνο και ιστού ορθοκολικού καρκινώματος, ταυτοποιήσαμε ένα νέο σύνολο γονιδίων στόχων για τις εν λόγω miRNAs. Η λίστα που προκύπτει δεν ήταν «ανοσολογική απόκριση»-ειδικά, αν και το έκανε περιλαμβάνουν γονίδια «ανοσολογική απόκριση», όπως τα miRNAs in vivo θα ήταν πιθανόν να μην περιορίσουν τη δράση τους σχετικά με τα mRNAs που στοχεύουν. Τα γονίδια αυτά στην συνέχεια αναλύονται, όπως περιγράφεται κατωτέρω, για τις ενώσεις με τις αντίστοιχες miRNAs στόχευση τους να διερευνήσει περαιτέρω την επίδραση των σπόρων τύπου δεσμευτικές για την έκφραση του mRNA.

Η

Στατιστικές Μέθοδοι

Το δείγμα μας αποτελούνταν από 1893 άτομα με επίπεδα έκφρασης των miRNAs τόσο για καρκίνωμα και φυσιολογικούς ιστούς βλεννογόνου. Συγκρίναμε συνδεθείτε βάσης 2 μεταμορφωθεί επίπεδα έκφρασης των miRNAs μεταξύ των αξιόπιστων ιστού καρκινώματος και φυσιολογικό ορθοκολικό βλεννογόνο συνολικά, στρωματοποιημένη από τη μελέτη με τη χρήση της ανάλυσης σημασία των μικροσυστοιχιών (SAM) τεχνική στα siggenes πακέτο R [22]. P-τιμές που παράγεται από SAM βασίστηκαν 1.000 μεταθέσεις με ποσοστό εσφαλμένης ανακάλυψη (FDR) ορίζεται σε & lt? 0.05 [23]. Αναλύσαμε τις τέσσερις περιοχές σπόρο, 6-mer, 7α-μερές, 7β-μερές, και 8-μερή, από κοινού. Για εκείνα τα miRNAs που ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο, αναφέρουμε το μέσο επίπεδο της έκφρασης και την πολλαπλή μεταβολή (σε μη-log μετασχηματισμένων δεδομένων) μεταξύ του ιστού καρκινώματος του παχέος εντέρου και του παχέος κανονική βλεννογόνο.

Στη συνέχεια, εξετάσαμε την επίδραση της διαφορική έκφραση των miRNAs στην επιβίωση με χρήση του μοντέλου Cox proportional κινδύνους στο 1855 άτομα με δεδομένα επιβίωσης διαθέσιμα. Υπολογίσαμε αναλογίες κινδύνου (HR) και τα αντίστοιχα διαστήματα εμπιστοσύνης 95% (CI) με τη μονάδα της αλλαγής είναι η διατεταρτημοριακό εύρος (IQR), την προσαρμογή για την ηλικία, το φύλο και το στάδιο AJCC συνολικό καθώς και στρωματοποιημένη από τη μελέτη και το στάδιο. Δοκιμάσαμε CRC-ειδική επιβίωση βασίζεται μήνες μεταξύ της ημερομηνίας διάγνωσης και θανάτου ή τελευταία παρακολούθηση ημερομηνία. Τα άτομα που πεθαίνουν από άλλες αιτίες ή που χάθηκαν κατά την παρακολούθηση είχαν λογοκριθεί κατά τη στιγμή του θανάτου τους ή την ημερομηνία της τελευταίας επαφής. Η επιβίωση πακέτο R χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό ρ-τιμές βασίζονται 10000 παραλλαγές της δοκιμής λόγου πιθανότητας. Επειδή μια σειρά από miRNAs ήταν σπάνια εκφράζεται, η οποία ορίσαμε ως έκφραση σε λιγότερο από το 50% των ασθενών, υπολογίσαμε το HR για αυτές τις miRNA με βάση την κάθε έκφραση χωρίς τη χρήση μεταθέσεων για τον υπολογισμό των p-τιμές σε SAS 9.4 (SAS Institute, Cary , NC). Συνδυάσαμε τις p-τιμές τόσο των πιο συχνά εκφράζεται miRNAs και τα σπάνια εκφράζονται miRNAs και προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας ένα FDR 0.05.

Τέλος, εξετάστηκε η σχέση μεταξύ διαφορικά εκφρασμένων miRNAs και των αντίστοιχων στόχων τους mRNA γονιδίων με την αξιολόγηση των 302 συνδυασμών προσδιορίζονται στο miRTarBase με τη μέθοδο που περιγράφεται παραπάνω για το υποσύνολο των 148 ασθενών με δεδομένα mRNA διαθέσιμα. Εμείς παράγεται γραμμικά μοντέλα παλινδρόμησης με προσαρμογή για την ηλικία και το φύλο σε 1.000 εκκίνησης [24] δείγματα. Υπολογίσαμε την έκφραση mRNA διαφορά ως η διαφορά της βάσης καταγραφής 2 του RPKM (Διαβάζει ανά κιλοβάσεων ανά εκατομμύριο) για το καρκίνωμα και φυσιολογικούς ιστούς βλεννογόνου. Ρ-τιμές παρήχθησαν από την κατανομή των συντελεστών β για κάθε miRNA και αξιολόγησης H

0: β = 0 vs. H

1: β ≠ 0 χρησιμοποιώντας το πακέτο εκκίνησης στο R. Εμείς προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις χρησιμοποιώντας ένα επίπεδο FDR 0,05. Έχουμε τυποποίησε τις πλαγιές που παράγεται από το συνολικό σύνολο δεδομένων, προκειμένου να συγκριθούν τα αποτελέσματα σε όλη την miRNA.

Αποτελέσματα

Μια γενική περίληψη των miRNAs που περιλαμβάνονται στις αναλύσεις και εξαιρούνται από την ανάλυση μετά την παραγωγή σπόρων προς σπορά μπορεί να να βρεθούν στον πίνακα S1.

Σαράντα τρία miRNAs ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο μεταξύ φυσιολογικών ιστών παχέος βλεννογόνο και ορθοκολικό καρκίνωμα (Πίνακας 1). Εκτός από αυτές που εκφράζονται διαφορικά για τον ορθοκολικό καρκίνο, τρία miRNAs εκφράστηκαν διαφορικά για μόνο καρκίνο του παχέος εντέρου και τρεις εκφράζονται διαφορικά μόνο για τον καρκίνο του ορθού. Από τις 49 συνολικές απορυθμισμένη miRNAs, 18 ήταν ρυθμισμένη προς τα πάνω και 31 προς τα κάτω σε ιστό καρκινώματος σε σχέση με την κανονική του παχέος βλεννογόνο. Έξι από τα miRNAs ταξινομήθηκαν ως 6-mer δεσμευτική, 12 ταξινομήθηκαν ως 7α-mer, 19 ως 7β-mer, και 12 ως 8-μερή. Δεκαέξι από αυτά τα miRNAs είχε μια φορές αλλαγή ≥1.5 ή ≤0.67 αντιπροσωπεύεται από ένα 6-mer, τέσσερις 7α-μερή, τέσσερις 7β-μερή, και επτά 8-μερή.

Η

Δεκαοκτώ miRNAs ήταν σημαντικά που συνδέονται με αλλοιωμένη επιβίωση? 17 από αυτά τα miRNAs συσχετίστηκαν με την επιβίωση μετά τη διάγνωση με καρκίνο του ορθού και ένα συσχετίστηκε με τη συνολική επιβίωση CRC μετά την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις (Πίνακας 2). Από τα 18 miRNAs που συνδέθηκαν με αλλοιωμένη επιβίωση, 15 επίσης ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο μεταξύ της κανονικής ορθοκολικό βλεννογόνο και ιστός ορθοκολικού καρκινώματος. Δεν miRNAs μεταβληθεί η επιβίωση μόνο για τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Τρία από αυτά τα miRNAs ταξινομήθηκαν ως 6-μερή, πέντε ως 7α-μερή, τέσσερα ως 7β-μερή, και τρεις ως 8-μερή.

Η

Δεκαεννέα miRNAs συσχετίστηκαν με την έκφραση των γνωστών στοχευμένων mRNAs τους (Πίνακας 3)? 12 από αυτούς παρέμεινε σημαντική μετά από προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις. Από αυτά τα 12, έξι miRNAs ήταν αντιστρόφως ανάλογα με την έκφραση στοχευμένες mRNA και έξι συνδέονταν άμεσα με την έκφραση στοχευμένες mRNA. Από τα miRNAs που έδειξε μια άμεση συσχέτιση με διαφορική έκφραση των mRNAs, το ένα ταξινομήθηκε ως 7α-μερές, δύο ως 7β-μερή, και τρεις ως 8-μερή. Των miRNAs που έδειξε μια αντίστροφη συσχέτιση με διαφορική έκφραση του mRNA δύο ταξινομήθηκαν ως 7α-μερή και τέσσερα ταξινομήθηκαν ως 7β-μερή.

Η

Μια περίληψη του αριθμού των miRNAs σημαντικά διαφορικά εκφρασμένων, που συνδέονται με την κίνδυνο θανάτου από ορθοκολικό ή καρκίνο του ορθού, και συνδέονται με διαφορική έκφραση του mRNA παρουσιάζονται για κάθε κατηγορία σπόρων στον πίνακα 4. Ενώ η ομάδα σπόρων 7α-mer είχε το υψηλότερο ποσοστό των miRNAs σε κάθε στατιστικό τεστ, τα ποσοστά για κάθε κατηγορία ήταν πολύ κοντά, γεγονός που υποδηλώνει καμία πραγματική διαφορά στις αναλογίες. Καθώς ο συνολικός αριθμός των miRNAs σε κάθε κατηγορία είναι σχετικά μικρό, ένα ή δύο miRNAs θα μπορούσε να εξηγήσει τη διαφορά στην αναλογίες.

Η

Η επικάλυψη των miRNAs αντιπροσωπεύονται από κάθε μια από τις αναλύσεις μπορεί να φανεί στο Σχήμα 3. Από αυτό το διάγραμμα, βλέπουμε ότι μόνο τέσσερα miRNAs ήταν σημαντικά διαφορικά εκφραζόμενο, συνδέθηκαν με αλλοιωμένη επιβίωση, και συσχετίστηκαν σε σημαντικό βαθμό με την έκφραση mRNA αλλαγμένη μετά την προσαρμογή για πολλαπλές συγκρίσεις. Από αυτά τα τέσσερα miRNAs, δύο ταξινομήθηκαν ως 8-μερή, το ένα ως 7β-μερές, και μία ταξινομήθηκε ως 7α-μερές. Μόνο ένα από αυτά τα τέσσερα, HSA-miR-150-3p, σχετίστηκε αντίστροφα με την έκφραση του mRNA, τα υπόλοιπα ήταν άμεσα συνδεδεμένες.

Η

Συζήτηση

Πολλοί miRNAs σε αυτή τη μελέτη ήταν διαφορικά που εκφράζεται μεταξύ ιστού ορθοκολικού καρκινώματος και φυσιολογικό ορθοκολικό βλεννογόνου, συσχετίστηκαν με αλλοιωμένη κίνδυνο θανάτου από είτε CRC ή καρκίνο του ορθού, ή συνδέθηκαν με διαφορική έκφραση του κόλου mRNA. Τέσσερα από αυτά τα miRNAs βρέθηκαν να έχουν σημαντικές ενώσεις και στις τρεις δοκιμασίες. Υποθέσαμε ότι, επειδή πλέον περιοχές σπόρου έχουν μια μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα της καταστολής mRNA και πιο ακριβή δεσμευτικό αποτέλεσμα αποικοδόμηση του mRNA, ότι οι μακρύτερες περιοχές σπόρος θα συνδεόταν περισσότερο με διαφορική έκφραση mRNA καθώς και τον κίνδυνο CRC. Σε γενικές γραμμές, η ομάδα σπόρος 7α-μερές, το οποίο αποτελείται από miRNAs με σπόρους που περιλαμβάνει τα νουκλεοτίδια 1-7, είχε περισσότερο σημαντικά ευρήματα από την άποψη του πόσα miRNAs που ανήκουν σε κάθε κατηγορία συσχετίστηκαν είτε με διαφορική έκφραση miRNA, mRNA διαφορική έκφραση ή την επιβίωση. Ωστόσο, καθώς τα ποσοστά είναι αρκετά κοντά για όλες τις ομάδες, είναι πιθανό ότι αυτό το εύρημα δεν είναι στατιστικά διαφορετική. Επιπλέον, δεν υπήρχε γραμμική τάση, δηλαδή αριθμός από 6-σπόρο & lt? αριθμό από 7α /β-σπόρους & lt? αριθμό από 8-σπόρους ή αντίστροφα, με το ποσοστό των miRNAs από κάθε ομάδα σπόρος που ήταν σημαντική, με διαφορική έκφραση του mRNA ή με την επιβίωση. Αυτό υποδηλώνει ότι η διάρκεια των σπόρων μόνο, τουλάχιστον όπως ορίζεται στην παρούσα μελέτη, δεν συνδέεται είτε με mRNA διαφορική έκφραση μεταξύ των ιστών καρκινώματος κόλου και φυσιολογικό βλεννογόνο του κόλου ή με κίνδυνο θανάτου από CRC. Υπήρξε μια μικρή γραμμική τάση στην διαφορική έκφραση των miRNAs με αναδιπλούμενη αλλαγές ≥1.5 ή ≤0.67 καθότι σχετίζεται με τους σπόρους μήκους της περιοχής, με διαδοχικά περισσότερα miRNAs που διαφορικά εκφράζονται ως αυξημένο μήκος περιοχής σπόρων. Αυτό, ωστόσο, δεν είναι πιθανό να είναι βιολογικά σημαντική.

Αντίθετα με καθιερωμένες ρόλο τους ως καταστολείς, miRNAs έχουν δειχθεί πρόσφατα να ενεργοποιήσει μετάφραση mRNA όταν κύτταρα είναι σε κατάσταση ηρεμίας [25]. Συγκεκριμένα, εξωγενείς HSA-ας-7 έδειξε να αυξάνει

HMGA2

μετάφραση όταν προστίθενται σε (ηρεμίας), κύτταρα HeLa ορό πεινασμένο. Στη μελέτη μας παρατηρήθηκε αυξημένη έκφραση του HSA-ας-7d-5P στον ιστό ορθοκολικού καρκινώματος σε σύγκριση με την κανονική του παχέος βλεννογόνο, και μια άμεση συσχέτιση μεταξύ της HSA-ας-7f-5P και

HGMA2

έκφρασης (β = 0,16, P

adj = 0,032), υποδεικνύοντας μια επακόλουθη αύξηση στο

HGMA2

έκφρασης σε ιστό καρκινώματος. HSA-ας-7d-5P κατηγοριοποιείται ως δεσμευτική miRNA στη δέσμη στοιχείων μας 7β-Mer. Καθώς αυτή η δυναμική, στο παρελθόν ήταν δει σε αδρανή κύτταρα, μπορεί να είναι ότι τα άτομα που εκφράζουν υψηλότερα επίπεδα της HSA-ας-7d-5P και

HMGA2

έχουν περισσότερα κύτταρα που βρίσκονται σε λανθάνουσα κατάσταση. Είδαμε αναρρύθμιση του HSA-miR-196a-5P και HSA-miR-196b-5P σε ιστό ορθοκολικού καρκινώματος σε σύγκριση με την κανονική του παχέος βλεννογόνο? μπορούμε στη συνέχεια είδε μια άμεση σχέση με HSA-miR-196a-5P και

HOXB7

και HSA-miR-196b-5P με

HOXA10

στον ιστό του παχέος καρκίνωμα. Οι ίδιες σχέσεις μεταξύ αυτών των miRNAs και mRNAs παρατηρήθηκαν σε ασθενείς με νόσο του Huntington, σε σύγκριση με την κανονική εγκεφάλους [26]? Η μελέτη αυτή αποδίδεται αυτό που παρατηρείται δυναμική ανώμαλης επεξεργασίας του mRNA. Καθώς αυτή η μελέτη προσδιορίζει ένα κλειδί μονοπάτι εμπλουτίζεται από αυτά τα γονίδια ως «Ο θάνατος των κυττάρων και την επιβίωση», που βρέθηκαν χρησιμοποιώντας ΙΡΑ, θα μπορούσε να είναι ότι αυτή η σχέση είναι ανορθόδοξη λόγω μεταβολών στη αυτής της οδού. Φωσφατάση και tensin ομόλογο, ή

ΡΤΕΝ

, κωδικοποιεί για ένα ένζυμο που βρίσκεται σε πολλά των ιστών του σώματος και ενεργεί για την αναστολή της ανεξέλεγκτης ανάπτυξης, λειτουργώντας έτσι ως καταστολέας όγκου [27]. Το γονίδιο αυτό συνδέεται άμεσα με HSA-miR-425-5p, το οποίο αυξήθηκε σε ιστό καρκινώματος (πάσο αλλαγή = 1,79, P-value & lt? 0,0001). Πάνω έκφραση της HSA-miR-425-5p σε ορθοκολικό καρκίνωμα συσχετίστηκε με μειωμένο κίνδυνο θανάτου από καρκίνο του ορθού (ΙΟΚ Σειρά HR 0,84 95% CI 0,74, 0,95 P

adj = 0.0354). Καθώς αυτή η miRNA συνδέθηκε με αυξημένη έκφραση του

ΡΤΕΝ

σε ιστό κόλου (β = 0,25, Ρ

adj = 0.024), και η διαφορική έκφραση αυτής miRNA ήταν παρόμοια για παχέος εντέρου και του ορθού ιστός, είναι δυνατόν ότι μια παρόμοια ένωση με ΡΤΕΝ θα φανεί σε πρωκτικές ιστό. Η αλλαγμένη κίνδυνο εμφάνισης καρκίνου του ορθού θα μπορούσε, επομένως, να επηρεαστούν από την ικανότητα PTEN να καταστείλει ανεξέλεγκτη ανάπτυξη.

Ένας περιορισμός είναι ότι εμείς αξιολογούνται τα δεδομένα mRNA μόνο ιστό του παχέος εντέρου. Ενώ έχουμε δείξει ότι απορύθμιση των miRNA είναι παρόμοια για παχέος εντέρου και του καρκίνου του ορθού [18], είναι άγνωστο αν ο απορύθμιση του mRNA είναι η ίδια για πρωκτική και του παχέος εντέρου. Ωστόσο, εάν είναι, είναι ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι, μεταξύ των miRNAs που σχετίζονται τόσο με αλλαγμένη επιβίωσης μετά τη διάγνωση με καρκίνο του ορθού και mRNA έκφραση σε ιστό του παχέος εντέρου, εκείνοι που αυξημένη επιβίωση (HSA-miR-192-5p, HSA- miR-30e-5P, HSA-miR-425-5p, HSA-miR-142-3p, και HSA-miR-196b-5P) είχε άμεση ενώσεις με την έκφραση του mRNA (β & gt? 0) και εκείνων που αυξημένο κίνδυνο θανάτου από καρκίνο (HSA-miR-486-5p και HSA-miR-150-3p) είχε μια αντίστροφη συσχέτιση με την έκφραση του mRNA (β & lt? 0). Ως ηρεμία κύτταρο δεν διαιρούνται ανεξέλεγκτα, είναι πιθανό ότι αυτή η σχέση μεταξύ miRNAs και ενεργοποίηση mRNA σε αδρανή κύτταρα συμβάλλει στην βελτίωση της επιβίωσης σε αυτά τα θέματα, ωστόσο, όπως μερικά από αυτά τα γονίδια έχουν ογκογόνες ιδιότητες (

MYC

,

ΜΥΒ

, και

IGF1R

) ή σχετίζονται με τη μεταγραφή του DNA και την κυτταρική διαφοροποίηση (

KAT2B

,

HOXB7

,

HOXB8

,

HOXA7

,

HOXA9

, και

HOXA10

) είναι πιθανόν ότι πολλοί παράγοντες επηρεάζουν την συνολική γονιδιακή έκφραση στο κύτταρο και την επακόλουθη επίδραση στην επιβίωση. Επίσης, επειδή όλα τα miRNAs που συνδέονται με αλλοιωμένη κινδύνου και η έκφραση του mRNA είναι από διαφορετικές ομάδες σπόρων, είναι απίθανο ότι η σύνδεση μόνη σπόρων συμβάλλει σε αυτή την εμφάνιση.

Αυτή η μελέτη αξιολογεί μόνο CRC ιστού. Ενώ πιστεύουμε ότι οι περιοχές σπόρος πρέπει να συμπεριφέρονται παρόμοια σε άλλους ιστούς, η έκφραση miRNA έχει δειχθεί ότι είναι ειδικό ιστό και αυτό μπορεί να περιορίσει τη γενίκευση των ευρημάτων αυτών, όπως εφαρμόζεται σε άλλους τύπους ιστών. Υπάρχουν πολλοί πιθανοί παράγοντες που μπορεί επίσης να επηρεάσει δεσμευτική miRNA-mRNA. Όπως ήμασταν ενδιαφέρονται για το πώς μήκους περιοχή σπόρου επηρεάζονται δεσμευτική, η έκφραση του mRNA, και την επιβίωση σε ασθενείς με CRC miRNA, υπάρχουν κάποια δυνητικά σχετικών στοιχείων που δεν είχαμε εξετάσει σε αυτή τη μελέτη. Αυτές οι επιδράσεις στις δεσμευτικές miRNA-mRNA περιλαμβάνουν: άλλα στοιχεία microRNA-αναγνώρισης (MRes), σύνθεση ΑΕ και AU-πλούσια στοιχεία (Άρη) και άλλες επιρροές για την προσβασιμότητα χώρο, 3 ‘(του miRNA) αντισταθμιστικής δέσμευσης, το περιεχόμενο GC του σπόρου περιοχή, αν η ακολουθία σπόρος διατηρείται, και την απόσταση από το κωδικόνιο τερματισμού μέσα και τοποθεσία κοντά στο τέλος του 3 ‘UTR του mRNA [1, 2, 15, 28]. Επιπλέον, μπορεί να είναι ότι κάποιες miRNAs αλληλεπιδρούν πρωταρχικά με mRNAs μέσω ‘άκρο τους 3, ή εμφανίζουν μη κανονικές θέσεις σύνδεσης (που μερικές φορές είναι στη βιβλιογραφία που απεικονίζεται ως σπόροι που είναι 6 νουκλεοτίδια μακρύ αντί για 7 ή 8), που εκδηλώνεται με εξογκώματα ή μονού νουκλεοτιδίου θηλιές στις περιφέρειες των σπόρων, ή να δεσμεύσει στη μεσαία περιοχή του miRNA [16]. Αυτές οι παραλλαγές miRNA-mRNA σύνδεση δεν διερευνήθηκαν σε αυτή τη μελέτη, και καθώς ορισμένες τέτοιες αλληλεπιδράσεις μπορεί να χαθεί. Τέλος, όπως αναφέρθηκε προηγουμένως, η 7α-mer (περιγράφεται αλλού ως 7-μερές-Α1) και 8-μερές σπόροι είναι σε μερικές μελέτες που απεικονίζονται ως εκείνα τα οποία έχουν αδενίνη σε θέση ένα. Εμείς δεν υπολόγισε περιοχές σπόρων με αυτόν τον τρόπο, αντί βρήκαμε ακριβή, Watson-Crick, αγώνες μεταξύ τους σπόρους των miRNAs και mRNA. Επειδή αυτή η διάκριση αυτή εφαρμόζεται συνήθως με την πρόβλεψη-στόχο mRNA, και κοιτάξαμε μόνο για τους αγώνες των σπόρων σε mRNAs που επαληθεύονται πειραματικά ως στόχοι για miRNAs που εκφράστηκαν διαφορικά, δεν αισθάνονται ότι αυτό είναι ένα βάρος για την έρευνά μας. Μερικά από τα miRNAs, εκείνοι που αρχίζουν με μια ουρακίλη, έχουν συμπληρωματικές ακολουθίες αρχίζουν με μια αδενίνη, και ως τέτοιο σύνολο δεδομένων μας περιλαμβάνει ορισμένα 7α-μερή και 8-μερή που κάνουν ακολουθούν αυτό το πρότυπο, και άλλοι που ακολουθούν την ευρύτερη αντιστοίχιση Watson-Crick . Η προσέγγιση που πήραμε κατά την εξέταση ομοιότητες περιοχή σπόρων κοίταξε τέλειο ταίριασμα και εκ προθέσεως πολωμένο το σύνολο δεδομένων αναλύοντας μόνο τα miRNAs που εμφανίζονται σε μία κατηγορία σπόρων. Ενώ αυτό έγινε προκειμένου να περιοριστούν οι συγκρίσεις και να κάνουν την ερμηνεία των αποτελεσμάτων ευκολότερη, θα μπορούσε να είναι ότι η προσέγγιση αυτή δεν είναι κατάλληλη για την επιθυμητή ανάλυση. Είναι πιθανό ότι μια προσέγγιση που καθορίζει μια συναινετική αλληλουχία ή αλληλουχίες και επιτρέπει miRNAs να είναι σε πολλές ομάδες θα είναι καλύτερη και θα ενθαρρύνει και άλλες μελέτες για να εξετάσει αυτό.

Συμπεράσματα

Υποθέσαμε ότι οι miRNAs που ανήκουν στις πλέον ομάδες σπόρων, δηλαδή εκείνες στις 7 και 8-σπόρος κατηγορίες, θα αποτελούν την πλειοψηφία των ευρημάτων για διαφορική έκφραση του mRNA, καθώς και για την επιβίωση, λόγω της ικανότητάς τους προτείνονται για καταστολή mRNA. Ενώ πολλοί miRNAs εκφράστηκαν διαφορικά μεταξύ του ιστού καρκινώματος και φυσιολογικό ορθοκολικό βλεννογόνου, συνδέθηκαν με κίνδυνο θανάτου μετά από μια διάγνωση με καρκίνο του ορθού, ή συνδέθηκαν με διαφορική έκφραση του mRNA, σπόρους μήκους περιοχή δεν επηρεάζουν αυτές τις ενώσεις. Τα ευρήματά μας θα μπορούσε να επηρεαστεί από τον τρόπο με τον οποίο θα καθορίζεται περιοχής σπόρων που miRNAs να συμπεριλάβει στην ανάλυση. Βρήκαμε ότι miRNAs που συνδέονται άμεσα με την έκφραση του παχέος mRNA αυξημένη επιβίωση από τον καρκίνο του ορθού, καθώς και εκείνα που είχαν αντίστροφα με έκφραση του παχέος mRNA αυξημένο κίνδυνο θανάτου από CRC. Λόγω του μικρού αριθμού των miRNAs που σχετίζονται με CRC επιβίωση, ενθαρρύνουμε άλλες μελέτες για να διερευνήσει τη δυναμική αυτή.

Υποστήριξη Πληροφορίες

S1 πίνακα. Περίληψη των miRNA αποτελεσμάτων και της περιοχής σπόρων ομάδα

doi:. 10.1371 /journal.pone.0154177.s001

(DOCX)

Ευχαριστίες

Το περιεχόμενο αυτού του χειρογράφου είναι αποκλειστικά η ευθύνη των συγγραφέων και δεν εκφράζουν κατ ‘ανάγκη την επίσημη άποψη του Εθνικού Ινστιτούτου Καρκίνου. Θα θέλαμε να αναγνωρίσουμε Δρ Bette Caan και το Kaiser Permanente Πρόγραμμα Ιατρικών Ερευνών για τη συμβολή του δείγματος, Erika Wolff και ο Michael Hoffman για την επεξεργασία miRNA, Brett Milash και της Βιοπληροφορικής κοινόχρηστο πόρο του Ινστιτούτου για τον Καρκίνο Huntsman και το Πανεπιστήμιο της Γιούτα για miRNA και του mRNA της βιοπληροφορικής επεξεργασίας δεδομένων, και Sandie Edwards για τις προσπάθειές της στη συνολική παρακολούθηση μελέτη και συλλογή ιστών όγκου.