Αφηρημένο

Altered μεθυλίωσης του DNA των υποκινητών ογκοκατασταλτικό γονίδιο παίζει ρόλο στην ανθρώπινη καρκινογένεση και DNA μεθυλοτρανσφεράσες (DNMTs) είναι υπεύθυνος γι ‘αυτό. Η παρούσα μελέτη στοχεύει να προσδιορίσει παρεκκλίνουσα έκφραση DNMT1, Dnmt3a, και DNMT3b σε καλοήθεις και κακοήθεις ιστούς των ωοθηκών όγκου για την ένωσή τους με κλινικοπαθολογοανατομικές σημασία και προγνωστική αξία. Ένα σύνολο 142 των ωοθηκών καρκίνους και 44 καλοήθεις όγκους των ωοθηκών στρατολογήθηκαν για ανοσοϊστοχημική ανάλυση της έκφρασης τους. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση του DNMT1, Dnmt3a και DNMT3b παρατηρήθηκε σε 76 (53,5%), 92 (64.8%) και 79 (55,6%) από 142 περιπτώσεις των ιστών καρκίνου των ωοθηκών, αντίστοιχα. Των σοβαρών όγκους, η έκφραση της πρωτεΐνης Dnmt3a ήταν σημαντικά υψηλότερη από ότι στα δείγματα καλοήθους όγκου (

P

= 0.001)? DNMT3b ήταν οριακά σημαντική κάτω ρυθμίζονται σε καρκίνους των ωοθηκών σε σχέση με εκείνη των καλοηθών όγκων (

P

= 0.054)? έκφραση DNMT1 δεν έχει καμία στατιστική διαφορά μεταξύ των καρκίνων των ωοθηκών και καλοήθης ιστούς όγκων (

P

= 0,837). Από τις mucious όγκους, η έκφραση του Dnmt3a, DNMT3b και DNMT1 δεν ήταν διαφορετική μεταξύ κακοήθεις και καλοήθεις όγκους. Επιπλέον, η έκφραση DNMT1 συσχετίστηκε με την έκφραση DNMT3b (

P

= 0,020, r = 0,195). έκφραση DNMT1 συσχετίστηκε με την ηλικία των ασθενών, την κατάσταση της εμμηνόπαυσης, και τον εντοπισμό του όγκου, ενώ η έκφραση Dnmt3a συνδέθηκε με ιστολογικών τύπων και επιπέδων CA125 στον ορό και η έκφραση DNMT3b συνδέθηκε με μετάσταση στους λεμφαδένες. Επιπλέον, οι ασθενείς με DNMT1 ή έκφραση DNMT3b είχε μια τάση καλύτερη επιβίωση από αυτούς με αρνητική έκφραση. Συν-έκφραση DNMT1 και DNMT3b συσχετίστηκε σημαντικά με καλύτερη συνολική επιβίωση (

P

= 0,014). Τα δεδομένα από τη μελέτη αυτή παρείχε την πρώτη απόδειξη για την διαφορική έκφραση των DNMTs πρωτεϊνών σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών και των ενώσεών τους με κλινικοπαθολογοανατομικές και την επιβίωση δεδομένα σε ασθενείς με σποραδικό καρκίνο των ωοθηκών

Παράθεση:. Bai Χ, Τραγούδι Ζ, Fu Υ, Yu Z, Zhao L, Zhao H, et al. (2012) κλινικοπαθολογοανατομικές Σημασία και προγνωστική αξία της DNA μεθυλοτρανσφεράσης 1, 3α, 3β και εκφράσεων στο Σποραδικές επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών. PLoS ONE 7 (6): e40024. doi: 10.1371 /journal.pone.0040024

Επιμέλεια: M.Carolina Ηλίας, Instituto Butantan, Laboratório Especial de Toxinologia Aplicada, Βραζιλία

Ελήφθη: 8 Φεβρουαρίου του 2012? Αποδεκτές: 30η Μαΐου 2012? Δημοσιεύθηκε: 29 του Ιούν 2012

Copyright: © 2012 Bai et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε εν μέρει με επιχορηγήσεις από το Εθνικό Ίδρυμα Φυσικών Επιστημών της Κίνας (Αρ 30873097 και Νο 30973559) και το τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας της επαρχίας Liaoning (Νο 2010225001). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Επιγενετική μεταβολή του γενωμικού DNA αναφέρεται σε λειτουργικά σχετικές τροποποιήσεις του γονιδιώματος που επηρεάζει την έκφραση του γονιδίου, αλλά δεν συνεπάγονται αλλαγή στην αλληλουχία νουκλεοτιδίου, η οποία διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στην ανθρώπινη καρκινογένεση. Τέτοιες τροποποιήσεις περιλαμβάνουν την μεθυλίωση του DNA, επαναμοντελοποίηση χρωματίνης και παραλλαγές ιστόνης, και η επιγενετική λειτουργία του μη κωδικοποιητικού RNA [1]. Μεταξύ αυτών, μεθυλίωση του DNA είναι μια ομοιοπολική τροποποίηση του DNA που παίζει σημαντικό ρόλο στον καθορισμό των προγραμμάτων γονιδιακή έκφραση κατά την ανάπτυξη του [2]. Παρ ‘όλα αυτά, ανώμαλη μεθυλίωση του DNA έχει επίσης να διαδραματίσει σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη του ανθρώπινου καρκίνου, και τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν μια παγκόσμια υπομεθυλίωση του γονιδιώματος που επάγει μη φυσιολογική έκφραση των γονιδίων, αλλά μια τοπική υπερμεθυλίωση που επιβάλλει σιωπή ογκοκατασταλτικών γονιδίων [1], [3]. Στα θηλαστικά, η μεθυλίωση του DNA είναι εγκατεστημένος και συντηρείται κυρίως από τρεις μεθυλοτρανσφεράσες DNA (DNMTs), δηλαδή DNMT1, Dnmt3a και DNMT3b. Η προτιμώμενη στόχος του DNMT1 είναι ημι-μεθυλιωμένο DNA [4], [5] και αυτή η πρωτεΐνη λειτουργεί ως μεθυλοτρανσφεράσης «συντήρηση» και το πρωτογενές ένζυμο που ευθύνεται για την αντιγραφή προτύπων μεθυλίωσης μετά την αντιγραφή του DNA. Είναι εντοπίζεται σε αντιγραφή εστίες και αλληλεπιδρά με πυρηνικό αντιγόνο κυτταρικού πολλαπλασιασμού (PCNA) [6]. Σε αντίθεση, Dnmt3a και DNMT3b είναι απαραίτητα για την πρώιμη εμβρυϊκή ανάπτυξη και υπεύθυνη για de novo μεθυλίωση [7]. Η υπερέκφραση των τριών αυτών DNMTs έχει αναφερθεί σε διάφορες κακοήθειες και συνδέεται με κακή επιβίωση διαφορετικών καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του πνεύμονα, του ήπατος, και του τραχήλου της μήτρας και τα λεμφώματα [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18]. Σε αντίθεση με τον καρκίνο που σχετίζεται με μεταλλάξεις του γονιδίου, ενισχύσεις, και διαγραφές, μεθυλίωση του DNA είναι δυνητικά αναστρέψιμη. Έτσι, οι DNMTs διερευνηθεί ως ένας στόχος για την εκ νέου έκφραση των ογκοκατασταλτικών γονιδίων και την αναστροφή του κακοήθους φαινοτύπων σε διαφορετικές κακοήθειες [19]. Πιο πρόσφατα, αντιπαράλληλα ολιγονουκλεοτίδια στόχευσης γονιδίων DNMT, για παράδειγμα MG98, φαίνεται να είναι αποτελεσματικά σε προκλινικές μελέτες και έχει τώρα τεθεί σε Ι και μελέτες φάσης II κλινική φάσης [20], [21].

επιθηλιακού καρκίνου των ωοθηκών είναι η έκτη ηγετική μορφή καρκίνου στις γυναίκες παγκοσμίως και η δεύτερη πιο κοινή γυναικολογικό καρκίνο, που αντιπροσωπεύουν περίπου το 4% του συνόλου των γυναικείων καρκίνων [22], [23]. Λόγω της έλλειψης πρώτα προειδοποιητικά σημάδια και αποτελεσματικά εργαλεία ελέγχου, πλειοψηφία των ασθενών με προχωρημένα στάδια της νόσου [24]. Επιθηλιακό καρκίνο των ωοθηκών είναι η πιο θανατηφόρα γυναικολογική κακοήθεια και το ποσοστό πενταετούς επιβίωσης είναι κάτω από 25% για τους ασθενείς που έχουν διαγνωστεί με σταδίου ΙΙΙ – IV ασθένειες [25], [26]. Παρόμοια με άλλες κακοήθειες, παρεκκλίνουσα μεθυλίωση του DNA για CpG νησίδες είναι επίσης ένας σημαντικός μηχανισμός για την ανάπτυξη του καρκίνου των ωοθηκών. Προκλινικές μελέτες έδειξαν ότι παράγοντες απο-μεθυλίωση ήταν σε θέση να αντιστρέψει την αντίσταση των καρκινικών κυττάρων των ωοθηκών σε πλατίνα [27], [28], που οδηγεί στη χρήση αναστολέων DNMT σε κλινικές δοκιμές των καρκίνων των ωοθηκών [29], [30], [31], [32]. Ωστόσο, δεν υπάρχουν διαθέσιμα στην μελέτη των πρωτεϊνών DNMT σε ιστούς καρκίνου των ωοθηκών δεδομένα, αν και δύο προηγούμενες μελέτες έχουν αναφέρει την έκφραση του mRNA DNMT σε κυτταρικές γραμμές καρκίνου ωοθηκών και μικρά δείγματα ιστού [33], [34]. Σε αυτή τη μελέτη, συλλέξαμε 142 περιπτώσεις των δειγμάτων επιθηλιακού καρκινώματος ωοθηκών και 44 περιπτώσεις καλοηθών όγκων των ωοθηκών για την ανίχνευση του DNMT1, Dnmt3a, και εκφράσεις πρωτεΐνη DNMT3b προκειμένου να προσδιοριστεί ο ρόλος των πρωτεϊνών DNMT στον καρκίνο των ωοθηκών και κλινική σημασία.

Αποτελέσματα

Χαρακτηριστικά Ασθενών

Σε αυτή τη μελέτη, θα προσληφθούν δείγματα ιστών από 186 δείγματα όγκων των ωοθηκών για την αξιολόγηση της έκφρασης πρωτεϊνών DNMTs. Τα κλινικοπαθολογοανατομικών δεδομένα από τους ασθενείς παρουσιάζονται στον Πίνακα 1. Εν συντομία, η μέση ηλικία των ασθενών κατά την επέμβαση ήταν 53 έτη (από 20 έως 74 ετών). 27 (23,3%) ασθενείς είχαν λεμφαδένα-μετάσταση νόσου κατά τη στιγμή της χειρουργικής επέμβασης και 110 (77,5%) ασθενείς είχαν ορώδες καρκίνωμα ως το κύριο ιστολογική διάγνωση, ακολουθούμενη από βλεννώδες καρκίνωμα (8,5%), διαυγές καρκίνωμα (~5.6%) και αδιαφοροποίητο καρκίνωμα (~5.6%). Τα επίπεδα του CA125, CA199, και CEA ορό ήταν αυξημένα πριν από την επέμβαση αλλά κανένας από τους ασθενείς έλαβαν καμία νεο-επικουρική χημειοθεραπεία. Συνέχεια στοιχεία ήταν διαθέσιμα για 85 ασθενείς. Η μέση και η διάμεση συνολική επιβίωση (OS) ήταν 56,1 και 41,0 μήνες, αντίστοιχα, με διάστημα εμπιστοσύνης 95% των 45,3 έως 66,9 και 33,2 έως 48,8 μήνες. Η μέση και διάμεση επιβίωση ελεύθερη νόσου (DFS) ήταν 46,6 και 26,0 μήνες, αντίστοιχα, με διάστημα εμπιστοσύνης 95% των 36,4 έως 56,9 και 14,6 έως 37,4 μήνες. Στις 44 καλοήθεις όγκους, 31 ήταν ορώδες και 13 βλεννώδες.

Η

διαφορική έκφραση των DNMT Πρωτεΐνες σε κακοήθεις και καλοήθεις όγκοι των ωοθηκών

Η διαφορική έκφραση των πρωτεϊνών DNMT σε κακοήθεις και καλοήθεις όγκοι των ωοθηκών σύμφωνα με ιστολογικό τύπο συνοψίζεται στον πίνακα 2. συγκεκριμένα, η έκφραση της πρωτεΐνης Dnmt3a ήταν σημαντικά υψηλότερη από εκείνη των καλοηθών καρκινικών ιστών (Mann-Whitney U-test,

P

= 0.001? Πίνακας 2), αλλά η διαφορά δεν παρατηρήθηκε σε mucious όγκους (Mann-Whitney test U-test,

P

= 0.813? Πίνακας 2). Ενώ DNMT3b πρωτεΐνη ανιχνεύθηκε σε 64 (58,2%) των 110 ορώδες περιπτώσεων καρκίνου και 22 (71.0%) από τα 31 ορώδεις καλοήθεις όγκοι, που δείχνει ότι η έκφραση DNMT3b σε καρκίνους των ωοθηκών ήταν χαμηλότερη, αλλά όχι σημαντικά από εκείνη των καλοηθών όγκων (Mann- Whitney U-test test,

P

= 0,054? Πίνακας 2), αλλά η διαφορά δεν παρατηρήθηκε σε mucious όγκους (Mann-Whitney U-test,

P

= 0,536? Πίνακας 2 ). Σε αντίθεση, η έκφραση της πρωτεΐνης DNMT1 δεν ήταν σημαντικά διαφορετική μεταξύ του καρκίνου των ωοθηκών και καλοήθης δείγματα όγκων, είτε σε σοβαρές ή mucious όγκους (Mann-Whitney U-test, ορώδες:

P

= 0.837? Mucious:

P

= 0,315 Πίνακας 2). Αντιπροσωπευτικά πρότυπα έκφρασης ανοσοϊστοχημική χρώση DNMTs στον καρκίνο των ωοθηκών και της καλοήθους ιστούς όγκων δείχθηκαν στο Σχήμα 1 και Σχήμα 2 αντίστοιχα. Στη συνέχεια, συνδέεται η έκφραση αυτών των τριών πρωτεϊνών DNMT στους ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών με τη χρήση της δοκιμής rank συσχέτιση Spearman του. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση του DNMT1 συσχετίστηκε σημαντικά με DNMT3b (r = 0.195,

P

= 0.020? Πίνακας 3), αλλά όχι με την πρωτεΐνη Dnmt3a (r = 0.130,

P

= 0,122 ? Πίνακας 3) ή μεταξύ των πρωτεϊνών Dnmt3a και DNMT3b (r = 0.152,

P

= 0.071?. πίνακα 3)

Η

τα αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των αρνητικών (Α, Ε, Ι) , ασθενώς θετικό (B, F, J), μέτρια θετικός (C, G, Κ), και ισχυρό θετικό (D, H, L) ανοσοχρώση για Dnmt3a, DNMT3b, και η έκφραση DNMT1 δείχνονται, αντίστοιχα? Τα βέλη δείχνουν το πεδίο διευρυμένη. Μεγέθυνση: × 400? διευρυμένη περιοχές:. × 1000

Η

Τα αντιπροσωπευτικά παραδείγματα των αρνητικών (Α, Ε, Ι), ασθενώς θετική (Β, F, J), μέτρια θετική (C, G, K), και την ισχυρή θετική (D, H, L) ανοσοχρώση για Dnmt3a, DNMT3b, και η έκφραση DNMT1 δείχνονται, αντίστοιχα. Μεγέθυνση:. × 400

Η

Σύνδεσης μεταξύ Έκφραση των DNMT Πρωτεΐνες και κλινικοπαθολογικών παραμέτρων

Μετά ανιχνεύεται έκφραση αυτών των τριών πρωτεϊνών DNMT χρησιμοποιώντας ανοσοϊστοχημεία, εμείς συνδέονται εκφράσεις τους με κλινικοπαθολογοανατομικές δεδομένων από τους ασθενείς. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η έκφραση DNMT1 συσχετίστηκε σημαντικά με την ηλικία και την κατάσταση της εμμηνόπαυσης των ασθενών και με τον εντοπισμό του όγκου. Έκφραση της πρωτεΐνης DNMT1 στο παλαιότερο (& gt? 53 χρόνια) ή μετεμμηνοπαυσιακές ασθενείς ήταν υψηλότερη από εκείνη των νεότερων ασθενών (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,028? Πίνακας 4) ή προεμμηνοπαυσιακές ασθενείς (Pearson Chi- square test,

P

& lt? 0.000? Πίνακας 4). Επιπλέον, η έκφραση της πρωτεΐνης DNMT1 ήταν υψηλότερη στους ασθενείς των οποίων ο όγκος εμφανίστηκαν σε μόνο πλευρά από εκείνη των ασθενών των οποίων ο όγκος εμφανίστηκε και στις δύο πλευρές (Pearson Chi-square test,

P

= 0.010? Πίνακας 4). Ωστόσο, δεν υπήρχαν σημαντικές συσχετίσεις υπάρχουν μεταξύ DNMT1 ανοσολογική αντίδραση και το μέγεθος του όγκου, λεμφικό μετάσταση στους λεμφαδένες, κλινικό στάδιο, ιστολογικό τύπο, CA125, ή CA199.

Η

Επίσης, υπήρξε μια σημαντική συσχέτιση μεταξύ Dnmt3a και ορό επίπεδο CA125 (τεστ Pearson Chi-Square,

P

= 0,044? Πίνακας 4). Η έκφραση της πρωτεΐνης ήταν Dnmt3a 69,1% το ορώδες καρκίνωμα, η οποία ήταν υψηλότερη από εκείνη της βλεννώδους καρκινώματος (33,3%) και σαφή καρκίνωμα (50%) (ακριβής δοκιμασία του Fisher,

P

= 0,027? Πίνακας 4). Αλλά δεν υπήρχε σχέση μεταξύ Dnmt3a ανοσολογική αντίδραση και άλλες κλινικές παθολογικές παραμέτρους, όπως εμφανίζεται στον Πίνακα 4.

Επιπλέον, τα στοιχεία έδειξαν ότι η έκφραση DNMT3b συσχετίστηκε σημαντικά με λεμφαδένα μετάσταση του καρκίνου των ωοθηκών (Pearson Chi-Square δοκιμή,

P

= 0,027? Πίνακας 4). Παρά το γεγονός ότι δεν υπάρχει στατιστικά σημαντική, η έκφραση της πρωτεΐνης DNMT3b φάνηκε να σχετίζεται με το υψηλό επίπεδο του CA199 στον ορό (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,061? Πίνακας 4).

Συνεργασίας έκφραση DNMT1 και Dnmt3a συσχετίστηκε σημαντικά με την κατάσταση της εμμηνόπαυσης (τεστ Pearson Chi-Square,

P

= 0,008? Πίνακας 4) και τη θέση του όγκου (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,036? Πίνακας 4), ενώ η συν-έκφραση των DNMT1 και DNMT3b συσχετίστηκε σημαντικά με την κατάσταση της εμμηνόπαυσης (τεστ Pearson Chi-Square,

P

= 0.001? Πίνακας 4) και τη θέση του όγκου (Pearson Chi- square test,

P

= 0,015? Πίνακας 4). Συν-έκφραση DNMT1 και DNMT3b ήταν επίσης σημαντικά που σχετίζονται με τα επίπεδα CA199 στον ορό (Pearson Chi-Square test,

P

= 0,013? Πίνακας 4).

Σύλλογος DNMT Εκφράσεις πρωτεΐνη με την επιβίωση από τους ασθενείς

Μετά από αυτό, εμείς συνδέονται έκφραση DNMT πρωτεΐνη με την επιβίωση των ασθενών που χρησιμοποιούν ανάλυση Kaplan-Meier (Σχήμα 3). Ιδιαίτερα, αν και δεν είναι σημαντικά διαφορετική, οι ασθενείς με εκφράσεις DNMT είχε μια τάση βελτιωμένη επιβίωση από εκείνους με αρνητική έκφραση, απέναντι των ευρημάτων από τις προηγούμενες μελέτες σε άλλους τύπους καρκίνου [8], [13], [17], [18 ], [35], [36]. Σε δείγματα μας, η έκφραση DNMT1 οριακά σχετίζονται με βελτιωμένη OS (

P

= 0.084? Εικ. 3Α) και DFS (

P

= 0,186? Εικ. 3D)? και το ίδιο έκανε DNMT3b. Επιπλέον, η συν-έκφραση της DNMT1 και DNMT3b συσχετίστηκε σημαντικά με βελτιωμένη συνολική επιβίωση σε σύγκριση με άλλα δείγματα (μόνο DNMT1 ή έκφραση DNMT3b ή και τα δύο αρνητικά) (

P

= 0.014, Σχ. 4C). Μονοπαραγοντική ανάλυση των πιθανών προγνωστικών επίπτωση των κλινικών και ιστοπαθολογικών παραμέτρων που προσδιορίζονται κλινικό στάδιο, τη θέση του όγκου, και το επίπεδο CA125 στον ορό ως σημαντικά ή οριακά σχετίζονται σημαντικά με μικρότερη OS και DFS (Πίνακας 5).

Οι καμπύλες επιβίωσης δείχνουν ότι παρόλο που δεν υπήρχε στατιστική σημαντικότητα, οι ασθενείς με την έκφραση DNMT1 είχε μια τάση βελτίωσης συνολική επιβίωση (Α) και την ελεύθερη νόσου επιβίωση (D) από ό, τι τα άτομα με αρνητική έκφραση, και το ίδιο έκανε DNMT3b (C και F). Αλλά δεν υπάρχει καμία σημαντική διαφορά μεταξύ της έκφρασης Dnmt3a και τη συνολική επιβίωση ή την επιβίωση ελεύθερη νόσου (Β και Ε).

P

-τιμή που λαμβάνεται από τη δοκιμασία log-rank.

Η

Οι καμπύλες επιβίωσης δείχνουν ότι η συν-έκφραση DNMT1 και DNMT3b συσχετίστηκε σημαντικά με βελτιωμένη συνολική επιβίωση σε σύγκριση με αρνητικά δείγματα (

P

= 0.014, Σχ. 3Ε).

P

-τιμή που λαμβάνεται από τη δοκιμασία log-rank.

Η

Στη συνέχεια, πολυπαραγοντικά μοντέλα παλινδρόμησης κατά Cox, χρησιμοποιώντας κλινικό στάδιο, το μέγεθος του όγκου, τη θέση της νεοπλασίας, DNMT1 και DNMT3b συνεργασία -έκφραση αποκάλυψε ότι μόνο το κλινικό στάδιο (OS,

P

= 0,022, RR = 6.977, 95% CI: 1.322~36.822? DFS,

P

= 0.026, RR = 4.686, 95% CI: 1.207~18.196) παρέμεινε ως ανεξάρτητος προγνωστικός παράγοντας (Πίνακας 6)

η

υποομάδα ανάλυση της σύνδεσης μεταξύ DNMT Εκφράσεις και της κλινικής έκβασης των ασθενών

Περαιτέρω ανάλυση πραγματοποιήθηκε με. υπόψη DNMTs έκφραση σε υποομάδες ασθενών με διαφορετικές κλινικοπαθολογοανατομικές παραμέτρους, όπως η ηλικία, η εμμηνόπαυση κατάσταση, το μέγεθος του όγκου, το κλινικό στάδιο, μετάσταση λεμφαδένα, και τη θέση του όγκου. Τα στοιχεία μας έδειξαν ότι η έκφραση της πρωτεΐνης DNMT1 συνδέθηκε με βελτιωμένη DFS σε ασθενείς με μεγαλύτερο μέγεθος των όγκων (DFS,

P

= 0,027? Σχήμα S1). Έκφραση DNMT1 φάνηκε να είναι ένας προστατευτικός παράγοντας σε ασθενείς των οποίων ο όγκος εμφανίστηκε και στις δύο πλευρές, αλλά δεν είναι στατιστικά σημαντική (OS,

P

= 0.139? Σχήμα S1) (DFS,

P

= 0.269? Σχήμα S1)? αντίθετο από ευρήματα από ασθενείς των οποίων ο όγκος συνέβη στην ενιαία πλευρά (OS,

P

= 0,429? Σχήμα S1) (DFS,

P

= 0,210? Σχήμα S1). Αντίθετα, τα επίπεδα της πρωτεΐνης Dnmt3a απέτυχε να δείξει τις ενώσεις με την επιβίωση των ασθενών (

P

& gt? 0.05, Εικόνα S2). έκφραση DNMT3b σχετίστηκε με την παρατεταμένη OS σε ηλικιωμένους ασθενείς (

P

= 0,011? Σχήμα S3), μετεμμηνοπαυσιακές ασθενείς (

P

= 0,019? Σχήμα S3), και οι ασθενείς των οποίων ο όγκος εμφανίστηκε και στις δύο πλευρές (

P

= 0.022? Σχήμα S3). Έκφραση της πρωτεΐνης DNMT3b επίσης οριακά σχετίζονται με παρατεταμένη DFS σε μετεμμηνοπαυσιακές ασθενείς (

P

= 0,098? Σχήμα S3) και οι ασθενείς των οποίων ο όγκος συνέβη και στις δύο πλευρές (

P

= 0,097? Σχήμα S3).

Συζήτηση

στην παρούσα μελέτη, για πρώτη φορά ανοσοϊστοχημικά καθόρισαν την έκφραση των πρωτεϊνών DNMT1, Dnmt3a, και DNMT3b σε καλοήθεις και κακοήθεις ιστούς όγκων των ωοθηκών. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση Dnmt3a ήταν υψηλότερη στον καρκίνο των ωοθηκών από ότι σε καλοήθεις όγκους, η οποία ήταν σύμφωνη με τις προηγούμενες μελέτες σε άλλους τύπους καρκίνου [15], [37], [38]. Ωστόσο, αν και αρκετές προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι τα επίπεδα έκφρασης του DNMT3b mRNA [8], [9], [39], [40] και την πρωτεΐνη [13], [40], [41] αυξήθηκαν σε ποικιλία κακοήθων όγκων , τρέχοντα δεδομένα μας έδειξαν μια χαμηλότερη έκφραση του DNMT3b σε ιστούς του καρκίνου των ωοθηκών σε σύγκριση με εκείνη των καλοηθών όγκων. Σε αυτή τη μελέτη, βρήκαμε επίσης ότι δεν υπήρχε διαφορά στην έκφραση της πρωτεΐνης DNMT1 μεταξύ των ωοθηκών καλοήθων και κακοήθων ιστών. Είναι ευχάριστο σε μια προηγούμενη αναφορά της μελέτης ότι δεν υπήρχε καμία διαφορά στην έκφραση του mRNA DNMT1 μεταξύ φυσιολογικού ιστού των ωοθηκών, πρωτογενή καρκίνο των ωοθηκών, και την επανάληψη των ιστών ωοθήκης καρκίνο [33]. Μια άλλη έκθεση έδειξε ότι η έκφραση των επιπέδων mRNA DNMT1 στον καρκίνο των ωοθηκών κυτταρικές σειρές HeyA8 και HeyC2 ήταν υψηλότερη από εκείνη της φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα των ωοθηκών [34]. τρέχουσα μελέτη μας ανιχνεύεται για πρώτη φορά την έκφραση πρωτεϊνών DNMT στον καρκίνο των ωοθηκών από σύγκριση με τις καλοήθεις ιστούς? έτσι περαιτέρω μελέτη είναι απαραίτητη για να αναλυθεί η αλλαγμένη έκφραση των πρωτεϊνών DNMT στον καρκίνο των ωοθηκών με τη σύγκριση με τους φυσιολογικούς ιστούς των ωοθηκών. Σε κάθε περίπτωση, λόγω των πολύπλοκων μηχανισμών που ευθύνονται για τη ρύθμιση των εκφράσεων DNMT και τις λειτουργίες του DNMTs στην καρκινογένεση, η αλλοιωμένη έκφραση και τα αποτελέσματα των DNMTs θα πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω στον καρκίνο των ωοθηκών, αν και παρεκκλίνουσα εκφράσεις τους, βρέθηκαν να είναι λόγω της μεθυλίωσης του γονιδίου τους υποκινητές σε διάφορες μορφές καρκίνου, όπως τα γλοιώματα και εμβρυϊκών ιστών [42], [43]. Ωστόσο, η μετάλλαξη και η απώλεια της έκφρασης της ρ53 πρωτεΐνης οδήγησε στην υπερέκφραση της DNMT1 σε λευχαιμία, ορθοκολικό καρκίνο και καρκίνο του πνεύμονα [44]. Επιπλέον, microRNAs είναι επίσης εμπλέκονται στη ρύθμιση της έκφρασης DNMT [45], [46]. Οριακά επιθηλιακά όγκου ήταν ένα σημαντικό και σημαντική ομάδα των επιθηλιακών όγκων της ωοθήκης. Έχουμε, επίσης, συγκεντρώθηκαν οριακά επιθηλιακών όγκων, αλλά ο αριθμός των οριακών όγκων διαθέσιμες στη μελέτη μας ήταν μόνο 6, έτσι ώστε να μην αναλυθούν τα οριακά επιθηλιακών όγκων σε αυτή τη μελέτη, και θα συνεχίσουμε να συλλέξει περισσότερα οριακά όγκους για μελλοντική μελέτη.

Επιπλέον, η τρέχουσα μελέτη μας συνδέεται περαιτέρω τη σημασία των εκφράσεων πρωτεΐνης τρεις DNMT με κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η έκφραση DNMT1 συσχετίστηκε θετικά με την ηλικία των ασθενών, δηλαδή, πρωτεΐνη DNMT1 εκφράστηκε περισσότερο σε ηλικιωμένους ασθενείς, τα δεδομένα των οποίων ήταν συνεπής με εκείνη του λεμφώματος [13]. Επιπλέον, DNMT1 πρωτεΐνη εκφράστηκε περισσότερο σε ασθενείς μετά την εμμηνόπαυση από ότι σε προ-εμμηνοπαυσιακές ασθενείς. Επιπλέον, τα δεδομένα μας έδειξαν ότι η έκφραση του DNMT1 πρωτεΐνης ήταν σχετικές με τον εντοπισμό του όγκου. Ωστόσο, μέχρι σήμερα, δεν ξέρουμε γιατί αυτά συνέβησαν ή η επίπτωση αυτών των ενώσεων. Επιπλέον, βρήκαμε επίσης ότι η έκφραση του DNMT1 ήταν υψηλότερη στη μονομερή καρκίνο των ωοθηκών σε σχέση με τις διμερείς καρκίνο των ωοθηκών, το οποίο μπορεί να υποδεικνύει την διαφορά της μονομερούς και διμερούς του καρκίνου των ωοθηκών σε σχέση με την βιολογικά χαρακτηριστικά, η γενετική, και μηχανισμό. Μία προηγούμενη μελέτη έχει αναφερθεί ότι η έκφραση DNMT1 συσχετίστηκε με μετάσταση στους λεμφαδένες στον καρκίνο του παγκρέατος [17], αλλά δεν βρήκαμε μια τέτοια σύνδεση στον καρκίνο των ωοθηκών.

Επιπλέον, η τρέχουσα μελέτη μας έδειξε ότι η έκφραση Dnmt3a ήταν που συνδέονται με ιστολογικό τύπο, π.χ., των ωοθηκών ορώδες καρκίνωμα εκφράζονται υψηλότερα επίπεδα Dnmt3a πρωτεΐνης. Dnmt3a έκφραση σχετίζεται θετικά με το επίπεδο CA125 στον ορό, ενώ η έκφραση DNMT3b συνδέθηκε με λεμφαδένα μετάσταση και το επίπεδο CA199 στον ορό, η οποία είναι νέα και δεν είχε αναφέρει πριν.

Όσον αφορά την πρόβλεψη της επιβίωσης χρησιμοποιώντας διαφορετικές εκφράσεις DNMT, τα προηγούμενα μελέτες έδειξαν ότι η υπερέκφραση του DNMT1 ή DNMT3b συσχετίστηκε με κακή πρόγνωση σε καρκίνους του πνεύμονα [15], το ήπαρ [18], [35], και το πάγκρεας [17], λέμφωμα [13] και άλλες κακοήθειες. Στον καρκίνο των ωοθηκών, η τρέχουσα μελέτη μας έδειξε μια διαφορετική τάση των συλλόγων DNMT με την πρόγνωση, δηλαδή, η συνολική επιβίωση (OS) και την ελεύθερη νόσου επιβίωση (DFS) των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών ήταν καλύτερα με την έκφραση των πρωτεϊνών DNMT1 και DNMT3b σε σύγκριση με τους ασθενείς χωρίς την έκφραση των πρωτεϊνών DNMT1 και DNMT3b. Επιπλέον, η συν-έκφραση των πρωτεϊνών DNMT1 και DNMT3b ήταν επίσης σημαντικά σχετίζεται με βελτιωμένη OS. Επιπλέον, πρόσθετα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι Dnmt3a σε διάφορα υποσύνολα των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών δεν είχε καμία επίδραση στην κατάσταση επιβίωσης, αν και DNMT1 έκφραση έδειξε καλύτερη OS και DFS σε ασθενείς με μεγάλους όγκους από ότι σε ασθενείς με μικρότερους όγκους. Το παρόμοιο ισχύει και για την έκφραση DNMT3b σε ηλικιωμένους ασθενείς, ασθενείς μετά την εμμηνόπαυση, και οι ασθενείς με όγκους οι διμερείς θετική. Αυτά τα εντελώς διαφορετικά δεδομένα από την τρέχουσα μελέτη υποδεικνύουν διαφορετικά βιολογικά χαρακτηριστικά του καρκίνου των ωοθηκών από άλλους καρκίνους. Ωστόσο, μελλοντική μελέτη είναι απαραίτητη για να επιβεβαιώσετε την τρέχουσα εύρημα μας.

Σε μια ποικιλία καρκίνων, DNMT1, Dnmt3a και DNMT3b αναφέρθηκαν πρέπει να εκφράζεται έντονα και συνδέονται με κακή πρόγνωση. Υπερμεθυλίωση κάποιων υποκινητών γονιδίων καταστολή του όγκου (ΕΠΠΕ) που επηρεάζουν την πρόγνωση μπορεί να εξηγήσει εν μέρει την κακή πρόγνωση που σχετίζεται με ασθενείς με DNMT υπερέκφραση [47], [48], [49], [50], αν και μεθυλίωση του τους περισσότερους φορείς του γονιδίου doesn ‘ t έχουν υψηλή συσχέτιση με την έκφραση του DNMTs [35], [51]. Ωστόσο, είναι άγνωστο γιατί η υψηλή έκφραση μερικών από αυτά τα DNMTs συσχετίστηκε με καλύτερη πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών. Προηγούμενες μελέτες έδειξαν ότι η μεθυλίωση του νησιού DNA CpG σε ιστούς όγκων δεν ήταν το μόνο μέρος της υπερμεθυλίωσης γονιδίων, ότι υπομεθυλίωση σημειώθηκαν επίσης σε ορισμένες περιοχές του γονιδιωματικού DNA, και ότι ανώμαλος υπομεθυλίωση στο ανθρώπινο γονιδίωμα επηρεάζονται πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο του προστάτη, του ήπατος καρκίνο, και γλοιώματος [52], [53], [54]. Όπως και άλλες μορφές καρκίνου, των ωοθηκών καρκινικά κύτταρα εμφανίζουν επίσης μια παγκόσμια υπομεθυλίωση στο γονιδίωμα και ένα τοπικό υπερμεθυλίωση προαγωγών ογκοκατασταλτικό γονίδιο [55]. Δύο προηγούμενες μελέτες χρησιμοποίησαν τσιπ μεθυλίωση ως μέθοδος υψηλής απόδοσης για τη διαλογή hypermethylations γονίδιο που μπορεί να επηρεάσουν την πρόγνωση των ασθενών με καρκίνο των ωοθηκών [56], [57] και διαπίστωσε ότι ένας υψηλότερος βαθμός CpG νησιού μεθυλίωσης σχετίζεται με μειωμένη εξέλιξης, ασθενής δωρεάν επιβίωση (PFS). Ενώ άλλες μελέτες ανέφεραν ότι υπερμεθυλίωση προαγωγού είχε εμπλακεί σε γονιδίων επιδιόρθωσης του DNA σε βλάβη του καρκίνου των ωοθηκών και συνδέονται με τη βελτιωμένη πρόγνωση των ασθενών μέσω της αύξησης της ευαισθησίας σε χημειοθεραπεία [58], [59]. Επιπλέον, πρόσφατες μελέτες έδειξαν ότι DNMT αναστολέας ήταν σε θέση να αναστρέψει μερικώς αντίστασης πλατίνας σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών [32] μόνο. Μια άλλη μελέτη αξιολόγησε τη δραστικότητα και την ανεκτικότητα του φαζαραβίνη παράγοντα απομεθυλίωσης (Ara-AC) σε ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών, και όχι πλήρεις ή μερικές αποκρίσεις παρατηρήθηκαν σε 19 ασθενείς [29]. Λαμβάνονται συνολικά, τρέχουσα μελέτη μας δείχνει ότι ο μηχανισμός και η κλινική σημασία των αλλαγμένη έκφραση DNMTs στον καρκίνο των ωοθηκών θα μπορούσε να αξιολογηθεί περαιτέρω.

Υλικά και Μέθοδοι

ιστών Δείγματα

Ιστός δείγματα από 186 ασθενείς με όγκους των ωοθηκών είχαν προσληφθεί από το Τμήμα Χειρουργικής Ογκολογίας και Γενική Χειρουργική, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου συνδεδεμένες Πρώτο και δεύτερο Νοσοκομεία μεταξύ 2002 και 2010. από 186 περιπτώσεις, 142 περιπτώσεις είχαν ιστολογικά επιβεβαιωμένη ως καρκίνωμα των ωοθηκών επιθηλιακής και 44 περιπτώσεις ήταν καλοήθεις όγκους των ωοθηκών. Κανένας από τους ασθενείς μας είχε οποιαδήποτε οικογενειακό ιστορικό καρκίνου. Οι ασθενείς υποβλήθηκαν σε χειρουργική οργάνωσε σύμφωνα με την τρέχουσα ΦΥΓΩ (Διεθνής Ομοσπονδία Γυναικολόγοι και Μαιευτήρες σύστημα ταξινόμησης). Η ιστολογική διάγνωση επιτεύχθηκε με βάση τα κριτήρια του Παγκόσμιου Οργανισμού Υγείας. Η μελέτη μας συνδέεται με μία άλλη κλινική δοκιμή που λάβαμε εν επιγνώσει συναίνεση από όλους τους συμμετέχοντες. Επειδή αυτή η δίκη ήταν περίπου αναστολέας DNMT και θέλουμε να γνωρίζουμε την κλινικοπαθολογοανατομικών σημασία και προγνωστική αξία των εκφράσεων DNMT στο σποραδικό καρκίνο των ωοθηκών. Έτσι, θα θέλαμε να προσθέσουμε αυτή τη μελέτη σχετικά με την έκφραση DNMT. Ζητήσαμε σε κάθε ασθενή, εξήγησε μελέτη μας, και λαμβάνονται εν επιγνώσει συναίνεση. Όταν καλέσαμε, συμβολαιογράφου ήταν παρών και θα δώσει μαρτυρία, και λάβαμε το κινητό τηλέφωνο σύντομο μήνυμα το οποίο θα απαιτούνται οι συμμετέχοντες που συναινούν τη μελέτη για να στείλετε σε εμάς. Επειδή ο χρόνος ήταν περιορισμένος και ορισμένοι από τους συμμετέχοντες ήταν έξω από το νοσοκομείο, οπότε είναι δύσκολο να αποκτηθούν γραπτή συγκατάθεση. Το Ινστιτούτο Ερευνών υγειονομική επιτροπή Δεοντολογίας της Κίνας Ιατρικού Πανεπιστημίου συζήτησε και ενέκρινε τη διαδικασία συναίνεσης. Τέλος, λαμβάνεται προφορική συγκατάθεση από 186 ασθενείς.

Ανοσοϊστοχημεία

φορμαλίνη σταθερών και δείγματα ιστού εγκλεισμένα σε παραφίνη κόπηκαν σε 4-μm πάχους τομές και τοποθετήθηκαν πάνω σε πολυ-Ε-λυσίνη γυάλινα πλακίδια. Για την ανοσοϊστοχημική χρώση, οι τομές αποπαραφινώθηκαν σε ξυλόλιο, επανυδατώθηκαν σε μια σειρά από αλκοόλ, και πλένονται στο νερό της βρύσης. Οι τομές στη συνέχεια μαγειρεύονται σε 10 mM ρυθμιστικό κιτρικού νατρίου, ρΗ 6,0, για 10 λεπτά σε ένα αυτόκλειστο για ανάκτηση αντιγόνου. Η ενδογενής δράση υπεροξειδάσης αποκλείστηκε με επώαση των τμημάτων σε 3% Η

2O

2 στους 37 ° C για 20 λεπτά. Μετά από αυτό, οι τομές δεσμεύτηκαν να αποφευχθεί μη ειδική σύνδεση με την προσθήκη ενός 10% φυσιολογικό ορό κατσίκας σε 37 ° C για 30 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν για 4 ° C όλη τη νύχτα με το πολυκλωνικό αντίσωμα έναντι DNMTs (DNMT1, sc-20701, 1: 200 αραίωση? Dnmt3a, sc-20703, 1:200 αραίωση? DNMT3b SC-130740, 1:100 αραίωση? Santa Cruz Biotechnology, USA). Η εξειδίκευση των αντισωμάτων επιβεβαιώθηκε με ανάλυση κηλίδας Western (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Στην επόμενη ημέρα, οι τομές πλύθηκαν πέντε φορές με 0,01 mol /L φωσφορικό ρυθμιστικό αλατούχο διάλυμα (PBS? ΡΗ 7.4) για 15 λεπτά και στη συνέχεια επωάστηκαν με βιοτινυλιωμένο δευτερεύον αντίσωμα για 30 λεπτά στους 37 ° C στο σκοτάδι. Μετά από αυτό, οι τομές επωάστηκαν με ένα διάλυμα στρεπταβιδίνης υπεροξειδάσης αρμορακίας για άλλα 30 λεπτά (kit LSAB? Dako, Glostrup, Denmark), πλύθηκαν σε PBS, και χρωματίστηκαν με DAB (3, 3-διαμινοβενζιδίνη). Τέλος, οι τομές βάφτηκαν αντίθετα με αιματοξυλίνη Mayer, η αφυδάτωση, και τοποθετημένα. Οι αρνητικοί μάρτυρες έτρεξαν παράλληλα, και παρήχθησαν με PBS αντικαθιστώντας το αντίσωμα αντι-DNMTs.

Αξιολόγηση της ανοσοϊστοχημείας

Οι ανοσοχρωματισμένες τμήματα εξετάστηκαν και βαθμολογήθηκαν ανεξάρτητα από δύο ερευνητές που αγνοούσαν την κλινικοπαθολογοανατομικές χαρακτηριστικά των ασθενών. Τα πυρηνικά εξέφρασε DNMTs είναι η λειτουργική είδος των πρωτεϊνών DNMT? Ως εκ τούτου, μόνο η πυρηνική θετικότητα για τις πρωτεΐνες DNMTs αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας ημι-ποσοτικά κριτήρια βαθμολόγησης, σύμφωνα με την ένταση χρώσης (0, αρνητικά? 1, αδύναμη? 2, μέτρια? και 3, σοβαρή) και η αναλογία των θετικών κυττάρων (0, αρνητικά? 1, θετικό σε ≤10%? 2, θετική & gt? 10% και ≤50%? 3, θετική & gt? 50% και ≤80%? 4, θετική & gt? 80% των καρκινικών κυττάρων). Οι δύο βαθμολογίες πολλαπλασιάστηκαν για κάθε περίπτωση και η έκφραση βαθμολογήθηκε ως: αρνητική, βαθμολογία = 0? ασθενής έκφραση, βαθμολογία = 1-4? μέτρια έκφραση, βαθμολογία = 5-8? και ισχυρή έκφραση, βαθμολογία = 9-12.

Στατιστική Ανάλυση

Σύγκριση των βαθμολογιών έκφρασης DNMT μεταξύ των δειγμάτων αναλύθηκε με τη χρήση του Mann-Whitney U-test. Spearman rank test συσχέτιση έγινε για να αναλυθεί η σχέση μεταξύ εκφράσεων DNMT. Συσχετίσεις μεταξύ κλινικοπαθολογοανατομικών παραγόντων και DNMTs έκφραση αναλύθηκαν με τη χρήση του Chi-square (X

2) τεστ ή Ακριβής Τεστ Πιθανότητα Fisher. Επιβίωση των ασθενών, σύμφωνα με τις εκφράσεις DNMT αναλύθηκε με χρήση ανάλυσης καμπύλης Kaplan-Meier με τη δοκιμασία log-rank. ανάλυση παλινδρόμησης Cox χρησιμοποιήθηκε για την πολυπαραγοντική ανάλυση. Η στατιστική σημαντικότητα ορίστηκε ως

P

& lt? 0,05. Όλες οι στατιστικές δοκιμές πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας το πακέτο λογισμικού SPSS (SPSS 11.5 Inc, Chicago, IL, USA).

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1. ανάλυση επιβίωσης

Kaplan-Meier των συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης DNMT1 και OS και DFS σε διάφορες υποομάδες.

doi: 10.1371 /journal.pone.0040024.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2. ανάλυση επιβίωσης

Kaplan-Meier των συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης Dnmt3a και OS και DFS σε διάφορες υποομάδες.

doi: 10.1371 /journal.pone.0040024.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3. ανάλυση επιβίωσης

Kaplan-Meier των συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης DNMT3b και OS και DFS σε διάφορες υποομάδες.

doi: 10.1371 /journal.pone.0040024.s003

(ΔΕΘ)

Ευχαριστίες

Θα θέλαμε να ευχαριστήσουμε τον Δρ Hua Chang και Caigang Liu από το Τμήμα Χειρουργικής Ογκολογίας και Γενική Χειρουργική, η Κίνα Ιατρικού Πανεπιστημίου συνδεδεμένες Πρώτο και δεύτερο Νοσοκομεία για βοήθεια στη συλλογή δειγμάτων ιστού.