Αφηρημένο

Το γάλα σφαιριδίων λίπους – ΕΤΠ – παράγοντα VIII (MFGE8), που ονομάζεται επίσης lactadherin, είναι μία εκκρινόμενη πρωτεΐνη, η οποία δεσμεύει εξωκυτταρικά σε φωσφατιδυλοσερίνη και να ανβ3 και ανβ5 ιντεγκρίνες. Στις ανθρώπου και ποντικού κύτταρα που εκφράζουν αυτές τις ιντεγκρίνες, όπως ενδοθηλιακά κύτταρα, φαγοκύτταρα και ορισμένους όγκους, MFGE8 /lactadherin έχει αποδειχθεί ότι προάγει την επιβίωση, επιθηλιακά μεσεγχυματικά να μετάβασης και φαγοκυττάρωση. Ένα protumoral λειτουργία του MFGE8 συνεπώς έχει τεκμηριωθεί για μερικούς τύπους ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του μελανώματος, ενός υποτύπου των καρκίνων του μαστού, και καρκίνωμα της ουροδόχου κύστης. Η αναστολή των λειτουργιών των MFGE8 θα μπορούσε έτσι να αντιπροσωπεύουν ένα νέο τύπο θεραπείας για καρκίνους του ανθρώπου. Εδώ, δείχνουμε με ανοσοϊστοχημεία σε μια συλλογή ανθρώπινων καρκίνων των ωοθηκών που MFGE8 υπερεκφράζεται στο 45% των όγκων αυτών, και να επιβεβαιώσει ότι είναι ειδικά υπερεκφράζεται στην τριπλή αρνητικά υποτύπου ανθρώπινων καρκίνων του μαστού. Έχουμε αναπτύξει νέα

in vitro δοκιμασίες

να μετρηθεί η επίδραση του MFGE8 στην επιβίωση, προσκόλληση και τη μετανάστευση των ανθρώπινων ωοθηκών και τριπλά αρνητικά κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού. Χρησιμοποιώντας αυτές τις δοκιμασίες, θα μπορούσαμε να εντοπίσουν νέες MFGE8-ειδικά μονοκλωνικά αντισώματα, που μπλοκάρει αποτελεσματικά αυτούς τους τρεις αποτελέσματα προαγωγής του καρκίνου της MFGE8. Τα αποτελέσματά μας δείχνουν τη μελλοντική χρήση των MFGE8-αντισωμάτων αποκλεισμού ως νέα θεραπευτικά αντι-καρκίνου σε υποομάδες καρκίνου των ωοθηκών, και ασθενείς με καρκίνωμα του μαστού τριπλά αρνητικό

Παράθεση:. Tibaldi L, Leyman S, Νικόλας Α, Notebaert S, Dewulf Μ, Ngo Θ, et al. (2013) Νέα Μπλόκο αντισώματα εμποδίζουν την προσκόλληση, τη μετανάστευση και την επιβίωση των κυττάρων του καρκίνου των ωοθηκών, τονίζοντας MFGE8 ως πιθανό θεραπευτικό στόχο του ανθρώπινου καρκινώματος των ωοθηκών. PLoS ONE 8 (8): e72708. doi: 10.1371 /journal.pone.0072708

Επιμέλεια: Jung Weon Lee, Εθνικό Πανεπιστήμιο της Σεούλ, Δημοκρατία της Κορέας

Ελήφθη: 18 του Ιανουαρίου, 2013? Αποδεκτές: 15 του Ιουλίου, 2013? Δημοσιεύθηκε: 16 Αυγ, 2013

Copyright: © 2013 Tibaldi et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτό το έργο υποστηρίχθηκε από Institut Curie, INSERM, Σύλλογος pour la Recherche contre le Καρκίνου, ένα βραβείο από το Fondation de France, και δύο χρόνια συμβόλαιο συνεργασίας μεταξύ Institut Curie, INSERM, και ThromboGenics NV, Leuven, Βέλγιο (www.thrombogenics.com) . ThromboGenics NV περιγράφεται η στρατηγική για την παραγωγή αντισωμάτων, πραγματοποίησε την ανοσοποίηση ποντικών, ελέγχεται η εξειδίκευση των νέων αντισωμάτων αντι-ανθρώπινης MFGE8, η αλληλουχία των μεταβλητών περιοχών τους, και συμμετείχαν στο σχεδιασμό των δοκιμών για την επιλογή των μολύβδινων υποψήφια αντισώματα.

Αντικρουόμενα συμφέροντα: Οι συγγραφείς έχουν διαβάσει την πολιτική του περιοδικού και έχουν τα ακόλουθα συγκρούσεων: μέρος της εργασίας αυτής επιχορηγήθηκε με τη χρηματοδότηση για την ομάδα του Clotilde Thery, συμπεριλαμβανομένων των μισθών Lorenzo Tibaldi, όπως μια σύμβαση συνεργασίας μεταξύ Institut Curie, INSERM, και ThromboGenics NV, Βέλγιο. Shirley Leyman, Sofie Notebaert, Πέμ Hoa των ΜΚΟ και Claudia Zuany-Amorim απασχολούνται από ThromboGenics NV. Μια διεθνής αίτηση PCT που καλύπτει τις περιγράφονται αντισώματα, που ανήκει από κοινού ThromboGenics NV, Institut Curie και INSERM, έχει κατατεθεί υπό τον αριθμό PCT /EP2013 /056057. Αυτό δεν αλλάζει την τήρηση των συγγραφέων σε όλες τις PLoS ONE πολιτικές για την ανταλλαγή δεδομένων και υλικών με ακαδημαϊκά εργαστήρια.

Εισαγωγή

Για να αναπτυχθεί ως ένα πλήρως ανεπτυγμένο όγκου, ένα κύτταρο πρέπει όχι μόνο να αποκτούν κύτταρο-αυτόνομες ιδιότητες του πολλαπλασιασμού και της αντίστασης σε προγραμματισμένο θάνατο, αλλά και θα δημιουργήσει αλληλεπιδράσεις με μικροπεριβάλλον του επιτρέπει συνεχή πολλαπλασιασμό του, και αποφεύγοντας την εξάλειψή της [1]. Ινοβλάστες, ενδοθηλιακά κύτταρα που σχηματίζουν τα αιμοφόρα αγγεία, και τα κύτταρα του ανοσοποιητικού όλα τα σήματα ανταλλαγή με τα μετασχηματισμένα κύτταρα, μέσω άμεσων αλληλεπιδράσεων συνδετήρα-υποδοχέα, καθώς επίσης και μέσω διαλυτών παραγόντων και εξωκυτταρικών κυστίδια μεμβράνης τα οποία ενεργούν σε μια απόσταση από τα κύτταρα του όγκου. Οι όγκοι μπορεί έτσι να εκκρίνουν αυξητικούς παράγοντες δρουν με αυτοκρινή τρόπο να διατηρήσουν την επιβίωσή τους, αλλά και σε ένα παρακρινή τρόπο για τα άλλα κύτταρα του μικροπεριβάλλοντος τους

Γάλα σφαιριδίων λίπους -. EGF – Παράγοντα VIII (MFGE8), που ονομάζεται επίσης lactadherin, είναι μία από αυτές που εκκρίνονται παράγοντες με πλειοτροπικές πιθανές λειτουργίες. Αρχικά κλωνοποιήθηκε ως ένα κύρια πρωτεΐνη του σφαιριδίων λίπους γάλακτος [2,3], βοοειδών, ανθρώπου (MFGE8) και ποντικού έχουν πρωτεΐνες (Mfge8) έχουν δειχθεί ότι περιέχουν δύο διακριτές λειτουργικές περιοχές: EGF περιοχές συμπεριλαμβανομένου ενός που περιέχουν RGD αλληλουχία πρόσδεσης για ανβ3 και ανβ5 ιντεγκρίνες, και παρόμοια με παράγοντα VIII (ή δισκοϊδίνης) περιοχές σύνδεσης προς φωσφολιπίδια (φωσφατιδυλοσερίνη και φωσφατιδυλαιθανολαμίνη). MFGE8 /Lactadherin θα έχει επομένως μη-ομοιοπολικά με λιπίδια στην εξωκυττάρια κυστίδια, και αλληλεπιδρά με κύτταρα-στόχους που εκφράζουν ανβ3 /5 ιντεγκρίνες. MFGE8 πρόσδεση σε ενδοθηλιακά κύτταρα έχει δειχθεί ότι προάγει VEGF εξαρτώμενη επιβίωση και την αγγειογένεση [4], καθώς και φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών κυττάρων [5]. Στον ποντικό, Mfge8 προάγει την φαγοκυττάρωση των αποπτωτικών κυττάρων από τα μακροφάγα [6], και τους ξεφεύγει να εκκρίνουν κυτοκίνες ανεκτικογόνο [7]. Στις ίδιοι ορισμένων καρκινικών κυττάρων, MFGE8 δείχθηκε ότι επάγει επιθηλιακή προς μεσεγχυματικά μετάβαση [8,9], και /ή να αυξηθεί η αντίσταση στο φάρμακο προκαλούμενη απόπτωση [10,11].

Όλα αυτά τα αποτελέσματα υπογραμμίζουν MFEG8 ως ένα υποσχόμενο στόχο για τους αναστολείς που θα μπορούσαν να αναπτυχθούν για τον περιορισμό της προόδου του όγκου. Σε ορισμένους τύπους ανθρώπινων καρκίνων, ένα προ-καρκινικές ρόλος του MFGE8 έχει αποδειχθεί, με βάση την υψηλή υπερέκφραση κατά τη διάρκεια της εξέλιξης του όγκου, και /ή για την ανάλυση των μοντέλων ποντικού: αυτοί οι καρκίνοι περιλαμβάνουν καρκίνωμα ουροδόχου κύστης (δική μας εργασία [12]), μελάνωμα [8], και το τριπλό-αρνητικό υποτύπου του καρκίνου του μαστού [13]. Ωστόσο, σε ορισμένες άλλες μορφές καρκίνου, όπως ορμονικούς υποδοχείς (HR) και /ή καρκίνων ανθρώπινου μαστού HER2-εκφράζουν [13], MFGE8 δεν υπερεκφράζεται, και φαίνεται αντί να αποτρέψει την εξέλιξη του όγκου. Έτσι, δημιουργώντας νέα εργαλεία για την αναστολή των πλειοτροπική λειτουργίες της MFGE8, καθώς και τον εντοπισμό των κατάλληλων ανθρώπινους στόχους καρκίνου των εργαλείων αυτών, πρέπει να εκτελούνται ταυτόχρονα, αν ελπίζουμε να επιτευχθεί αποτελεσματική νέων θεραπειών.

Εδώ, αναλύοντας MFGE8 έκφραση σε μεγάλες συστοιχίες των ανθρώπινων βιοψιών όγκου, και με τη δημιουργία νέων λειτουργικές δοκιμασίες για τη μέτρηση των αποτελεσμάτων των MFGE8 και νέων MFGE8-αντισώματα αποκλεισμού για την φυσιολογία των κυττάρων του όγκου, εντοπίσαμε καρκίνωμα ωοθήκης, και επιβεβαιώθηκε τριπλά αρνητικά καρκινώματος μαστού ως υποσχόμενους στόχους τα οποία θα μπορούσαν να επωφεληθούν από MFGE8 αναστολής θεραπείες.

Αποτελέσματα

MFGE8 υπερέκφραση σε καρκίνους των ωοθηκών

σε μια προηγούμενη εργασία, χρησιμοποιώντας τα διαθέσιμα δημοσιευμένα στοιχεία έκφρασης mRNA συγκεντρώνονται στο oncomine ιστοσελίδα (

www.oncomine.org

), παρατηρήσαμε μια σημαντική προς τα πάνω ρύθμιση του

MFGE8

γονίδιο στο transcriptomic επίπεδο σε ένα υποσύνολο ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων των ωοθηκών ορώδες αδενοκαρκινώματα [12]. Με δεδομένη την ανάγκη για νέες θεραπείες για τον καρκίνο αυτό, το οποίο παρουσιάζει συχνά σε προχωρημένο στάδιο, αποφασίσαμε να διερευνήσει περαιτέρω τους ρόλους των MFGE8 στο καρκίνωμα των ωοθηκών. Για να επιβεβαιώσετε την παρατήρηση του

MFGE8

υπερέκφραση του mRNA σε επίπεδο πρωτεΐνης, χρησιμοποιήσαμε δύο μικροσυστοιχίες όγκου που δημιουργείται in-house, που περιέχει 50 βιοψίες από ασθενείς με καρκίνο των ωοθηκών όλων των βαθμίδων και τύπων (Πίνακας S1). Ανοσοϊστοχημεία για την ανίχνευση MFGE8 σε αυτούς τους όγκους εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας περιγράφηκε προηγουμένως πολυκλωνικά κουνελιού αντι-MFGE8 αντίσωμα μας [4], και η ανάλυση των χρώσεις διεξήχθη από έναν παθολόγο. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [4,12], MFGE8 ανιχνεύθηκε σε αιμοφόρα αγγεία που υπάρχουν εντός των όγκων (βέλος στο Σχήμα 1α). Επιπλέον, οι ίδιοι MFGE8-θετικά κύτταρα όγκου παρατηρήθηκαν σε αρκετές βιοψίες. Όπως φαίνεται στο σχήμα 1α, το συνολικό επίπεδο έκφρασης της πρωτεΐνης ήταν μεταβλητή μεταξύ των επιμέρους όγκους, που κυμαίνονται από απών (0), έως πολύ ισχυρή σε όλο τον όγκο (3). Κατάταξη των όγκων σύμφωνα με το επίπεδο της MFGE8 πρωτεΐνης (Σχήμα 1 β) έδειξε ότι το 45% (22/48) εκφράζεται έντονα MFGE8 (επίπεδο 2-3). MFGE8 υπερεκφράζουν όγκοι ήταν όλων των βαθμών (1 έως 3, Σχήμα 1β), όλων των τύπων, καθώς και διαφόρων μεταστατική κατάσταση (Πίνακας S1), έτσι MFGE8 υπερέκφραση δεν θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί είτε ως προγνωστικό ή διαγνωστικό δείκτη του καρκίνου των ωοθηκών. Το υψηλό ποσοστό των όγκων που υπερεκφράζουν MFGE8, ωστόσο, μας ώθησε να διερευνήσει περαιτέρω την αξία της ως θεραπευτικό στόχο για καρκίνους των ωοθηκών

(α) Τα παραδείγματα των Ανθρωπίνων MFGE8 ανοσοϊστοχημεία σε τομές καρκινώματος ωοθηκών που δείχνει: αριθ. Χρώση των καρκινικών κυττάρων (βαθμός 0), αλλά MFGE8 θετικά ενδοθηλιακά κύτταρα (μαύρο βέλος) στο αριστερό πάνελ. Περιοχές ασθενής έκφραση (W) και του μέσου έκφρασης (m) του MFGE8 στο ίδιο τμήμα, έτσι κατατάσσεται ως αποτέλεσμα 2 στο μεσαίο πλαίσιο. Ισχυρή έκφραση MFGE8 (ες) σε όλο τον όγκο, κατατάσσεται ως βαθμολογίας 3 (δεξιά πλευρά). (Β) Η βαθμολόγηση της έκφρασης MFGE8 (γ-άξονας) σε 48 βιοψίες ωοθηκών όγκου από ασθενείς Institut Κιουρί, ως συνάρτηση του βαθμού του όγκου (χ-άξονας). Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά δεν παρατηρήθηκε στην κατανομή των όγκων που υπερεκφράζουν MFGE8 (σκορ 2-3) ή όχι (0-1) με βαθμό 2 έναντι βαθμού 3 όγκους.

Η

Ανάπτυξη της in vitro αναλύσεις για την ποσοτικοποίηση οι επιδράσεις των MFGE8 σε καρκινικά κύτταρα των ωοθηκών

από MFGE8 έχει δειχθεί σε διάφορους τύπους κυττάρων συμπεριλαμβανομένων και ορισμένων κυττάρων όγκου, για την προαγωγή της προσκόλλησης, την επιβίωση και /ή επιθηλιακά-to-μεσεγχυματικά μετάβαση ενδέχεται να οδηγήσει σε μετανάστευση, έχουμε δημιουργήσει νέο

in vitro

προσδιορισμούς για μέτρηση αυτών των φυσιολογικών αποτελεσμάτων στο πλαίσιο του καρκινώματος ωοθηκών. Στις περισσότερες μελέτες, αυτές οι επιδράσεις του MFGE8 αποδόθηκαν στις δεσμευτικές της για ανβ3 ή /και ανβ5 ιντεγκρίνες επί κυττάρων στόχων. Για την επιλογή κυτταρικών γραμμών για την αξιολόγηση της επίδρασης των θεραπειών κατά της MFGE8, αναλύσαμε πρώτα το επίπεδο έκφρασης του mRNA της

MFGE8

και των υποδοχέων του σε μια συλλογή από ανθρώπινες καρκινικές κυτταρικές σειρές των ωοθηκών. Δημόσια αποτελέσματα από την κυτταρική σειρά Broad-Novartis Καρκίνος Εγκυκλοπαίδεια χρησιμοποιήθηκαν για το σκοπό αυτό (https://www.broadinstitute.org/ccle/home). Έξω από το κύτταρο 38 γραμμές όγκου (Σχήμα 2α), μόνο 5 δεν εκφράζουν

MFGE8

πάνω από το επίπεδο εμπιστοσύνης ((MAS5 «Απών» σημαία που αντιστοιχεί σε ένα σήμα έκφρασης Affymetrix U133plus2.0 (Σύνδεση

2 .) χαμηλότερο από 6,1 για αυτό το probeset) Επιβεβαιώσαμε έκκριση πρωτεΐνης MFGE8 με ανάλυση ELISA του ρυθμισμένου μέσου των δύο από τα mRNA που εκφράζουν κυτταρικές σειρές: SKOV-3 και IGROV-1, και αναγνωρίσαμε μια άλλη κυτταρική γραμμή καρκινώματος των ωοθηκών, επικαλαμίδα 3 [14], η οποία δεν εκκρίνουν ανιχνεύσιμα επίπεδα MFGE8

in vitro

(Σχήμα 2β). τα 38 κυτταρικές γραμμές όγκου που εκφράζεται τα γονίδια που κωδικοποιούν αν- (

ITGAV

, σήμα έκφρασης πάνω από 10 σε περισσότερες περιπτώσεις, τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται), και οι αλυσίδες β5 ιντεγκρίνη (

ITGB5

, Σχήμα 2c). Αντιθέτως, το σήμα Affymetrix για την αλυσίδα β3 ιντεγκρίνης (

ITGB3

) ήταν μόνο κοντά στην εμπιστοσύνη επίπεδο (σήμα έκφρασης = 4,8 για αυτό το probeset) για περισσότερες κυτταρικές σειρές (23/38 = 60,5%), συμπεριλαμβανομένης SKOV-3 και IGROV-1, υποδηλώνοντας ασθενή ή καθόλου έκφραση αυτής της ιντεγκρίνης. με κυτταρομετρία ροής, ωστόσο, τόσο SKOV-3 και IGROV-1 εμφανίζεται ανβ3 επιπροσθέτως ανβ5 στην επιφάνειά τους, ενώ SHIN-1 εμφανίζονται μόνο ανβ5 (Σχήμα 2d). έτσι επιλέξαμε την κυτταρική σειρά SKOV-3 ως ένα αντιπροσωπευτικό παράδειγμα ενός μεγάλου ποσοστού των κυτταρικών σειρών καρκίνου των ωοθηκών (μεσαίας έως υψηλής

MFGE8

, ανιχνεύσιμη

ITGB3

και

ITGB5

), και ένα ευαίσθητο να ανταποκριθεί στις MFGE8 αφού εξέφρασε τις γνωστές υποδοχείς για MFGE8, να αναπτύξουν τις λειτουργικές

in vitro

δοκιμασίες.

(α) Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του mRNA ( Σύνδεση

2 (σήμα Affymetrix U133plus2.0)) του

MFGE8

σε δημόσιους αποτελέσματα των δεδομένων μικροσυστοιχιών της κυτταρικής σειράς ευρείας Novartis Καρκίνος εγκυκλοπαίδεια. Το όριο επίπεδο έκφρασης πίσω από την οποία θα μπορούσε να θεωρηθεί ως θόρυβος (MAS5 «Απουσία» κατάσταση της σημαίας, το γονίδιο δεν εκφράζεται) είναι 6,1 για αυτό το probeset. Μαύρα βέλη δείχνουν τις κυτταρικές σειρές SKOV-3 και IGROV-1. (Β) Ποσοτικοποίηση των MFGE8 με ELISA σε SKOV-3, IGROV-1 και Shin-3 ρυθμισμένο μέσο (24 ώρες). Εκκρινόμενο MFGE8 εκφράζεται σε ng /ml ανά 10

6 καλλιεργημένα κύτταρα. Η μέση των δύο πειραμάτων + SD. (Γ) Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του mRNA (Σύνδεση

2 (σήμα Affymetrix U133plus2.0)) του

ITGB3

(κόκκινο) και

ITGB5

(πράσινο) στις δημόσιες αποτελέσματα των δεδομένων μικροσυστοιχιών της κυτταρικής σειράς ευρείας Novartis Καρκίνος εγκυκλοπαίδεια. Το όριο επίπεδο έκφρασης πίσω από την οποία θα μπορούσε να θεωρηθεί ως θόρυβος (MAS5 «Απουσία» κατάσταση της σημαίας, το γονίδιο δεν εκφράζεται) είναι 4,8 για το

ITGB3

probeset. (Δ) FACS ανάλυση της ανβ3 (άνω πάνελ) και ανβ5 (κάτω πίνακας) έκφραση ιντεγκρινών στην επιφάνεια του SKOV-3, IGROV-1 και Shin-3 κύτταρα. Ειδικό αντίσωμα (μπλε γραμμή). έλεγχος ισοτύπου (κόκκινη γραμμή).

Η

Έχουμε αναπτύξει 3 τύπους προσδιορισμών να διερευνηθούν οι επιδράσεις του MFGE8 στην προσκόλληση, μετανάστευση και την επιβίωση των κυττάρων του όγκου. Το σύστημα xCELLigence (ACEA Biosciences), μια συσκευή που επιτρέπει σε πραγματικό χρόνο μέτρηση της σύνδεσης σε ένα υπόστρωμα κυττάρων, χρησιμοποιήθηκε για την ποσοτικοποίηση των βραχυπρόθεσμων προσκόλληση σε ανθρώπινη ανασυνδυασμένη MFGE8 (Σχήμα 3a-e), και μακροχρόνια μετανάστευση transwell προς MFGE8 σε η παρουσία ορού εμβρύου μόσχου (FCS 0,1%) (Σχήμα 3F-h). Κλασική με βάση φθορισμό ποσοτικοποίηση του αριθμού των κυττάρων χρησιμοποιήθηκε για την αξιολόγηση μακροπρόθεσμη επιβίωση σε συνθήκες λιμοκτονίας (Σχήμα 3i, j).

(α-ε) Δοκιμασία για την πρόσφυση του SKOV-3 να MFGE8 χρησιμοποιώντας το σύστημα xCELLigence . (Α) Παράδειγμα δείκτη κυττάρου (CI) ως συνάρτηση του χρόνου, σε PBS ή ανθρώπου MFGE8 (huMFGE8), με την παρουσία του αντι-huMFGE8 ή IgG ελέγχου. Μπλε και κόκκινες κάθετες γραμμές δείχνουν τα χρονικά σημεία που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των τιμών κλίση. (Β) Η προσκόλληση του SKOV-3 να MFGE8, σε σύγκριση με PBS (Ctrl), ποσοτικά με τιμή κλίσης μεταξύ 0 και 2 ώρες. (Γ) Αναστολή της πρόσφυσης σε 5 μg /mL MFGE8 από 10 μg /mL αντι-huMFGE8 (hMc3) ή ένα αρνητικό μάρτυρα (Rituximab, Ritux). (Δ) Επίδραση επί προσκόλληση σε 5 μg /mL MFGE8 (Ctrl) πολυκλωνικών ορών αντι-huMFGE8 (1/100) ειδικό για την RGD-τομέα (αντι RGD), η περιοχή C1 (αντι C1) ή το RGD τομέα του ποντικού Mfge8 (αντι RGD ποντικού). (Ε) αναστολή της προσκόλλησης σε 5 μg /mL MFGE8 (Ctrl) με αντι-ανβ3 ή /και -αvβ5 ιντεγκρίνης αντισωμάτων (5 μg /mL το καθένα). (Στ-ζ) Δοκιμασία για τη μετανάστευση της SKOV-3 χρησιμοποιώντας xCELLigence. Τα κύτταρα σπάρθηκαν στον άνω θάλαμο, και MFGE8 και αντισώματα στον κάτω θάλαμο του CIM-πλακών. (Στ) Παράδειγμα δείκτη κυττάρου (άξονας γ) ως συνάρτηση του χρόνου (χ άξονας), σε παρόμοιες συνθήκες όπως (α). Μπλε και κόκκινες κάθετες γραμμές δείχνουν τα χρονικά σημεία που χρησιμοποιούνται για τον υπολογισμό των τιμών κλίση. (Ζ) δοσο-εξαρτώμενο αποτέλεσμα των MFGE8 επί SKOV-3 μετανάστευση, σε σύγκριση με PBS (Ctrl), ποσοτικά με τιμή κλίσης μεταξύ 0 και 18 ώρες. (H) αναστολή της μετανάστευσης σε 5 μg /mL huMFGE8 με 10 μg /ml αντι-huMFGE8 hMc3, σε σύγκριση με αρνητικό έλεγχο (Ritux). (I-j) Επιβίωση δοκιμασία SKOV-3 καλλιεργήθηκαν για 96 ώρες παρουσία 0.1% ορό. Ο αριθμός των κυττάρων προσδιορίζεται ποσοτικά ως αυθαίρετες μονάδες φθορισμού (A.U.) σε σύγκριση με την κατάσταση ελέγχου που αντιστοιχεί στο 100%. (I) δοσο-εξαρτώμενο αποτέλεσμα των MFGE8 επί SKOV-3 επιβίωση. 100% = βασικό επίπεδο Α.υ. σε απουσία εξωγενών MFGE8 (Ctrl). (Ι) Η αναστολή της επιβίωσης σε παρουσία 10 μg /mL huMFGE8, από 10 μg /mL hMc3 ή το αρνητικό αντίσωμα. 100% = βασικό επίπεδο Α.υ. παρουσία MFGE8. Τα δεδομένα παρουσιάζονται ως Box-and-μουστάκια γραφήματα που δείχνουν την ελάχιστη (κάτω γραμμή σφάλματος), 25

ο εκατοστημόριο-μέση-75

ου τιμές (άνω ράβδος σφάλματος) εκατοστημόριο και τη μέγιστη. Ν = 4 (εκτός 3j: Ν = 5). *** = Ρ & lt? 0.001? ** = Ρ & lt? 0,01? * = P & lt? 0,05 σε σύγκριση με το Ctrl = PBS σε 3b, g? σε 0.312 μg /ml MFGE8 στην 3i? ή Ctrl = MFGE8 στο 3γ, δ, ε, η, ι ..

Η

Η συσκευή xCELLigence μετρά συνεχώς αλλαγές στην αντίσταση που προκαλείται από τα κύτταρα, όταν αντιμετωπίζουν ηλεκτρόδια που καλύπτει το κάτω μέρος του ένα μικροπλάκα καλλιέργειας (ePlate ). Το επίπεδο του σήματος σύνθετη αντίσταση είναι ανάλογη με τον αριθμό των κυττάρων και την ένταση της αλληλεπίδρασης τους με το υπόστρωμα, και αυτό το σήμα μπορεί έτσι να μετατραπεί σε μία αυθαίρετη τιμή του δείκτη κυττάρου (Σχήμα 3a, f). Αποτελεσματικότητα της κυτταρικής πρόσδεσης υπολογίζεται ως η κλίση της σύνθετης αντίστασης που παρατηρείται στις πρώτες δύο ώρες μετά την σπορά των κυττάρων (Σχήμα 3a-e). Για τη μέτρηση της πρόσφυσης του SKOV-3 προς MFGE8, ανασυνδυασμένη ανθρώπινη MFGE8 επικαλύφθηκε στις μικροκυψελίδες xCELLigence, σε συνθήκες παρόμοιες με εκείνες που είχαν προηγουμένως χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση πρόσδεσης των ανθρώπινων ενδοθηλιακών κυττάρων σε MFGE8 [4]. Το Σχήμα 3b δείχνει ότι MFGE8 επιτρέπεται πρόσδεση των κυττάρων στο υπόστρωμα με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Δοκιμάσαμε τα αποτελέσματα του περιγράφηκε προηγουμένως αντισωμάτων ειδικών για ανθρώπινη MFGE8 σε αυτή τη δοκιμασία: οροί κουνελιών που παράγεται στο εργαστήριο μας, αναγνωρίζοντας αντίστοιχα είτε το περιέχον RGD σύνδεσης με ιντεγκρίνη τομέα [4] ή την περιοχή δισκοϊδίνης C1 του ανθρώπινου MFGE8 (C. Thery, αδημοσίευτα δεδομένα), και μία εξανθρωπισμένη εκδοχή του μονοκλωνικού αντισώματος Mc3 περιγράφεται από Ceriani κ.ά. [15], (hMc3) [16] που αναγνωρίζει επίσης την περιοχή σύνδεσης με ιντεγκρίνη της MFGE8. Τόσο το αντίσωμα hMC3 (Σχήμα 3c) και το αντι-RGD τομέα κουνελιού (Εικόνα 3d) ισχυρά ανέστειλε προσκόλληση κυττάρου, ενώ ούτε ένα εξανθρωπισμένο αντίσωμα ελέγχου (Ritux, Εικόνα 3c), ούτε ο αντι-C1 ορό τομέα κουνέλι, ούτε ένας ορός κουνελιού με την RGD-πεδίο του Mfge8 ποντικού (αντι C1 ή αντι RGD ποντικού, Εικόνα 3d) ανέστειλε. Τέλος, το κλείδωμα αντισωμάτων σε ανβ3 ή ανβ5 ανέστειλε την πρόσδεση, και τα αποτελέσματά τους ήταν πρόσθετο (σχήμα 3e). Ετσι, η προσκόλληση του SKOV-3 να MFGE8 διαμεσολαβείται από την αλληλεπίδραση των ανβ3 /5 κύτταρα που εκφράζουν με τον περιέχοντα RGD τομέα MFGE8.

Η συσκευή xCELLigence ήταν δίπλα χρησιμοποιείται με ηλεκτρόδιο επικαλυμμένο με Boyden μικροφρεάτια θάλαμο ( CIM πλακίδια), το οποίο επιτρέπει τη μέτρηση της σύνθετης αντίστασης που παράγεται μετά τη μετανάστευση των κυττάρων στην κάτω πλευρά του ένα 8 μm φίλτρο πόρου που χωρίζει το ανώτερο από τον κατώτερο θάλαμο (Σχήμα 3F). Η ικανότητα των κυττάρων να μεταναστεύουν προς την MFGE8 περιέχει κάτω διαμέρισμα, με την παρουσία ενός πανομοιότυπου μικρής ποσότητας FCS και στα δύο διαμερίσματα (0,1%), υπολογίστηκε ως η κλίση της δείκτη κυττάρου μεταξύ 0 και 18 ώρες μετά την κυτταρική σπορά στην άνω θάλαμο (Σχήμα 3F-h). Το σχήμα 3g και 3h δείχνουν ότι MFGE8 επάγεται SKOV-3 μετανάστευση με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, και ότι, όπως και για τη δοκιμασία προσκόλλησης, hMC3 αναστέλλεται ειδικά αυτό το αποτέλεσμα.

Η τρίτη δοκιμασία μέτρησε την επίδραση της MFGE8 στην επιβίωση του SKOV-3 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες λιμοκτονίας (0,1% FCS). Η παρουσία του MFGE8 προκάλεσε μια δοσοεξαρτώμενη αύξηση του SKOV-3 επιβίωση, ανιχνεύσιμα τέσσερις ημέρες μετά την σπορά (Σχήμα 3i), η οποία, αν και δεν είναι πολύ ισχυρή, ήταν επαναλήψιμη. Αυτή η επίδραση επίσης αποκλειστεί ρητά από το MFGE8-ειδικό αντίσωμα hMC3 (Σχήμα 3ι).

Δημιουργία νέου αντι-MFGE8 μονοκλωνικά αντισώματα με αντικαρκινικές ιδιότητες

Για να επικυρώσετε το νέο μας ισχυρή και επαναλήψιμη

in vitro

δοκιμασίες ως εργαλεία για τον εντοπισμό νέων ανασταλτικοί παράγοντες MFGE8, εμείς τους που χρησιμοποιούνται για τον έλεγχο ενός μεγάλου συνόλου νέα αντισώματα αντι-MFGE8 δημιουργούνται με ανοσοποίηση Mfge8-ανεπαρκή ποντίκια μας [4,17] με ανασυνδυασμένη MFGE8. Σε όλους τους προσδιορισμούς, πειραματικές συνθήκες συγκρίθηκαν με τα κύτταρα αναπτύσσονται παρουσία του MFGE8, θεωρείται ως 100% σήμα. Τα μονοκλωνικά αντισώματα εμφάνιση συγκεκριμένων σύνδεση με ανθρώπινο MFGE8

in vitro

, και καμία δέσμευση σε άλλες πρωτεΐνες με κοινές δομικές περιοχές (δηλαδή βιτρονεκτίνη και τον παράγοντα VIII) ελέγχθηκαν στην δοκιμασία προσκόλλησης SKOV-3. Τα διαφορετικά αντισώματα που εμφανίζονται διαφορετικές ανασταλτικές δραστηριότητες σε αυτή τη δοκιμασία. Σχήμα 4α δείχνει παραδείγματα των αποτελεσμάτων της αρχικής οθόνης (εκτελείται μία φορά) για 10 υποψηφίους. Επιλέξαμε πέντε αντισώματα τα οποία εμφανίζονται δραστηριότητες παρόμοιες με το hMc3 αντίσωμα αναφοράς όταν χρησιμοποιήθηκε σε 50 ή 10 μg /mL.

(α) Επίδραση των 10 νέων αντισωμάτων αντι-MFGE8 (10 ή 50 μg /mL) για προσκόλληση να MFGE8 (δοκιμασία προσκόλλησης), σε σύγκριση με hMC3. 100% πρόσφυση αντιστοιχεί σε 5 μg επίστρωση /mL MFGE8 χωρίς αντισώματα (ctrl). Παράδειγμα από τα πειράματα διαλογής, εκτελείται μία φορά με καθένα από τα 40 νέα αντισώματα. Μαύρο βέλη δείχνουν τα αντισώματα επιλέγονται για περαιτέρω χαρακτηρισμό. (Β) επίδραση δόσης-απόκρισης των 5 επιλεγμένων αντισωμάτων, σε σύγκριση με hMC3 στη δοκιμασία προσκόλλησης. (Γ) η επίδραση δόσης-απόκρισης των 5 επιλεγμένων αντισωμάτων, σε σύγκριση με hMC3 στη δοκιμασία μετανάστευσης. 100% μετανάστευση αντιστοιχεί σε 5 μg /mL MFGE8 χωρίς αντισώματα. (Δ) φαινόμενο δόσης-απόκρισης των 5 επιλεγμένων αντισωμάτων, σε σύγκριση με hMC3 στη δοκιμασία επιβίωσης. 100% επιβίωση αντιστοιχεί σε 10 μg /ml ανασυνδυασμένης MFGE8 χωρίς αντισώματα. Box-and-μουστάκια γραφήματα όπως στο Σχήμα 3. Ν = 4 (εκτός από (γ) για 215A9 -10 μg /mL και 311A7 -0.625 μg /mL: Ν = 3 και για hMc3: N = 2? Στο (Β) για 215A9 -5μg /mL: N = 2). *** = Ρ & lt? 0.001? ** = Ρ & lt? 0,01? * = P & lt?. 0.05 σε σύγκριση με την χαμηλότερη συγκέντρωση αντισώματος (0.5 ή 0.625 μg /ml) για κάθε μεμονωμένο αντίσωμα σε 4b, c, d

Η

Για να προσδιοριστεί η αποτελεσματικότητα αυτών των 5 υποψηφίων, μειούμενες ποσότητες του αντισώματος από 50 να 0,5 μg /mL χρησιμοποιήθηκαν στη δοκιμασία προσκόλλησης (σχήμα 4β). Με την παρουσία 10 μg /mL του hMc3 ή όλους τους κλώνους, εκτός από 346B6, παρατηρήθηκε λιγότερο από 20% της κυτταρικής συγκόλλησης. Στην περίπτωση των 346B6 σε 10 μg /ml, 40% των προσκόλλησης κυττάρου ανιχνεύθηκε (διάμεση τιμή των 4 μετρήσεων). Με την παρουσία του 0,5 μg /mL από τρεις κλώνους (416H9, 399A12 και 311A7), παρατηρήθηκε 60% κυτταρικής προσκόλλησης, ενώ το 90% προσκόλληση ελήφθη με hMc3 σε αυτή τη συγκέντρωση.

Όταν ελέγχθηκε σε ένα δοσο ρύθμιση απόκριση στη δοκιμασία μετανάστευσης (Σχήμα 4γ), όλα τα αντισώματα μειωμένη μετανάστευση όταν χρησιμοποιείται στην υψηλότερη συγκέντρωση (20 μg /mL). Δύο κλώνοι (416H9, 399A12) μειώθηκε σημαντικά μετανάστευση όταν χρησιμοποιήθηκε σε 2,5 μg /mL.

Τέλος, τα αντισώματα δοκιμάστηκαν στην δοκιμασία επιβίωσης με την παρουσία 10 μg /mL MFGE8 (= 100% επιβίωση στην Εικόνα 4δ). 346B6, το λιγότερο αποτελεσματικό κλώνος στις άλλες δύο δοκιμασίες, δεν μείωσε την επιβίωση σε οποιαδήποτε συγκέντρωση, δύο άλλοι επαγόμενη το πολύ 30% αναστολή (= σήμα επιβίωσης κυττάρου 70% παρέμεινε) όταν χρησιμοποιείται στην υψηλότερη συγκέντρωση (2154A9 και 311A7), ενώ τα δύο τελευταία (416H9 και 399A12) ήταν τόσο αποτελεσματική όσο hMc3, και μείωσαν τον αριθμό των κυττάρων σε λιγότερο από το 50% των MFGE8-alone κατεργασμένων κυττάρων (= 50% επιβίωση).

η συνδυασμένη χρήση τριών συμπληρωματικών δοκιμασιών έτσι επιτρέπει τη σαφή επιλογή των 2 αντισωμάτων, από τα 40, ως δυνητικά τα πιο αποτελεσματικά εργαλεία για να αναστέλλουν ταυτόχρονα την πρόσφυση, τη μετανάστευση και την επιβίωση των MFGE8- και ανβ3 /5 εκφράζουν καρκίνωμα ωοθήκης.

Επίδραση των MFGE8 και MFGE8 -blocking αντισώματα σε άλλα κύτταρα του καρκινώματος των ωοθηκών

για να προσδιοριστεί κατά πόσον τα αποτελέσματα που λαμβάνονται με SKOV-3 ήταν αντιπροσωπευτικές άλλων κυτταρικές γραμμές καρκινώματος των ωοθηκών, εκτελέσαμε τις ίδιες τρεις δοκιμασίες, χρησιμοποιώντας IGROV-1 και Shin-3, η οποία, όπως φαίνεται στο Σχήμα 2, είτε εκφράζονται MFGE8 και ανβ3 /5 ιντεγκρίνες σε επίπεδα παρόμοια με SKOV-3 (IGROV-1), ή δεν εκφράζουν MFGE8 ή την ιντεγκρίνη ανβ3 (Shin-3). Τρία αντισώματα εκπρόσωπος των τριών μορφές βελτίωσης της αποτελεσματικότητας που παρατηρείται σε SKOV-3 χρησιμοποιήθηκαν εδώ: 399A12, 311A7 και 346B6, αντίστοιχα αποδόσεις υψηλής, μέσης και χαμηλής δέσμευσης. Στην δοκιμασία προσκόλλησης xCELLigence-based (Σχήμα 5α, β), SHIN-3 έδωσε μια 20-φορές χαμηλότερο σήμα σύνθετης αντίστασης από SKOV-3 ή IGROV-1 (σύγκρινε τιμές κλίσης στο σχήμα 5b και 5α), αλλά όπως και στην SKOV-3 , προσκόλληση αυξήθηκε και για τις δύο κυτταρικές γραμμές με την παρουσία 5 μg /mL MFGE8, και ανέστειλε με δοσο-εξαρτώμενο τρόπο από τα 3 αντισώματα. Στη δοκιμασία μετανάστευσης (Εικόνα 5c, d), όπου SHIN-3 εμφανίζεται ένα ποσοστό μετανάστευσης παρόμοια με SKOV-3 και IGROV-1, οι τρεις αντισώματα ανέστειλαν επίσης MFGE8 εξαρτώμενη μετανάστευση των IGROV-1 και Shin-3 σε μια δόση εξαρτώμενο τρόπο και με την ίδια υψηλής, μέσης και χαμηλής απόδοσης, όπως το SKOV-3. Αντίθετα, η δοκιμασία επιβίωσης (Σχήμα 5e, ί) έδειξε μια διαφορετική επίδραση των MFGE8 στις τρεις κυτταρικές γραμμές: SHIN-3 δεν εμφανίζει καμία αυξημένη επιβίωση παρουσία MFGE8, ούτε οποιαδήποτε επίδραση των αντισωμάτων MFGE8-blocking σε αυτό δοκιμασίας, ενώ IGROV-1 συμπεριφέρθηκε σαν SKOV-3.

(α-β) προσκόλληση των IGROV-1 (α) και Shin-3 (β) σε 5 μg /mL MFGE8, σε σύγκριση με PBS, ποσοτικοποιείται με τιμή κλίσης μεταξύ 0 και 2 ώρες. Η επίδραση των τριών επιλεγμένων αντισωμάτων που παραδίδεται σε δύο δόσεις (2,5 και 10 μg /mL) επί MFGE8 επικαλυμμένα φρεάτια δείχνεται επίσης. (C-d) IGROV-1 (c) και Shin-3 (δ) δοκιμασία μετανάστευσης προς 5 μg /mL MFGE8 όπως στο Σχήμα 3-4, και η αναστολή από αντισώματα όπως στο πάνελ Α και Β για την πρόσφυση. Πλαγιές τιμές που υπολογίζονται μεταξύ 0 και 18 ώρες. (Δ-ε) IGROV-1 (δ) και Shin-3 (ε) δοκιμασία επιβίωσης με την παρουσία 10 μg /mL MFGE8, όπως στο Σχήμα 3-4, και αναστολή από 2,5 ή αντισώματα 10μg /mL. 100% επιβίωση αντιστοιχεί σε 10 μg /mL MFGE8 χωρίς αντισώματα. Box-and-μουστάκια γραφήματα όπως στο Σχήμα 3. Ν = 4 (εκτός από (β): 399A12 -2,5 μg /mL, 346B6 -10 μg /mL, 311A7 -10 μg /mL: Ν = 3? Στο (ε, στ) PBS και MFGE8: Ν = 5? στο (στ) MFGE8 + 311A7: Ν = 3). *** = Ρ & lt? 0.001? ** = Ρ & lt? 0,01? * = P & lt?. 0.05, σε σύγκριση με το Ctrl = MFGE8

Η

MFGE8 υπερέκφραση σε τριπλή αρνητική καρκίνους του μαστού

Τέλος, για να καθοριστεί εάν νέοι παράγοντες MFGE8-αποκλειστές, όπως τα αντισώματα που προσδιορίζονται παραπάνω, θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για τη θεραπεία άλλων όγκων, αναλύσαμε την έκφραση MFGE8 με ανοσοϊστοχημεία στη συλλογή μας από βιοψίες καρκίνου του μαστού που δημιουργείται από ασθενείς που έλαβαν τα Institut Curie (Πίνακας S2). MFGE8 ήταν περισσότερο έντονα εκφρασμένη σε ασθενείς με προχωρημένο βαθμούς του καρκίνου του μαστού (Σχήμα 6Α), και πιο συγκεκριμένα στον τριπλό-αρνητικό HR-/HER2- υπότυπο αυτών των καρκίνων (τα οποία είναι, στην πλειονότητά του βαθμού 3): 13/20 = 65 % του triple-αρνητικών βιοψιών εμφανίζεται επίπεδα MFGE8 κατατάσσεται ως 2 ή 3, ενώ μόνο το 5/36 = 13,8% των ορμονικών υποδοχέων (HR) ή /και HER2 θετικό όγκοι εμφανίζονται τα επίπεδα 2 ή 3 της έκφρασης MFGE8 (Σχήμα 6β). έτσι αυτές οι παρατηρήσεις επιβεβαιώνουν τα αποτελέσματα που δημοσιεύθηκαν πρόσφατα από Yang και συναδέλφους [13].

(α-β) Η βαθμολόγηση της έκφρασης MFGE8, αναλύθηκαν με ανοσοϊστοχημεία, όπως στο σχήμα 1, στο 59 βιοψίες των όγκων του μαστού από ασθενείς Institut Curie, το ως συνάρτηση του βαθμού του όγκου (α) ή φαινότυπο σε όρους Hormon Receptor (HR) ή έκφραση HER2 (β). ***: P = 0.0001 για τη διανομή των όγκων που υπερεκφράζουν (σκορ 2-3) ή όχι (0-1) MFGE8 μεταξύ βαθμού 2 σε σχέση με βαθμού 3 όγκων (α), ή μεταξύ HR + /HER2- έναντι τριπλά αρνητικούς όγκους ( σι). (Γ) Ανάλυση των επιπέδων έκφρασης του mRNA (Σύνδεση

2 (σήμα Affymetrix U133plus2.0)) του

MFGE8

σε δημόσιους αποτελέσματα της Affymetrix δεδομένων μικροσυστοιχιών της κυτταρικής σειράς ευρείας Novartis Καρκίνος Εγκυκλοπαίδεια όπως στο σχήμα 2 . Μαύρο βέλος δείχνει η κυτταρική σειρά MDA-MB-231 (HR-/HER2- τριπλά αρνητικό φαινότυπο) που επιλέγεται για τα επόμενα πειράματα. (Δ) Ποσοτικοποίηση των MFGE8 με ELISA σε MDA-MB-231 ρυθμισμένο μέσο (24 ώρες). Εκκρινόμενο MFGE8 εκφράζεται σε ng /ml ανά 10

6 καλλιεργημένα κύτταρα. Η μέση των δύο πειραμάτων + SD. (Ε) FACS ανάλυση της ανβ3 (αριστερό πάνελ) και ανβ5 (δεξί πάνελ) ιντεγκρίνης έκφραση στην επιφάνεια των κυττάρων MDA-MB-231 κύτταρα. Ειδικό αντίσωμα (μπλε γραμμή). ελέγχου ισοτόπου (κόκκινη γραμμή). (Στ) δοκιμασία MDA-MB-231 πρόσφυση σε 5 μg /mL MFGE8, όπως στο Σχήμα 3-5, και αναστολή από 10 μg /mL hMC3, που απεικονίζεται ως τιμές κλίσης μεταξύ 0 και 1 ώρα. (Ζ) MDA-MB-231 δοκιμασία μετανάστευσης σε 5μg /mL MFGE8 όπως στο Σχήμα 3-5, και αναστολή από 10 μg /mL 215A9 αντίσωμα. Δεδομένα που παριστάνεται ως τιμές κλίσης που υπολογίζεται μεταξύ 0 και 18 ώρες. (H) MDA-MB-231 δοκιμασία επιβίωσης με την παρουσία 10 μg /mL MFGE8, όπως στο Σχήμα 3-5, και αναστολή από 10 μg /mL 399A12. 100% επιβίωση αντιστοιχεί σε 5 μg /mL MFGE8 χωρίς αντισώματα. Box-and-μουστάκια γραφήματα όπως στο Σχήμα 3. Ν = 4 (εκτός από (ζ): PBS Ν = 6, MFGE8 + 215A9 Ν = 5, και (h): Ctrl Ν = 6, MFGE8: Ν = 5) . ***: Ρ & lt? 0.001, **:. Ρ & lt? 0,01, σε σύγκριση με το Ctrl = MFGE8

Η

Με συνέπεια, η ανάλυση της γραμμής τηλέφωνα Broad-Novartis Καρκίνος δεδομένων έκφραση Εγκυκλοπαίδεια των κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού έδειξε έκφραση του

MFGE8

πάνω από το επίπεδο εμπιστοσύνης (Σύνδεση

2 Affymetrix U133plus2.0 σήμα της MAS5 «απουσίας» σημαία = 6,1 για

MFGE8

) στην πλειοψηφία των triple-αρνητικών κύτταρα του μαστού (24/29 = 82%), ενώ μόνο το 2/23 = 9% του HR ή /και HER2 + κύτταρα εκφράζουν το γονίδιο (Σχήμα 6γ). Τέλος, εξετάσαμε τις επιδράσεις της MFGE8 και τα αντισώματα αποκλεισμού στην προσκόλληση, η μετανάστευση και η επιβίωση του τριπλού-αρνητική κυτταρική σειρά MDA-MB-231, το οποίο εκκρίνει MFGE8 και εκφράζει ανβ3 και ανβ5 ιντεγκρίνες, όπως SKOV-3 και IGROV-1 (Σχήμα 6d, e). Όπως φαίνεται στο Σχήμα 6f-h, MDA-MB-231 εμφανίζεται MFGE8 επαγόμενη προσκόλληση (Σχήμα 6f), μετανάστευση (Σχήμα 6g), και την επιβίωση (Σχήμα 6Η). Επιπλέον, τα αντισώματα αντι-MFGE8 εμφανίζονται παρόμοιες συνέπειες για MDA-MB-231, όπως έκαναν στο SKOV-3 κύτταρα.

έτσι αποτελέσματά μας επιβεβαιώνουν MFGE8 ως μια πολλά υποσχόμενη στόχο για μια στρατηγική βασισμένη σε αντισώματα που στοχεύουν στο να εμποδίσουν όγκου ανάπτυξη της triple-αρνητικών καρκίνων του μαστού

Συζήτηση

Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ αναδείξει ένα νέο τύπο καρκίνου ως πιθανός στόχος για MFGE8-blocking θεραπείες:. καρκίνωμα των ωοθηκών. Επιπλέον, περιγράφουμε νέες δοκιμασίες προσαρμόσιμο σε διαλογή μεγάλης κλίμακας, και σε κυτταρικές σειρές καρκίνου διαφορετικών προελεύσεων ιστού, η οποία θα επιτρέψει τον προσδιορισμό των πλέον χρήσιμοι παράγοντες MFGE8-αποκλειστές που θα χρησιμοποιηθεί την επόμενη σε προ-κλινικές

in vivo

δοκιμασίες ανάπτυξης όγκου.

Η συνδυασμένη ανάλυση των 3 φυσιολογικά αποτελέσματα MFGE8 /lactadherin επί κυττάρων όγκου, δηλαδή προσκόλληση, η μετανάστευση και επιβίωση, μας επέτρεψε να ταξινομήσει 5 διαφορετικά MFGE8-ειδικά αντισώματα, και να τα συγκρίνουν με την αναφορά αντισώματος hMc3. Mc3 περιγράφηκε πριν από 30 χρόνια για την ικανότητά του να δεσμεύεται σε κυκλοφορούσες μαστικών επιθηλιακών κυττάρων αντιγόνα σε ασθενείς με καρκίνο [18]. Σύντομα μετά δειχθεί ότι αναστέλλει την ανάπτυξη των ανθρώπινων όγκων του μαστού σε γυμνά ποντίκια είτε μόνα τους [15], ή, πιο αποτελεσματικά, ως ένα συζυγές με

131I [19]. Το αντιγόνο που αναγνωρίζεται από Mc3 κλωνοποιήθηκε ως MFGE8 (κατά τον χρόνο που ονομάζεται ΒΑ46) λίγα χρόνια αργότερα [3], και χαρτογράφηση επιτόπων αναγνώρισε την περιέχουν RGD περιοχή EGF ως στόχος του Mc3, ενώ ένα άλλο αντίσωμα, MC8, αναγνωρίζεται ένα επιτόπιο στην C2 τομέα και δεν εμφανίζουν αντικαρκινική δράση

in vivo

[20]. Σε τρεις δοκιμασίες μας, Mc3 ανέστειλε αποτελεσματικά τις επιδράσεις του ανασυνδυασμένου MFGE8, υποδηλώνοντας ότι η RGD τομέα και την αλληλεπίδρασή του με ανβ3 /5 ιντεγκρίνες απαιτούνται για την προσκόλληση, η μετανάστευση μέσω της Transwell, και την επιβίωση των κυττάρων. Επειδή παρατηρήσαμε ότι, μεταξύ δύο αντι-MFGE8 αντιορούς κουνελιού μας, μόνο από τη μία αναγνωρίζει το RGD μπλοκ τομέα προσκόλληση, μπορούμε να αποκλείσει ένα ρόλο άλλους τομείς της MFGE8 σε αυτόν τον τύπο λειτουργίας. Αλλά δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι η μετανάστευση και η επιβίωση θα μπορούσε επίσης να προκαλείται από άλλους τύπους αλληλεπιδράσεων του MFGE8 με το κύτταρο-στόχο, ενδεχομένως μέσω άλλου υποδοχέα, όπως προτείνεται για δέσμευση του σπέρματος στο αυγό διαμεσολαβείται από SED1 (ένα άλλο όνομα του MFGE8) [21].