Αφηρημένο

Ιστορικό

Runt σχετίζονται μεταγραφικού παράγοντα 3 (RUNX3) είναι ένα ογκοκατασταλτικό του καρκίνου και φαίνεται να είναι μια σημαντικό συστατικό του μετασχηματιστικού αυξητικού παράγοντα-βήτα (TGF-β) προκληθείσα μονοπάτι καταστολή όγκου. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης RUNX3 στο κεφάλι και το λαιμό καρκίνωμα πλακωδών κυττάρων (HNSCC) ιστών, η οποία είναι μία από τις πιο κοινές μορφές καρκίνου στον άνθρωπο, ήταν υψηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς από ένα προηγουμένως δημοσιευθεί σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχίας στην προκαταρκτική μελέτη μας. Ως εκ τούτου, εδώ εξετάσαμε την ογκογόνο ρόλο του RUNX3 σε HNSCC.

Κύρια Ευρήματα

Η συχνή έκφραση RUNX3 και ο συσχετισμός της με κακοήθη συμπεριφορά παρατηρήθηκαν σε HNSCC. Έκτοπη RUNX3 υπερέκφραση προωθείται κυτταρική ανάπτυξη και λιμοκτονία επαγόμενη απόπτωση αναστέλλεται ορού και χημειοθεραπευτικό φάρμακο απόπτωση που επάγεται σε κύτταρα HNSCC. Τα ευρήματα αυτά επιβεβαιώθηκαν από RUNX3 νοκ ντάουν. Επιπλέον, RUNX3 υπερέκφραση ενισχυμένη tumorsphere σχηματισμό. επίπεδο έκφρασης RUNX3 ήταν καλά συσχετίζεται με την κατάσταση μεθυλίωσης σε κύτταρα HNSCC. Επιπλέον, η έκφραση RUNX3 ήταν χαμηλή λόγω της μεθυλίωσης του υποκινητή του σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα του στόματος.

Συμπεράσματα /Σημασία

Τα ευρήματά μας υποδηλώνουν ότι i) RUNX3 έχει ογκογόνο ρόλο στην HNSCC, ii) έκφραση RUNX3 παρατηρείται σε HNSCC μπορεί να προκληθεί εν μέρει από απομεθυλίωση κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του καρκίνου, και iii) η έκφραση RUNX3 μπορεί να είναι ένας χρήσιμος δείκτης για την πρόβλεψη κακοήθη συμπεριφορά και τη δράση των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων σε HNSCC

Παράθεση:. Tsunematsu Τ, Kudo Υ, Iizuka S, Ogawa I, Fujita Τ, Kurihara Η, et al. (2009) RUNX3 έχει ογκογόνο ρόλο στη καρκίνου κεφαλής και τραχήλου. PLoS ONE 4 (6): e5892. doi: 10.1371 /journal.pone.0005892

Επιμέλεια: Torbjorn Ramqvist, του Ινστιτούτου Καρολίνσκα, στη Σουηδία

Ελήφθη: 4 Φεβρουαρίου 2009? Αποδεκτές: 15η Μαΐου 2009? Δημοσιεύθηκε: 12 Ιουνίου 2009

Copyright: © 2009 Tsunematsu et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Η έρευνα υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις-σε-βοήθειας από το Υπουργείο Παιδείας, Επιστημών και Πολιτισμού της Ιαπωνίας (YK και ΤΤ) και Satake εκπαίδευση και την έρευνα επιχορήγησης (YK). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

RUNX3 /AML2 /PEBP2C /CBFA3 είναι ένας παράγοντας μεταγραφής και ένα από τα Runt που σχετίζονται με την οικογένεια (RUNX). Τρία μέλη της οικογένειας γονιδίων Runx,

RUNX1

,

RUNX2

και

RUNX3

, και σχετικό γονίδιο,

ΟΒΡΒ /Pebpb2

, είναι όλα γνωστά ως οι αναπτυξιακές ρυθμιστικές αρχές και έχει δειχθεί ότι είναι σημαντική σε ανθρώπινους καρκίνους [1]. RUNX3 αρχικά κλωνοποιήθηκε ως AML2 και εντοπίζεται στο χρωμόσωμα 1ρ36.1 [2]. RUNX3 έχει πολλαπλές λειτουργίες και αρχικά αναφέρθηκε ότι συσχετίζεται με την γένεση και την εξέλιξη του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου ως καταστολέας όγκου [2]. RUNX3-null ποντίκια εμφανίζουν υπερπλασία του γαστρικού βλεννογόνου, ως αποτέλεσμα της διεγείρει τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση κατέστειλε των επιθηλιακών κυττάρων [3]. Στην πραγματικότητα, RUNX3 αδρανοποιείται σε περισσότερες από 80% του ανθρώπινου γαστρικού καρκίνου με γονιδιακή σίγηση και πρωτεΐνη ο εσφαλμένος εντοπισμός [4]. Εκτός γαστρικό καρκίνο, έχει αναφερθεί ότι η μειωμένη έκφραση του RUNX3 παρατηρήθηκε σε διάφορους καρκίνους, συμπεριλαμβανομένων της ουροδόχου κύστης, του ήπατος, του παχέος εντέρου και του πνεύμονα [5] – [8]. Σε αυτούς τους όγκους, μειωμένη έκφραση του RUNX3 ήταν συχνά προκαλούνται από CpG νησίδα υπερμεθυλίωση [9]. Επιπλέον, σημειακές μεταλλάξεις του

RUNX3

παρατηρήθηκαν σε ορισμένο τύπο ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων γαστρικών και της ουροδόχου κύστης καρκίνους [3], [5]. Στο σύνολό τους, RUNX3 δρα ως καταστολέας όγκων σε διάφορους καρκίνους.

Head και ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα αυχένα (HNSCC) είναι ένας από τους πιο κοινούς τύπους καρκίνου στον άνθρωπο, με ετήσια συχνότητα εμφάνισης πάνω από 500.000 περιπτώσεις παγκοσμίως [ ,,,0],10]. Όπως τα περισσότερα επιθηλιακά καρκίνους, HNSCC αναπτύσσεται μέσω της συσσώρευσης πολλαπλών γενετικών και επιγενετικών μεταβολές σε μια διαδικασία πολλών σταδίων [11]. Απροσδόκητα, βρήκαμε ότι το επίπεδο έκφρασης RUNX3 σε ιστούς HNSCC ήταν υψηλότερη από ότι σε φυσιολογικούς ιστούς με προηγουμένως δημοσιευθέντα μικροσυστοιχία σύνολο δεδομένων του 41 ασθενείς HNSCC και 13 φυσιολογικούς ελέγχους στην προκαταρκτική μελέτη μας [12] (Σχήμα 1Α). Είναι ενδιαφέρον, ότι πρόσφατα έχει αναφερθεί ότι η υπερέκφραση RUNX3 παρατηρήθηκε σε βασικοκυτταρικό καρκίνωμα του δέρματος [13]. Ως εκ τούτου, πιστεύαμε ότι RUNX3 μπορεί να έχει μια ογκογόνο ρόλο στην HNSCC καθώς και σε καρκίνωμα βασικών κυττάρων του δέρματος. Στην παρούσα μελέτη, εξετάσαμε την έκφραση και τους ρόλους των RUNX3 για την ανάπτυξη HNSCC

Α:. Ολικό RNA από 41 πρωτοβάθμια HNSCC και 13 φυσιολογικούς ιστούς σημάνθηκε και υβριδοποιήθηκε σε Affymetrix U133A Gene μάρκες όπως αναφέρθηκε προηγουμένως. Γράφημα δείχνει την μέση τιμή της εντάσεως σήματος του RUNX3 σε 41 HNSCC και 13 φυσιολογικούς ιστούς σε ανάλυση μικροσυστοιχιών. επίπεδο έκφρασης RUNX3 σε HNSCC είναι υψηλότερη από εκείνη των φυσιολογικών ιστών. Β: Έκφραση του RUNX3 mRNA σε 14 HNSCC κυτταρικές γραμμές (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ηο-1-Ν-1, ΗΟ-1-U-1, ΖΑ, HOC719-ΡΕ, HOC719-ΝΕ, HOC621, HOC119, HOC313, TSU και ΟΜΙ) με RT-PCR. GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. C: Έκφραση του RUNX3 mRNA σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου (RKO και HCT116), γαστρικό καρκίνο (ΜΚΝ-1 και ΜΚΝ-45), λευχαιμία (HL60), λέμφωμα (U937) και του καρκίνου του μαστού (MCF7 και SK-BR3 ). GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. D: Έκφραση του RUNX3 mRNA σε 18 περιπτώσεις HNSCC με RT-PCR. GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. Ε: Έκφραση πρωτεΐνης RUNX3 σε 6 HNSCC κυτταρικές γραμμές (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ηο-1-Ν-1 και ΗΟ-1-U-1) εξετάστηκε με ανάλυση κηλίδος Western. έκφραση Cul1 χρησιμοποιήθηκε ως μάρτυρας φόρτωσης.

Η

Υλικά και Μέθοδοι

Αντιδραστήρια

Μετασχηματισμός SS1 αυξητικού παράγοντα (TGF-β), βασικός αυξητικός παράγοντας των ινοβλαστών (bFGF ) και αιμοπετάλια παράγοντα ανάπτυξης που λαμβάνεται-ΑΑ (PDGF-ΑΑ) ελήφθησαν από την Κ & amp? συστήματα D (Minneapolis, ΜΝ). ινσουλίνη αυξητικού παράγοντα (IGF) ελήφθη από την Sigma (Saint Louis, ΜΟ). Επιδερμικού αυξητικού παράγοντα (EGF) λήφθηκε από ΡβρίΌ Tech ΕΚ (London, UK). Αδριαμυκίνη (υδροχλωρική δοξορουβικίνη) ελήφθη από τη Sigma.

Κυτταρικές γραμμές και δείγματα ιστών

HNSCC κυτταρικές γραμμές (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ηο-1-U-1 και Ho -1-Ν-1) δόθηκαν από τους Ιάπωνες Συλλογή της Έρευνας Bioresources Τράπεζας κυττάρων. HNSCC κυτταρικές σειρές (ZA, HOC719-ΡΕ, HOC-719-ΒΑ, HOC621, HOC119, HOC313, TSU και ΟΜΙ) παρασχέθηκαν ευγενώς από τον Dr. Kamata (Πανεπιστήμιο της Χιροσίμα). Κυτταρικές γραμμές γαστρικού καρκίνου (ΜΚΝ-1 και ΜΚΝ-45), κυτταρικές σειρές καρκίνου του κόλου (RKO και HCT116), κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού (MCF7 και SK-BR3), λέμφωμα κυτταρική γραμμή (U937) και κυττάρων λευχαιμίας γραμμής (HL-60 ) δόθηκαν από τους Ιάπωνες Συλλογή της Έρευνας Bioresources τράπεζας κυττάρων. Αυτά διατηρήθηκαν σε RPMI-1640 ή κατά Dulbecco Modified Eagle Medium (Nissui Pharmaceutical Co., Tokyo, Japan) συμπληρωμένο με 10% θερμο-απενεργοποιημένο FBS (Invitrogen) και /ml πενικιλλίνη-στρεπτομυκίνη (Gibco) υπό συνθήκες 100 U 5% CO

2 στον αέρα στους 37 ° C. Για δοκιμασία ανάπτυξης, 5000 κύτταρα τοποθετήθηκαν πάνω σε πλάκες 24 φρεατίων (Falcon), και επεξεργασία με θρυψίνη κύτταρα μετρήθηκαν σε 0, 2, 4, 6 μέρα με Κυττάρων Counter (Coulter Ζ1). ιστούς Tongue εμβρύων ποντικού σε εμβρυϊκή ημέρα 15.5 και 10 εβδομάδων ποντικούς BALB /c χρησιμοποιήθηκαν για ιστολογία και ανοσοϊστοχημεία. Τα πειραματικά πρωτόκολλα εγκρίθηκαν από την επιτροπή των ζώων Φροντίδα και Χρήση του Πανεπιστημίου της Χιροσίμα.

Τα δείγματα ιστών από HNSCC ανακτήθηκαν από την Χειρουργική Παθολογία Γραμματεία του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Χιροσίμα, μετά την έγκριση από την Επιτροπή Ηθικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου της Χιροσίμα. Κάθε ασθενής έδωσαν γραπτή ενημερωμένη συγκατάθεση. Πενήντα-δύο περιπτώσεις HNSCC και 9 κανονική του στοματικού βλεννογόνου ιστοί που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη. Πέντε καρκινικούς ιστούς παχέος εντέρου χρησιμοποιήθηκαν επίσης για ανάλυση ανοσοϊστοχημείας (ευγενώς από τον Dr. Shimamoto, Νομαρχιακή Πανεπιστήμιο της Χιροσίμα).

10% ρυθμισμένη φορμαλίνη-σταθερών και ενσωματωμένα σε παραφίνη ιστοί χρησιμοποιήθηκαν για ανοσοϊστοχημική εξέταση. Η ιστολογική βαθμό και το στάδιο του όγκου που ταξινομούνται σύμφωνα με τα κριτήρια της Ιαπωνικής Εταιρείας για καρκίνο κεφαλής και τραχήλου. Φρέσκα δείγματα ελήφθησαν από τους ιστούς HNSCC για ανάλυση RT-PCR.

RT-PCR

Ολικό RNA απομονώθηκε από καλλιέργειες κυττάρων σε συρροή χρησιμοποιώντας το RNeasy Mini Kit (Qiagen). Οι προετοιμασίες ήταν ποσοτικά και η καθαρότητα τους προσδιορίστηκε με πρότυπες μεθόδους φασματομετρική. cDNA συντέθηκε από 1 μα ολικού RNA σύμφωνα με την Dash ReverTra (Toyobo Biochemicals, Tokyo, Japan). PCR ενίσχυση του RUNX3 έγινε χρησιμοποιώντας πρόσθιο εκκινητή? 5′-CAGAAGCTGGAGGACCAGAC-3 ‘και αντίστροφος εκκινητής? 5’-TCGGAGAATGGGTTCAGTTC-3 ‘. GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. Κλάσματα των συνολικών cDNA ενισχύθηκαν με Go Taq® Πράσινο Master Mix (Promega), και ενισχύσεις διεξήχθησαν σε ένα θερμικό ανακυκλωτή PC701 (Astec, Fukuoka, Japan) για 30 κύκλους μετά από μία αρχική μετουσίωση 30 δευτερόλεπτα στους 94 ° C, ανόπτηση για 30 sec στους 60 ° C, και παρατείνεται για 1 λεπτό στους 72 ° C σε όλα τα εναύσματα. Τα προϊόντα αντίδρασης ενίσχυσης αναλύθηκαν σε 1.5% πηκτές αγαρόζης /ΤΑΕ (Nacalai Tesque, Inc., Kyoto, Japan), ηλεκτροφορήθηκαν στα 100 mV, και έγινε ορατό με χρώση βρωμιούχο αιθίδιο.

Western blot ανάλυση

κηλίδωση Western διεξήχθη όπως περιγράψαμε προηγουμένως [14]. Ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-RUNX3 (R3-5G4, ευγενική προσφορά από τον Dr. Ito, Ινστιτούτο Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Σιγκαπούρη), μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-FLAG (Μ2, Sigma) και αντι-Cul1 πολυκλωνικό αντίσωμα (Zymed) χρησιμοποιήθηκαν. Τριάντα μα πρωτεΐνης υποβλήθηκε σε ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου 10% που ακολουθείται από ηλεκτροκηλίδωση πάνω σε ένα φίλτρο νιτροκυτταρίνης. Για την ανίχνευση του, το σύστημα western αποτύπωση ανίχνευσης ανοσο-πολύπλοκη ECL (Amersham) χρησιμοποιήθηκε.

Η ανοσοϊστοχημική χρώση

Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση RUNX3 σε περιπτώσεις HNSCC πραγματοποιήθηκε σε 4,5 μm τμήματα τοποθετημένα σε πυρίτιο -επικαλυμμένα γυάλινα πλακίδια, χρησιμοποιώντας μια τεχνική υπεροξειδάσης στρεπταβιδίνης-βιοτίνης όπως περιγράφηκε προηγουμένως [14]. Ανοσοϊστοχημική ανίχνευση RUNX3 σε ανθρώπινα διάφορες περιπτώσεις καρκίνου, συμπεριλαμβανομένου 3 οισοφάγου καρκίνων, 3 γαστρικών καρκίνων, 3 καρκίνους του παχέος εντέρου, 3 καρκίνων του ορθού, 3 καρκίνους του παγκρέατος, 3 καρκίνων του ήπατος, 3 καρκίνους του πνεύμονα, 3 καρκίνους νεφρού, 3 καρκίνους της ουροδόχου κύστης, και 4 καρκίνοι της μήτρας διεξήχθη χρησιμοποιώντας μικροσυστοιχιών ιστού (MBL Co. Ltd., Nagoya, Japan). Για ανοσοϊστοχημική μελέτη, χρησιμοποιήθηκε ένα μονοκλωνικό αντίσωμα αντι-RUNX3 (R3-6E9, ευγενική προσφορά από τον Dr. Ito, Ινστιτούτο Μοριακής Βιολογίας και Cell, Σιγκαπούρη). Για ανοσοϊστοχημική μελέτη των ιστών ποντικού, χρησιμοποιήθηκε ένα αντι-RUNX3 μονοκλωνικό αντίσωμα (R3-1E10, MBL Co. Ltd.). Η έκφραση του RUNX3 βαθμολογήθηκε ως θετικό (άνω του 5% του όγκου ή επιθηλιακά κύτταρα έδειξαν ανοσοθετικότητα) και αρνητικό (λιγότερο από 5% του όγκου ή επιθηλιακών κυττάρων έδειξαν ασθενή ή εστιακή ανοσοθετικότητα ή καθόλου χρώση). Τρεις παθολόγους (Υ.Κ., Ι.Ο., και Τ.Τ.) έκανε όλες αυτές τις εκτιμήσεις. Πιθανή συσχέτιση μεταξύ των μεταβλητών των δειγμάτων που αναλύθηκαν όγκου ελέγχθηκε συνδέσεως με την ακριβή δοκιμή του Fisher. Ένα

P

αξία & lt? 0,05 απαιτήθηκε για σημαντικότητα

θεραπεία

5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης

HSC4 κύτταρα και φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο που περιέχει 300 ηΜ. 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-αζα-dC, Sigma) για 72 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν την έκφραση του RUNX3 mRNA με RT-PCR.

τροποποίηση όξινου θειώδους και μεθυλίωσης-ειδική αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Γονιδιωματικό DNA από κύτταρα ή ιστούς εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το DNeasy Kit (Qiagen, Hilden, Germany). Πενήντα μικρολίτρα του υπερκειμένου χρησιμοποιηθεί απευθείας ως πηγή του DNA για τη θεραπεία όξινο θειώδες νάτριο. δείγματα DNA υποβλήθηκαν σε θεραπεία με όξινο θειώδες για να μετατρέψει όλες τις μη μεθυλιωμένες κυτοσίνες σε ουρακίλες αφήνοντας μετουσιωμένο κυτοσίνες ανεπηρέαστη. DNA μετουσιώθηκε με ΝαΟΗ (τελική συγκέντρωση, 0,2 Μ) επί 10 λεπτά στους 37 ° C. Τριάντα μΐ 10 mM υδροκινόνης (Sigma) και 520 μΙ 3 όξινο θειώδες νάτριο Μ (Sigma) σε ρΗ 5.0 και τα δύο πρόσφατα παρασκευασμένο, προστέθηκαν και αναμείχθηκαν, και τα δείγματα επωάστηκαν στους 50 ° C για 16 ώρες. Τροποποιημένο ϋΝΑ καθαρίστηκε χρησιμοποιώντας Οδηγό ρητίνη καθαρισμού DNA (Promega) και εκλούεται σε 50 μΐ ύδατος. Τροποποίηση ολοκληρώθηκε με NaOH (τελική συγκέντρωση, 0,3 Μ) θεραπεία για 5 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου, που ακολουθείται από καταβύθιση αιθανόλης. Τροποποιημένο DNAs ενισχύθηκαν σε όγκο αντίδρασης 20 μι που περιέχει ρυθμιστικό διάλυμα 2 μί 10 χ PCR με 15 mM MgCl2, 4 μλ 5xQ-Solution, 10 ρΜ εκάστου εναρκτήρα, 0.2 mM dNTPs και 0,75 U Taq πολυμεράση (HotStar Taq DNA πολυμεράση? Qiagen, Hilden, Germany). Αφού το μίγμα θερμάνθηκε στους 95 ° C για 15 λεπτά, πραγματοποιήθηκε PCR σε ένα θερμικό ανακυκλωτή (GeneAmp 2400? ΡΕ Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) για 35 κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C για 30 δευτερόλεπτα, ανόπτηση σε 58 ° C για 60 δευτερόλεπτα, και επέκταση στους 72 ° C για 60 δευτερόλεπτα, ακολουθούμενη από μία τελική επέκταση 10 λεπτά στους 72 ° C. Τα προϊόντα PCR διαχωρίστηκαν σε 8% μη μετουσιωτικής πηκτής πολυακρυλαμιδίου. RUNX3 νησί CpG και αναλύθηκαν περιοχές (Νο 1-10) δείχνονται στο Σχήμα 2Β. Οι ομάδες εναρκτών χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη απαριθμούνται στον Πίνακα S1 (GenBank αριθμός πρόσβασης AL023096) [15]

Α:. Έκφραση RUNX3 εξετάστηκε σε επιθήλιο του δέρματος (× 100 και 250 ×, άνω πάνελ), η κανονική στοματική βλεννογόνο (× 100 και 250 ×, μεσαίο πλαίσιο) και κανονικά από το στόμα βλεννογόνου με διήθηση των χρόνιων φλεγμονωδών κυττάρων (χ 100 και 250 ×, κάτω πίνακας). Στο επιθήλιο του δέρματος, μερικά από τα επιδερμικά κύτταρα έδειξαν έκφραση RUNX3 σε πυρήνες του. Στην κανονική του στοματικού βλεννογόνου ιστούς, μόνο μερικά επιθηλιακά κύτταρα στο βασικό στρώμα εκφράζονται RUNX3 στους πυρήνες τους, και τα περισσότερα επιθηλιακά κύτταρα δεν εκφράζουν RUNX3. Στην κανονική του στόματος βλεννογόνου με διήθηση των χρόνιων φλεγμονωδών κυττάρων, τα λεμφοκύτταρα που διεισδύουν σε στοματικό βλεννογόνο έδειξαν έκφραση RUNX3. Β: Η έκφραση του RUNX3 εξετάστηκε σε περιπτώσεις HNSCC (× 100). Τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα εξέφρασαν RUNX3 στους πυρήνες τους.

Η

Δημιουργία κυττάρων HNSCC RUNX3 που υπερεκφράζουν

Ένα πλασμίδιο έκφρασης RUNX3, pcDNA3 που κωδικοποιεί FLAG ετικέτα cDNA RUNX3, παραχωρήθηκε ευγενικά από τον Dr. Ito (Ινστιτούτο Μοριακής και Κυτταρικής Βιολογίας, Σιγκαπούρη). Η RUNX3 /pcDNA3 πλασμίδιο ή ο φορέας μόνος εισήχθη σε κύτταρα HSC3, και στη συνέχεια, G418 (500 μg /ml, Gibco) προστέθηκε στο μέσο καλλιέργειας μετά από 48 ώρες από την επιμόλυνση. Μετά από 2 εβδομάδες επιλογής G418, λάβαμε τις σταθερών κλώνων πισίνα. επιμολύνσεις κυττάρων πραγματοποιήθηκαν με τη χρήση Fugene 6 (Roche) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

Σίγαση από μικρό παρεμβαλλόμενο RNA

λογαριθμικά αναπτυσσόμενα κύτταρα Ca9-22 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 10

5cells /6 cm τρυβλίου και επιμολύνθηκαν με ολίγο δύο φορές (στις 24 και 48 ώρες μετά επανεπίστρωσης) χρησιμοποιώντας Oligofectamine (Invitrogen), όπως περιγράφεται [16]. Σαράντα οκτώ ώρες μετά την τελευταία επιμόλυνση, παρασκευάστηκαν προϊόντα λύσης και αναλύθηκαν με SDS-PAGE και ανοσοκηλίδωση. Το siRNA είναι ένα 19-bp duplex ολιγοριβονουκλεοτίδιο με ένα κλώνο νόημα που αντιστοιχεί στα νουκλεοτίδια 275-293 του mRNA αλληλουχίας ανθρώπινης RUNX3? 5′-ccuucaaggugguggcauu-3 ‘. Μια κωδικοποιημένα αλληλουχία η οποία δεν παρουσιάζει σημαντική ομολογία με αλληλουχίες αρουραίου, ποντικού ή ανθρώπου γονίδιο χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος.

Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής

Η κατανομή κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ανάλυση του περιεχομένου του DNA μετά ιωδιούχο προπίδιο χρώση. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν όπως περιγράφεται παραπάνω, και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη και αποθηκεύονται στους 4 ° C πριν από την ανάλυση. Προσδιορισμός με κυτταρομετρία ροής του περιεχομένου DNA αναλύθηκε με FACS Calibur (Becton-Dickinson, San Jose, CA) κυτταρόμετρο ροής. Για κάθε δείγμα, 20,000 συμβάντα είχαν αποθηκευθεί.

αννεξίνης V και ιωδιούχου προπιδίου Dual-Χρώση Δοκιμασία

Μετά την ασιτία ορού ή θεραπεία Dox, τα κύτταρα στη συνέχεια χρωματίστηκαν με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (FITC) Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ), χρησιμοποιώντας το κιτ ανίχνευσης Annexin V-FITC απόπτωση (Becton-Dickinson) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Τα αποπτωτικά κύτταρα ταυτοποιήθηκαν με διπλής χρώσης με ανασυνδυασμένο FITC-συζευγμένο με Annexin V και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ). απόκτηση και ανάλυση δεδομένων έγιναν σε ένα FACSCalibur (Becton-Dickinson) κυτταρόμετρο ροής χρησιμοποιώντας το λογισμικό CellQuest.

Αποτελέσματα

Εξαιρετικά έκφραση του RUNX3 σε HNSCC

Κατ ‘αρχάς, θα εξεταστεί η έκφραση του RUNX3 σε 14 κυτταρικές σειρές HNSCC (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ho-1-U-1, Ho-1-Ν-1, ΖΑ, HOC719-ΡΕ, HOC719-ΒΑ, HOC621, HOC119, HOC313 , TSU, και ΟΜΙ). RUNX3 mRNA παρατηρήθηκε σε 9 από 14 HNSCC κυτταρικές σειρές (Σχήμα 1Β). Σε ορισμένες είδους ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων γαστρικών και της ουροδόχου κύστης, έχει αναφερθεί παρατηρήθηκαν ότι οι σημειακές μεταλλάξεις του RUNX3 [3], [5]. Ωστόσο, δεν βρέθηκαν μεταλλάξεις σε κυτταρικές σειρές HNSCC με mRNA έκφραση RUNX3 (Ca9-22, Ho-1-U-1 και ΗΟ-1-Ν-1) (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). mRNA έκφραση RUNX3 εξετάστηκε επίσης σε διάφορες κυτταρικές σειρές καρκίνου συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου (RKO και HCT116), γαστρικό καρκίνο (ΜΚΝ-1 και ΜΚΝ-45), λευχαιμία (HL60), λέμφωμα (U937) και του καρκίνου του μαστού (MCF7 και SK-BR3 ) (Σχήμα 1 C). RKO, MCF7 και SK-BR3 κύτταρα δεν εκφράζουν RUNX3 mRNA. Όπως έχει ήδη αναφερθεί, η έκφραση RUNX3 ήταν καλά συσχετίζεται με την κατάσταση μεθυλίωσης, εκτός από τα κύτταρα SK-BR3 [17] – [20]. Σε κύτταρα SK-BR3, κάτω ρύθμιση των RUNX3 πιστεύεται ότι προκαλείται από άγνωστο μηχανισμό [20]. Επίσης εξετάσαμε την έκφραση του RUNX3 mRNA σε 18 ιστούς HNSCC. Σε 13 από 18 (72,2%) σε ιστούς HNSCC, η έκφραση RUNX3 mRNA παρατηρήθηκε (Σχήμα 1 D). Στη συνέχεια, η έκφραση της πρωτεΐνης RUNX3 εξετάστηκε με ανάλυση κηλίδος Western σε 6 κύτταρα HNSCC (HSC2, HSC3, HSC4, Ca9-22, Ηο-1-U-1 και ΗΟ-1-Ν-1) (Σχήμα 1 Ε). Μεταξύ αυτών, Ca9-22, Ηο-1-U-1 και ΗΟ-1-Ν-1 κύτταρα εξέφρασαν πρωτεΐνη RUNX3, που αντιστοιχεί σε έκφραση mRNA. Στη συνέχεια, εξετάσαμε την έκφραση RUNX3 σε 9 κανονικά από το στόμα βλεννογόνους ιστούς και 52 περιπτώσεις HNSCC με ανοσοϊστοχημεία. Πρώτον, χρησιμοποιήσαμε επιθήλιο δέρματος και των βλεννογόνων του παχέος εντέρου για αντιδραστικότητα της έκφρασης RUNX3. Όπως φαίνεται στην πρόσφατη έκθεση [13], τα επιδερμικά κύτταρα επίσης έδειξαν έκφραση RUNX3 σε πυρήνες του (Σχήμα 2Α, άνω πάνελ). Επίσης εξετάσαμε την έκφραση RUNX3 στον καρκίνο του παχέος εντέρου. Στον καρκίνο του παχέος εντέρου, RUNX3 πιστεύεται ότι είναι ένα ογκοκατασταλτικό γονίδιο [18]. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [18], η έκφραση RUNX3 παρατηρήθηκε σε πυρήνες της κανονικής βλεννογόνου, ενώ ο καρκίνος του παχέος εντέρου κύτταρα δεν εκφράζουν RUNX3 (Σχήμα S1). Στην κανονική του στοματικού βλεννογόνου ιστούς, μόνο μερικά επιθηλιακά κύτταρα στο βασικό στρώμα εκφράζονται ελαφρώς RUNX3 στους πυρήνες τους, και τα περισσότερα επιθηλιακά κύτταρα δεν εκφράζουν (Σχήμα 2Α, μεσαίο πλαίσιο). Τα λεμφοκύτταρα που διηθούν σε κανονικό βλεννογόνο του στόματος έδειξε έκφραση RUNX3 (Εικόνα 2Α, κάτω πάνελ). Ανοσοθετικότητα του RUNX3 στα λεμφοκύτταρα χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος της χρώσης. Από την άλλη πλευρά, τα περισσότερα καρκινικά κύτταρα εξέφρασαν RUNX3 στους πυρήνες τους (Σχήμα 2Β). Επιβεβαιώσαμε επίσης ότι η πυρηνική έκφραση του RUNX3 χρησιμοποιώντας πυρηνικά και κυτταροπλασματικά κλάσμα HNSCC κυτταρικών σειρών, υποδεικνύοντας καθόλου ο εσφαλμένος εντοπισμός της πρωτεΐνης (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). έκφραση RUNX3 ήταν συχνά παρατηρήθηκε στο 50% (26 από 52) των περιπτώσεων HNSCC (Πίνακας 1). Επιπλέον, συγκρίναμε την έκφραση RUNX3 με τα ευρήματα κλινικο-παθολογικές όπως η διαφοροποίηση, η εισβολή και τη μετάσταση. Είναι ενδιαφέρον ότι, η έκφραση RUNX3 ήταν καλά συσχετίζεται με κακοήθη συμπεριφορές συμπεριλαμβανομένης κακώς διαφοροποίησης, διεισδυτικότητα και μετάσταση (Πίνακας 1).

Η

Η μεθυλίωση κατάσταση του

RUNX3

ήταν καλά συσχετίζεται με την έκφραση του mRNA του σε HNSCC

Σας ρώτησε πώς η έκφραση RUNX3 προκλήθηκε από το HNSCC. Μειωμένη έκφραση του RUNX3 ήταν συχνά προκαλούνται από CpG νησιού υπερμεθυλίωση σε διάφορους τύπους καρκίνου [9]. Στην πραγματικότητα, η έκφραση RUNX3 παρατηρήθηκε σε κύτταρα HSC4 χωρίς έκφραση RUNX3 μετά από θεραπεία 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (Σχήμα 3Α). Homma et al. εξέτασε την κατάσταση μεθυλίωσης των πολλαπλών περιοχών του

υποκινητή RUNX3

CpG νησίδα (3478 bp) εντός του εγγύς υποκινητή (Νο 1-10) σε γαστρικούς καρκίνους και διαπίστωσε ότι η μεθυλίωση στην περιοχή που καλύπτουν την θέση έναρξης της μεταγραφής (αριθ . 5-8) είναι κρίσιμη για την απώλεια της έκφρασης RUNX3 (Σχήμα 3Β) [15]. Για να εξεταστεί η

RUNX3

κατάσταση μεθυλίωσης σε HNSCC, αναλύσαμε την μεθυλίωση του

RUNX3

σε όλες τις περιοχές προαγωγού (Νο 1-10) με μεθυλίωση-ειδική PCR στον πίνακα των κυτταρικών γραμμών HNSCC (Εικόνα 3C και 3D). HNSCC κυττάρων με έκφραση RUNX3 έδειξε unmethylation ή μερικώς μεθυλίωση στο Νο 5-8 περιοχή (Σχήμα 3D). κύτταρα HNSCC χωρίς έκφραση RUNX3 έδειξε πλήρη μεθυλίωση στο Νο 5 και Νο 6 περιοχής. Έτσι, κατάσταση μεθυλίωσης του

περιοχή προαγωγού RUNX3

ήταν καλά συσχετίζεται με την έκφραση του mRNA RUNX3 σε κυτταρικές γραμμές HNSCC

Α:. Έκφραση RUNX3 εξετάστηκε μετά από 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης (5 -αζα) θεραπεία. κύτταρα HSC4 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο που περιέχει 300 ηΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης για 72 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν την έκφραση του RUNX3 mRNA με RT-PCR. Β:

RUNX3

νησί CpG και αναλύονται περιοχές (Νο 1-10) εμφανίζονται ως κάθετες μπάρες. Η μεταγραφική θέση έναρξης (TSS) βρίσκεται εντός της περιοχής Νο 7. Γ: κατάσταση μεθυλίωσης του RUNX3 σε κυτταρικές γραμμές HNSCC. Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από HNSCC κυτταρικές σειρές και υποβλήθηκε σε επεξεργασία με όξινο θειώδες. κατάσταση μεθυλίωσης του υποκινητή περιοχή (Νο 1-10) εξετάστηκε με μεθυλίωση συγκεκριμένη μέθοδο PCR. D: Η περίληψη της μεθυλίωσης και της έκφρασης καθεστώς των RUNX3 στις κυτταρικές γραμμές HNSCC. Ε: Έκφραση του RUNX3 στην γλώσσα του ποντικιού επιθήλιο του εμβρύου (άνω τμήμα) και ενηλίκων (κάτω πίνακας) ποντίκι με ανοσοϊστοχημεία. ιστούς Tongue εμβρύων ποντικού σε εμβρυϊκή ημέρα 15.5 και 10 εβδομάδων χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια ηλικίας BALB /c. F: mRNA έκφραση RUNX3 εξετάστηκε με RT-PCR σε 4 πρωτογενή καλλιεργημένα κανονικά από το στόμα επιθηλιακά κύτταρα (# 1- # 4). HSC4 κύτταρο χρησιμοποιήθηκε ως αρνητικός έλεγχος και Ca9-22 κύτταρο χρησιμοποιήθηκε ως θετικός έλεγχος για έκφραση RUNX3. GAPDH χρησιμοποιήθηκε σαν ένας έλεγχος. G: έκφραση RUNX3 εξετάστηκε μετά από 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-Αζα) θεραπεία. Πρωτογενή καλλιεργημένα κανονικά από το στόμα επιθηλιακά κύτταρα (# 1 και # 2) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με μέσο που περιέχει 300 ηΜ 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης για 72 ώρες. Μετά την αγωγή, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν την έκφραση του RUNX3 mRNA με RT-PCR. H: Γενωμικό DNA εκχυλίστηκε από 4 πρωτογενή καλλιεργημένα κανονικά από το στόμα επιθηλιακά κύτταρα (# 1- # 4). κατάσταση μεθυλίωσης στην περιοχή Νο 5-8 εξετάστηκε από μεθυλίωση συγκεκριμένη μέθοδο PCR. I: Η περίληψη της μεθυλίωσης και της έκφρασης κατάσταση του RUNX3 σε φυσιολογικά επιθηλιακά κύτταρα

Η

Πρόσφατα έκθεση δείχνει ότι RUNX3 εκφράζεται γλώσσας και του ουρανίσκου επιθήλιο εμβρύων ποντικού από εμβρυϊκή ημέρα 12,5 να 16,5, και ότι. έκφραση RUNX3 μειώνεται μετά την εμβρυϊκή ημέρα 16.5 και εξαφανίζεται σε νεογέννητα ποντίκια [21]. Εδώ επιβεβαίωσε επίσης ότι η έκφραση RUNX3 παρατηρήθηκε σε γλώσσα επιθήλιο των εμβρύων ποντικού (Ε15.5), αλλά όχι σε ενήλικες επιθήλιο γλώσσα ποντικού (ηλικίας 10 εβδομάδων) (Σχήμα 3Ε). Τα ευρήματα αυτά μας έκαναν να υποθέτουν ότι

RUNX3

μπορεί να σιγήσει μέσω μεθυλίωσης σε ενήλικες προφορική επιθηλιακά κύτταρα. Του στοματικού βλεννογόνου ιστού συνήθως περιέχει συνδετικό ιστό και διηθητικά λεμφοκύτταρα. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 2Α (κάτω πλαίσιο), λεμφοκύτταρα που διηθούν σε κανονικό βλεννογόνο του στόματος έδειξε έκφραση RUNX3. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήσαμε πρωτογενείς καλλιεργημένα επιθηλιακά κύτταρα που ελήφθησαν από την κανονική στοματική επιθήλιο σε αυτή τη μελέτη για την αποφυγή μόλυνσης των λεμφοκυττάρων. Σε παρόμοιο με ανοσοϊστοχημικές μελέτες (Σχήμα 2Α), 4 πρωτογενή καλλιεργημένα επιθηλιακά κύτταρα που ελήφθησαν από την κανονική του στόματος επιθήλιο (# 1- # 4) δεν εκφράζουν RUNX3 mRNA (Σχήμα 3F), υποδεικνύοντας ότι το επίπεδο έκφρασης του RUNX3 είναι χαμηλή ή απούσα σε ενήλικες κανονική στοματικό επιθήλιο. Εξετάσαμε την έκφραση RUNX3 μετά από αγωγή 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη. έκφραση RUNX3 ήταν πάνω ρυθμισμένα με κατεργασία 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνης σε 2 πρωτογενή καλλιεργημένα επιθηλιακά κύτταρα (# 1 και # 3) (Εικόνα 3G). Στη συνέχεια, θα εξεταστεί κατά πόσον

RUNX3

είχε σιγήσει μέσω μεθυλίωσης σε ενήλικες προφορική επιθηλιακά κύτταρα. Πραγματοποιήσαμε μεθυλίωσης-ειδική PCR σε 4 πρωτογενή καλλιεργημένα επιθηλιακά κύτταρα στην περιοχή που καλύπτουν την θέση έναρξης της μεταγραφής του

RUNX3

(Νο 5-8), η οποία είναι κρίσιμη για την απώλεια της έκφρασης RUNX3 στα κύτταρα HNSCC (Εικόνα 3C). Είναι ενδιαφέρον, 2 πρωτογενή καλλιεργημένα επιθηλιακά κύτταρα (# 1 και # 2) έδειξε μερικώς μεθυλίωση στο Νο 6 και Νο 7 περιοχή, και ένα άλλο 2 πρωτογενή καλλιεργημένα επιθηλιακά κύτταρα (# 3 και # 4) έδειξε πλήρη μεθυλίωση στο Νο 7 και αριθ . 8 περιοχής (Σχήμα 3η και 3θ).

RUNX3 υπερέκφραση αυξημένη πολλαπλασιασμό των κυττάρων και παρεμπόδισε την απόπτωση

Για να ξέρει το ρόλο του RUNX3 σε HNSCC, έχουμε σταθερά επιμολυσμένα φορέα έκφρασης της FLAG-RUNX3 σε κύτταρα HSC3 με χαμηλότερη έκφραση του RUNX3. Λάβαμε σταθερώς RUNX3 υπερεκφράζουν κύτταρα (Σχήμα 4Α). Είναι ενδιαφέρον, RUNX3 υπερέκφραση αυξημένη κυτταρική ανάπτυξη (Σχήμα 4Β). Σε 6 ημέρες, ο αριθμός των κυττάρων που υπερεκφράζουν RUNX3 ήταν αξιοσημείωτα υψηλότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου. Αν και εξετάσαμε τη μετανάστευση και την εισβολή, RUNX3 υπερέκφραση δεν προωθούν τη μετανάστευση και την εισβολή (Εικόνα S2). Επιπλέον, αύξηση του πληθυσμού που αντιστοιχεί σε υπο-G1 μετά παρατηρήθηκε ασιτία ορού μόνο σε κύτταρα ελέγχου, αλλά όχι σε κύτταρα που υπερεκφράζουν RUNX3 (Σχήμα 4C). Για να αποδειχθεί αν αυτή η αύξηση των υπο-G1 ανιχνεύθηκε σε κύτταρα ελέγχου μετά από στέρηση ορού οφείλεται σε απόπτωση, το επίπεδο της απόπτωσης αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας αννεξίνη V-FITC /δοκιμασίες ιωδιούχο προπίδιο (Σχήμα 4D). Annexin V /ιωδιούχο προπίδιο διπλά θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε 1,8% του RUNX3 υπερεκφράζουν κύτταρα, ενώ σε 21,7% των κυττάρων ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι η υπερέκφραση RUNX3 ασιτία ορού ανέστειλε απόπτωση. Για την επιβεβαίωση αυτών των φαινοτύπων, εξετάσαμε την knockdown του RUNX3 στα κύτταρα Ca9-22, η οποία έδειξε RUNX3 υπερέκφραση και ήταν ανθεκτικά σε λιμοκτονία απόπτωση ορό. Για νοκ ντάουν του RUNX3, χρησιμοποιήσαμε τρία διαφορετικά siRNAs (si-RUNX3-1, si-RUNX3-2 και si-RUNX3-3) και το κοκτέιλ τους. έκφραση RUNX3 ήταν αξιοσημείωτα σιγήσει si-RUNX3-1 (Σχήμα S3A). Ως εκ τούτου, χρησιμοποιούνται SI-RUNX3-1 για τις ακόλουθες μελέτες. RUNX3 siRNA διαμόλυνση μείωσε την έκφραση του RUNX3 mRNA και πρωτεΐνης σε Ca9-22 κύτταρα (Σχήμα 5Α). Εξετάσαμε εάν siRNA προκάλεσε μια μη ειδική αντίδραση ιντερφερόνη στρες. RUNX3 θεραπεία siRNA δεν προκάλεσε κλασική ιντερφερόνη-απόκρισης γονίδια, OAS1 και ISG54 mRNAs, υποδεικνύοντας ότι η θεραπεία RUNX3 siRNA δεν προκάλεσε σημαντική ανταπόκριση ιντερφερόνης (Σχήμα S3b). Όπως περιμέναμε, RUNX3 siRNA ανέστειλε την κυτταρική ανάπτυξη (Σχήμα 5Β). Σε 6 ημέρες, ο αριθμός κυττάρων σε επεξεργασία RUNX3 siRNA ήταν αξιοσημείωτα χαμηλότερη από εκείνη των κυττάρων ελέγχου. Επιπλέον, RUNX3 siRNA αύξησε τον πληθυσμό που αντιστοιχεί στο υπο-G1 μετά ασιτία ορού (Σχήμα 5C). Αννεξίνη V /ιωδιούχο προπίδιο διπλά θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε 10,5% των κυττάρων ελέγχου, ενώ στο 18,1% των RUNX3 νοκ ντάουν κυττάρων (Σχήμα 5D)

Α:. Παραγωγή RUNX3 υπερεκφράζουν κυττάρων. Η RUNX3 /πλασμίδιο pcDNA3 ή ο φορέας μόνος εισήχθη σε κύτταρα HSC3, και οι σταθεροί κλώνοι πισίνα ελήφθησαν με επιλογή G418 για 2 εβδομάδες. Η εξωγενής έκφραση του mRNA και της πρωτεΐνης RUNX3 εξετάστηκε με RT-PCR και ανάλυση Western blot (WB). Cul1 χρησιμοποιήθηκε ως έλεγχος φόρτωσης. Β: Το γράφημα δείχνει την ανάπτυξη των κυττάρων του RUNX3 που υπερεκφράζουν και κύτταρα HSC3 ελέγχου. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκες και επεξεργασία με θρυψίνη κύτταρα μετρήθηκαν με μετρητή κυττάρων (Coulter Ζ1) σε 0, 2, 4 και 6 την ημέρα. C: RUNX3 υπερέκφραση ανέστειλε την επαγόμενη από ασιτία ορού απόπτωση. Τα κύτταρα επωάστηκαν για 0, 48 και 96 ώρες μετά την ασιτία ορού και σταθεροποιήθηκαν σε 70% αιθανόλη. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ανάλυση DNA περιεχόμενο μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής. Για κάθε δείγμα, 20,000 συμβάντα είχαν αποθηκευθεί. Πραγματοποιήσαμε δύο ανεξάρτητα πειράματα. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της αννεξίνης V και χρώση ιωδιούχου προπιδίου σε έλεγχο και RUNX3 κύτταρα που υπερεκφράζουν μετά ασιτία ορού για 96 ώρες: D. Πραγματοποιήσαμε δύο ανεξάρτητα πειράματα

Η

Α:. RUNX3 αποσιώπηση από μικρά παρεμβαλλόμενα RNA. Λογαριθμικά αναπτυσσόμενα κύτταρα Ca9-22 με έκφραση RUNX3 σπάρθηκαν σε πυκνότητα 10

5cells /6 cm τρυβλίου και επιμολύνθηκαν με ολίγο δύο φορές (στις 24 και 48 ώρες μετά την επανεπίστρωσης). Σαράντα οκτώ ώρες μετά την τελευταία επιμόλυνση, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και RUNX3 mRNA και η έκφραση της πρωτεΐνης εξετάσθηκε με RT-PCR και ανάλυση κηλίδας Western. Β: Το γράφημα δείχνει ότι η ανάπτυξη των κυττάρων του RUNX3 siRNA θεραπεία και τον έλεγχο Ca9-22 κύτταρα. Τα κύτταρα απλώθηκαν σε 24 φρεατίων πλάκες και επεξεργασία με θρυψίνη κύτταρα μετρήθηκαν με μετρητή κυττάρων σε 0, 2, 4 και 6 την ημέρα. C: RUNX3 siRNA ενίσχυσαν την επαγόμενη από ασιτία ορού απόπτωση. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ανάλυση DNA περιεχόμενο μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής. Για κάθε δείγμα, 20,000 συμβάντα είχαν αποθηκευθεί. Πραγματοποιήσαμε δύο ανεξάρτητα πειράματα. D: Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της αννεξίνης V και χρώση ιωδιούχου προπιδίου σε έλεγχο και RUNX3 knockdown κυττάρων μετά ασιτία ορού για 96 ώρες. Πραγματοποιήσαμε δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Επιπλέον, εξετάσαμε την παρεμπόδιση της απόπτωσης μετά από αγωγή με χημειοθεραπευτικό φάρμακο στον έλεγχο και RUNX3 υπερεκφράζουν HNSCC (Σχήμα 6). Έλεγχος και RUNX3 κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC3 εκτέθηκαν για 72 ώρες για να αδριαμυκίνη (DOX? 0,5 ​​και 1 μg /ml), η οποία είναι ένας χημειοθεραπευτικός παράγοντας που χρησιμοποιείται συνήθως στη θεραπεία του HNSCC. Ο πληθυσμός υπο-G1 του RUNX3 κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC3 ήταν 7,49%, ενώ εκείνη των κυττάρων ελέγχου ήταν 44,76% μετά από αγωγή με 1 μg /ml του DOX (Σχήμα 6Α). Επιπλέον, μετά από αγωγή με 1 μg /ml του DOX, αννεξίνης V /ιωδιούχο προπίδιο διπλά θετικά κύτταρα παρατηρήθηκαν σε 25,2% των κυττάρων ελέγχου, ενώ στο 8,9% του RUNX3 υπερεκφράζουν κυττάρων (Σχήμα 6Β). Από την άλλη πλευρά, η αννεξίνη V /ιωδιούχο προπίδιο διπλά θετικών κυττάρων αυξήθηκε κατά RUNX3 knockdown (Σχήμα 6C). Συνολικά αυτά υποδεικνύουν ότι η υπερέκφραση RUNX3 μπορεί να εμπλέκονται στην ανάπτυξη HNSCC μέσω της προώθησης της ανάπτυξης των κυττάρων και η αναστολή της απόπτωσης

Α:. Αδριαμυκίνη (Dox, 0, 0,5 και 1 μg /ml) υποβλήθηκε σε επεξεργασία για 72 ώρες σε έλεγχο και RUNX3 κύτταρα που υπερεκφράζουν HSC3. Η κατανομή κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με ανάλυση DNA περιεχόμενο μετά από χρώση με ιωδιούχο προπίδιο χρησιμοποιώντας ένα κυτταρόμετρο ροής. Για κάθε δείγμα, 20,000 συμβάντα είχαν αποθηκευθεί. Ποσοστό του πληθυσμού υπο-G1 ενδείκνυται. Πραγματοποιήσαμε δύο ανεξάρτητα πειράματα με τριπλά φρεάτια ανά συνθήκη. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα εμφανίζεται. Η ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της αννεξίνης V και χρώση ιωδιούχου προπιδίου σε έλεγχο και RUNX3 υπερεκφράζουν κυττάρων μετά κατεργασία DOX για 72 ώρες στις ενδεικνυόμενες δόσεις: Β. C: Ανάλυση κυτταρομετρίας ροής της αννεξίνης V και χρώση ιωδιούχου προπιδίου σε έλεγχο και RUNX3 knockdown κυττάρων μετά κατεργασία DOX για 72 ώρες στις ενδεικνυόμενες δόσεις. Πραγματοποιήσαμε δύο ανεξάρτητα πειράματα.

Η

Για να ξέρει το ρόλο του RUNX3 στην ογκογένεση, εξετάσαμε τον σχηματισμό tumorsphere χρησιμοποιώντας εξαιρετικά χαμηλές πλάκες στήριξης. RUNX3 υπερέκφραση προωθείται tumorsphere σχηματισμό (Σχήμα S4A και S4B). Ο μέσος αριθμός των αποικιών ήταν 535,6 και 663,3 στον έλεγχο και RUNX3 υπερεκφράζουν κύτταρα, αντίστοιχα (Σχήμα S4B). Επιπλέον, RUNX3 νοκ ντάουν ανέστειλε tumorsphere σχηματισμό (Σχήμα S4C και S4D).