You must be logged into post a comment.
Αφηρημένο
Gene
MAGEA1
ανήκει σε μια ομάδα της ανθρώπινης βλαστικής σειράς ειδικών γονιδίων που στηρίζονται σχετικά με μεθυλίωση του DNA για την καταστολή σε σωματικούς ιστούς. Πολλά από αυτά τα γονίδια, που ονομάζονται γονίδια του καρκίνου-βλαστικής γραμμής (CG), γίνονται απομεθυλιωθεί και ενεργοποιείται σε μια ευρεία ποικιλία όγκων, όπου κωδικοποιούν αντιγόνα όγκου-ειδικά. Η διαδικασία που οδηγεί σε DNA απομεθυλίωση των γονιδίων CG σε όγκους παραμένει ασαφής. Προηγούμενη δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ακετυλίωση των ιστονών μπορεί να εμπλέκονται. Εδώ, ερευνήσαμε την σχετική συμβολή της μεθυλίωσης του DNA και ακετυλίωση ιστονών στην επιγενετική ρύθμιση της γονιδιακής
MAGEA1
. Θα δείξουμε ότι
MAGEA1
DNA υπομεθυλίωση σε κύτταρα που εκφράζουν το μελάνωμα είναι πράγματι συσχετίζεται με τις τοπικές αυξήσεις της ιστόνης Η3 ακετυλίωση (H3ac). Ωστόσο, όταν
MAGEA1
-αρνητική κύτταρα εκτέθηκαν σε έναν αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης (TSA), παρατηρήσαμε μόνο βραχυπρόθεσμη ενεργοποίηση του γονιδίου και ανιχνεύονται καθόλου απομεθυλίωση προαγωγέα του. Ως πιο ευαίσθητη δοκιμασία, χρησιμοποιήσαμε ένα κύτταρο κλώνος που φέρει μία μεθυλιωμένη
MAGEA1 /hph
κατασκεύασμα, το οποίο παρέχει αντίσταση στην υγρομυκίνη πάνω σταθερός επαναδραστηριοποίηση. TSA προκαλούμενη μόνο παροδική de-καταστολή του διαγονιδίου, και δεν οδήγησαν στην εμφάνιση της υγρομυκίνης-ανθεκτικών κυττάρων. Σε πλήρη αντίθεση, η παροδική εξάντληση του DNA μεθυλοτρανσφεράσης-1 στο κύτταρο ανταποκριτή κλώνου οδήγησε σε υγρομυκίνη-ανθεκτικό πληθυσμό, κατά την οποία η εκ νέου ενεργοποιημένο
MAGEA1 /hph
διαγονίδιο δεν εμφανίζεται μόνο σήμανση DNA υπομεθυλίωση, αλλά επίσης, σημαντική αντιστροφή των σημαδιών της ιστόνης, συμπεριλαμβανομένων των κερδών σε H3ac και H3K4me2, και οι απώλειες των H3K9me2. Συλλογικά, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι η μεθυλίωση του DNA έχει έναν κυρίαρχο ρόλο στην επιγενετικές ιεραρχία που διέπουν
MAGEA1
έκφραση
Παράθεση:. Cannuyer J, Loriot Α, Parvizi GK, De Smet C (2013) Επιγενετική ιεραρχία μέσα στο
MAGEA1
Καρκίνος-βλαστικής σειράς Gene: Ανάδοχος μεθυλίωσης του DNA υπαγορεύει Τοπική ιστόνης τροποποιήσεις. PLoS ONE 8 (3): e58743. doi: 10.1371 /journal.pone.0058743
Επιμέλεια: Wei-Guo Zhu, το Πανεπιστήμιο του Πεκίνου Κέντρο Επιστημών Υγείας, Κίνα
Ελήφθη: 30, Νοέμ 2012? Αποδεκτές: 5 Φεβ του 2013? Δημοσιεύθηκε: 5 Μαρτίου, 2013
Copyright: © 2013 Cannuyer et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται
Χρηματοδότηση:. JC είναι ο αποδέκτης της επιχορήγησης FSR-FNRS-Télévie (https://www2.frs-fnrs.be/). GKP έλαβε υποτροφία από FSR-FNRS-FRIA (https://www2.frs-fnrs.be/). Η εργασία αυτή υποστηρίζεται από μια επιχορήγηση FRSM από το FSR-FNRS (ref. 3.4563.11, https://www2.frs-fnrs.be/). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου
Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα
Εισαγωγή
μεθυλίωσης του DNA, που συμβαίνουν κυρίως σε CpG δινουκλεοτίδια, είναι ένας ισχυρός μηχανισμός του γονιδίου καταστολής σε κύτταρα θηλαστικών [1]. Ιστού-ειδικά πρότυπα της CpG μεθυλίωσης, οι οποίες είναι εγκατεστημένες κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης του εμβρύου, είναι γενικά καλά διατηρημένα σε ενήλικα κύτταρα, αλλά να γίνει μεταβάλει ριζικά σε καρκινικά κύτταρα [2]. Αμφότερα τα κέρδη (υπερμεθυλίωση) και ζημίες (υπομεθυλίωση) της μεθυλίωσης του DNA μπορεί να ανιχνευθεί εντός του ίδιου κυττάρου όγκου. Η παρεκκλίνουσα υπερμεθυλίωση σε καρκίνο συχνά επηρεάζει τον υποκινητή των γονιδίων καταστολής όγκων, και έχει ως εκ τούτου έχουν συσχετισθεί με απώλεια του όγκου κατασταλτικής λειτουργίες [3]. DNA υπομεθυλίωση, από την άλλη πλευρά, έχει ανιχνευθεί σε μια ποικιλία αλληλουχιών εντός γονιδιωμάτων καρκίνο, συμπεριλαμβανομένων των επαναλαμβανόμενων αλληλουχιών [4], και δείχθηκε να συνεισφέρει στην ενίσχυση της γενωμική αστάθεια [5]. Παραδόξως, το DNA υπομεθυλίωση σε όγκους έχει συσχετιστεί με μεταγραφική ενεργοποίηση μόνο ενός περιορισμένου αριθμού γονιδίων, τα περισσότερα από τα οποία έχουν φυσιολογική θέση τους της έκφρασης περιορίζεται στην βλαστική σειρά [6]. Αυτή η συγκεκριμένη ομάδα γονιδίων ονομάσθηκε γονίδια του καρκίνου-βλαστικής γραμμής (CG) [7]. Στον άνθρωπο, τα γονίδια CG περιλαμβάνουν περίπου 50 γονίδια ή οικογένειες γονιδίων ασκώντας μια ποικιλία κυτταρικών λειτουργιών [8]. Η ενεργοποίηση αυτών των γονιδίων έχει αναφερθεί σε ένα ευρύ φάσμα τύπων όγκων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του πνεύμονα, καρκίνο κεφαλής και λαιμού, καρκίνο ουροδόχου κύστης, και μελάνωμα. Μια σημαντική συνέπεια της ενεργοποίησης των γονιδίων CG σε όγκους είναι η παραγωγή όγκου-ειδικά αντιγόνα, τα οποία μπορούν να αναγνωριστούν από κυτταρολυτικά Τ λεμφοκύτταρα [9]. Κλινικές δοκιμές του εμβολιασμού κατά του καρκίνου που στοχεύονται έναντι αυτών των αντιγόνων είναι υπό εξέλιξη [10]. Θεωρητικά, η κατανόηση των μηχανισμών που συμβάλλουν στη ρύθμιση των γονιδίων CG μπορεί να διευκολύνει την ανάπτυξη στρατηγικών γονιδίου-επαγωγής, η οποία θα καταστήσει τα καρκινικά κύτταρα πιο ευάλωτα σε ανοσοθεραπεία.
Η διαδικασία που οδηγεί στην υπομεθυλίωσης του DNA και την επακόλουθη ενεργοποίηση των γονιδίων CG σε όγκους παραμένει ασαφές [11]. Μια πιθανότητα είναι ότι το DNA απομεθυλίωση σε γονίδια CG είναι συνέπεια των αλλαγών στο επίπεδο των πρωτεϊνών ιστόνης, τα βασικά συστατικά της χρωματίνης. Ειδικά υπολείμματα μέσα ουρές των ιστονών υφίστανται μια ποικιλία χημικών τροποποιήσεων, συμπεριλαμβανομένων ακετυλίωση και μεθυλίωση, οι οποίες έχουν αντίκτυπο στη δομή της χρωματίνης και μεταγραφή [12]. Αρκετές τροποποιήσεις των ιστονών εμφανίζονται επίσης να ρυθμίζουν μέλη μεθυλίωση του DNA [13]. Κατασταλτικά σήματα των ιστονών, όπως η μεθυλίωση των ιστονών H3 λυσίνη 9 ή 27 (H3K9 ή H3K27), έδειξαν να υπαγορεύσει την εναπόθεση της μεθυλίωσης του DNA σε συγκεκριμένες θέσεις, ευνοώντας την τοπική πρόσληψη μεθυλοτρανσφεράσες DNA [14], [15]. Από την άλλη πλευρά, ενεργοποιώντας τροποποιήσεις ιστόνης όπως ακετυλίωση ιστονών ή μεθυλίωση των ιστονών Η3 λυσίνης 4 (H3K4) φαίνεται να αποκλείουν τα μηχανήματα μεθυλίωσης του DNA [16], [17]. Ως εκ τούτου, ήταν δελεαστικό να προτείνει ότι η απομεθυλίωση DNA σε γονίδια CG μπορεί να είναι μια συνέπεια των αλλαγών στο επίπεδο των τροποποιήσεων ιστονών.
Προηγούμενες μελέτες αποκάλυψαν ότι υποκινητές γονιδίων CG συνδέονται συχνά με H3K9 και H3K27 μεθυλίωση σε μη εκφράζοντα κύτταρα. Αυτά τα κατασταλτικά τροποποιήσεις γενικά χαθεί από την ενεργοποίηση των γονιδίων CG στα καρκινικά κύτταρα, και να αντικατασταθεί από την ενεργό σήματα των ιστονών, όπως η ακετυλίωση των ιστονών και H3K4 μεθυλίωσης [18], [19]. Ένα κρίσιμο ερώτημα είναι το κατά πόσον οι αλλαγές στο επίπεδο των τροποποιήσεων των ιστονών είναι ένα αίτιο ή συνέπεια της CG υποκινητή γονιδίου DNA απομεθυλίωση σε καρκινικά κύτταρα. Μελέτες που χρησιμοποιούν αναστολείς της H3K9 και H3K27 μεθυλτρανσφεράσες έδειξε ότι αυτά ήταν από μόνες τους δεν μπορούν να επάγουν σημαντική απομεθυλίωση DNA και την ενεργοποίηση των γονιδίων CG [18], [19]. Παρόμοια αποτελέσματα ελήφθησαν μετά την αναστολή της demethylases H3K4 [19]. Αντίθετα, διάφορες μελέτες ανέφεραν ότι η γονιδιακή έκφραση CG μπορεί να επάγεται σε κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με έναν αναστολέα αποακετυλασών ιστόνης [20] – [22]. Σε μια αναφορά [20], αλλά όχι στα άλλα, ήταν η αγωγή φαίνεται να επάγει DNA απομεθυλίωση ενός γονιδίου υποκινητή CG. Αυτές οι παρατηρήσεις έθεσε ως εκ τούτου η πιθανότητα που κερδίζει σε ακετυλίωση ιστονών μπορεί να είναι μια επαρκής σκανδάλη για να προκληθεί απομεθυλίωση DNA και την ενεργοποίηση των γονιδίων CG σε καρκινικά κύτταρα.
Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε το δυναμικό της ακετυλίωσης ιστόνης για την επαγωγή DNA απομεθυλίωση και ενεργοποίηση των γονιδίων
MAGEA1
, ένα καλά χαρακτηρισμένο μέλος της ομάδας CG γονιδίων. Αυτό αξιολογήθηκε με τον έλεγχο της επίδρασης του τριχοστατίνη Α (TSA), έναν αναστολέα αποακετυλάσης ιστόνης, σε μη εκφράζοντα κύτταρα μελανώματος και σε ένα κυτταρικό κλώνο που φέρει ένα μεθυλιωμένο
MAGEA1 /hph
κατασκεύασμα, το οποίο επιτρέπει την επιλογή (αντίσταση υγρομυκίνης ) των κυττάρων όπου συνέβη η ενεργοποίηση του διαγονιδίου. Επιπλέον, αυτό το σύστημα ευαίσθητο κυτταρικό αναφοράς χρησιμοποιήθηκε σε ένα αντίστροφο πείραμα, στο οποίο αξιολογήσαμε την ικανότητα ενός αναστολέα της μεθυλίωσης του DNA για την πρόκληση αλλαγών των σημάτων ιστόνης εντός του
MAGEA1
υποκινητή.
αποτελέσματα
μεταβολές της ιστόνης που σχετίζονται με
MAGEA1
ενεργοποίηση σε κυτταρικές σειρές μελανώματος
για τον εντοπισμό των ιστονών αλλαγές τροποποίηση σχετίζεται με το
MAGEA1
ενεργοποίηση, πραγματοποιήσαμε χρωματίνης ανοσοκαταβύθιση (μάρκας) πειράματα σε μη έκφραση και κυτταρικές σειρές που εκφράζουν. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε αθανατοποιημένη ανθρώπινης ακροποσθίας ινοβλάστες (HFF2-hTERT) και δύο κυτταρικές σειρές μελανώματος που δεν εκφράζουν
MAGEA1
(SK-MEL-23 και EB16-MEL), καθώς και σε τρεις κυτταρικές σειρές μελανώματος ότι εκφράζουν
MAGEA1
(ΜΖ2-MEL3.1, BB74-MEL και Mi13443-MEL). Όπως ήταν αναμενόμενο, η αξιολόγηση των
MAGEA1
επίπεδα μεθυλίωσης του DNA προαγωγού με ποσοτική MS-PCR σε αυτές τις κυτταρικές σειρές, έδειξε υψηλά επίπεδα μεθυλίωσης σε μη εκφράζοντα κύτταρα, και χαμηλά μεθυλίωση σε κύτταρα που εκφράζουν (Εικ. 1Α). πειράματα ChIP, εξετάζει το
MAGEA1
5′-περιοχή, αποκάλυψε προνομιακή εμπλουτισμό διμεθυλιωμένης H3K9 (H3K9me2) στο
MAGEA1
-αρνητικοί έναντι
MAGEA1
-θετικό κυτταρικές σειρές (Εικ . 1Β). Σε έντονη αντίθεση, ακετυλίωση της ιστόνης Η3 (H3ac) και διμεθυλίωση της H3K4 (H3K4me2) στο εσωτερικό της
MAGEA1
5′-περιοχή έδειξε αξιοσημείωτη αύξηση στις τρεις κυτταρικές σειρές που εκφράζουν, σε σύγκριση με τα μη-εκφράζοντα κύτταρα (Εικ. 1Β). Σημαντικές εμπλουτισμό τριμεθυλιωμένη H3K27 (H3K27me3) στο εσωτερικό της
MAGEA1
5′-περιοχή παρατηρήθηκε σε κύτταρα HFF2-hTERT, αλλά όχι σε οποιαδήποτε από τις άλλες κυτταρικές σειρές. Μαζί, τα αποτελέσματα μας πρότεινε ότι η απομεθυλίωση του DNA και της ενεργοποίησης του
MAGEA1
σε κύτταρα μελανώματος συνδέεται με την απώλεια του H3K9me2, και τα κέρδη του H3ac και H3K4me2 εντός της 5′-περιοχής του γονιδίου. Αυτό ήταν συνεπές με ένα δυνητικό ρόλο της ακετυλίωση των ιστονών στην επιγενετική ενεργοποίηση του
MAGEA1
στα καρκινικά κύτταρα.
Μια
,
MAGEA1
επίπεδα έκφρασης του mRNA
(άνω πάνελ) και τα επίπεδα μεθυλίωσης του DNA 5′-περιοχή (κάτω πίνακας) αξιολογήθηκαν σε τρεις μη κυτταρικές σειρές που εκφράζουν (HFF2-hTERT, SK-MEL-23 και EB16-MEL), καθώς και σε τρεις κυτταρικές σειρές που εκφράζουν (ΜΖ2 -MEL3.1, BB74-MEL και Mi13443-MEL). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή (± SEM) των δύο ανεξάρτητων πειραμάτων qRT-PCR ή QMS-PCR, το καθένα εις διπλούν.
Β
, Chip-ποσοτική PCR εφαρμόστηκε στις ίδιες κυτταρικές σειρές για την αξιολόγηση εμπλουτισμό των ενδεικνυόμενων τροποποιήσεων ιστονών εντός είτε το
MAGEA1
5′-περιοχή ή το
GAPDH
υποκινητή (που αντιπροσωπεύουν παντού ενεργό υποκινητή). Τα δεδομένα προέρχονται από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα ChIP, με δύο διπλές μέτρα qPCR σε κάθε περίπτωση.
Η
TSA προκαλεί παροδική ενεργοποίηση του
MAGEA1
στα κύτταρα μελανώματος
προκειμένου να αξιολογηθεί η συμβολή των ακετυλίωση των ιστονών στην επιγενετική ρύθμιση της
MAGEA1
, εκθέσαμε κυτταρικές σειρές SK-MEL-23 και EB16-MEL στο δεακετυλάσης της ιστόνης (HDAC) αναστολέας TSA, και εξετάζεται η επίδρασή του στην τα επίπεδα μεταγραφής και DNA μεθυλίωση του γονιδίου. Στην SK-MEL-23 κύτταρα, η έκθεση σε TSA συνδέθηκε με μια τριπλάσια αύξηση 3,3 στο
MAGEA1
επίπεδο mRNA, όταν αξιολογείται μία ημέρα μετά τη θεραπεία. Ωστόσο, αυτή η επίδραση χάθηκε κατά τις ημέρες 4 και 7 μετά τη θεραπεία (Εικ. 2Α). Σε EB16-MEL, ήμασταν σε θέση να ανιχνεύσει οποιαδήποτε σημαντική ενεργοποίηση του
MAGEA1
μετά την TSA (Εικ. 2Α), η οποία ήταν σύμφωνη με τα προηγούμενα στοιχεία που δείχνουν ότι η επίδραση της TSA στο
MAGEA1
ενεργοποίησης είναι τύπου κυττάρου που εξαρτώνται από [22]. Για σύγκριση, οι δύο κυτταρικές σειρές υποβλήθηκαν σε θεραπεία με τον αναστολέα μεθυλίωσης DNA 5-αζα-2′-δεοξυκυτιδίνη (5-azadC). Επειδή αυτό το φάρμακο προκαλεί την αντιγραφή που εξαρτάται από απομεθυλίωση DNA, η θεραπεία διατηρήθηκε κατά τη διάρκεια τέσσερις ημέρες πριν από την ανάλυση. Ποσοτική πειράματα RT-PCR αποκάλυψε ότι 5-azadC (1 μΜ) προκάλεσε σημαντική
MAGEA1
έκφρασης σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές. Στην SK-MEL-23 κύτταρα, το επίπεδο του
MAGEA1
mRNA παρατηρήθηκε μετά από 4 ημέρες θεραπείας 5-azadC ήταν 135 φορές υψηλότερη από αυτή που παρατηρήθηκε μετά από μία ημέρα θεραπείας TSA. Επιπλέον, σε αμφότερες τις κυτταρικές σειρές, η 5-azadC επαγόμενη ενεργοποίηση του
MAGEA1
ήταν ακόμη ανιχνεύθηκε σε ημέρες 3 και 6 μετά την απομάκρυνση του φαρμάκου (Εικ. 2Β).
SK-MEL -23 και EB16-MEL κυτταρικές γραμμές εκτέθηκαν είτε σε 300 ηΜ TSA κατά την διάρκεια 24h (
A
), ή 1 μΜ 5-azadC κατά την διάρκεια 96h (
B
), και το RNA εκχυλίστηκε από τα κύτταρα στις ημέρες 1, 4 και 7 μετά τη θεραπεία TSA ή κατά τις ημέρες 4, 7, 10 μετά από 5-azadC θεραπεία.
MAGEA1
επίπεδα έκφρασης προσδιορίστηκαν με ποσοτική RT-PCR. Αξίες, οι οποίες απορρέουν από τρία ανεξάρτητα πειράματα, ομαλοποιήθηκαν από το
ACTINB
επίπεδο έκφρασης, και εκφράζονται σε σχέση με τα επίπεδα που βρέθηκαν σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (ctrl). *
P
& lt? 0,05, **
P
& lt? 0,01, ***
P
& lt? 0.001.
C
, Η επίδραση της TSA και 5-azadC στο
MAGEA1
5′-DNA περιοχή απομεθυλίωση αξιολογήθηκε με εφαρμογή MS-PCR σε δείγματα DNA που εκχυλίζεται 10 ημέρες μετά την έναρξη των θεραπειών. Δεδομένων (πάσο απομεθυλίωση) αντιστοιχούν στο σχετική ποσότητα μη μεθυλιωμένων αλληλουχιών σε κατεργασμένα κύτταρα αναφερθεί ότι σε μη επεξεργασμένα κύτταρα (Ctrl). Οι τιμές αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή (± SEM) των τριών ανεξάρτητων πειραμάτων ΣΔΠ-PCR. *
P
& lt? 0,05, **
P
& lt?. 0.01
Η
Σύμφωνα με τις μελέτες μας έκφραση, ποσοτικά αποτελέσματα MS-PCR αποκάλυψε ότι TSA προκαλούμενη δεν σημαντική μείωση του
MAGEA1
επίπεδο μεθυλίωσης υποκινητή, είτε σε SK-MEL-23 ή κυτταρικών γραμμών EB16-MEL (Σχ. 2C). Σημαντική απομεθυλίωση του
MAGEA1
προαγωγός αντί παρατηρήθηκε και στις δύο κυτταρικές γραμμές μετά από θεραπεία 5-azadC (Σχ. 2C).
Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι ενώ TSA μπορεί να επάγει παροδικές de-καταστολή του
MAGEA1
σε αρχικά μη-εκφράζοντα κύτταρα, αυτό δεν οδηγεί σε απομεθυλίωση DNA και μακροπρόθεσμη μεταγραφική ενεργοποίηση του γονιδίου.
ιστόνης τροποποιήσεις που σχετίζονται με ένα
in vitro
μεθυλιωμένο
MAGEA1
διαγονιδίου
η αδυναμία μας να ανιχνεύσει TSA που προκαλείται από απομεθυλίωση και μακροπρόθεσμη ενεργοποίηση του γονιδίου
MAGEA1
, όπως αναφέρθηκε παραπάνω, μπορεί να οφείλεται σε πειραματικό περιορισμούς . Είναι δυνατόν, πράγματι, ότι η επιγενετική επίδραση του TSA στο
MAGEA1
εμφανίστηκαν μόνο σε ένα μικρό ποσοστό των κυττάρων, γεγονός που καθιστά πολύ δύσκολη την ανίχνευση σημαντικές αλλαγές ενεργοποίηση γονιδίων και μεθυλίωσης του DNA στο κατεργασμένο κύτταρο πληθυσμού. Επιπλέον, απροκάλυπτη επιγενετική ενεργοποίηση του
MAGEA1
από την TSA μπορεί να απαιτεί την παρουσία των κατάλληλων παραγόντων μεταγραφής, η οποία δεν μπορεί να είναι παρόν σε SK-MEL-23 ή EB16-MEL κυτταρικές σειρές. Δείξαμε, πράγματι, ότι η μακροχρόνια ενεργοποίηση των
MAGEA1
απαιτεί όχι μόνο μια διαδικασία απομεθυλίωσης DNA, αλλά επίσης την παρουσία μεταγραφικών ενεργοποιητών για την πρόληψη της μετέπειτα επαναμεθυλίωση του προαγωγού [23].
Ως εκ τούτου, αποφάσισε να αξιολογήσει εκ νέου η επίδραση της TSA σε ένα προηγουμένως καθιερωμένο σύστημα κυττάρων (ΜΖ2-MEL.TrHM) που περιέχει έναν επιλέξιμο
MAGEA1
κατασκευή [24]. κύτταρα MZ2-MEL.TrHM περιέχουν διαγονίδιο (
MAGEA1 /hph
) που περιλαμβάνει ένα μεγάλο μέρος του
MAGEA1
τόπο (συμπεριλαμβανομένης της περιοχής υποκινητή) ακολουθούμενη από την αλληλουχία που κωδικοποιεί την αντίσταση στην υγρομυκίνη (
HPH
? Εικ. 3Α). Το διαγονίδιο μεθυλιώθηκε
in vitro
πριν από την επιμόλυνση, και παραμένει μεθυλιωμένα και αθόρυβη σε κύτταρα MZ2-MEL.TrHM, τα οποία είναι ως εκ τούτου ευαίσθητα στην υγρομυκίνη. Ωστόσο, δείξαμε ότι με αντοχή στην υδρομυκίνη (hygro
r) κλώνοι κυττάρων προκύψουν όταν η
MAGEA1 /HPH
διαγονιδίου γίνεται σταθερά ενεργοποιηθεί, για παράδειγμα μετά από παροδική θεραπεία με 5-azadC [24]. Σημαντικά, τα κύτταρα MZ2-MEL.TrHM προήλθαν από ένα
MAGEA1
εκφράζοντα κυτταρική γραμμή μελανώματος. Ως εκ τούτου, αυτά τα κύτταρα περιέχουν όλα τα απαραίτητα παράγοντες μεταγραφής για να διασφαλίσει τη μακροπρόθεσμη ενεργοποίηση του υποκινητή του γονιδίου, όπως αποδεικνύεται από την παρουσία ενός ενεργού και μη μεθυλιωμένου ενδογενών
MAGEA1
γονίδιο.
A
, Σχηματική αναπαράσταση της κατάστασης δομή και μεθυλίωσης του DNA των δραστικών μη-μεθυλιωμένου (κενοί κύκλοι)
MAGEA1
γονίδιο και τα ανενεργά μεθυλιωμένο (γεμάτοι κύκλοι)
MAGEA1 /hph
διαγονιδίου σε MZ2-MEL κύτταρα .TrHM. Μαύρα κουτιά αντιστοιχούν στις
MAGEA1
εξώνια, το σκούρο γκρι πλαίσιο εντός του
MAGEA1 /HPH
διαγονιδίου αντιπροσωπεύει το
HPH
μονάδα μεταγραφής, και ο αστερίσκος (*) είναι η τοποθεσία όπου εισήχθη ένα 12-bp αλληλουχία tag (που μεταφέρουν ένα
Xba ιστοσελίδα περιορισμού Ι). Το κάτω πάνελ είναι μια διεύρυνση της amplicon που ενισχύθηκε σε πειράματα ChIP, και δείχνει τα αναμενόμενα μεγέθη θραύσματος παρακάτω
Xba
Ι πέψη.
Β
, πειράματα ChIP εφαρμόστηκαν σε ΜΖ2-MEL.TrHM. Το προκύπτον
MAGEA1
αμπλικόνια χωνεύτηκαν με
Xba
Ι και διαχωρίστηκαν σε πηκτώματα αγαρόζης, αποκαλύπτοντας έτσι τη σχετική εμπλουτισμό των υποδεικνυόμενων τροποποιήσεις των ιστονών εντός είτε του
MAGEA1
γονίδιο (άνω ζώνη ) ή το
MAGEA1 /Ε.Α.Ε
διαγονιδίου (κάτω ζώνη).
C
, Σχετική εμπλουτισμό των σημάτων των ιστονών στην διαγονιδίου συναχθεί από την ποσοτικοποίηση εντάσεις ζώνης σε εικόνες ηλεκτροφόρηση γέλης (λογισμικό ImageJ), και τον υπολογισμό του κάτω επάνω αναλογία /. Δεδομένα, τα οποία κανονικοποιήθηκαν από την κάτω /επάνω αναλογία στα δείγματα εισόδου, προέρχονται από δύο τουλάχιστον ανεξάρτητα πειράματα ChIP, με αναλύσεις δύο PCR /XbaI /ηλεκτροφόρηση σε κάθε περίπτωση. *
P
& lt? 0,05, ***
P
& lt?. 0.001
Η
Πρέπει πρώτα διεξήγαγε πειράματα τσιπ για τον εντοπισμό των ιστονών τροποποιήσεις που σχετίζονται με τη σιωπηλή em
MAGEA1 /HPH
διαγονιδίου στα κύτταρα ΜΖ2-MEL.TrHM. Η παρουσία μιας αλληλουχίας ετικέτας στο
MAGEA1 /hph
διαγονιδίου, εισάγεται στη θέση 158 σε σχέση με τη θέση έναρξης μεταγραφής και περιέχει ένα
Xba
-Ι θέση περιορισμού, μας επέτρεψε να διακρίνουμε
MAGEA1
αμπλικόνια που προέρχονται είτε από το εξωγενές διαγονιδίου ή του ενδογενούς γονιδίου. Έτσι, ΜΖ2-MEL.TrHM χρωματίνης που προέρχονται από
MAGEA1
αμπλικόνια αφομοιώθηκαν με
Xba
-Ι, αποδίδοντας έτσι μια ανώτερη ζώνη (330 bp) που απορρέουν από την ενδογενή
MAGEA1
γονίδιο και ένα κάτω ζώνη (269 bp) που απορρέουν από τη
MAGEA1 /hph
διαγονιδίου μετά από ηλεκτροφόρηση σε αγαρόζη (3Α Σχ., Β). Με την εφαρμογή της διαδικασίας αυτής για την ανάλυση των δειγμάτων χρωματίνης τσιπ που προέρχεται, βρήκαμε ότι H3ac και H3K4me2 σημάδια της ιστόνης έντονα εξαντληθεί εντός του
MAGEA1 /HPH
διαγονιδίου, σε σύγκριση με την ενδογενή
MAGEA1
γονίδιο. Αντίθετα, η κατασταλτική σήμα H3K9me2 εμφανίστηκε κυρίως εμπλουτισμένο εντός του διαγονιδίου (Σχ. 3Β, C). Αυτά τα αποτελέσματα δείχνουν ότι, μετά την ένταξη στο γονιδίωμα ΜΖ2-MEL.TrHM, η
in vitro
μεθυλιωμένο
MAGEA1 /HPH
διαγονιδίου υιοθέτησε σήματα των ιστονών που συνήθως συνδέονται με την κατάσταση καταστολής του
MAGEA1
γονιδίου σε μη-εκφράζοντα κύτταρα.
η έλλειψη μακροπρόθεσμης ενεργοποίηση του
MAGEA1 /HPH
παρακάτω TSA θεραπεία
Όπως μάθαμε χαμηλή ακετυλίωση της ιστόνης εντός της σιωπηλός
MAGEA1 /hph
διαγονιδίου, εξετάσαμε την ικανότητα της TSA να επάγει σταθερές ενεργοποίηση του διαγονιδίου, και ως εκ τούτου η εμφάνιση hygro
κλώνους r μεταξύ του επεξεργασμένου κυτταρικού πληθυσμού ΜΖ2-MEL.TrHM. Εκτός από τη συμβατική θεραπεία 24h TSA, ένα 72h-μακρά έκθεση TSA εφαρμόστηκε σε κύτταρα MZ2-MEL.TrHM, όπως είχε αναφερθεί ότι παρατεταμένη θεραπεία με αναστολείς HDAC μπορεί να είναι απαραίτητη σε ορισμένες περιπτώσεις για να επάγει εντοπισμένη DNA απομεθυλίωση [25]. Η συγκέντρωση του TSA για τη θεραπεία 72 ώρες μειώθηκε σε 80 ηΜ, διότι υψηλότερες δόσεις βρέθηκαν να σκοτώσει τα περισσότερα κύτταρα κατά τη διάρκεια αυτής της χρονικής περιόδου. Εκτός από TSA-επεξεργασμένα κύτταρα, αναλύσαμε επίσης κύτταρα που κατεργάζονται με μία υποβέλτιστη δόση της 5-azadC (20 ηΜ? Εικ. 4Α). 5-azadC σε αυτή τη δόση βρέθηκε να επάγει
MAGEA1 /hph
έκφραση mRNA σε επίπεδο συγκρίσιμο με αυτό που παρατηρήθηκε κατά την ημέρα 1 μετά τη θεραπεία 24h TSA (Εικ. 4Β). Ως εκ τούτου, η θεραπεία με τη μη βέλτιστη δόση των 5-azadC μας επέτρεψε να ελέγξει αν διαδικασία επιλογής υγρομυκίνης μας ήταν ακόμα αποτελεσματικό σε συνθήκες όπου συνέβη μόνο ενεργοποίηση χαμηλού επιπέδου του διαγονιδίου.
Α
, σχηματική περιγραφή του πειράματος. κύτταρα MZ2-MEL.TrHM υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε όχι (έλεγχος) με 300 ηΜ TSA για 24 ώρες, 80 ηΜ TSA για 72 ώρες, ή με 20 ηΜ 5-azadC για 72 ώρες. Μετά από τρεις ημέρες, 10
6 κύτταρα από κάθε ομάδα μεταφέρθηκαν σε δύο φιάλες (75 cm
2) και επιλέχθηκαν σε μέσο που περιέχει υγρομυκίνη (180 μg /mL) κατά την διάρκεια 13 ημερών.
B
, Το επίπεδο έκφρασης του
MAGEA1 /hph
διαγονιδίου ποσοτικοποιήθηκε με qRT-PCR στον υποδεικνυόμενο χρονικό σημείο (d1 ή d3) σε κάθε ομάδα κυττάρων. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή (± SEM) του al τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. ***
P
& lt? 0.001.
C
, Το επίπεδο του DNA απομεθυλίωση ο
MAGEA1 /hph
5′-περιοχή στις διάφορες ομάδες κυττάρων εκτιμήθηκε με ποσοτική MS-PCR, χρησιμοποιώντας εναρκτήρες που ενισχύουν ειδικά την ετικέτα διαγονίδιο αλληλουχία. Τα δεδομένα (πάσο DNA απομεθυλίωση) υπολογίσθηκαν όπως στο Σχ 2C, και αντιστοιχεί στον μέσο (± SEM) των τουλάχιστον τριών ανεξάρτητων πειραμάτων. *
P
& lt? 0,05.
D
, ο αριθμός των κλώνων που διασώθηκαν υγρομυκίνης επιλογή μετρήθηκαν κατά την ημέρα 16 στις τρεις ομάδες των κυττάρων. Τα δεδομένα προέρχονται από τουλάχιστον δύο ανεξάρτητα πειράματα, το καθένα εις διπλούν.
Η
Ποσοτική RT-PCR πειράματα αποκάλυψαν ότι, ενώ μικρή αλλά σημαντική
MAGEA1 /HPH
επαγωγή mRNA παρατηρήθηκε κατά την ημέρα 1 μετά η θεραπεία TSA 24h, αυτό επαγωγή είχε ήδη χάσει δύο ημέρες αργότερα (Σχ. 4Β). κύτταρα MZ2-MEL.TrHM που είχαν εκτεθεί στην θεραπεία 72h TSA εμφανίζεται μια πολύ μέτρια αύξηση
MAGEA1 /hph
έκφραση mRNA (όχι σημαντική,
p = 0,1428
), σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου (Σχ. 4Β). Αυτό το χαμηλό επίπεδο επαγωγής ήταν πιθανόν οφείλεται στην μειωμένη συγκέντρωση TSA σε αυτή την κατάσταση. Επιπλέον, ποσοτική PCR MS-κατευθύνονται ειδικά προς το διαγονιδιακό
MAGEA1
5′-περιοχή, δεν αποκάλυψε απομεθυλίωση αυτής της αλληλουχίας DNA σε ένα από τα κατεργασμένα με TSA κυτταρικούς πληθυσμούς, σε σύγκριση με μη επεξεργασμένα κύτταρα (Εικ. 4C) . Σε αντίθεση, τα κύτταρα που έλαβαν θεραπεία με τη μη βέλτιστη δόση των 5-azadC εμφανίζεται μέτρια, αν και σημαντικές, DNA απομεθυλίωση του
MAGEA1 /HPH
διαγονιδίου.
Για την ανίχνευση σπάνιων κυττάρων όπου
MAGEA1 HPH
ενεργοποίηση /διαγονιδίου μπορεί να έχουν συμβεί, και τα οποία μπορεί να έχουν παραμείνει αόρατο σε RT-PCR και MS-PCR μας αναλύει, υποβάλαμε τα διαφορετικά αντιμετωπίζονται κυτταρικών πληθυσμών ΜΖ2-MEL.TrHM για επιλογή σε υγρομυκίνη. Μετά από 13 μέρες επιλογής, hygro
αποικίες r μετρήθηκαν. Η μέση συχνότητα των hygro
r κλώνους που λαμβάνονται μετά είτε το 24ωρο ή τη θεραπεία 72 ώρες TSA (6 × 10
-6 και 5,5 × 10
-6, αντίστοιχα) δεν ήταν υψηλότερη από εκείνη που παρατηρήθηκε για το μη επεξεργασμένο έλεγχο κύτταρα (9.5 × 10
-6), και αντιστοιχούσε επομένως στο επίπεδο υποβάθρου αυθόρμητα hygro
κύτταρα r αναστροφής (Εικ. 4D). Σε σύγκριση, η θεραπεία με τη μη βέλτιστη δόση των 5-azadC είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση ενός πολύ μεγαλύτερου αριθμού hygro
κλώνους r (& gt? 3 × 10
-4). Στο σύνολό τους, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η TSA δεν προκαλεί απομεθυλίωση DNA και σταθερή ενεργοποίηση του
MAGEA1 /HPH
διαγονιδίου, ούτε καν σε ένα μικρό ποσοστό των κατεργασμένων κυττάρων ΜΖ2-MEL.TrHM.
DNA απομεθυλίωση προκαλεί αντιστροφή των σημαδιών της ιστόνης στο
MAGEA1 /HPH
η
Λαμβάνοντας υπόψη προηγούμενες μελέτες από άλλους [18], [19], καθώς και οι παρατηρήσεις που περιγράφονται εδώ παραπάνω, φαίνεται απίθανο ότι οι αλλαγές στο επίπεδο των τροποποιήσεων ιστονών μπορούν από μόνοι τους να είναι επαρκής έναυσμα για να προκαλέσει απομεθυλίωση DNA και μακροπρόθεσμη ενεργοποίηση του
MAGEA1
γονίδιο. Επομένως, ήταν λογικό να προταθεί ότι η αντιστροφή των σημαδιών της ιστόνης που σχετίζονται με
MAGEA1
ενεργοποίησης είναι αντί συνέπεια του DNA απομεθυλίωση. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, εμείς κατέφυγε σε μια προηγουμένως συσταθεί hygro
r υπο-πληθυσμός των κυττάρων MZ2-MEL.TrHM (H
πληθυσμού r, Σχ. 5Α και [24]), το οποίο είχε ληφθεί μετά από παροδική έκθεση των κυττάρων σε αντινοηματικά ολιγονουκλεοτίδια που κατευθύνονται έναντι
DNMT1
, το κυρίαρχο μεθυλτρανσφεράση DNA σε αυτά τα κύτταρα [24]. Αποφασίσαμε να διεξάγει πειράματα τσιπ στην H
πληθυσμού r, προκειμένου να προσδιοριστεί η επίδραση του DNA απομεθυλίωση για H3ac, H3K4me2 και H3K9me2 σημάδια της ιστόνης εντός του
MAGEA1 /HPH
διαγονιδίου. Οι αναλύσεις πραγματοποιήθηκαν επίσης σε ένα κυτταρικό κλώνο (Η
R κλώνου 1), η οποία είχε απομονωθεί από το H
πληθυσμός r (Εικ. 5Α). Ποσοτική RT-PCR και αλληλούχιση όξινο θειώδες νάτριο επιβεβαίωσαν ισχυρή μεταγραφική ενεργοποίηση και DNA απομεθυλίωση του
MAGEA1 /hph
διαγονιδίου στο H
πληθυσμός R και H
R κλώνου 1 (Σχ. 5Β).
Μια
, Σχηματική περιγραφή της προέλευση του H
πληθυσμού R και H
r κλώνος 1 από τα κύτταρα MZ2-MEL.TrHM (βλέπε αναφορά [24] για λεπτομέρειες) . κύτταρα MZ2-MEL.TrHM επανειλημμένα διαμολυσμένους με αντιπληροφοριακά ολιγονουκλεοτίδια που κατευθύνονται έναντι
DNMT1
(
DNMT1-AS
) κατά τη διάρκεια 7 ημερών, και είχαν στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε μέσο που περιέχει υγρομυκίνη. Μετά από 9 ημέρες επιλογής υγρομυκίνη, ένας ανθεκτικός πληθυσμός προέκυψε (H
πληθυσμός r), και ένας κλώνος (Η
R κλώνου 1) απομονώθηκε από αυτόν τον πληθυσμό με περιοριστική αραίωση. Η H
r πληθυσμού και H
r κλώνος 1 ήταν στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν χωρίς επιλογή υγρομυκίνης.
Β
, το επίπεδο έκφρασης του mRNA (αναλογία 10
4
ACTINB
) και 5′-περιοχή κατάστασης μεθυλίωσης του DNA (% μεθυλιωμένα CpGs) από το
MAGEA1 /HPH
διαγονιδίου προσδιορίστηκαν σε κύτταρα MZ2-MEL.TrHM, το H
πληθυσμού R και H
r κλώνος 1 από qRT-PCR και όξινο θειώδες αλληλουχίας, αντίστοιχα.
C
, Chip-qPCR χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογήσει τον εμπλουτισμό της H3K9me2 μέσα στο
MAGEA1 /HPH
διαγονιδίου στις τρεις ομάδες κυττάρων (βλέπε κείμενο για λεπτομέρειες). Φορές εμπλουτισμός επίπεδα ελήφθησαν από την υποβολή των
MAGEA1
5′-περιοχή τιμών εμπλουτισμό με εκείνη του
GAPDH
5′-περιοχή στο ίδιο δείγμα. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή (± SEM) από δύο έως τρία πειράματα ChIP, με δύο διπλές μετρήσεις qPCR σε κάθε περίπτωση. ***
P
& lt? 0.001.
D
, το τσιπ /ΡΟΚ /
Xba
I Διαδικασία (βλ. Σχήμα 3Α, Β) εφαρμόστηκε για να αξιολογήσει τον εμπλουτισμό των H3ac και H3K4me2 εντός της 5′-περιοχή του
MAGEA1 /HPH
διαγονιδίου σε τρεις ομάδα κυττάρων.
E
, ImageJ αναλύσεις των εικόνων ηλεκτροφόρηση γέλης χρησιμοποιήθηκαν για να προσδιοριστεί ποσοτικά η
MAGEA1
5′-περιοχή αναλογία διαγονιδίου /γονιδίου. Τα δεδομένα αντιπροσωπεύουν τη μέση τιμή (± SEM) των δύο ανεξάρτητα πειράματα ChIP, με αναλύσεις δύο PCR /XbaI /ηλεκτροφόρηση σε κάθε περίπτωση. **
P
& lt? 0,01, ***
P
& lt?. 0.001
Η
Για την ανάλυση των H3K9me2, δείγματα ChIP υποβλήθηκαν σε ποσοτική PCR με αστάρια δεν διακρίνει μεταξύ των ενδογενών και διαγονιδιακά
MAGEA1
ακολουθίες. Έλλειψη H3K9me2 εντός του ενδογενούς δραστικού
MAGEA1
γονιδίων σε κύτταρα MZ2-MEL.TrHM (βλέπε Σχ. 3Β, C) σιωπηρή, ωστόσο, ότι τα περισσότερα αμπλικόνια ChIP προερχόμενο θα προέρχονται από το
MAGEA1 /hph
διαγονιδίου. Τα αποτελέσματα, τα οποία απεικονίζονται στο σχήμα 5C, ήταν σύμφωνες με μειωμένο εμπλουτισμό H3K9me2 εντός της περιοχής 5 ‘του
MAGEA1 /hph
στην H
πληθυσμός r και στην H
R κλώνου 1 , σε σύγκριση με κύτταρα ελέγχου MZ2-MEL.TrHM. Για την ανάλυση των H3ac και H3K4me2, καταφύγαμε στο τσιπ-PCR-
Xba
I Διαδικασία που περιγράφεται παραπάνω (Σχ. 3Α). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι, ενώ η
MAGEA /HPH
διαγονιδίου δεν συνδέθηκε με H3ac και H3K4me2 στα κύτταρα ελέγχου MZ2-MEL.TrHM, αυτό εμφανίζεται σημαντικά τον εμπλουτισμό αυτών των δύο σημάτων ενεργοποίησης στο H
πληθυσμού r και στην H
R κλώνου 1 (Σχ. 5D, E). Συνολικά, τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν ότι η παροδική μείωση των DNMT1 στα κύτταρα MZ2-MEL.TrHM, είχε ως αποτέλεσμα την εμφάνιση του hygro
r κύτταρα, στα οποία η εκ νέου ενεργοποιημένο
MAGEA1 /HPH
τόπος δεν εμφανίζεται μόνο που σημειώνονται DNA υπομεθυλίωση, αλλά και σημαντική αναστροφή του προφίλ τροποποίηση των ιστονών της προς μια ενεργή διαμόρφωση.
Συζήτηση
Γονιδιώματος υπομεθυλίωση συχνά παρατηρείται σε καρκινικά κύτταρα και έχει συνδεθεί με κακοήθη εξέλιξη. Ωστόσο, οι μηχανισμοί που διέπουν αυτή την επιγενετική μεταβολή είναι ακόμη άγνωστες. Λαμβάνοντας υπόψη την υφιστάμενη μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και τροποποιήσεων ιστονών στενό σύνδεσμο, ήταν λογικό να προταθεί ότι το DNA υπομεθυλίωση σε όγκους μπορεί να είναι μια συνέπεια των αλλαγών που επέρχονται στο επίπεδο των σημάτων των ιστονών. Αλλοιώσεις του προφίλ τροποποίηση ιστονών πράγματι παρατηρηθεί σε διάφορους τύπους όγκων, και σε ορισμένες περιπτώσεις έχουν συνδεθεί με μεταλλάξεις στα ένζυμα ιστόνης τροποποίηση [26].
Στην παρούσα μελέτη, αναλύσαμε τη σχέση μεταξύ της μεθυλίωσης του DNA και τροποποιήσεις των ιστονών εντός του
MAGEA1
γονίδιο, καθώς ανήκει στη μοναδική ομάδα γονιδίων CG, για την οποία συχνά παρατηρείται υπομεθυλίωση υποκινητή σε μία ποικιλία όγκων και συνδέθηκε με συνέπεια με μεταγραφική ενεργοποίηση [11]. Έχει αναφερθεί στο παρελθόν ότι απομεθυλίωση και την ενεργοποίηση των γονιδίων CG σε όγκους γενικά σχετίζεται με τις απώλειες των κατασταλτικών σημάδια της ιστόνης και τα κέρδη στην ενεργοποίηση σημάτων της ιστόνης [18], [19]. Τέτοιας ένωσης επιβεβαιώθηκε στην παρούσα μελέτη μας, όπως έχουμε διαπιστώσει ότι
MAGEA1
απομεθυλίωση και ενεργοποίηση σε κύτταρα μελανώματος συσχετίζεται με απώλειες H3K9me2, και τα κέρδη σε H3ac και H3K4me2. Προηγούμενες μελέτες, ωστόσο, έδειξαν ότι η έκφραση του
MAGEA1
δεν θα μπορούσε να ενεργοποιηθεί με την απλή ρύθμιση των επιπέδων H3K9me2 ή H3K4me2, γεγονός που υποδηλώνει ότι οι δύο αυτές τροποποιήσεις ιστονών παίζουν μόνο δευτερεύοντα ρόλο στην επιγενετική ρύθμιση αυτού του γονιδίου [18], [19]. Αναστολείς αποακετυλασών ιστόνης, συμπεριλαμβανομένων TSA, ήταν αντ ‘αυτού βρέθηκε να επάγει την ενεργοποίηση του
MAGEA1
, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ακετυλίωση των ιστονών μπορεί να συμβάλει πιο ενεργά στην επιγενετική ρύθμιση αυτού του γονιδίου [22], [27]. παρόντα δεδομένα μας όμως, δείχνουν ότι η θεραπεία TSA οδηγεί μόνο παροδική ενεργοποίηση του
MAGEA1
και δεν προκαλεί απομεθυλίωση DNA εντός του υποκινητή του γονιδίου.
Η μελέτη μας παρέχει μια σε βάθος ανάλυση της επίδρασης της TSA στο
MAGEA1
ενεργοποίηση, αφού εξετάσαμε τις επιπτώσεις της, όχι μόνο σε μη-κυτταρικές σειρές που εκφράζουν, αλλά και στον κλώνο MZ2-MEL.TrHM κύτταρο, το οποίο περιέχει ένα
in vitro
μεθυλιωμένα διαγονίδιο που περιλαμβάνει το τμήμα 5 ‘του
MAGEA1
ακολουθούμενη από την αλληλουχία που κωδικοποιεί την αντίσταση στην υγρομυκίνη. Αυτό το κυτταρικό σύστημα παρέχει υψηλή ευαισθησία, καθώς επιτρέπει την επιλογή των κυττάρων (ακόμη και αν είναι σπάνια), στις οποίες η ενεργοποίηση του
συνέβη MAGEA1
υποκινητή. Επιπλέον, επειδή τα κύτταρα εκφράζουν το ενδογενές
MAGEA1
γονίδιο, που προφανώς περιέχουν όλα τα απαραίτητα στοιχεία για τη διασφάλιση μεταγραφική ενεργοποίηση των διαγονιδιακών
MAGEA1
υποκινητή, τη στιγμή που εξαπολύεται από τους περιορισμούς της χρωματίνης. Είναι σημαντικό, δείξαμε ότι, σε αντίθεση με τον ενδογενή
MAGEA1
γονίδιο υποκινητή, το εξωγενές
MAGEA1
διαγονιδίου προαγωγό σε κύτταρα MZ2-MEL.TrHM συνδέθηκε με υψηλά επίπεδα H3K9me2 και χαμηλά επίπεδα H3ac και H3K4me2.
You must be logged into post a comment.