Αφηρημένο

Ιστορικό

Αναφέρουμε εδώ την απομόνωση και το χαρακτηρισμό μιας νέας ένωσης Ailanthus excelsa χλωροφόρμιο εκχύλισμα-1 (AECHL-1) (C

29Η

36o

10? μοριακό βάρος 543,8) από το φλοιό των ριζών

Ailanthus excelsa

Roxb. Η ένωση έχει αντικαρκινική δράση έναντι μιας ποικιλίας κυτταρικών σειρών καρκίνου διαφορετικής προέλευσης.

Principal Εκτίμηση

AECHL-1 θεραπεία για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ανέστειλε 12 έως 48 ώρες και θάνατο που προκαλείται σε Β16Ρ10, MDA-MB-231, MCF-7, και PC3 κυττάρων με ελάχιστη αναστολή ανάπτυξης σε φυσιολογικά ΗΕΚ 293. Η αντικαρκινική δράση του AECHL-1 ήταν συγκρίσιμο με εκείνο του συμβατικού paclitaxel αντικαρκινικών φαρμάκων και τη σισπλατίνη. AECHL-1-επαγόμενη αναστολή της ανάπτυξης συσχετίστηκε με S /G

συλλήψεις 2-Μ σε MDA-MB-231, MCF-7 και κύτταρα PC3 και G

1 σύλληψη στην Β16Ρ10 κύτταρα. Παρατηρήσαμε μικροσωληνίσκων διάσπαση σε κύτταρα MCF-7 σε κατεργασία με AECHL-1 in vitro. Σε σύγκριση με τον έλεγχο, υποδόρια ένεση AECHL-1 στις θέσεις του όγκου B16F10 μελανώματος ποντικού εμφυτευμένων σε ποντικούς C57BL /6 και MCF-7 κύτταρα καρκίνου του μαστού ανθρώπου σε αθυμικούς γυμνούς ποντικούς είχε σαν αποτέλεσμα σημαντική μείωση στον όγκο του όγκου. Σε Β16Ρ10 όγκους, AECHL-1 σε 50 μg //ημέρα δόση το ποντίκι για 15 ημέρες είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση του ογκοκατασταλτικών πρωτεϊνών Ρ53 /p21, η μείωση στην έκφραση του ογκογονιδίου c-Myc, και προς τα κάτω ρύθμιση κυκλίνης D1 και CDK4. Επιπλέον, AECHL-1 θεραπεία είχε ως αποτέλεσμα την φωσφορυλίωση του ρ53 στη σερίνη 15 σε B16F10 όγκους, η οποία φαίνεται να επιδεικνύουν ρ53-εξαρτώμενη ανασταλτική αποκρίσεις ανάπτυξης.

Συμπεράσματα

Τα παρόντα δεδομένα αποδεικνύουν τη δραστικότητα της ένα τριτερπενοειδείς AECHL-1 που διαθέτουν ένα ευρύ φάσμα δράσης κατά των καρκινικών κυττάρων. Προτείνουμε εδώ ότι AECHL-1 είναι ένα φουτουριστικό φάρμακο κατά του καρκίνου του οποίου θεραπευτικές δυνατότητες θα πρέπει να διερευνηθεί ευρέως για τη χημειοθεραπεία κατά του καρκίνου

Παράθεση:. Lavhale MS, Kumar S, Mishra SH, Sitasawad SL (2009) A μυθιστόρημα τριτερπενοειδείς Απομονωμένος από το φλοιό της ρίζας του

Ailanthus excelsa

Roxb (Tree of Heaven), AECHL-1 ως πιθανό αντικαρκινικό παράγοντα. PLoS ONE 4 (4): e5365. doi: 10.1371 /journal.pone.0005365

Επιμέλεια: Ιωσήφ Alan Bauer, Cleveland Clinic, Ηνωμένες Πολιτείες της Αμερικής

Ελήφθη: 3η Φεβρουαρίου, 2009? Αποδεκτές: 11 Μαρ 2009? Δημοσιεύθηκε: 28, Απρ 2009

Copyright: © 2009 Lavhale et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Αυτή η έρευνα ήταν η υποστήριξη από το Τμήμα Βιοτεχνολογίας, Υπουργείο Επιστημών και Τεχνολογίας, κυβέρνηση της Ινδίας, Νέο Δελχί. Santosh Kumar έλαβε ερευνητική υποτροφία από το Συμβούλιο της Ινδίας Ιατρική Έρευνα και Manish Lavhale από την Επιτροπή Πανεπιστήμιο επιχορηγήσεις. Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

Σύμφωνα με τον Παγκόσμιο Οργανισμό υγείας με βάση τη νοσηρότητα, τη θνησιμότητα, οικονομική επιβάρυνση, και συναισθηματικές δυσκολίες, ο καρκίνος μπορεί να θεωρηθεί η πιο επαχθείς πρόβλημα υγείας που πλήττει τους ανθρώπους σε όλο τον κόσμο [1]. Επί του παρόντος, πάνω από 22,4 εκατομμύρια άνθρωποι παγκοσμίως που πάσχουν από καρκίνο. Περίπου 10,1 εκατομμύρια νέες περιπτώσεις διαγιγνώσκονται με καρκίνο κάθε χρόνο, και πάνω από 6,2 εκατομμύρια πεθαίνουν από την ασθένεια το 2000 [2]. Αυτό αντιπροσωπεύει μια αύξηση της τάξης του 19% στην επίπτωση και 18% της θνησιμότητας από το 1990. Ένας σημαντικός στόχος της έρευνας για τον καρκίνο είναι να βρεθούν θεραπευτικές ενώσεις οι οποίες έχουν υψηλή ειδικότητα για καρκινικά κύτταρα /όγκου και λιγότερες παρενέργειες από τα σήμερα χρησιμοποιούμενα κυτταροστατικά /κυτταροτοξικών παραγόντων.

Πολυάριθμες φυτικής προέλευσης ενώσεις που χρησιμοποιούνται στην χημειοθεραπεία καρκίνου περιλαμβάνουν βινμπλαστίνη, βινκριστίνη, παράγωγα καμπτοθεκίνης, ετοποσίδη προέρχονται από επιποδοφυλλοτοξίνη, και πακλιταξέλη (Ταχοί ®) [3]. Ωστόσο, οι περισσότερες από αυτές τις κυτταρικής τοξικότητας ενώσεις επιδεικνύουν και μπορεί να προκαλέσει γονοτοξική, καρκινογόνο και τερατογόνο δράση σε μη νεοπλασματικά κύτταρα, και μερικά από αυτά απέτυχαν σε προηγούμενες κλινικές μελέτες [4], [5]. Μια άλλη πιο ευρέως χρησιμοποιούμενη βάση μέταλλο φάρμακο επί του παρόντος έναντι επιλεγμένων τύπων καρκίνων είναι η σισπλατίνη [6], αλλά η χρήση της σισπλατίνης σε θεραπευτική αγωγή συσχετίστηκε με κάποια σοβαρά κλινικά προβλήματα, όπως σοβαρή φυσιολογική τοξικότητα των ιστών και την αντίσταση στη θεραπεία [7] . Αυτές οι παρενέργειες περιορίζουν τη χρήση τους ως χημειοθεραπευτικούς παράγοντες παρά την υψηλή αποτελεσματικότητά τους στη θεραπεία κακοήθη κύτταρα-στόχους. Κατά συνέπεια, νέες θεραπείες και στρατηγικές θεραπείας για την ασθένεια αυτή είναι αναγκαία για τη θεραπεία ασθενών με την ασθένεια αυτή. Ως εκ τούτου, η έρευνα για εναλλακτικά φάρμακα που είναι τόσο αποτελεσματική στη θεραπεία του καρκίνου, καθώς και μη-τοξικά για τον κανονικό ιστό είναι μία σημαντική έρευνα γραμμή [8].

Τερπενοειδή χρησιμοποιούνται εκτενώς για αρωματικές τους ιδιότητες. Παίζουν ρόλο σε παραδοσιακά φάρμακα φυτικής προέλευσης και είναι υπό έρευνα για τις αντιβακτηριακές, αντινεοπλασματικά και άλλες φαρμακευτικές λειτουργίες. Φυσικό triterpenoids, όπως ολεανολικό οξύ και ουρσολικό οξύ, είναι ενώσεις με αντι-ογκογόνο και αντι-φλεγμονώδεις ιδιότητες [9]. Συνθετικά παράγωγα τριτερπενοειδείς όπως 2-κυανο-3, 13 dioxooleana-1,9 (11) -διεν-28-οϊκό οξύ (CDDO) [10] και του παραγώγου 1- [2-κυανο-3-, 12-dioxooleana- του 1,9 (11) -διεν-28-οϋλ] ιμιδαζόλη (CDDO-Im) [11] έχουν επίσης δραστικότητα κατά του όγκου. φλοιό της ρίζας του

Ailanthus excelsa

Roxb (Tree of Heaven), ένα δέντρο που ανήκει στην οικογένεια

Simaroubaceae

χρησιμοποιείται ευρέως σε Αγιουρβέδα, όπως αποδεικνύεται από φυτοθεραπεία [12]. Άλλα είδη από αυτή την οικογένεια είναι ευρέως γνωστά για δραστηριότητες αντικαρκινικές τους [13]. Χημικά συστατικά του

A. excelsa

περιλαμβάνουν ορισμένα τριτερπένια και αλκαλοειδή [14]. Στην παρούσα μελέτη έχουμε αξιολογήσει το

in vitro

και

in vivo

αντικαρκινική δραστικότητα ενός νέου τριτερπενοειδούς, AECHL-1 απομονώνεται από το φλοιό της ρίζας του φυτού και βρέθηκε να είναι εξαιρετικά αποτελεσματικά στα καρκινικά κύτταρα διαφορετικών γενεαλογίας.

Υλικά και Μέθοδοι

Απομόνωση και χαρακτηρισμός AECHL-1

Η ρίζα φλοιός του

A. excelsa

ήταν βοτανικά επαληθεύεται από τον καθηγητή Shrihari Mishra (ένας από τους συγγραφείς της παρούσας χειρόγραφο) και η εκχύλιση και κλασματοποίηση των ξηραίνεται στον αέρα σε σκόνη φλοιός ρίζας έγινε με τη χρήση χλωροφορμίου. Απομόνωση AECHL-1 έγινε χρησιμοποιώντας χρωματογραφία στήλης πυριτικής γέλης και χαρακτηρίζεται από υπεριώδες (Shimadzu 1700), υπέρυθρο (Perkin Elmer Spectrum RX1), πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (Bruker Avance Ι NMR Spectrometer) και φασματοσκοπία μάζας (από Jeol SX 102 μάζα φασματόμετρο). Η καθαρότητα του AECHL-1 αξιολογήθηκε με HPLC σε RP C-18 στήλη Phenomenex χρήση μεθανόλης-νερού (90:10, όγκος για όγκο) ως κινητή φάση. Η καθαρισμένη ένωση, AECHL-1 διαλύθηκε σε DMSO ως διαλύματα αποθέματος.

Οι κυτταρικές σειρές

Κανονικό ανθρώπινη κυτταρική γραμμή εμβρυϊκού νεφρού (ΗΕΚ 293), κύτταρα μελανώματος ποντικού B16F10 (B16F10), ανθρώπινο μητρικό καρκίνωμα (ΜϋΑ-ΜΒ-231), ανθρώπινου μαστού αδενο-καρκίνωμα (MCF-7) και κύτταρα ανθρώπινου προστάτη (PC3) ελήφθησαν από την ATCC (Manassas, VA). ΗΕΚ 293, MCF-7 και Β16Ρ10 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο και PC3 Dulbecco τροποποιημένο Eagle σε Ham F-12 μέσο (Gibco) στους 37 ° C υπό 5% CO

2. MDA-MB-231 κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε L-15 Leibovitz (Gibco) συμπληρωμένο με 10% FCS (Gibco), 100 μονάδες /ml πενικιλλίνη και 100 μg /ml στρεπτομυκίνη σε μία υγροποιημένη ατμόσφαιρα στους 37 ° C.

κυτταρική βιωσιμότητα

δοκιμασία

δεν παρατηρήθηκε άμεση παρέμβαση μεταξύ των διαφόρων συγκεντρώσεων AECHL-1 (0-200 μΜ) και ΜΤΤ σε ένα ελεύθερο κυττάρων σύστημα, ως εκ τούτου, ΜΤΤ δοκιμασία χρησιμοποιήθηκε για να ελεγχθεί η βιωσιμότητα των κυττάρων κατά την τρέχουσα σύστημα. ΗΕΚ 293, B16F10, PC3, MCF 7 και MDA-MB-231 κύτταρα (4 χ 10

3 /φρεάτιο) καλλιεργήθηκαν σε πλάκες 96 φρεατίων και μετά από 24 ώρες κατεργάζεται με διαφορετικές συγκεντρώσεις AECHL-1 (0-200 μΜ), σισπλατίνη (0-100 μΜ) ή πακλιταξέλη (0-50 μΜ) για 12, 24, και 48 ώρες στους 37 ° C. Η βιωσιμότητα των κυττάρων εκτιμήθηκε με ΜΤΤ (0,5 mg /ml) μετατροπή όπως περιγράφηκε προηγουμένως [15].

Προσδιορισμός πολλαπλασιασμού κυττάρων

Ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων MCF-7 προσδιορίστηκε με μέτρηση (

3Η ) ενσωμάτωση θυμιδίνης. Εν συντομία, δείγματα πλήρους μέσου που περιείχε 4 × 10

3 κύτταρα κατανεμήθηκαν σε τρυβλία καλλιέργειας ιστού 96 φρεατίων. Μετά από 24 ώρες, τα μέσα αντικαταστάθηκαν με διάφορες συγκεντρώσεις του AECHL-1 (0-100 μΜ), σισπλατίνη (0-100 μΜ) ή πακλιταξέλη (0-50 μΜ). Έξι ώρες μετά την αγωγή 1 μΟί /φρεάτιο (

3Η) θυμιδίνης (Συμβούλιο της ακτινοβολίας και Isotope Τεχνολογίας, Mumbai, Ινδία) προστέθηκε και οι καλλιέργειες επωάστηκαν περαιτέρω για 42 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα ξεπλύθηκαν και συλλέγονται σε μίγμα σπινθηρισμού, και η ραδιενέργεια που ενσωματώνεται στο DNA προσδιορίστηκε με έναν μετρητή υγρού σπινθηρισμού (Canberra Packard).

Annexin V-FITC δοκιμασίας δέσμευσης

B16F10, MDA-ΜΒ -231 και MCF-7 κύτταρα (3 χ 10

5 /ml) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις AECHL-1 (0-40 μΜ) για 24 ώρες στους 37 ° C. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν μετά από 24 ώρες, η απόπτωση ανιχνεύθηκε χρησιμοποιώντας κιτ ανίχνευσης απόπτωσης αννεξίνης V-FITC (Calbiochem, USA) με κυτταρομετρία ροής (FACS Vantage-BD Sciences, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Cell Quest για τον προσδιορισμό της επί τοις εκατό των αποπτωτικών κυττάρων.

κυτταρικού κύκλου ανάλυση

B16F10, PC3, MDA-MB-231 και MCF-7 κύτταρα (3 χ 10

5 /ml) υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διάφορες συγκεντρώσεις AECHL-1 (0-100 μΜ), ή πακλιταξέλη (0-10 μΜ) για 24 ώρες. Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου διεξήχθη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [16], με κυτταρομετρία ροής (FACS Vantage-BD Sciences, USA). Τα δεδομένα αναλύθηκαν χρησιμοποιώντας λογισμικό Cell Quest

Η ανοσοκυτταροχημεία

MCF-7 κύτταρα μονιμοποιήθηκαν με 3,7% παραφορμαλδεΰδη, και στη συνέχεια επωάστηκαν με αντισώματα αντι-α-τουμπουλίνης (1:10000?. Sigma, St. Louis, ΜΟ). Αφού τα αντισώματα πλύθηκαν μακριά, τα κύτταρα επωάστηκαν με δευτερεύοντα αντισώματα συζευγμένα Alexa-(1:200? Sigma, St. Louis, ΜΟ). Οι εικόνες συλλήφθηκαν με ένα μικροσκόπιο συνεστιακό λέιζερ σάρωσης (Zeiss LSM 510).

ζωικά μοντέλα όγκων

Αρσενικά C57BL /6 (ηλικίας 6-8 εβδομάδων) και θηλυκά αθυμικά γυμνά ποντίκια, ΝΙΗ, nu /nu Swiss (10 εβδομάδες) διατηρήθηκαν σύμφωνα με τις διαδικασίες επιτροπής δεοντολογίας της Κεντρικής ζώων και τις κατευθυντήριες γραμμές. Β16Ρ10 κύτταρα μελανώματος συλλέχθηκαν, αιωρήθηκαν σε PBS, και υποδορίως εγχέεται στο δεξιό πλευρό (2 × 10

6 κύτταρα /πλευρό) της C57BL /6 ποντίκια και τα κύτταρα MCF-7 (5 χ 10

6 κύτταρα /πλευρό ) σε θηλυκούς αθυμικούς γυμνούς ποντικούς. Κάθε αθυμικό ποντικό εμφυτεύθηκε υποδόρια με ένα 0.72-mg 17-β-οιστραδιόλη σφαιριδίων, 2 εβδομάδες πριν από τον εμβολιασμό των MCF-7 κυττάρων [17], [18]. Το μέγεθος του όγκου μετρήθηκε κάθε 3-4 ημέρες με ένα παχύμετρο και ογκο όγκων προσδιορίζεται από το μήκος (

L

) και το πλάτος (

W

):

V

= (

LW

2) /2 [19]. Μετά από δύο εβδομάδες, AECHL-1 (50 μg), AECHL-1 (100 μg), σισπλατίνη (100 μg) και PBS ως μάρτυρα φορέα εγχύθηκαν υποδορίως στην περιοχή του όγκου για 15 ημέρες σε ποντικούς C57BL /6 (n = 6 ) και AECHL-1 (5 μg), AECHL-1 (10 μg), πακλιταξέλη (20 μg) και PBS ως μάρτυρα φορέα εγχύθηκαν υποδορίως στην περιοχή του όγκου ανά ημέρα για 10 ημέρες σε θηλυκούς αθυμικούς γυμνούς ποντικούς (η = 6 ). Ο όγκος του όγκου μετρήθηκε σε τακτά διαστήματα κατά τη διάρκεια της μελέτης. Στο τέλος του πειράματος του όγκου και άλλα όργανα αποκόπηκαν για ιστολογική ανάλυση και στυπώματα western.

Ανοσοϊστοχημεία

ιστούς και όργανα του C57BL /6 και γυμνά ποντίκια σταθεροποιήθηκαν σε φορμαλίνη αλκοόλ για 24 hr και ενσωματωμένα σε παραφίνη όπως περιγράφηκε προηγουμένως [20]. Τομές ιστού (5 μm) βάφτηκαν με αιματοξυλίνη και εοσίνη (Η &? Ε), οπτικοποιήθηκαν και φωτογραφήθηκαν με ένα ανεστραμμένο μικροσκόπιο (Nikon, έκλειψη, TE2000-U, Ιαπωνία)

ανοσοαποτύπωσης

όγκου ιστός ομογενοποιήθηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα RIPA (20 mM Tris-HCl ρΗ 7.5, 120 mM NaCl, 1,0% Triton Χ 100, 0.1% SDS, 1% δεοξυχολικό νάτριο, 10% γλυκερόλη, 1 mM EDTA και 1 × αναστολέα πρωτεάσης κοκτέιλ, ) πρωτεΐνες Roche απομονώθηκαν σε διαλυτοποιημένη μορφή και οι συγκεντρώσεις μετρήθηκαν με δοκιμασία Bradford (κιτ προσδιορισμού Bio-Rad πρωτεΐνης). Διαλυτοποιημένη πρωτεΐνη (60 μg) μετουσιώθηκε σε 2 χ ρυθμιστικό διάλυμα SDS-PAGE δείγμα (Sigma), επιλύονται σε 10% SDS-PAGE και μεταφέρθηκαν σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης και ακολούθησε αποκλεισμός της μεμβράνης με 5% άπαχο γάλα σε σκόνη (w /v) σε TBST (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20). Οι μεμβράνες επωάστηκαν με πολυκλωνικά αντισώματα κουνελιού αντι-ρ21 και αντι-pp53 (1:1000? Santa Cruz, CA), μονοκλωνικό ποντικού αντι-CDK4, αντισώματα αντι-κυκλίνη D1 (1:1000? Cell Signaling Technology, Beverly, ΜΑ) , μονοκλωνικό ποντικού αντι-ο-Μγο αντίσωμα και αντι-ρ53 μονοκλωνικό αντίσωμα ποντικού (1:1000? Abcam, USA), που ακολουθείται από συζευγμένο με HRP κατάλληλα δευτερογενή αντισώματα και οπτικοποιούνται με ένα σύστημα ανίχνευσης ενισχυμένης χημειοφωταύγειας (Pierce). Οι μεμβράνες απογυμνώθηκαν και επανα-διερευνήθηκαν με β-ακτίνη πρωτογενές αντίσωμα (1:10000? ΜΡ Biomedicals, Ohio, USA). Ως έλεγχος φόρτωσης πρωτεΐνης

Στατιστικά

Τα δεδομένα που αναφέρονται για τους όγκους των όγκων εκφράζονται ως μέση ± SEM. Στατιστικές διαφορές προσδιορίζονται με ANOVA και μετά τη δοκιμή εφαρμόστηκε ήταν Tukey-Kramer πολλαπλή συγκριτική δοκιμή

Αποτελέσματα

Χημεία:. Υπεριώδους, υπερύθρου, πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού, και η μάζα χαρακτηρισμός AECHL-1

IR (KBr): 3425, 3419 (ομάδα υδροξυλίου), 2972, 2966, 2923, 2873 (αλκυλ CH τέντωμα), 1733 (δ λακτόνη), 1718 (Bi ακετύλιο), 1680 (C = O σύζευξη με αλκένιο), 1652 (-C = C επιμήκυνση), 1600 (αρωματικό), 1492, 1454, 1394 (μεθύλιο επιμήκυνση), 1222 (δ λακτόνη), 1184, 1110, 1051, 1031 (ακετάλες), 1018 nm (αλκάνια).

1H-NMR (DMSO, 400 Ηζ) δ: 0,95 (3Η,

t

, 4′-CH

3), δ: 1.15 (3Η, d, Η-24), δ : 1,235 (3Η, d, 5′-CH

3), δ: 1,5 (2Η, ddd, 5′-CH

2), δ: 1.73 (3Η, ddd, Η-21), δ: 1.83 (1Η, s, Η-9), δ: 1.87 (1Η, s, Η-14), δ: 1,9 (2Η, s, Η-18), δ: 2.16 (3Η, s, Η-18), δ: 2.3 (3Η, d, Η-19) δ: 2.71 (2Η, s, Η-20), δ: 3.45 (2Η, dd, Η-23), δ: 3.65 (2Η, d, Η-22) , δ: 3.95 (1 Η, t, Η-12), δ: 4.05 (2Η, s, Η-22), δ: 5.30 (1Η, s, Η-15), δ: 5.46 (1Η, s, ΟΗ -2), δ: 5.73 (1Η, d, ΟΗ-2 ‘), δ: 6.89 (1Η, s, Η-3), δ:. 8,82 (1Η, s, ΟΗ-11)

άτομο φασματοσκοπία μάζας ταχέως βομβαρδισμού:

m /z:

1068 λόγω του σχηματισμού dimmer. Η πραγματική (Μ

+) θεωρήθηκε ότι είναι 543,8, 463,3 (MC

4Η

1Ο

2), 461,4 (MC

4Η

2O

2), 459.4 (MC

4Η

4O

2), 361,2 (MC

9Η

11o

4) (Εικόνα 1Β) και φάσματα μάζας (Σχήμα S1). AECHL-1 είναι ένα στερεό, mp. 248-250 ° C διέθετε ένα μοριακό τύπο C

29 H

36o

10, όπως υποδεικνύεται από EI και ES φάσματα μάζας. Το φάσμα IR έδειξε την παρουσία υδροξυλίου (ων) (3425 nm, 3419 nm), δ λακτόνη (1733 nm), και αρωματικό τμήμα (1600 nm). Το φάσμα UV έδωσε ένα χαρακτηριστικό μέγιστο απορρόφησης στα 235 nm, υποδεικνύοντας την παρουσία auxochromic ομάδες όπως υδροξυλίου και κετόνης. Το

φάσμα 1H-NMR του AECHL-1 αποκάλυψε την παρουσία ενός αρωματικού πρωτονίου δ 6,89 και απλή σε δ 5.30 η οποία είναι χαρακτηριστική της λειτουργίας εστέρα στο C-15. H-22 εμφανίστηκε ως ένα ΑΒ σύστημα, ως απλή σε δ 4,05 και διπλή στο δ 3,65 και Η-12 εμφανίστηκε ως μια τριπλέτα στα 3.95 δ. Η μεθυλ ομάδα Η-19 επί του αρωματικού δακτυλίου εμφανίστηκε ως απλή σε δ 2,3. Μια διπλή στο δ 1,235 για έξι πρωτόνια αποδίδεται στο Η-5 ‘. Η-4 ‘εμφανίστηκε ως μια τριπλέτα στα 0.95 δ. . Η ομάδα μεθυλίου, Η-18 εμφανίστηκε ως μια απλή σε δ 2.16 (Σχήμα 2)

Ενιαία αιχμής ανέφερε ότι η προετοιμασία ήταν & gt?. 99% καθαρό

Η

η αναστολή της βιωσιμότητας των κυττάρων, τον πολλαπλασιασμό και την απόπτωση με AECHL-1

εκτιμήθηκε Επίδραση AECHL-1 για τη βιωσιμότητα του B16F10, PC3, MDA-MB-231 και MCF-7 κύτταρα. AECHL-1 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων των κυττάρων MCF-7 σε ένα συγκέντρωσης- και χρονοεξαρτώμενο τρόπο με δοκιμασία ΜΤΤ (Σχήμα 3Α). AECHL-1 ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων σε διαφορετικές κυτταρικές γραμμές καρκίνου με ένα ελάχιστο αναστολή ανάπτυξης σε ΗΕΚ 293 στις 48 ώρες (Σχήμα 3Β). ΗΕΚ 293 που έλαβαν θεραπεία με 200 μΜ AECHL-1 παρουσίασαν υψηλό ποσοστό επιβίωσης (& gt? 90%) σε σύγκριση με τα καρκινικά κύτταρα. AECHL-1 βρέθηκε να είναι πιο αποτελεσματική σε MCF-7 σε σύγκριση με B16F10, PC3 και MDA-MB-231 σε αναστολή του πολλαπλασιασμού των κυττάρων όπως παρατηρείται από την (

3Η) θυμιδίνης μετά από 48 ώρες (Σχήμα 3C). Επιπλέον, AECHL-1 βρέθηκε να είναι πιο ισχυρή από την πακλιταξέλη ή σισπλατίνη σε αναστολή του κυτταρικού πολλαπλασιασμού σε κύτταρα MCF-7 μετά από 48 ώρες (Σχήμα 3D).

(Α) Η κυτταρική ανάπτυξη με δοκιμασία ΜΤΤ σε MCF-7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις AECHL-1 (10, 20, 40 και 100 μΜ) για 12, 24 και 48 ώρες και η κυτταρική βιωσιμότητα προσδιορίστηκε με δοκιμασία ΜΤΤ? (Β) Η κυτταρική ανάπτυξη με δοκιμασία ΜΤΤ σε B16F10, PC3, κύτταρα MDA-MB-231 MCF-7 και ΗΕΚ-293. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις AECHL-1 (10, 20, 40 100 και 200 ​​μΜ) για 48 ώρες, και η βιωσιμότητα των κυττάρων προσδιορίστηκε με ανάλυση ΜΤΤ? (C) Cell πολλαπλασιασμού από (

3Η) θυμιδίνης σε B16F10, PC3, MDA-MB-231, και τα κύτταρα MCF-7. Τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις AECHL-1 (10, 20, 40 και 100 μΜ) για 48 ώρες, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με ενσωμάτωση θυμιδίνης (

3Η)? (D) Σύγκριση AECHL-1 με άλλα χημειοθεραπευτικά φάρμακα. Τα κύτταρα MCF-7 υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις (5, 10, 20, και 50 μΜ) του paclitaxel, cisplatin και AECHL-1 για 48 ώρες, και ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων προσδιορίστηκε με (

3Η) ενσωμάτωση θυμιδίνης. Τα δεδομένα είναι τα μέσα ± SEM τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

Αννεξίνη FITC και ιωδιούχο προπίδιο (ΡΙ) κηλίδα V-συζευγμένο χρησιμοποιήθηκε για να αναλυθεί η συνολική εκατοστιαία αναλογία των αποπτωτικών κυττάρων που επάγεται από AECHL-1. Ο ερευνητής για τον εντοπισμό πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνη V-FITC θετικά, PI αρνητικό), κύτταρα που βρίσκονται στο τέλος της απόπτωσης (Αννεξίνη V-FITC και θετική PI), τα νεκρωτικά κύτταρα (PI θετικά μόνο) και τα κύτταρα που είναι βιώσιμες (αννεξίνη V -FITC και PI αρνητική). Το συνολικό ποσοστό των αποπτωτικών κυττάρων αυξήθηκε έως 36,25% και 37,18% στα 20 μΜ σε B16F10, MDA-MB-231, αντίστοιχα, και 60,66% στα 5 μΜ σε κύτταρα MCF-7 (Σχήμα 4).

Ανίχνευση απόπτωση έγινε με το κιτ ανίχνευσης απόπτωσης Annexin V-FITC σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και μετά αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής: UR δείχνει το ποσοστό των καθυστερημένων αποπτωτικών κυττάρων (Αννεξίνη V και θετικά κύτταρα ΡΙ), και LR δείχνει το ποσοστό των πρώιμων αποπτωτικών κυττάρων (αννεξίνης V θετικά κύτταρα) Τα δεδομένα που παρουσιάζονται στο στυπώματα κηλίδας που απεικονίζει αννεξίνης /ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη (

x

άξονας) έναντι χρώσης ΡΙ (

y

άξονας). Το ποσοστό των κυττάρων σε κάθε τεταρτημόριο παρουσιάζεται. Τα αποτελέσματα είναι αντιπροσωπευτικά τριών ανεξάρτητων πειραμάτων.

Η

AECHL-1 επάγεται διακοπή του κυτταρικού κύκλου στα καρκινικά κύτταρα

Για τον προσδιορισμό της φάσης του κυτταρικού κύκλου στην οποία AECHL-1 ασκεί την ανάπτυξή της Ανασταλτικό αποτέλεσμα, αυξάνεται εκθετικά B16F10, PC3, MDA-MB-231 και MCF-7 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με διαφορετικές συγκεντρώσεις AECHL-1 για 24 ώρες και αναλύθηκαν με κυτταρομετρία ροής (Πίνακας 1). Παρατηρήσαμε ότι τα κύτταρα B16F10 σε επεξεργασία με AECHL-1 έδειξαν αύξηση στον πληθυσμό σε G

1 φάση (52,18 – 72,08%) με ταυτόχρονη μείωση του ποσοστού των κυττάρων σε S-φάση G2 /M (47,98 – 26,16% ), γεγονός που υποδηλώνει G

1 σύλληψης. Σε αντίθεση, ο αριθμός των PC3, MDA-MB-231 και MCF-7 κύτταρα σε S-G2 /M φάση αυξήθηκε από 42,91% σε 57,62%, 49,40% έως 77,16% και 45,13% έως 70,97% αντίστοιχα σε απόκριση σε θεραπεία με AECHL-1 και μια μειωμένη σε φάση G1 από 55,65% έως 39,02%, 49,54% και 22,82%, 53,67% και 27,85% αντίστοιχα υποδηλώνοντας μια διακοπή της ανάπτυξης σε S-G2 /M φάση σε PC3, MDA-MB-231 και MCF- 7 κύτταρα. αγωγή με πακλιταξέλη εμφάνισαν αύξηση στον πληθυσμό των κυττάρων MCF-7 σε φάση G2 /M (29,30% έως 72,55%) με μείωση του ποσοστού των κυττάρων σε φάση G1 (48,30% σε 4,62%) γεγονός που υποδηλώνει μια διακοπή της ανάπτυξης σε G2 /Μ φάση (Πίνακας 1). Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αναστολή της προόδου του κυτταρικού κύκλου θα μπορούσε να είναι ένα από τα μοριακά γεγονότα που συνδέονται με την επιλεκτική αποτελεσματικότητα αντικαρκινική AECHL-1 σε καρκινικά κύτταρα.

Η

Επίδραση AECHL-1 επί κυτταρικών μικροσωληνίσκων

χρώση μικροσωληνίσκων στον έλεγχο και κύτταρα επεξεργασμένα με AECHL-1 και πακλιταξέλη, έδειξαν ότι και οι δύο AECHL-1 και πακλιταξέλη οδήγησε σε διάσπαση των μικροσωληνίσκων με την αύξηση της πυκνότητας των κυτταρικών μικροσωληνίσκων και το σχηματισμό του πάχους δεσμίδες μικροσωληνίσκων που περιβάλλει τον πυρήνα σε σύγκριση στα κύτταρα χωρίς θεραπεία ελέγχου (Σχήμα 5).

κύτταρα MCF-7 υπέστησαν επεξεργασία με το όχημα ως έλεγχος, AECHL-1 (5 μΜ) και πακλιταξέλη (5 μΜ) ως ένας θετικός έλεγχος για 24 ώρες, και μικροσωληνίσκων (κόκκινο) έγιναν ορατά με έμμεσο ανοσοφθορισμό. DAPI χρησιμοποιήθηκε για τη χρώση του πυρήνες κυττάρων (μπλε). Εκπρόσωπος του 25-30 κύτταρα το καθένα σε 3 ξεχωριστά πειράματα.

Η

Επίδραση των AECHL-1 σε πρωτογενή όγκο όγκου σε αλλομόσχευμα και ξενομόσχευμα

Θα εξεταστούν επίσης τα αποτελέσματα της AECHL-1 για η in vivo ανάπτυξη των πρωτογενών όγκων. προκαταρκτικές μελέτες μας έδειξαν ότι, μεταξύ των διαφόρων δόσεων AECHL-1 (0,5 έως 5 mg /kg) ενίεται ενδοπεριτοναϊκά σε ποντικούς C57BL /6, η μέγιστη ανεκτή δόση ήταν μια εφάπαξ δόση των 0,5 mg /kg, που δεν έδειξε εμφανή ένδειξη τοξικότητας όταν παρατηρείται για ένα μήνα. Σε αυτή τη βάση, η δόση που επιλέχθηκε ήταν 50 και 100 μg /kg /ημέρα (μία δόση η οποία ήταν 10-20% αυτής της μέγιστης ανεκτής δόσης). Την ημέρα 18 σημαντική αύξηση του όγκου του όγκου στην ομάδα ελέγχου (ρ & lt? 0.001) και μια οπισθοδρόμηση σε όγκο του όγκου ήταν εμφανής σε ποντικούς που υπέστησαν αγωγή με 50 μg AECHL-1 (44,303 ± 5,20% (ρ & lt? 0.001)) και με 100 μg AECHL- 1 (51,014 ± 1,27% (p & lt? 0.001)). Οι όγκοι που έλαβαν θεραπεία με 100 μα σισπλατίνης έδειξε μια μείωση του όγκου του όγκου (93,13 ± 0,539% (ρ & lt? 0.001)). Ωστόσο, AECHL-1 (50 μg) vs. AECHL-1 (100 μg) βρέθηκε να είναι μη σημαντική (ρ & gt? 0,05). Την ημέρα 24 του ελέγχου, AECHL-1 (50 μg) και AECHL-1 (100 μg) ποντικούς που υπέστησαν αγωγή έδειξαν περαιτέρω αύξηση του όγκου του όγκου (ρ & lt? 0.001), αλλά ποντικών που υπέστησαν αγωγή με σισπλατίνη έδειξε μείωση στον όγκο του όγκου (ρ & lt? 0.001). Ωστόσο, αν και η σισπλατίνη έδειξε περαιτέρω μείωση στον όγκο του όγκου, η ζημιά που προκαλείται σε άλλα όργανα ήταν περισσότερο από ότι στο AECHL-1 (50 & amp? 100 μg) κατεργάστηκε ομάδα σε C57BL /6 ποντίκια (Εικόνα 6Α και 6Β)

.

(Α) Οι φωτογραφίες του ποντικούς C57BL /6 που δείχνει 4-εβδομάδων ανάπτυξη του όγκου αλλομοσχεύματος από Β16Ρ10 κύτταρα?

κάτω,

εκτομή όγκων με τους αντίστοιχους ποντίκια? όγκος (Β) του όγκου προσδιορίστηκε σε χρονικά διαστήματα, όπως περιγράφεται στο «Υλικά και Μέθοδοι». Ο όγκος του όγκου των πειραματόζωων μετά την αγωγή με 50, 100 μg AECHL-1 και 100 μg σισπλατίνη συγκρίθηκε με τον όγκο του όγκου των ζώων ελέγχου? (C) Οι φωτογραφίες των αθυμικών γυμνών ποντικών που δείχνει 4-εβδομάδων ανάπτυξη ξενομοσχεύματος όγκου από κύτταρα MCF-7?

κάτω,

εκτομή όγκων με τους αντίστοιχους ποντίκια? (Δ) Ο όγκος του όγκου των πειραματόζωων μετά την αγωγή με 5, 10 μg AECHL-1 και 20 μg paclitaxel συγκρίθηκε με τον όγκο του όγκου των ζώων ελέγχου. Τα αποτελέσματα αντιπροσωπεύουν το μέσο όρο ± SE από έξι ξεκινώντας ζώων σε κάθε ομάδα. Σημαντικές διαφορές μεταξύ των

* εντός της ομάδας σε κάθε χρονικό σημείο είναι εκπροσωπήθηκαν ως:

ns p & gt? 0,05,

* p & lt? 0,05,

** P & lt? 0,01,

*** P & lt? 0.001 και

#Inter ομάδα σε διαφορετικές δόσεις εκπροσωπούνται ως

ns P & gt? 0,05,

# & lt? 0,05,

## P & lt? 0,01,

### P & lt?. 0,001

Επειδή οι κυτταροτοξικές δόσεις του AECHL-1 για κύτταρα MCF-7 in vitro ήταν πολύ χαμηλές, οι δόσεις που επιλέγονται για ξενομοσχεύματα όγκων σε θηλυκούς αθυμικούς γυμνούς ποντικούς που έλαβαν ένεση με κύτταρα MCF-7 ήταν 5 και 10 μg. Αυτές οι δόσεις παρουσίασαν υποχώρηση του μεγέθους του όγκου ως: 35,72 ± 0,05% για 5 μg (ρ & lt? 0.001) και 28,55 ± 0,06% για τα 10 μg (ρ & lt? 0.001), ενώ οι όγκοι σε επεξεργασία με 20 μg paclitaxel έδειξε μια οπισθοδρόμηση σε όγκο του όγκου (14,19 ± 0,32% (ρ & lt? 0,05).), η οποία ήταν μικρότερη από την ομάδα που υπέστη αγωγή AECHL-1 (Σχήμα 6C και 6D)

Επιδράσεις της AECHL 1-θεραπεία για ρυθμιστικές πρωτεΐνες καταστολής όγκου και του κυτταρικού κύκλου σε Tumor αλλομοσχεύματος του C57BL /6 ποντίκια

αξιολόγησε την επίδραση των AECHL-1 θεραπεία για την έκφραση της ρ53 πρωτεΐνης καταστολέα όγκου, ο κυτταρικός κύκλος ρυθμιστικής πρωτεΐνης κυκλίνη D και CDK4 και το ογκογονίδιο c-Myc. Όπως φαίνεται στο Σχήμα 4Ε, AECHL-1 σε 50 μg /ποντίκι /ημέρα χορηγούνται σε B16F10-εμφυτευμένων όγκων σε ποντικούς C57BL /6 οδήγησε σε αύξηση στην έκφραση της πρωτεΐνης ρ53 άγριου τύπου και στη συνέχεια μειώθηκε σε υψηλότερη συγκέντρωση (100 μg /ποντικό /ημέρα). Το επίπεδο του p53 ήταν μεγαλύτερη στην ομάδα AECHL-1-αγωγή από ό, τι στην ομάδα που σισπλατίνη επεξεργασμένο, υποδεικνύοντας ότι η αντικαρκινική δράση του AECHL-1 ήταν διαφορετική από τη σισπλατίνη. Δεδομένου ότι η φωσφορυλίωση σε Ser-15 κατάλοιπο της ρ53 είναι κρίσιμη για ρ53-εξαρτώμενη ενεργοποίηση των ρυθμιστικών πρωτεϊνών του κυτταρικού κύκλου για G1 σύλληψη, προσδιορίσαμε την κατάσταση φωσφορυλίωσης της ρ53 και η κυκλίνη D1 και CDK4. AECHL-1 θεραπεία οδήγησε σε αύξηση στη φωσφορυλίωση της ρ53 στη σερίνη 15 υπολείμματος σε όγκους στα 50 μg /ποντίκι /ημέρα με ταυτόχρονη αύξηση του επιπέδου της ρ21 και μειώθηκε σε 100 μg /ποντικό /ημέρα. Η ανάλυση στυπώματος Western αποκάλυψε ότι η θεραπεία με 50 και 100 μg /ποντικό /ημέρα AECHL-1 προκάλεσε μια σημαντική μείωση στον κύκλο-ρυθμιστικές πρωτεΐνες κυκλίνης D1 και CDK4. Η θεραπεία με 50 και 100 μg /ποντικό /ημέρα AECHL-1 προκάλεσε επίσης μια σημαντική μείωση του ογκογονιδίου c-Myc υποδηλώνοντας έτσι ότι η αναστολή του κυτταρικού κύκλου μπορεί να είναι υπεύθυνη για αντικαρκινική επιδράσεις των AECHL-1 (Σχήμα 7).

προϊόντα λύσης καρκινικού ιστού υποβλήθηκαν σε SDS-PAGE ακολουθούμενη από ανοσοαποτύπωση Western. Οι μεμβράνες ανιχνεύθηκαν με αντι-ρ53, pp53, ρ21, c-myc, κυκλίνη D1, cdk4, και β-ακτίνη αντισώματα που ακολουθείται από κατάλληλη δευτερογενή αντισώματα συζευγμένα με υπεροξειδάση, και οπτικοποιήθηκαν με ενισχυμένο σύστημα ανίχνευσης χημειοφωταύγειας. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν τρεις φορές με παρόμοια αποτελέσματα και μια αντιπροσωπευτική κηλίδα εμφανίζεται για κάθε πρωτεΐνη.

Η

Η ιστολογική ανάλυση του ιστού του όγκου και άλλα όργανα σε ποντικούς C57BL /6

Η ιστολογική εξέταση του όγκου

σε C57BL /6 ποντίκια ελέγχου έδειξαν καλά ανεπτυγμένα αιμοφόρα αγγεία, αυξημένη νεοαγγείωση, κυτταρική πυκνότητα και η παρουσία των περιοχών αιμορραγικού με πιθανή σημάδια αγγειογένεσης με αυξημένη δυνατότητα μετάστασης (Εικόνα 8.1α). Η θεραπεία των όγκων με 50 μg AECHL-1 δεν έδειξε μεγάλη επιρροή στην αγγείωση του όγκου αλλά έδειξε μικρότερη εμφάνιση περιοχών αιμορραγικού, μείωση του όγκου πυκνότητα κυττάρων και εμφάνιση picnotic /νεκρωτικών κυττάρων στο κέντρο του όγκου (Σχήμα 8.1b). Η θεραπεία με 100 μα AECHL-1 έδειξαν αύξηση στην νεκρωτικά κύτταρα, εξαφάνιση της νεοαγγείωσης, περιοχές αιμορραγικής και η χαμηλή πυκνότητα των κυττάρων σε σύγκριση με το μάρτυρα (Εικόνα 8.1c), υποδεικνύοντας έτσι ότι AECHL-1 εμπόδισε την πρόοδο της αγγειογένεσης και του κινδύνου μετάστασης μπλοκάροντας νεοαγγείωση . ομάδα που έλαβε αγωγή Cisplatin παρουσίασαν σημαντική αύξηση των νεκρωτικών κυττάρων, μείωση στην πυκνότητα κυττάρου όγκου και του όγκου (Σχήμα 8.1D)

(1) Αντιπροσωπευτική Η &?. Ε-χρωματισμένες τομές από όγκους αλλομοσχεύματος B16F10 και τα χαρακτηριστικά αυτών των όγκων ήταν αναλύθηκαν (1Α-1ϋ). Μορφολογικά χαρακτηριστικά της καρδιάς (1Ε-1), νεφρό (1θ-1L), το ήπαρ (1Μ-1Ρ) και σπλήνα (1Q-1T), έξι ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα πειραμάτων. (2) Αντιπροσωπευτική Η &? Ε-χρωματισμένες τομές από MCF-7 όγκων ξενομοσχεύματος και τα χαρακτηριστικά αυτών των όγκων αναλύθηκαν (2Α-2D). Μορφολογικά χαρακτηριστικά της καρδιάς (2Ε-2Η), νεφρό (2Θ-2L) και του ήπατος (2Μ-2P), σπλήνα (2Q-2Τ), τρεις ποντικοί χρησιμοποιήθηκαν σε κάθε ομάδα πειραμάτων.

Η

Σε σύγκριση με τον έλεγχο, το καρδιακό ιστό των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με 50 μg AECHL-1 έδειξε φυσιολογική δομή ενώ 100 μg έδειξαν εκτεταμένη νέκρωση του μυοκαρδίου ινών και συστολή συγκροτήματα. Ο κατακερματισμός και μουτζούρες της μυϊκών ινών χαρακτηριστικό της νέκρωσης που παρατηρήθηκε (Σχήμα 8.1E-8,1 g). ποντίκια που έλαβαν θεραπεία cisplatin έδειξαν επίσης νέκρωση των μυοκαρδιακών ινών, ελαφρές λεμφοκυτταρικής διήθησης και επίσης τον κατακερματισμό και τη δημιουργία κηλίδων των μυϊκών ινών (Σχήμα 8.1H).

Σε σύγκριση με τον έλεγχο, ο νεφρός των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με 50 μg AECHL-1 παρουσίασε ελαφρά σωληναριακή δημιουργία κενών και σωληναριακή διάταση με χώρους αιμορραγικό με φυσιολογική σπειράματα που εμφανίζονται στο κάτω μέρος. Η θεραπεία με 100 μg AECHL-1 έδειξε σωληνοειδή δημιουργία κενών, σωληναριακή διάταση, κατάσταση αιμορραγικό και διάσπαρτα χρόνιες φλεγμονώδεις διηθήσεις κυττάρων (Σχήμα 8.1I-8.1K). ποντίκια που έλαβαν θεραπεία cisplatin έδειξαν διάσπαρτα λεμφοκυττάρων μέσα και γύρω από το δοχείο. Πολλοί ουδετερόφιλα παρατηρήθηκαν επίσης στα σωληνάρια και διάμεσο δηλ πυελονεφρίτιδα (Σχήμα 8.1L).

Σε σύγκριση με τον έλεγχο, το ήπαρ των ποντικών που έλαβαν θεραπεία με 50 μg AECHL-1 δεν επηρεάζει την κανονική αρχιτέκτονα. Τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με 100 μα AECHL-1 διατήρησε την κανονική αρχιτέκτονα του ήπατος (Σχήμα 8,1-8.1O). Σε θεραπεία με σισπλατίνη ποντίκια όμως, εκτεταμένη νέκρωση των ηπατοκυττάρων είχαν δει. Το βέλος στη δεξιά πλευρά δείχνει νεκρό ηπατοκύτταρα και αυτό το μοτίβο μπορεί να δει με μια ποικιλία από ηπατοτοξίνες, όπου λαμβάνει χώρα εστιακή ηπατοκύτταρα νέκρωση με λεμφοκυτταρική διήθηση. Σε αυτούς τους ιστούς, οι βλάβες να μοιάζει με εκείνη της νόσου Tyzzer χαρακτηρίζονται από νέκρωση με ποικίλους βαθμούς φλεγμονής ως απάντηση στην νέκρωση. Οξεία ηπατική βλάβες αποτελούνται από νεκρωτικές εστίες περιβάλλονται από ελάχιστες, κυρίως ουδετερόφιλη, φλεγμονή (Σχήμα 8.1P).

Αντιπροσωπευτικές τομές σπληνός από Ελέγχου και ποντικούς που έλαβαν αγωγή με 50 μα AECHL-1 έδειξε φυσιολογική αρχιτέκτονα σπλήνα και ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με 50 μg AECHL-1. Έλεγχος και ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με 100 μg AECHL-1 και σισπλατίνη παρουσίασαν υπερπλασία του λευκού πολτού, ειδικά στην οριακή ζώνη (Ψ). Η ιστολογική εξέταση έδειξε αύξηση του αριθμού των κοκκιοκυττάρων στις περιθωριακές ζώνες (Σχήμα 8.1Q-8.1T).

Η ιστολογική εξέταση του ιστού του όγκου και άλλα όργανα σε άτριχα ποντίκια

Οι όγκοι από τα ποντίκια ελέγχου παρουσίασαν έντονη νεοαγγείωση σε όλη την το τμήμα που περιβάλλεται από εξαιρετικά πυκνά κύτταρα και απουσία νεκρωτικών κυττάρων (Σχήμα 8.2A). AECHL-1 στα 5 δόση μg έδειξαν μειωμένη όγκου κυτταρική πυκνότητα και κενά σε όλη την περιοχή του όγκου. Έδειξε επίσης την απώλεια της neovasulization και απουσία περιοχές αιμορραγικού (Σχήμα 8.2B). AECHL-1 σε 10 μg έδειξε πολλά κενά διαστήματα, εμφάνιση των περιοχών αιμορραγικού είχε δει, αλλά μείωση του vasculization δεν παρατηρήθηκε (Σχήμα 8.2C). Η θεραπεία με πακλιταξέλη μείωσε την πυκνότητα των κυττάρων του όγκου με εμφάνιση πολλών κενών χώρων και νεκρωτικές περιοχές στο τμήμα (Σχήμα 8.2D).

Η θεραπεία με 5 μg AECHL-1 δεν παρουσίασαν καμία μεταβολή στην κανονική μυοκάρδιο, ενώ 10 μg AECHL-1 και πακλιταξέλη έδειξε νέκρωση των μυοκαρδιακών ινών. Η πακλιταξέλη έδειξαν εκτεταμένη νέκρωση του μυοκαρδίου ίνα με τον κατακερματισμό και τη δημιουργία κηλίδων του μυοκαρδίου (Σχήμα 8.2E-Η). Καμία σημαντική μεταβολή δεν παρατηρήθηκε στη δομή νεφρό από ομάδες που έλαβαν AECHL-1, ενώ η αγωγή με πακλιταξέλη εμφάνισαν σημάδια σωληνοειδούς κενοτοπίων διαστολή με περιοχές αιμορραγικό (Σχήμα 8.2I-8.1L). Τόσο AECHL-1 και πακλιταξέλη δεν παρουσίασαν καμία μεταβολή στην κανονική αρχιτεκτονική του ήπατος (Σχήμα 8,2-8.2P) και τα τμήματα σπλήνα (Σχήμα 8.2Q-8.2T).

Συζήτηση