Αφηρημένο

Πρωτεΐνη αργινίνη Deiminases (μαξιλάρια) καταλύουν τη μετα-μεταφραστική μετατροπή της πεπτιδυλο -αργινίνης σε πεπτιδυλο-κιτρουλίνη σε ένα εξαρτώμενο από ασβέστιο, μη αναστρέψιμη αντίδραση. Υπάρχουν ενδείξεις ότι αυτό μαξιλάρια παίζουν ρόλο στην καρκινογένεση. Για τον προσδιορισμό των καρκίνου που σχετίζονται με λειτουργικές επιπτώσεις των μαξιλαριών, σχεδιάσαμε ένα αναστολέα PAD μικρό μόριο (που ονομάζεται Chor-αμιδίνης ή Cl-αμιδίνη), και δοκιμάστηκε η επίδραση αυτού του φαρμάκου επί του κυτταρικού κύκλου. Τα δεδομένα που λαμβάνονται από πειράματα σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου δείχνουν ότι Cl-αμιδίνη προκαλεί μια σύλληψη G1, και ότι αυτό ήταν ρ53-εξαρτώμενη. Σε ένα ξεχωριστό σύνολο πειραμάτων, βρήκαμε ότι Cl-αμιδίνη προκάλεσε μια σημαντική αύξηση των microRNA-16 (miRNA-16), και ότι αυτή η αύξηση ήταν επίσης ρ53-εξαρτώμενη. Επειδή miRNA-16 είναι ένα υποθετικό ογκοκατασταλτικό miRNA, και άλλοι έχουν βρει ότι miRNA-16 καταστέλλει τον πολλαπλασιασμό, υποθέσαμε ότι η ρ53-εξαρτώμενη G1 σύλληψη σχετίζεται με την αναστολή PAD ήταν, με τη σειρά του, εξαρτάται από την miRNA-16 έκφρασης. Τα αποτελέσματα είναι συνεπή με την υπόθεση αυτή. Όπως επίσης, βρήκαμε ότι η σύλληψη G1 είναι τουλάχιστον εν μέρει λόγω της ικανότητας του Cl-αμιδίνης μεσολάβηση έκφραση miRNA-16 για την καταστολή «G1-σχετίζεται στόχους της: κυκλίνες D1, D2, D3, Ε1, και CDK6. υπόστεγα μελέτη μας φως στους μηχανισμούς με τους οποίους η αναστολή PAD μπορεί να προστατεύσει από ή τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου

Παράθεση:. Cui Χ, Witalison EE, Chumanevich AP, Chumanevich ΑΑ, Poudyal D, Subramanian V, et al. (2013) Η επαγωγή των microRNA-16 στον Καρκίνο του παχέος εντέρου κύτταρα από Πρωτεΐνη δεϊμινάσης αργινίνης Αναστολή προκαλεί μια εξαρτώμενη από ρ53 του κυτταρικού κύκλου σύλληψης. PLoS ONE 8 (1): e53791. doi: 10.1371 /journal.pone.0053791

Επιμέλεια: Michel Simon, CNRS-Πανεπιστήμιο της Τουλούζης, Γαλλία

Ελήφθη: 25 Οκτωβρίου 2012? Αποδεκτές: 5 Δεκεμβρίου, 2012? Δημοσιεύθηκε: 7 Ιανουαρίου 2013

Copyright: © 2013 Cui et al. Αυτό είναι ένα άρθρο ανοικτής πρόσβασης διανέμεται υπό τους όρους της άδειας χρήσης Creative Commons Attribution, το οποίο επιτρέπει απεριόριστη χρήση, τη διανομή και την αναπαραγωγή σε οποιοδήποτε μέσο, ​​με την προϋπόθεση το αρχικό συγγραφέα και την πηγή πιστώνονται

Χρηματοδότηση:. Το έργο υποστηρίχθηκε από τις ακόλουθες επιδοτήσεις: Εθνικά Ινστιτούτα Υγείας χορηγούν 5R01CA151304 να LJH και PRT (https://projectreporter.nih.gov/reporter_searchresults.cfm). Οι χρηματοδότες δεν είχε κανένα ρόλο στο σχεδιασμό της μελέτης, τη συλλογή και ανάλυση των δεδομένων, η απόφαση για τη δημοσίευση, ή την προετοιμασία του χειρογράφου

Αντικρουόμενα συμφέροντα:.. Οι συγγραφείς έχουν δηλώσει ότι δεν υπάρχουν ανταγωνιστικά συμφέροντα

Εισαγωγή

η κακή ρύθμιση της πρωτεΐνης αποϊμινάση αργινίνης (PAD) δραστηριότητα έχει προταθεί ότι παίζει ένα ρόλο στην έναρξη και την εξέλιξη πολλών ανθρώπινων ασθενειών, περιλαμβανομένου του καρκίνου [1]. Pads είναι μια οικογένεια ενζύμων που μετατρέπουν πεπτιδυλ-αργινίνης σε πεπτιδυλ-κιτρουλίνη (Cit Arg →) [2], μια διαδικασία που ονομάζεται «κιτρουλλινοποίηση». Θηλαστικά κωδικοποιούν 5 ισοενζύμων εντός ενός ενιαίου εξελικτικά συντηρημένη συστάδα γονιδίων, η οποία στον άνθρωπο βρίσκεται στο χρωμόσωμα 1 (1p35-36) [3]. Τα μέλη των θηλαστικών της οικογένειας PAD, τα οποία έχουν χαρακτηριστεί ως μαξιλάρια 1-4 και PAD6, είναι ιδιαίτερα σχετιζόμενα ένζυμα τόσο εντός όσο και μεταξύ των επιμέρους ειδών. Αυξημένα επίπεδα των ενζύμων PAD και /ή κιτρουλλινοποιημένα πρωτεϊνών που βρέθηκαν σε πολλαπλές χρόνιες παθήσεις, συμπεριλαμβανομένης της κολίτιδας και του παχέος εντέρου [1], [4], [5], [6], [7]. Υπό αυτό το πρίσμα, έχουμε αναπτύξει αναστολείς μαξιλάρια, και ένα συγκεκριμένο αναστολέα, που ονομάζεται Chlor-αμιδίνης (Cl-αμιδίνη), έχει αποδειχθεί ότι έχουν κυτταροτοξικότητα έναντι καρκινικών κυτταρικών σειρών [8], και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόληψη και τη θεραπεία της υψηλής κόλον ασθένεια κίνδυνο καρκίνου, ελκώδη κολίτιδα σε ποντίκια [4].

τα microRNAs (miRNA) είναι εξελικτικά συντηρημένη, 20- έως 25-νουκλεοτιδίων-μήκους, μη κωδικοποιητική RNAs που συνδέονται προς τους στόχους τους μέσω μερικής συμπληρωματική αναγνώριση ακολουθίας. Τέτοια δεσμευτικά αποτελέσματα είτε σε αποδόμηση του mRNA ή την αναστολή της μετάφρασης, και ως εκ τούτου η καταστολή της έκφρασης των στόχων miRNA [9]. Οι σπονδυλωτών γονιδιώματα προβλέπεται ότι κωδικοποιεί όσο 1.000 μοναδικά miRNAs [10], που πιστεύεται ότι ρυθμίζουν την έκφραση τουλάχιστον το 30% των γονιδίων [11]. Ως εκ τούτου, δεν προκαλεί έκπληξη το ότι miRNAs έχουν διαφορετικές βιολογικές δραστηριότητες, συμπεριλαμβανομένης της ρύθμισης του κυτταρικού πολλαπλασιασμού, της διαφοροποίησης και της απόπτωσης. Για το σκοπό αυτό, miRNA-16 είναι ένα υποθετικό ογκοκατασταλτικό miRNA, και ρυθμίζεται προς τα κάτω σε μια ποικιλία ανθρώπινων καρκίνων, συμπεριλαμβανομένου του καρκίνου του παχέος εντέρου [12], [13], [14], [15], [16], [ ,,,0],17], [18]. Ένα αναγνωρισμένο λειτουργία του miRNA-16 είναι ότι ελέγχει τον κυτταρικό κύκλο πρωτίστως μέσω ενός σημείου ελέγχου G1 του κυτταρικού κύκλου [13], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [ ,,,0],25], [26]. Ως εκ τούτου, σε περίπτωση απουσίας του miRNA-16, τα καρκινικά κύτταρα μπορούν να αναπτυχθούν ανεξέλεγκτα. Με αυτό κατά νου, έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι η αναστολή των μαξιλαριών με Cl-αμιδίνης προκαλεί επαγωγή του ρ21

WAF1, οδηγώντας σε διακοπή κύκλου G1 κυττάρου σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου [27]. Αξιοποιώντας αυτά τα αποτελέσματα, για την καλύτερη κατανόηση των μηχανισμών με τους οποίους Cl-αμιδίνη προκαλεί μια σύλληψη G1 του κυτταρικού κύκλου, δείχνουμε εδώ ότι με την παρουσία του p53, η σύλληψη G1 που προκαλείται από Cl-αμιδίνη εξαρτάται από miRNA-16.

Μέθοδοι

Cl-αμιδίνη

Η σύνθεση του Cl-αμιδίνης έχει περιγραφεί στο παρελθόν [28], [29]. συγκεντρώσεις στοκ Cl-αμιδίνης αραιώθηκαν σε 1χ Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) αμέσως πριν από την προσθήκη σε καλλιέργεια κυττάρων.

Κυτταρική καλλιέργεια

HCT 116 άγριου τύπου (WT) καρκινικά κύτταρα κόλου αγοράστηκαν από την American Type Culture Collection (ATCC? Manassas, VA). HCT 116 p53

– /- κύτταρα καρκινώματος του παχέος εντέρου προέρχονται από HCT 116 WT κύτταρα, και παρέχονται από Β Vogelstein και Κ ΚίηζΙβΓ. HCT 116 WT και ρ53

– /- κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε μέσο McCoy (ATCC, Manassas, VA) συμπληρωμένο με 10% Νεογέννητα Εμβρυϊκό Ορό (NBCS? GIBCO /Life Technologies, Grand Island, ΝΥ), 2 mM γλουταμίνη (Biofluids , Rockville, MD), πενικιλίνη (10 U /ml, Biofluids) και στρεπτομυκίνη (10 μg /ml, Biofluids). LS-180 κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, που αγοράστηκε από την ATCC, καλλιεργήθηκαν σε Dulbecco Τροποποιημένο Eagles Medium (Hyclone, Logan, Utah) συμπληρωμένο με 10% Εμβρυϊκό Ορό νεογέννητα (NBCS)? GIBCO /Life Technologies), 2 mM γλουταμίνη (Biofluids, Rockville, MD), πενικιλίνη (10 U /mL, Biofluids) και στρεπτομυκίνη (10 μg /mL, Biofluids).

siRNA και miRNA Επιμόλυνση

Για PAD4 siRNA, 3 × 10

5 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο σε 6 φρεατίων 1 ημέρα πριν την επιμόλυνση. Χρησιμοποιώντας ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ siRNA Μορφομετατροπή Regent (Plyplus, iLllkirch, Γαλλία), τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 20 nmol /L scambled siRNA ως αρνητικός έλεγχος ή PAD4 Trilencer-27 ανθρώπινα siRNA (ΟηΟεηε, Rockville, MD). Μετά από 24 h επιμόλυνσης, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για ανάλυση κηλίδος western για να αξιολογηθεί η αποτελεσματικότητα του γκρεμίζω. κυτταρικού κύκλου εξετάστηκε μετά από 24 ώρες επιμόλυνσης. Για αντι-miR-16 και miR-16-μιμούνται (Ambion, Austin, ΤΧ) επιμόλυνση, 3 × 10

5 κύτταρα αναπτύχθηκαν σε μέσο σε 6 φρεατίων 1 ημέρα πριν την επιμόλυνση. Χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΣΗ siRNA επιμόλυνση, τα κύτταρα επιμολύνθηκαν με 45 nmol /L κωδικοποιημένα siRNA ως αρνητικός έλεγχος και αντι-miR-16 ή HSA-miR-16. Μετά από 24 h επιμόλυνσης, τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε σωληνάρια ελεύθερη ΕΡ ΚΝάσης. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας ΤΚΙζοΙ Regent. Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε με Nanodrop 2000. 10 ng ολικού RNA μεταγράφηκε αντίστροφα σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ TaqMan microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή με microRNA εκκινητές ειδικούς για HSA-miR-16 και η μικρή πρωτεΐνη RNU6B πυρηνικό (U6) για ομαλοποίηση. μέτρηση qPCR του miRNA-16 και U6 έκφραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας TaqMan microRNA Δοκιμασίες με το σύστημα προσδιορισμού PCR 7300. Η σχετική αλλαγή φορές σε miRNA-16 επίπεδο χρησιμοποιήθηκε για να αντιπροσωπεύει την σχετική αφθονία των miRNA-16 σε σύγκριση με την έκφραση U6. Μετά από 24 h επιμόλυνσης με αντι-miR-16, Cl-αμιδίνη (50 μg /mL) προστέθηκε και συλλέχθηκαν για ανάλυση κυτταρικού κύκλου σε 0 h, 2 h, 8 h, και 24 ώρες. του κυτταρικού κύκλου εξετάστηκε επίσης 24 ώρες μετά την επιμόλυνση του miRNA-16 μιμούνται. Όλα τα δείγματα πειραματικές ελέγχου υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με ένα ίσο συγκέντρωση ενός μη-στόχευσης μιμούνται ακολουθία ελέγχου ή αναστολέας αρνητικής ακολουθίας ελέγχου, για χρήση ως έλεγχοι για μη-αλληλουχίας-ειδική επίδραση σε πειράματα miRNA. Mock-επιμολυσμένα έλεγχοι δεν παράγει κανένα σημαντικό αποτέλεσμα σε οποιαδήποτε από τις παραμέτρους που αναλύθηκαν.

έκφραση microRNA

Παγκόσμια miRNA έκφραση.

HCT 116 WT κύτταρα σπάρθηκαν σε 1 × 10

6 κύτταρα /πλάκα 6 φρεατίων εις τριπλούν. Μετά από καλλιέργεια για 24 ώρες, 25 μg /mL Cl-αμιδίνη προστέθηκαν σε κάθε φρεάτιο. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν σε 0, 12, και 24 ώρες χωριστά σε σωληνάρια ελεύθερη ΕΡ ΚΝάσης. Ολικό RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας αντιδραστήριο ΤΚΙζοΙ (Ambion, Austin, ΤΧ). Η συγκέντρωση του RNA προσδιορίστηκε από την Nanodrop 2000 (NanoDrop, Wilmington, DE). 100 ng RNA από HCT 116 WT κύτταρα χρησιμοποιήθηκε για την nCounter miRNA έκφραση Δοκιμασία v1.2 (Nanostring Technologies, Seattle, WA) που περιέχει 800 miRNA σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή.

miRNA-16 έκφρασης.

τα κύτταρα σπάρθηκαν, εκτίθενται σε Cl-αμιδίνη, και συλλέχθηκαν στα ίδια χρονικά σημεία, όπως περιγράφεται για την παγκόσμια έκφραση miRNA. Για miRNA-16 ανίχνευση, 10 ng ολικού RNA χρησιμοποιήθηκε για την αντίστροφη μεταγραφή σε cDNA χρησιμοποιώντας κιτ TaqMan microRNA Αντίστροφη Μεταγραφή (Applied Bisystems, Foster City, CA) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή και miRNA εκκινητές ειδικούς για HSA-miRNA-16 για την ανίχνευση και η μικρή πρωτεΐνη RNU6B πυρηνικό (U6) για ομαλοποίηση (Applied Biosystems). μέτρηση qPCR των miRNA-16 και U6 έκφραση διεξήχθη χρησιμοποιώντας TaqMan miRNA Αναλύσεις (Applied Bisystems) με το 7300 σύστημα προσδιορισμού PCR (Applied Bioystems). Η μέθοδος συγκριτικής κύκλος κατωφλίου (Ct) χρησιμοποιήθηκε για να αξιολογηθεί η σχετική αφθονία του miR-16 σε σύγκριση με την έκφραση U6 (πολλαπλές μεταβολές σε σχέση με το U6). Όλες οι πειραματικές θεραπείες διεξήχθησαν σε τρεις ξεχωριστές περιπτώσεις? κάθε φορά με τρεις επαναλήψεις.

Western ανάλυση κηλίδος

στυπώματα Western πραγματοποιήθηκαν όπως περιγράφεται προηγουμένως [30]. Τα αντισώματα που χρησιμοποιήθηκαν περιλαμβάνουν αντι-ρ53 (EMD Millipore, Rockland ΜΑ? Mouse Monoclonal, cat # op43, 1:500), αντι-ρ21

WAF1 /Cip1 (Sigma? Πολυκλωνικός, cat # p1486, 1:1000), αντι -GAPDH (Cell Signaling, Κουνέλι μονοκλωνικά, cat # 2118, 1:1000), και αντι-PAD4 (ΟηΟεηε? Mouse Monoclonal, cat # TA504813, 1:2000). Χρένου συζευγμένο με υπεροξειδάση αντι-ποντικού και αντι-κουνελιού δευτερογενή αντισώματα αγοράστηκαν από την Amersham. Τόσο δευτερογενή αντισώματα αραιώθηκαν σε 1:2000. σήμα κηλίδας Western ανιχνεύθηκε από SuperSignal West Pico Χημειοφωταυγές υπόστρωμα (Thermo Scientific, Rockford, IL) και αναπτύχθηκε σε Hyperfilm (GE Life Sciences, Piscataway, NJ).

Η ανάλυση κυτταρικού κύκλου

1 × 10

6 κύτταρα αναπτύσσονται σε τρυβλία 6 φρεατίων σε μέσο 5Α 1 ημέρα McCoy πριν τη θεραπεία και στη συνέχεια υποβλήθηκε σε επεξεργασία με 50 μg /mL Cl-αμιδίνη για αντίστοιχους χρόνους. Τα κύτταρα συλλέχθηκαν και μονιμοποιήθηκαν με παγωμένη αιθανόλη. Μετά από πλύση με 1χ Ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) που περιέχει 0.5% αλβουμίνη βόειου ορού δύο φορές, τα κύτταρα επωάστηκαν με διάλυμα χρώσης DNA που αποτελείται από ιωδιούχου προπιδίου (ΡΙ? 10 μg /mL) και RNase (0,1 mg /mL) για 30 λεπτά σε θερμοκρασία δωματίου στο σκοτάδι. Η αναλογία των κυττάρων σε κάθε φάση του κυτταρικού κύκλου προσδιορίστηκε με περιεχόμενο DNA χρωματίζονται με ΡΙ χρησιμοποιώντας ένα BD-LSR-ΙΙ κυτταρόμετρο ροής (BD Biosciences, San Jose, CA). Τα ληφθέντα δεδομένα αναλύθηκαν με BD FACSDiva Λογισμικού (BD Biosciences). Κάθε θεραπεία επαναλήφθηκε τρεις φορές.

mRNA ανάλυση

Το συνολικό RNA εξήχθη χρησιμοποιώντας το αντιδραστήριο ΤπζοΙ (Invitrogen, CA). Ενα μα του συνολικού RNA χρησίμευσε ως μήτρα για σύνθεση ενιαία κλώνου cDNA σε μία αντίδραση χρησιμοποιώντας ολίγο (dT) εναρκτήρες και ΑΜν αντίστροφη μεταγραφάση (Promega Corp, WI) υπό συνθήκες που υποδεικνύονται από τον κατασκευαστή. PCR των δειγμάτων cDNA διεξήχθη με δείγματα ενισχύθηκαν για 30 κύκλους μετουσίωσης στους 94 ° C για 30 s, ανόπτηση στους 50 ° C για 30 s, και επέκταση στους 72 ° C για 30 s με τελική επέκταση στους 72 ° C για 10 λεπτά . Οι αλληλουχίες για Real Time PCR εκκινητών που χρησιμοποιήθηκαν ήταν: CCND1 Forward 5′-CCC TCG ΟΤΟ TCC TAC TTC AA-3 ‘, CCND1 αντίστροφη 5′-ΑΟΟ ΑΑΟ CGG TCC ΑΟΟ TAG ΤΤ-3′? CCND2 Forward 5’-ΤΟΟ GGA AGT TGA AGT GGA AC-3 ‘, CCND2 αντίστροφη 5′-ATC CAC GTC TGT Γ.Ο.Σ. GGT GA-3′? CCND3 Forward 5’-TGA ΤΤΤ ΚΔ GGC CTT CAT TC-3 ‘, CCND3 αντίστροφη 5′-AGC TTC GAT CTG CTC CTG AG-3′? CCNE1 Forward 5’-ATC CTC CAA AGT TGC ACC AG-3 ‘, CCNE1 αντίστροφη 5′-ΑΟΟ GGA CTT ΑΑΑ ΚΕΔ CAC ΤΤ-3′? CDK6 Forward 5’-CCG TGG ATC TCT GGA ΟΤΟ ΤΤ-3 ‘, CDK6 αντίστροφη 5′-TCT GGG ΚΔ AGT CCA ATC AC-3′? GAPDH Forward 5’-GAG TCA ACG GAT TTG GTC GT-3 ‘, GAPDH αντίστροφη 5′-TTG ΑΤΤ TTG GAG GGA TCT CG-3’ (Integrated DNA Technologies, Inc). Real-time PCR (qPCR) εκτελέστηκε χρησιμοποιώντας το Real-Time System 7300 PCR δοκιμασίας (Applied Biosystems, CA) με το Power SYBR πράσινο κύριου μείγματος PCR (Applied Biosystems, CA) και εκκινητές για CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, CDK6 και GAPDH σύμφωνα με το πρωτόκολλο του προμηθευτή. Η έκφραση του γονιδίου CDK6 CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, ομαλοποιήθηκε με την έκφραση του γονιδίου GAPDH. Το φορές αλλαγή στην έκφραση γονιδίου είναι σε σχέση με το διάνυσμα επεξεργασμένα κύτταρα (1χ PBS) συλλέχθηκαν σε 24 ώρες.

Στατιστικά

Όταν συγκρίθηκαν περισσότερες από δύο ομάδες, προσδιορίσαμε στατιστικές διαφορές με χρήση μονόδρομη ανάλυση της διακύμανσης, ακολουθούμενη από το τεστ πολλαπλής σύγκρισης ενός του Scheffe. Αν συγκρίθηκαν δύο ομάδες, χρησιμοποιήσαμε Τ-test του Student. Για την παγκόσμια ανάλυση miRNA, όλα τα δεδομένα που εισήχθησαν v1.0 NSolver Λογισμικό Ανάλυσης (Nanostring Technologies) και ομαλοποιήθηκε ως προς την γεωμετρική μέση τιμή των 100 microRNAs με τις υψηλότερες τιμές έκφρασης. Κανονικοποιημένα δεδομένα που εισάγονται BRB-ArrayTools v4.1.0 για ανάλυση. Πριν από την ανάλυση, τα δεδομένα διηθούνται όπου οποιαδήποτε τιμή μικρότερη από 10 παραλείφθηκε και κάθε microRNA λείπει (C) HCT 116 p53

– /- κύτταρα. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε 25 μg /mL Cl-αμιδίνη για υποδεικνυόμενους χρόνους (Ν = 9 πλάκες ανά χρονικό σημείο). Σχετική ενδογενή επίπεδα έκφρασης miR-16 ανιχνεύθηκαν με qRT-PCR χρησιμοποιώντας Taqman εκκινητές και ανιχνευτές για την ανίχνευση ώριμη miR-16 και η μικρή RNU6B πυρηνικό RNA (U6), ένας εσωτερικός έλεγχος. Σχετική miR-16 επίπεδα έκφρασης κανονικοποιήθηκαν στη μέση τιμή των μη επεξεργασμένων δειγμάτων (0 h). *, Υποδηλώνει σημαντική διαφορά από τον έλεγχο 0 ώρα.

Η

Επειδή p53 ενισχύει την μετα-μεταγραφική ωρίμανση των miRNA-16 [32], και Cl-αμιδίνης προκαλεί επαγωγή σε p53 (Σχήμα S2), εξετάσαμε αν η επαγωγή της miRNA-16 από Cl-αμιδίνης ήταν p53-εξαρτώμενη. Το σχήμα 1C δείχνει Cl-αμιδίνη δεν ήταν σε θέση να προκαλέσει αύξηση της miRNA-16 σε HCT 116 p53

– /-. Κύτταρα, υποδεικνύοντας miRNA-16 επαγωγή ήταν πράγματι ρ53-εξαρτώμενη

Η ρ53-εξαρτώμενη G1 σύλληψη από Cl-αμιδίνη ρυθμίζεται από miRNA-16

με δεδομένη την παρατήρηση ότι τόσο η σύλληψη G1 και αύξηση των miRNA-16 από Cl-αμιδίνης ήταν p53-εξαρτώμενη? ότι η ρ53 ενισχύει την ωρίμανση του miR-16 [32]? και ότι οι άλλοι έχουν δείξει miRNA-16 προκαλεί G1 σύλληψης [13], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25], [26], υποθέσαμε ότι miRNA-16 βρίσκεται στο σταυροδρόμι της p53-εξαρτώμενη σύλληψη G1 που προκαλείται από την αναστολή PAD. Για να ελέγξει την υπόθεση αυτή, έχουμε χτυπηθεί κάτω miRNA-16 (Σχήμα S3C) σε HCT 116 κύτταρα, στη συνέχεια εκτίθενται τα κύτταρα να CL-αμιδίνη. Τα αποτελέσματα φαίνονται στον Πίνακα 3Α και Σχήμα S3D πράγματι δείχνουν ότι η σύλληψη G1 που προκαλείται από Cl-αμιδίνης σε HCT 116 κύτταρα WT εξαρτάται miRNA-16, διότι σε περίπτωση απουσίας του miRNA-16, Cl-αμιδίνη δεν ήταν σε θέση να προκαλέσει τον κυτταρικό κύκλο σύλληψη. Για να επιβεβαιώσουν αυτά τα αποτελέσματα, εμείς επιμολυσμένα HCT 116 κύτταρα με miRNA-16 siRNA και miRNA-16 μιμούνται. Μετά από επώαση για 24 ώρες χωρίς την επιμόλυνση, επιμόλυνση των miRNA-16 siRNA ή ΜΙΚ-16 μιμούνται, τα κύτταρα συλλέχθηκαν και εξετάστηκαν κυτταρικού κύκλου. Ο Πίνακας 3Β παρουσιάζει το miRNA-16 μιμητικό προκάλεσε μια διακοπή κύκλου G1 κύτταρο, υποστηρίζοντας την υπόθεση ότι η επαγωγή του miRNA-16 από Cl-αμιδίνη είναι ένα γεγονός κλειδί που οδηγεί σε μια σύλληψη G1 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου με ένα υπόβαθρο p53 WT. Στο σύνολό τους, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι το ρ53-εξαρτώμενη G1 σύλληψη με τη σειρά της εξαρτάται από την ικανότητα της αναστολής PAD από Cl-αμιδίνη την πλειορύθμιση της έκφρασης του miRNA-16.

Η

Cl-αμιδίνη αιτίες μια ρύθμιση προς τα κάτω των miRNA-16 στόχους που εμπλέκονται σε μια

G1 σύλληψη

Έχουμε δείξει ότι miRNA-16 βρίσκεται στο σταυροδρόμι της σύλληψης G1 σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου από Cl-αμιδίνη. Θα ήταν επομένως αναμένεται να λόγο να εξετάσει τα αποτελέσματα της Cl-αμιδίνης για miRNA-16 στόχους που εμπλέκονται σε μια σύλληψη G1 του κυτταρικού κύκλου. Τέτοιοι στόχοι περιλαμβάνουν: κυκλίνη D1 (CCND1) [13], [19], [33], [34], [35], [36], κυκλίνη D2 (CCND2) [13], η κυκλίνη D3 (CCND3) [33] , η κυκλίνη Ε1 (CCNE1) [13], [21], [24], [35], και οι εξαρτώμενες από κυκλίνη κινάση-6 (CDK6) [35]. Κατά την εξέταση των επιπτώσεων της Cl-αμιδίνης σε αυτούς τους στόχους miRNA-16, βρήκαμε μια σημαντική μείωση σε όλες τις παραμέτρους (Σχήμα 2). Αυτό είναι συνεπές με την υπόθεση ότι η αναστολή PAD από Cl-αμιδίνη ενεργοποιεί miRNA-16, το οποίο με τη σειρά του, ρυθμίζει προς τα κάτω πολλαπλά γονίδια που είναι γνωστό ότι συμμετέχουν εις την πρόοδον G1.

HCT 116 κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 1χ PBS ( -.) ή 25 μg /mL Cl-αμιδίνη (+) για 24 ώρες, στη συνέχεια το RNA που συγκομίζονται για qPCR όπως περιγράφεται στις μεθόδους. Η CCND1, CCND2, CCND3, CCNE1, και γονιδιακή έκφραση CDK6 ομαλοποιήθηκαν με την έκφραση του γονιδίου GAPDH. *, Υποδηλώνει σημαντική διαφορά από τον έλεγχο (-) (ρ & lt? 0,05)

Η

Συζήτηση

μαξιλάρια ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά στα σπονδυλωτά στις αρχές της δεκαετίας του 1980 μέσα από την επιδερμίδα του νεογέννητους αρουραίους [. ,,,0],37]. Από τότε, έχει γίνει όλο και περισσότερο προφανές ότι η δραστηριότητα PAD, με προκύπτουσα πρωτεΐνη κιτρουλλινοποίηση, οδηγεί πολλές φλεγμονώδεις ασθένειες και καρκίνων, συμπεριλαμβανομένων κολίτιδα και καρκίνο του παχέος εντέρου [1], [4], [5], [6]. Ως εκ τούτου, για την ανάπτυξη θεραπειών με βάση την PAD σηματοδότησης για την καταστολή ή την πρόληψη του καρκίνου του παχέος εντέρου, είναι σημαντικό να κατανοηθούν οι μηχανισμοί. Έχουμε εντοπίσει ότι η αναστολή των μαξιλαριών με νέα μας μικρό μόριο αναστολέα (Cl-αμιδίνη) καταστέλλει την υψηλού κόλον ασθένεια κίνδυνο καρκίνου, της ελκώδους κολίτιδας, σε ποντικούς [4]. Εδώ, έχουμε επεκτείνει αυτές τις μελέτες, και απέδειξαν ότι Cl-αμιδίνη προκαλεί μια διακοπή G1 του κυτταρικού κύκλου σε κύτταρα καρκίνου του παχέος εντέρου, ότι αυτή η επίδραση προκαλείται από τη ρύθμιση της έκφρασης του υποθετικού ογκοκατασταλτικό καρκίνου του παχέος εντέρου microRNA, miRNA-16? και ότι αυτό συμβαίνει μόνο με την παρουσία της πρωτεΐνης καταστολέα όγκου, ρ53. Αν και έχουμε ακόμη να δείξουμε ότι Cl-αμιδίνη καταστέλλει καρκίνο του παχέος εντέρου σε ποντικούς, τα αποτελέσματα εδώ αναλύσουμε τους μηχανισμούς με τους οποίους PAD αναστολή από Cl-αμιδίνη πιθανότατα θα καταστείλει τον καρκίνο του παχέος εντέρου. Με δεδομένη τη στενή σχέση μεταξύ της φλεγμονής του παχέος εντέρου και του κινδύνου καρκίνου του παχέος εντέρου [38], [39], [40], [41], [42], προηγούμενη μελέτη μας δείχνει ότι η Cl-αμιδίνη καταστέλλει κολίτιδα [4] προβλέπει, επίσης, ότι η Cl-αμιδίνη μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την πρόληψη ή /και τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου. Εκτός από την καταστολή της φλεγμονής, η παρούσα μελέτη δείχνει ότι ένας πρόσθετος μηχανισμός (για την καταστολή του καρκίνου του παχέος εντέρου από Cl-αμιδίνη) είναι μέσω της ρ53 και miRNA-16 εξαρτώμενη διακοπή κύκλου G1 κυττάρων σε καρκινικά κύτταρα του παχέος εντέρου. Η ακριβής αιτιολογία για την διακοπή του κυτταρικού κύκλου που προκαλείται από την αναστολή με τη μεσολάβηση αύξηση PAD σε miRNA-16, ωστόσο, παραμένει να διευκρινιστεί. Παρά το γεγονός ότι είδαμε μια αύξηση της p21

WAF1 με τη θεραπεία Cl-αμιδίνης (Εικόνα S2), αυτό δεν φαίνεται να είναι η μόνη εκδήλωση που προκαλεί τη σύλληψη G1, λόγω των miRNA-16 αποδείξεις μας (miRNA-16 κατάλυσης αναιρεί το G1 σύλληψη από Cl-αμιδίνης: Πίνακας 3? Σχήματα S3C και S3D). Για το σκοπό αυτό, miRNA-16 έχει αναδειχθεί σε ειδικά κλειδί miRNA στο σημείο ελέγχου G1 του κυτταρικού κύκλου. miRNA-16 στόχους αρκετές ρυθμιστές του κυτταρικού κύκλου, συμπεριλαμβανομένης της κυκλίνης D1 (CCND1), κυκλίνη D2 (CCND2), κυκλίνη D3 (CCND3), κυκλίνη Ε1 (CCNE1), κυκλίνη εξαρτώμενη κινάση-1 (CDK1), CDK6, cdc25A και ADP -ribosylation πρωτεΐνη παράγοντα όπως είναι το 2 (ARL2) [13], [19], [21], [24], [26], [33], [34], [35], [36], [43], [44]. Δεδομένου σαφείς ρόλους τους στην οδήγηση της εξέλιξης της διαίρεσης κυττάρων μέσω της φάσης G1, ειδικά CDK6, κυκλίνη D και κυκλίνη Ε, η ικανότητα των miRNA-16 για τη στόχευση αυτών των μορίων είναι η πιο πιθανή αιτία για τα ευρήματά μας (Σχήματα 2 και 3) . Μια άλλη ξεχωριστή σειρά πειραμάτων εκτός του πεδίου εφαρμογής της παρούσας μελέτης αφορά τις λειτουργικές επιπτώσεις των άλλων miRNA που φαίνεται να έχουν διαφορετική έκφραση μετά την έκθεση της HCT 116 κύτταρα να CL-αμιδίνη (Πίνακας 2).

Η αναστολή των μαξιλαριών από Cl-αμιδίνη ενεργοποιεί p53, η οποία με τη σειρά της ενεργοποιεί miRNA-16. Η ενεργοποίηση των miRNA-16 προκαλεί μια διακοπή κύκλου G1 κυττάρων, προφανώς στοχεύοντας κυκλίνες D, E και /ή CDK6.

Η

Από Cl-αμιδίνη είναι ένας αναστολέας παν-PAD [45], παραμένει να εμφανίζεται το οποίο PAD είναι το κλειδί για την επαγωγή μιας σύλληψης G1 του κυτταρικού κύκλου. Η ανακάλυψή μας ότι η ρύθμιση προς τα κάτω του PAD4 μέσω siRNA προκαλεί μια συγκρίσιμη G1 σύλληψη με εκείνο των Cl-αμιδίνης (Πίνακες 1Α και 1 D), δείχνει PAD4 είναι τουλάχιστον ένα από τα βασικά ένζυμα PAD υπεύθυνα για τον κυτταρικό κύκλο εξέλιξης ανεξάρτητο από τα άλλα μαξιλάρια . Συνεπής με αυτό το εύρημα είναι η κατανόηση ότι η δραστηριότητα PAD4 είναι αυξημένη σε αδενοκαρκινώματα του παχέος εντέρου [6]. Ωστόσο, λόγω της δραστηριότητας παν-PAD του Cl-αμιδίνης, δεν μπορούμε να αποκλείσουμε την επίδραση των άλλων pads σε εξέλιξη του κυτταρικού κύκλου. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για μαξιλάρια γνωστό ότι εκφράζεται σε κύτταρα προέλευσης επιθηλιακών /καρκίνωμα (αυτά που χρησιμοποιούνται σε αυτή τη μελέτη), συμπεριλαμβανομένων των pad1 [46], PAD2 [47] και PAD3 [7].

Η ανακάλυψή μας ότι Cl-αμιδίνη προκαλεί επαγωγή του ρ53 (σχήμα S2) και αναστέλλει την ανάπτυξη των κυττάρων σε ένα ρ53-εξαρτώμενο τρόπο είναι σύμφωνη με άλλες ομάδες [27], [48]. Οι μηχανισμοί της επαγωγής ρ53 με αναστολή PAD, ωστόσο, παραμένουν ασαφείς. PAD4 μπορεί να ρυθμίσει την γονιδιακή έκφραση με κατάλυση της μετα-μεταφραστική κιτρουλλινοποίηση ενός αριθμού καταλοίπων Arg σε υποστρώματα ιστόνης [49], [50]. PAD4 μπορούν να προσληφθούν σε ιστόνες από την αλληλεπίδρασή του με το p53 [27]. Ως αποτέλεσμα, PAD4 παίρνει προσλαμβάνονται με τους φορείς των γονιδίων p53-στοχευμένη όπου citrullinates ιστόνες και καταστέλλει τη μεταγραφή των γονιδίων p53-στόχο. PAD4 μπορεί επίσης citrullinate μη ιστόνης πρωτεΐνες που συνδέουν με p53 και εμπλέκονται στην καρκινογένεση. Αξίζει να σημειωθεί ότι, PAD4 μπορεί citrullinate αναστολέα της πρωτείνης ανάπτυξης 4 (ING4), αναστέλλοντας έτσι την ING4 διαμεσολαβούμενη ενεργοποίηση της p53 [51]. Οι μηχανισμοί αυτοί υποστηρίζουν το συμπέρασμα ότι η αναστολή PAD από Cl-αμιδίνη προκαλεί επαγωγή ρ53. Τέλος, διερευνούμε τη δυνατότητα ότι η ρ53 μπορεί να είναι κιτρουλλινοποιημένα, που οδηγεί στην παραγωγή του SDS-αδιάλυτων συσσωματωμάτων, παρόμοιο με μια σειρά από καρκίνο που σχετίζεται μεταλλάξεων ρ53 [52]. Αν αυτή είναι η περίπτωση, η αναστολή του p53 κιτρουλλινοποίηση (από Cl-αμιδίνη) θα οδηγήσει σε αυξημένα επίπεδα ρ53 με την πρόληψη αυτού του φαινοτύπου συνάθροιση.

Εν κατακλείδι, δεδομένης της αυξανόμενης κατανόηση ότι η δραστηριότητα PAD (και την επακόλουθη κιτρουλλινοποίηση) διαδραματίζει βασικό ρόλο στις χρόνιες ασθένειες όπως οι φλεγμονώδεις παθήσεις και ο καρκίνος, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε καλύτερα τους μηχανισμούς. Πολύ λίγα είναι γνωστά σήμερα στον τομέα αυτό. Όσον αφορά τον καρκίνο, εδώ έχουμε αποδείξει ότι miRNA-16 παίζει ένα ζωτικό ρόλο στη ρύθμιση της G1 σημείο ελέγχου του κυτταρικού κύκλου που επάγεται από την αναστολή PAD σε καρκίνο του παχέος εντέρου κυτταρικές σειρές ρ53 WT

in vitro

. Αν και το

in vivo

μετάφρασης μένει να αποδειχθεί, αυτοί οι τρέχουσες πειράματα ρίξει φως στο μηχανισμό με τον οποίο PAD αναστολή από νέο αναστολέα PAD μας, Cl-αμιδίνη, λειτουργεί. μηχανιστική ευρήματά μας ανοίγουν την πιθανότητα ότι οι αναστολείς PAD μόνη της, είτε σε συνεννόηση με ρ53 ή /και miRNA-16 μιμείται, μπορεί να έχει αποτελεσματικότητα στην χημειοπροφύλαξη ή /και τη θεραπεία του καρκίνου του παχέος εντέρου.

Υποστήριξη Πληροφορίες

Εικόνα S1.

Εκπρόσωπος ιστογράμματα κυτταρομετρίας ροής για υποδεικνύεται κυτταρικές σειρές καρκίνου του παχέος εντέρου. (Α) ιστογράμματα σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία που δείχνουν Cl-αμιδίνη (50 μg /mL) επάγει μία σύλληψη φάση G1 σε HCT 116 κύτταρα, τα οποία είναι p53 WT. (Β) ιστογράμματα σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία που δείχνουν Cl-αμιδίνη (50 μg /mL) επάγει μία σύλληψη φάση G1 σε LS-180 κύτταρα, τα οποία είναι p53 WT. (Γ) ιστογράμματα σε υποδεικνυόμενα χρονικά σημεία που δείχνουν Cl-αμιδίνη (50 μg /mL) δεν επάγει μια σύλληψη φάση G1 σε HCT 116 p53

– /- κύτταρα, τα οποία είναι ελλειμματικά σε p53

DOI:. 10.1371 /journal.pone.0053791.s001

(ΔΕΘ)

Εικόνα S2.

Cl-αμιδίνη προκαλεί επαγωγή σε ρ53 και ρ21 σε HCT 116 κύτταρα, αλλά όχι σε HCT 116 p53

– /- κύτταρα. Τα κύτταρα εκτέθηκαν σε υποδεικνυόμενες συγκεντρώσεις Cl-αμιδίνης για 24 ώρες, στη συνέχεια συλλέγονται για ανάλυση στυπώματος western. Οι αριθμοί κάτω από τις ζώνες είναι GAPDH προσαρμοσμένο τιμές πυκνότητας σε σχέση με την ομάδα ελέγχου (0 μg /mL Cl-αμιδίνη)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0053791.s002

(ΔΕΘ)

Εικόνα S3 .

(Α, Β). Να χτυπήσει κάτω PAD4 (Α) προκαλεί G1 διακοπή του κυτταρικού κύκλου σε HCT 116 κύτταρα (Β). (Α) ανάλυση Western blot δείχνει PAD4 νοκ ντάουν με siRNA να PAD4. Οι αριθμοί κάτω από τις ζώνες είναι GAPDH προσαρμοσμένο τιμές πυκνότητας σε σχέση με την ομελέτα ομάδα ελέγχου siRNA. (Β) Εκπρόσωπος οικόπεδα κυτταρικού κύκλου μετά από 24 ώρες. επιμόλυνση είτε με μπερδεμένο siRNA ή siRNA να PAD4. (C, D). Μετά από να χτυπήσει κάτω miR-16 (C), Cl-αμιδίνη (50 μg /mL) δεν προκαλεί διακοπή κύκλου κυττάρου σε G1 HCT 116 κύτταρα (D). (Γ) Ποσοτικοποίηση των miRNA-16 έκφραση με Q-PCR. *, Δείχνει σημαντική μείωση στην έκφραση miRNA-16 στις 24 ώρες μετά την επιμόλυνση σε σύγκριση με τα ανακατωμένα ελέγχου siRNA. Σημειώστε ότι Cl-αμιδίνης δεν επηρέασε την απόδοση των miRNA-16 νοκ ντάουν. (Δ) Εκπρόσωπος κυτταρομετρίας ροής histogrtams μετά από 24 ώρες. επιμόλυνση με αντι-miR-16, τότε η έκθεση σε Cl-αμιδίνη (50 μg /mL) για ενδεικνυόμενα χρονικά σημεία

doi:. 10.1371 /journal.pone.0053791.s003

(TIF)